Graphenoxid-basierte Nanokomposite, dekoriert mit Silbernanopartikeln als antibakterielles Mittel

Hintergrund

Die Entwicklung von Antibiotika hat eine bedeutende Rolle bei der Kontrolle der Zahl bakterieller Infektionen gespielt. Der unsachgemäße Gebrauch und der übermäßige Gebrauch von Antibiotika haben jedoch bei vielen Bakterienarten zur Entwicklung von Mehrfachresistenzen geführt. Einige Stämme sind gegen praktisch alle gängigen Wirkstoffe resistent geworden:Beta-Lactame, Tetrazykline und Aminoglykoside [1]. Die wichtigsten resistenten Erreger sind Methicillin-resistente Staphylococcus aureus , Vancomycin-resistenter Enterococcus und β-Lactamase-produzierendes Klebsiella pneumoniae mit erweitertem Spektrum und Escherichia coli [2, 3]. Bakterien mit ihren sehr großen Populationen und ihrer schnellen Proliferationszeit sind in der Lage, schnell Mechanismen der Antibiotikaresistenz zu entwickeln, wenn eine Untergruppe der Bakterienpopulation eine Antibiotikabehandlung überlebt. Zudem sind antibiotikaresistente Bakterien in der Lage, DNA-Kopien, die für einen Resistenzmechanismus kodieren, auf andere entfernt verwandte Bakterien zu übertragen, die dann die Resistenzgene an nachfolgende Generationen weitergeben können. Somit stellt das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterien ein ernstes Problem dar, das durch die Entwicklung neuer antimikrobieller Mittel überwunden werden könnte. Antibakterielle Wirkstoffe sind in der Textilindustrie, Wasserdesinfektion, Medizin und Lebensmittelverpackung sehr wichtig. Als Alternative zu Antibiotika können Nanopartikel und Nanomaterialien eingesetzt werden [4]. Der Mechanismus der antibakteriellen Aktivität von Nanopartikeln variiert zwischen den verschiedenen Arten von Nanopartikeln. Während sich einige vorgeschlagene Mechanismen auf die physikalisch-chemische Struktur der Nanopartikel beziehen, beziehen sich andere auf die erhöhte Freisetzung antibakterieller Ionen von Nanopartikeloberflächen. Mehrere gleichzeitige Wirkmechanismen gegen Mikroben würden eine Vielzahl von synchronen DNA-Mutationen in derselben mikrobiellen Zelle für die Entwicklung von Resistenzen erfordern; Daher ist es für Bakterienzellen schwierig, gegen Nanopartikel und Nanomaterialien resistent zu werden. Antimikrobielle Nanomaterialien wie Silber, Kupfer, Fullerene und einwandige Kohlenstoffnanoröhren können aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften und großen Oberflächen mehrere Vorteile bieten [5,6,7,8]. Die genauen Mechanismen der Toxizität von Nanopartikeln (NP) gegen verschiedene Bakterien sind nicht vollständig verstanden. Nach der aktuellen Forschung sind die Hauptprozesse, die der antibakteriellen Wirkung von NPs zugrunde liegen, die Zerstörung der bakteriellen Zellmembran, die Freisetzung von Metallionen, die Bildung von ROS, das Eindringen in die bakterielle Zellmembran und die Induktion intrazellulärer antibakterieller Wirkungen, einschließlich Wechselwirkungen mit DNA und Proteine ​​[9, 10]. Nanopartikel können sich durch elektrostatische Wechselwirkung an die Membran von Bakterien anlagern und die Integrität der Bakterienmembran zerstören. Wesentlich für die Haftung ist die positive Ladung der Oberfläche der NPs. Die positive Ladung ermöglicht eine elektrostatische Addition zwischen NPs und negativ geladener Zellmembran der Mikroorganismen [11]. Die elektrostatische Verbindung zwischen NPs mit den schwefelhaltigen Proteinen auf der Oberfläche von Bakterienzellen führt zu irreversiblen Veränderungen der Zellwandstruktur, die zu Schäden an Zellwand und Membran führen [12]. Die Bakterienmembran ist unabhängig vom Stoffwechselstatus der Zelle von entscheidender Bedeutung, da sie eine selektive Permeabilität für die zelluläre Homöostase und die metabolische Energieübertragung bietet. Die zweite antibakterielle und antimykotische Aktivität von NPs beruht auf ihrer Fähigkeit, ROS und freie Radikale zu produzieren [13]. Ein erhöhter ROS-Spiegel induzierte eine Hyperoxidation von Lipiden, Proteinen und DNA [14].

Darüber hinaus sind die Strukturen vieler Arten von NPs geeignet, antimikrobielle Wirkstoffe zu tragen [15, 16]. Träger können helfen, die Medikamente vor Resistenzen durch Zielbakterien zu schützen. Ein auf Nanopartikeln basierendes Wirkstoffabgabesystem kann dabei helfen, Antibiotika gezielt an eine Infektionsstelle zu bringen und dadurch systemische Nebenwirkungen zu minimieren. Weitere Vorteile sind eine verbesserte Löslichkeit hydrophober Wirkstoffe, eine verlängerte systemische Zirkulationszeit und Wirkstoffhalbwertszeit sowie eine anhaltende Wirkstofffreisetzung [4].

Kürzlich wurde gezeigt, dass Graphen, ein neues Allotrop von Kohlenstoff, eine antibakterielle Wirkung hat. Graphen ist ein Material aus Kohlenstoffatomen, die in einem sich wiederholenden Muster von Sechsecken miteinander verbunden sind. Ein einzigartiges Merkmal von Graphenflocken ist das Verhältnis ihrer Dicke zur Oberfläche. Die Oberfläche von Graphen ist mit einer Elektronenwolke bedeckt, die dieses Material wahrscheinlich als Elektronendonator prädisponiert und ihm die Fähigkeit verleiht, spezielle Bindungen einzugehen. Die Kanten von Graphen haben andere Bindungen (charakteristisch für Diamantbindungen vom sp3-Typ), und diese Stellen können unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen [17]. Diese Eigenschaften legen nahe, dass Graphen einer plastischen Adhäsion an verschiedene interzelluläre Strukturen, einschließlich Bakterienzellen, ausgesetzt sein kann [18, 19, 20]. Darüber hinaus kann Graphen aufgrund seiner zwei aktiven Seiten (Oberfläche und Kanten) biologische Moleküle an seinen Kanten anlagern und an der Zelloberfläche haften. Eine oxidierte Form von Graphen, Graphenoxid (GO), ist aufgrund der Sauerstofffunktionalitäten leicht in Wasser und anderen organischen Lösungsmitteln dispergierbar. Die sauerstoffhaltigen Gruppen ermöglichen die unkomplizierte chemische Funktionalisierung von GO-Faltblättern über kovalente und nicht-kovalente Wechselwirkungen. Über die starke antibakterielle Aktivität von GO wurde berichtet. Die antibakterielle Aktivität von GO wurde dem Membranstress zugeschrieben, der durch scharfe Kanten von Graphenoxid-Nanoblättern induziert wird und zu einer physikalischen Schädigung der Zellmembranen führen kann, was zum Verlust der Integrität der Bakterienmembran führt [21]. In letzter Zeit wurden Graphen-funktionalisierte antimikrobielle Nanopartikel als vielversprechende antibakterielle Materialien verwendet [22, 23]. Nanokomposite können die Grenzen der einzelnen Komponenten überwinden. Beispielsweise sind antibakterielle Nanomaterialien, die auf dem Graphen-Substrat angebracht sind, stabiler und gut dispergiert [24]. Diese Nanokomposite können Metalle, Metalloxide und Polymere enthalten.

Eine der vielversprechendsten Methoden gegen arzneimittelresistente Bakterien können oberflächenmodifizierte Materialien mit bioziden Nanopartikeln sein. Ultraschalltechnologien haben sich als wirksame Methode zur Beschichtung verschiedener Materialien mit antibakteriellen und fungiziden Substanzen bestätigt [25,26,27,28]. Viele Forscher klassifizieren das Ultraschallverfahren als „grüne Technologie“ [29, 30]. Die Methode basiert auf der Nutzung von Kavitationsphänomenen, also der Bildung, dem Wachstum und dem Kollaps von Kavitationsblasen im flüssigen Medium [31, 32]. Implodierende Blasen erzeugen innerhalb kurzer Zeit immense Energiemengen in Mikroregionen bis 5000 K und Druck bis 2000 atm [33, 34]. Infolgedessen werden Stoßwellen und sogenannte Mikrojets erzeugt, die auf die feste Oberfläche gerichtet sind [35]. In einem flüssigen Medium gelegen, werden NPs durch den Implosionseffekt und Jetstreams mit hoher Geschwindigkeit (> 100 m/s) auf die feste Oberfläche getrieben und bilden eine Schicht [36]. Akustische Kavitation kann auch zu einer Änderung der physikalischen Eigenschaften von beschallten Objekten führen, z. B. die Größenänderung von GO-Flocken [37, 38].

Wir haben in unseren früheren Studien mit Salmonella enterica vielversprechende Ergebnisse erzielt und Listeria monocytogenes behandelt mit reinem Graphen, GO und reduziertem GO [20]. Von den verschiedenen Graphentypen wurde auch festgestellt, dass GO bei niedriger Konzentration die höchste antibakterielle Aktivität aufweist. Bakterienzellen wurden über die gesamte Oberfläche des GO verteilt. In dieser Studie stellten wir die Hypothese auf, dass mit Silbernanopartikeln (GO-Ag) dekoriertes GO einen stärkeren toxischen Einfluss auf mikrobielle Zellen hat als bloßes GO oder Silbernanopartikel (Ag-NPs). Da es zwei aktive Seiten (Oberfläche und Kanten) hat, kann GO-Oxid Ag-NPs an den Kanten anlagern und an der Zelloberfläche haften. Die antibakterielle Aktivität von Graphen-basierten Nanokompositen kann auf die Zerstörung der Zellmembran und oxidativen Stress zurückzuführen sein. Das Ziel dieser Studie war es, die antimikrobielle Aktivität von GO-basierten Nanokompositen, die mit Ag-NPs dekoriert sind, im Vergleich zu bloßem GO und Ag-NPs unter Verwendung von gramnegativen Bakterien (Escherichia coli ), grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis ) und pathogene Hefen (Candida albicans ) unter Verwendung eines In-vitro-Modells. Die Untersuchung umfasste die Strukturanalyse von Nanokompositen mittels Röntgenbeugung, Raman-Spektroskopie-Transmission, FT-IR, Elektronenmikroskopie (TEM), Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Rasterkraftmikroskopie (AFM), Bewertung der mikrobiellen Zellmorphologie, Beurteilung von Zelllebensfähigkeit durch PrestoBlue™-Test, Untersuchung der Zellmembranintegrität durch Laktat-Dehydrogenase-Test (LDH) und Bewertung der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS).

Methoden

Synthese, Modifikation und Charakterisierung von Graphenoxid

In dieser Studie wurde ein kommerziell erhältliches Graphitpulver (Acros Organics, New Jersey, USA) nach der modifizierten Hummers-Methode oxidiert [39]. Zehn Gramm Graphitpulver wurden mit 230 ml konzentrierter Schwefelsäure (98%) unter 10 °C gemischt. Dann wurden 4,7 g Natriumnitrat und 30 g Kaliumpermanganat nach und nach zu der Mischung aus Schwefelsäure und Graphit gegeben, während die Temperatur unter 10 °C gehalten wurde. Dann wurde die Mischung auf 30 °C erhitzt und 2 h gerührt. Im nächsten Schritt wurden 100 ml Wasser zugegeben und die Mischungstemperatur erreichte ~ 100 °C. Schließlich wurde die Mischung mit 10 ml Wasserstoffperoxid behandelt. Zur Reinigung wurde die Aufschlämmung filtriert und mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Filtrats 6,5 erreichte.

Röntgenbeugungsmuster von GO wurden bei Raumtemperatur im Bereich von 2 Theta-Winkeln von 10° bis 100° mit einem Schritt von 0,02° unter Verwendung des Röntgenpulverdiffraktometers (CuK _α1 ) (X’Pert PRO, PANalytical, Almelo, Niederlande).

Die Analyse des Kohlenstoff-, Wasserstoff-, Stickstoff- und Schwefelgehalts nach Gewicht in GO wurde unter Verwendung des Vario EL III-Geräts, hergestellt von Elementar Analysensysteme GmbH (Langenselbold, Deutschland), durchgeführt. Vor der Durchführung chemischer Analysen von GO wurden die Proben in einer Desorptionsstation (VcPrep 061, Micromeritics, Norcross, GA, USA) 24 h unter Vakuum (0,05 mbar) bei 50 °C desorbiert. Der Sauerstoffgehalt wurde berechnet, indem die ermittelten Gehalte an Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Schwefel von 100 % des Gewichts abgezogen wurden.

Die Raman-Spektroskopie wurde unter Verwendung eines inVia-Raman-Mikroskops (Renishaw, UK) durchgeführt. Graphenoxid wurde mit der 514-nm-Laserwellenlänge mit 5% seiner Anfangsleistung analysiert. Die Spektren wurden von fünf verschiedenen Punkten auf der Probe gesammelt. Die Belichtungszeit betrug 10 s und es wurden zwei Scans gesammelt.

FT-IR-Messungen wurden mit dem Nicolet iS10-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, USA) im abgeschwächten Totalreflexionsmodus an einem Diamantkristall durchgeführt. Fünf Mikroliter Graphenoxid-Wassersuspension wurden auf die Oberfläche des Diamantkristalls getropft und trocknen gelassen. Nach dem Trocknen wurde das Spektrum im Bereich von 400–4000 cm ^–1 . aufgenommen .

Die Messungen der durchschnittlichen Partikelgröße und des Zetapotentials wurden mit dem Zetasizer Nano-ZS ZEN 3600, hergestellt von Malvern Instruments Ltd. (Malvern, UK) im dynamischen Lichtstreuungsmodus (DLS) bzw. Laser-Doppler-Elektrophorese bei Raumtemperatur (23 ° .) durchgeführt C).

TEM/SEM/AFM-Analyse von Nanomaterialien

Die Morphologie von Pulvern und Folien wurde mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM; JEM-1220 JEOL, Tokio, Japan, Beschleunigungsspannung 80 kV) und dem Rasterelektronenmikroskop (REM; Zeiss, Ultra Plus, Oberkochen, Deutschland) bestimmt. Proben für TEM-Beobachtungen wurden hergestellt, indem Tröpfchen von Hydrokolloiden auf TEM-Gitter (Formvar auf 3 mm 200 Mesh Cu Grids, Agar Scientific, Stansted, UK) platziert wurden. Unmittelbar nach der Lufttrocknung der Tröpfchen wurden die Gitter in das Mikroskop eingesetzt.

Für die REM-Analyse wurden Proben mit dem Sputter-Coater (SCD 005/CEA 035, BAL-TEC, Pfäffikon, Schweiz) mit einer dünnen Kohlenstoffschicht beschichtet. Es wurde ein laborinternes Messverfahren angewendet (P5.10, Ausgabe 6 vom 26.08.2015).

Die AFM-Bildgebung (Atomkraftmikroskopie) wurde mit der Software Asylum Research MFP3D Bio (Version:Asylum Research MFP3D 15.106.09) durchgeführt. Die Oberflächentopographie-Bildgebung und die Detektion von GO auf den getesteten Folienoberflächen wurden mit zwei Bildgebungsmodi durchgeführt, dem AC-Modus für die Phasenkontrastbildgebung und der Lateral Force Microscopy (LFM) für die GO-Detektion, da GO die Reibungskräfte reduziert [40].

Herstellung von Polyurethanfolien, die mit GO und Ag-NPs beschichtet sind

Zur Abdeckung von Polyurethanfolien wurden Suspensionen von Ag-NPs (HydroSilver1000, Amepox, ódź, Polen) und GO verwendet. Suspensionen von GO, Ag-NPs und GO-Ag (GO (200 μg/ml), Ag-NPs (100 μg/ml), GO (200 μg/ml) + Ag-NPs (100 μg/ml)) waren hergestellt in entionisiertem Wasser (Leitwert 0,09 μS/cm, Entionisierer:HLP 20UV, Hydrolab, Staszyn, Polen). Die Suspensionen wurden ohne zusätzliche Reinigung und Filtration verwendet.

Die Ultraschallbeschichtung von Polyurethanfolien (15 × 15 × 0,05 mm) erfolgte in einem Glaskolben mit einem Volumen von 50 ml. Folienproben wurden auf einem Stativ (Teflon) befestigt und anschließend in die vorbereiteten Suspensionen getaucht. Der Beschichtungsprozess wurde unter Verwendung eines Ultraschallhorns (Ti-Horn, Ø13 mm, 60 % Effizienz, 20 kHz, Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) durchgeführt, das rechtwinklig zu den in der Suspension vorhandenen Folienproben platziert wurde. Die Prozesstemperatur betrug 30 ± 1 °C. Die abgedeckten Proben wurden in entionisiertem Wasser gespült und in einer Laminarkammer getrocknet und anschließend in sterile Verpackungen verpackt.

Freie Oberflächenenergie

Benetzbarkeitstests wurden mit dem Data Physics OCA – 20 Goniometer (DataPhysics Instruments GmbH, Filderstadt, Deutschland) durchgeführt. Die freie Oberflächenenergie (SFE) wurde nach der Methode von Owens, Wendt, Rabel und Kaelble (OWRK) mit zwei Testflüssigkeiten berechnet:entionisiertem Wasser und Diiodmethan [41].

Kultivierung und Vorbereitung von Bakterien und Hefen

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Escherichia coli (ATCC 25922) und Candida albicans (90028) wurden von LGC Standards (Lomianki, Polen) erhalten. Die Stämme wurden als Sporensuspensionen in 20 % (v /v ) Glycerin bei − 20 °C. Vor ihrer Verwendung in Experimenten wurden die Stämme aufgetaut und das Glycerin durch Waschen der Bakterienzellen mit destilliertem Wasser entfernt. Die Bakterien und Hefe wurden dann auf den folgenden Nährmedien gezüchtet:tryptisches Soja-Agar für S . aureus und E . Coli , Hirn-Herz-Agar für S . Epidermidis , und Sabouraud-Agar für C . albicans (Merck Millipore, Darmstadt, Deutschland). Die auf Agarplatten gewachsenen Bakterien und Hefen wurden durch vorsichtiges Waschen der Platten mit steriler destillierter Kochsalzlösung geerntet. Um die Anzahl der Bakterien in der Zellsuspension zu berechnen, muss die optische Dichte der Suspensionen bei 600 nm (OD₆₀₀ ) wurde mit einem Spektrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA) gemessen. Kalibrierungskurven für jeden der Mikroorganismen wurden erstellt, indem serielle zehnfache Verdünnungen (bis zu 10 ^– 5 ) von Bakterien- und Hefesuspensionen bekannter optischer Dichte. Ein Milliliter jeder Verdünnung wurde auf Petrischalen verteilt, die das Nährmedium enthielten. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurde die Anzahl der auf den Petrischalen gebildeten Kolonien gezählt. Basierend auf den Ergebnissen der Auszählungen (in dreifacher Ausführung durchgeführt) wurde die Dichte der ursprünglichen Bakteriensuspension in koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml berechnet.

Antimikrobieller Assay

Das Inokulum für den antibakteriellen Test wurde aus aktiv wachsenden Organismen hergestellt (logarithmische Phase). Die Inokulums aller Mikroorganismen wurden aus einer Übernachtkultur hergestellt, die aerob in Mueller-Hinton (MH)-Bouillon bei 37 °C gezüchtet wurde. Die Bakterien- und Hefekonzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀ ). Kurz gesagt, Bakterien- und Hefesuspensionen wurden aus Übernachtkulturen hergestellt und auf 10 ⁶ . eingestellt KBE/ml. Inokulum wurde durch Abtupfen gleichmäßig auf die Oberfläche von MH-Agar in Petrischalen geimpft. Mit GO, Ag-NPs und GO-Ag beschichtete sterile Folien wurden auf die Agaroberfläche aufgebracht. Als Kontrollgruppe dienten Folien ohne Nanopartikel. Das Bakterien- und Hefewachstum unter den Folien wurde nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C gemessen.

Lebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem PrestoBlue™ Cell Viability Assay (Life Technologies, Taastrup, Dänemark) bewertet. PrestoBlue™ Reagenz wird durch metabolisch aktive Zellen schnell reduziert und liefert ein quantitatives Maß für Lebensfähigkeit und Zytotoxizität. Bakterien- und Hefezellen wurden auf mit GO, Ag-NPs und GO-Ag beschichteten Folien kultiviert, die sich auf Einsätzen befanden, die in 6-Well-Platten eingesetzt wurden (200 μl MH-Bouillon mit 5 × 10 ³ Zellen pro Folie) und 24 h inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 90 μl jeder Probe auf 96-Well-Platten übertragen und 10 μl PrestoBlue™-Reagenz in jede Vertiefung gegeben und weitere 2 h bei 37 °C inkubiert. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde bei 570 nm auf einem ELISA-Lesegerät (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA) aufgezeichnet. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz ausgedrückt (OD_Test − OD_leer )/(OD_Kontrolle − OD_leer )×100 %, wobei OD_test ist die optische Dichte von Zellen, die getesteten Folien ausgesetzt wurden, OD_Kontrolle ist die optische Dichte der Kontrollprobe und OD_blank ist die optische Dichte von Wells ohne Bakterien- und Hefezellen.

Membranintegrität

Ein LDH-Test (In Vitro Toxicology Assay Kit, basierend auf Milchsäuredehydrogenase, Sigma-Aldrich, Hamburg, Deutschland) wurde verwendet, um die Integrität der Zellmembran zu bewerten. Die resultierende reduzierte NAD (NADH ⁺ ) wurde bei der stöchiometrischen Umwandlung eines Tetrazoliumfarbstoffs verwendet. Wenn zellfreie Aliquots des Mediums aus Kulturen untersucht wurden, konnte die Menge an LDH-Aktivität als Indikator für die Membranintegrität verwendet werden. Wenn die Membran beschädigt war, wurden intrazelluläre LDH-Moleküle in das Kulturmedium freigesetzt. Bakterien- und Hefezellen wurden auf Folien (GO, Ag-NPs und GO-Ag) kultiviert, die sich auf Inserts befanden, die in 6-Well-Platten eingesetzt wurden (200 μl MH-Bouillon mit 5 × 10 ³ Zellen pro Folie) und 24 h inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, die auf Folie ohne Nanopartikel kultiviert wurden. Nach dieser Zeit wurden die Proben in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Einhundert Mikroliter Überstand wurden in 96-Well-Platten überführt und 100 μl des LDH-Assay-Gemischs wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde abgedeckt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die optische Dichte jedes Wells wurde bei 450 nm auf einem ELISA-Lesegerät (Infinite M200, Tecan, Männedorf, Schweiz) aufgezeichnet. LDH-Leckage wurde als Prozentsatz ausgedrückt {(OD_test − OD_leer ) − (OD_Kontrolle − OD_leer )/(OD_Kontrolle − OD_leer )}×100 %, wobei OD_test ist die optische Dichte von Zellen, die getesteten Folien ausgesetzt wurden, OD_Kontrolle ist die optische Dichte der Kontrollprobe und OD_blank ist die optische Dichte von Wells ohne Zellen.

SEM-Analyse von Mikroorganismen

Vor der SEM-Analyse wurden Proben von Bakterien und Hefe hergestellt, die auf Folien mit GO-Ag und unbehandelten Bakterien inkubiert wurden. Kurz gesagt, ein Tropfen Bakterien- und Hefekultur (10 ⁶ CFU/ml) wurde auf Folien mit GO-Ag Nanokomposit inkubiert oder unbehandelte Bakterien wurden auf der Oberfläche eines sterilen Deckglases abgelegt und 24 h bei 37 °C in einer leeren Petrischale inkubiert. Alle Proben wurden getrocknet und mit Gold bedeckt. Schließlich wurden die Proben mit SEM (FEI Quanta 200, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV abgebildet.

ROS-Produktion

Die ROS-Produktion wurde unter Verwendung von DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit (Abcam, Cambridge, UK) bewertet. DCFDA verwendet das zelldurchlässige Reagens 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat, einen fluorogenen Farbstoff, der Hydroxyl-, Peroxyl- und andere ROS-Aktivitäten innerhalb der Zelle misst. Nach der Diffusion in die Zelle wird DCFDA durch zelluläre Esterasen zu einer nicht fluoreszierenden Verbindung deacetyliert, die später von ROS zu 2′,7′-Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert wird. Bakterien- und Hefezellen wurden auf Folien (GO, Ag-NPs und GO-Ag) kultiviert, die sich auf Inserts befanden, die in 6-Well-Platten eingesetzt wurden (200 μl MH-Bouillon mit 5 × 10 ³ Zellen pro Folie) und 24 h inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen verwendet, die auf Folie ohne Nanopartikel kultiviert wurden. Nach dieser Zeit wurden die Proben in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 5 Minuten bei 1200 U/min zentrifugiert. Einhundert Mikroliter Überstand wurden auf 96-Well-Platten überführt, und 100 μl verdünntes DCFDA wurden in jede Vertiefung gegeben und weitere 45 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Die DCF-Produktion wurde durch Fluoreszenzspektroskopie mit einer Anregungswellenlänge bei 485 nm und einer Emissionswellenlänge bei 535 nm auf einem ELISA-Lesegerät (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA) gemessen.

Ergebnisse

Eigenschaften von GO und Ag-NPs

Die chemische Analyse ergab das Vorhandensein von Stickstoff, Kohlenstoff, Schwefel, Wasserstoff und Sauerstoff (Tabelle 1).

Die Phasenanalyse der GO-Probe (Abb. 1) ergab das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Spuren von Graphit, Natriumnitrat und wahrscheinlich einer reduzierten Form von Graphenoxid.

Röntgenbeugungsmuster von GO-Pulvern. Die Phasenanalyse der GO-Probe ergab das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Spuren von Graphit, Natriumnitrat und wahrscheinlich einer reduzierten Form von Graphenoxid

Die Raman-Spektroskopie kann Aufschluss über die strukturellen Eigenschaften von Graphenoxid geben. Die D-Bande wird der strukturellen Unordnung zugeschrieben, während die G-Bande von der Bindungsstreckung des Kohlenstoffs sp ² . stammt Atome [42]. Die zusätzlichen Bänder (einschließlich D′, 2D und D + G) ergeben sich aus den Defekten, die in der graphitischen Struktur des Kohlenstoffmaterials vorhanden sind. Ich _D /Ich _G Verhältnis (berechnet aus der Intensität der D- und G-Banden) kann verwendet werden, um die Unordnung der graphitischen Struktur in Kohlenstoffmaterialien zu charakterisieren. Wie in Abb. 2 zu sehen ist, weist GO aufgrund vieler funktioneller Gruppen in der Struktur, die während der Oxidation von Graphitpulver gebildet werden, eine stark ungeordnete Struktur auf. Die Position der D-Bande beträgt 1351 cm ⁻¹ und das G-Band 1590 cm ⁻¹ ; das Ich _D /Ich _G Verhältnis ist 1,15.

Raman-Spektrum von Graphenoxid mit vorgeschlagener Entfaltung der D-, G-, D′-, 2D- und D + G-Banden. GO hat eine stark ungeordnete Struktur aufgrund vieler funktioneller Gruppen in der Struktur, die während der Oxidation von Graphitpulver gebildet wird. Die Position der D-Bande beträgt 1351 cm ⁻¹ und das G-Band 1590 cm ⁻¹ ; das Ich _D /Ich _G Verhältnis ist 1,15

Das im ATR-Modus gesammelte FT-IR-Spektrum von Graphenoxid zeigte, dass GO viele funktionelle Gruppen in der Struktur aufweist. Der bemerkenswerteste Peak kann bei ~ 3500 cm ⁻¹ . beobachtet werden , die hauptsächlich Wasser- und Hydroxylgruppen zugeordnet wird (Abb. 3). Ein sehr intensiver Peak um 1080 cm ⁻¹ kann auch auf Hydroxylgruppen zurückgeführt werden. Der Peak bei 1600 cm ⁻¹ wird normalerweise C=C-Bindungen zugeordnet, die in graphitischem Kohlenstoff vorhanden sind. Unsere früheren XPS-Studien zeigen jedoch, dass Graphenoxid einige C=C-Bindungen enthält [43]; Daher führen wir diesen Peak hauptsächlich auf Wasser zurück, das noch im Graphenoxid vorhanden ist. Andere im FT-IR-Spektrum beobachtete Peaks zeigen, dass GO reich an Gruppen mit C=O-Bindungen (hauptsächlich Carboxylgruppen) ist, Peak um 1720 cm ⁻¹ , Epoxy (C–O–C) mit einem sichtbaren Peak bei etwa 1200 cm ⁻¹ , und C-H-Bindungen (Peak um 2800 cm ⁻¹ .) ). Die FT-IR-Analyse stimmt gut mit XPS-Messungen überein, die für Graphenoxid durchgeführt wurden, bei denen auch Hydroxy-, Carboxyl-, Epoxy- und Carbonylgruppen identifiziert wurden [44]. GO und GO nach einer 10-minütigen Ultraschallhomogenisierung wurden verglichen (Abb. 4 und 5) und auf ähnliche Weise wurden Ag-NPs mit Ag-NPs nach einer 10-minütigen Ultraschallhomogenisierung (Abb. 4 und 6) verglichen. Um Veränderungen der Substanzmorphologie zu vermeiden, wurden alle Verbindungen schnell mit flüssigem Stickstoff abgekühlt und in einem Lyophilisator getrocknet. Abbildung 5a, b zeigt GO-Flocken, während Fig. 5c, d die Auswirkungen von Ultraschall auf GO-Flocken zeigen, die einer teilweisen Faltung und Fragmentierung unterliegen. Abbildung 6 zeigt auch einen ähnlichen Effekt für Ag-NPs, bei denen eine Änderung der Materialmorphologie sichtbar ist. Abbildung 6a, b zeigen getrockneten Poly(vinylalkohol), der zur Stabilisierung der wässrigen Suspension von Ag-NPs verwendet wurde. Die zerstörerische Wirkung der Ultraschallhomogenisierung war bemerkenswert, da die Polyvinylalkoholstruktur in lange heterogene Teile mit kleinen kugelförmigen Öffnungen zerlegt wurde (Abb. 6c, d).

FT-IR (ATR, Attenuated Total Reflectance)-Spektrum von Graphenoxid mit vorgeschlagener Zuordnung der in GO vorhandenen funktionellen Gruppen. Die bemerkenswertesten Peaks wurden bei ~ 3500 cm ⁻¹ . beobachtet , (auf Wasser und Hydroxylgruppen zurückzuführen), ~ 1080 cm ⁻¹ (Hydroxylgruppen), ~ 1600 cm ⁻¹ (zugewiesen C=C-Bindungen in graphitischem Kohlenstoff zu). Andere im FT-IR-Spektrum beobachtete Peaks zeigen, dass GO reich an Gruppen mit C=O (hauptsächlich Carboxylgruppen) ist, Peak um 1720 cm ⁻¹ , Epoxy (C–O–C) mit einem sichtbaren Peak bei etwa 1200 cm ⁻¹ , und C-H-Bindungen (Peak um 2800 cm ⁻¹ .) )

TEM-Bilder von agglomerierten GO-Flocken (a ), GO-Flocken nach Ultraschallbehandlung (b ), agglomerierte Ag-NPs (c ), Ag-NPs nach Ultraschallbehandlung (d ) und GO-Ag (e , f ). Die Abnahme der durchschnittlichen GO-Partikelgröße nach der Ultraschallbehandlung wurde durch Defragmentierung oder Faltung der GO-Flocken verursacht. Die Abnahme der durchschnittlichen Ag-Größe nach der Ultraschallbehandlung wurde durch die Defragmentierung von Ag-Agglomeraten verursacht. Hinweis:Pfeile zeigen auf Ag-NPs/Agglomerate

Vergleich der Morphologie von lyophilisierten GO-Flocken (a , b ) und GO-Flocken nach Ultraschallbehandlung (c , d ) mittels Rasterelektronenmikroskopie. Die Abnahme der durchschnittlichen GO-Partikelgröße nach der Ultraschallbehandlung wurde durch Defragmentierung oder Faltung der GO-Flocken verursacht

Vergleich der Morphologie der lyophilisierten Ag-NP-Mischung (a , b ) und Ag-NP-Gemisch nach Ultraschallbehandlung (c , d ) mit Rasterelektronenmikroskopie

Durchschnittliche Größe und Zeta-Potenzial

Die Ergebnisse der durchschnittlichen Partikel-/Agglomeratgröße in Wassersuspensionen sind in Tabelle 2 dargestellt. Analysen der durchschnittlichen Größe wurden für konzentrierte Suspensionen, die keiner Ultraschallhomogenisierung (wie erhalten) unterzogen wurden, und für verdünnte Suspensionen durchgeführt. Verdünnte Suspensionen wurden vor dem Test einer Ultraschallhomogenisierung unterzogen, wobei die Homogenisierungsparameter mit denen identisch waren, die bei der Ultraschallbeschichtung der Folie mit Nanomaterialschichten (Ag-NPs, GO) verwendet wurden. Bei der Ag-NP-Suspension führte die Einwirkung des Ultraschalls zu einer Erhöhung der durchschnittlichen Partikelgröße von 80 auf 218 nm. Hauptursache für den Anstieg der mittleren Partikelgröße nach Ultraschallhomogenisierung in der Suspension (abgesehen vom Prozess der Ag-NP-Agglomeration) war, dass Ag-NPs in den zur Suspensionsstabilisierung verwendeten Poly(vinylalkohol) eingetrieben wurden. The large standard deviation of the Ag-NP sample homogenized by ultrasound resulted from the presence of both loose Ag-NPs and Ag-NPs driven into the poly(vinyl alcohol) in the suspension. In the case of GO suspension, the average particle size of the sample subject to ultrasonic homogenization was 263 nm and was ca 7.7 times smaller than the average particle size of the sample that was not subject to homogenization. The obtained results are convergent with the SEM tests (Fig. 5), which show the destructive effect of ultrasounds on GO flakes. The decrease of the average GO particle size was caused by defragmentation or folding of the GO flakes. However, it should be emphasized that the results of the average particle size of GO suspension samples involve an error related to the nanomaterial shape. The results obtained by the DLS method are a hydrodynamic average that is calculated based on the shape of a sphere that has the same diffusion coefficient as the measured particles; however, the shape of GO was flakes, which was confirmed by SEM images.

Test results of the zeta potential analysis of samples are provided in Table 3. The zeta potential of Ag-NPs in a water suspension was merely − 5.9 mV, which resulted in a lack of electrostatic stability of the sample. The sample of Ag-NP suspension was stabilized sterically by preserving Ag-NP distances through poly(vinyl alcohol) addition, which prevented agglomeration/aggregation of Ag-NPs. The zeta potential of the GO suspension sample, in turn, was − 41 mV, which gave a moderate electrostatic stability to the sample. A moderate electrostatic stability of a sample is characterized by slow sedimentation with virtually negligible change of particle size in the period of declared fitness of the suspension. The zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO was − 7.1 mV, which potentially means that during the action of the ultrasounds, the GO flakes were coated by poly(vinyl alcohol) and Ag-NPs. The obtained zeta potential result of the mixture of Ag-NPs and GO sample in the water suspension implied that electrostatic stability was not present.

Foil Characteristics

In order to determine the morphology of the created layers, four types of foil samples were compared (Fig. 7):pure polyurethane foil (A, B), GO-coated polyurethane foil (C, D), Ag-NP-coated polyurethane foil (E, F), and GO-Ag mixture-coated polyurethane foil (G, H).

Scanning electron microscopy images of a , b non-coated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities; c , d foil coated with GO, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface; e , f foil coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observed; und g , h foil coated with GO-Ag, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface

Figure 7a, b shows an uncoated polyurethane foil with a smooth surface with single impurities. In Fig. 4c, d, the broken-down GO flakes deposited on the polyurethane foil surface are noticeable. Figure 7e, f shows the foil surface coated with Ag-NPs on which grid structures composed of polyvinyl alcohol and Ag-NPs are observable. Figure 7g, h presents a mixture of GO-Ag composition, which was mixed under the influence of ultrasounds and deposited on the foil surface.

AFM Analysis and Surface Free Energy

AFM and LFM were used to complement the information about the surface morphology investigated by SEM. The investigation confirmed evolution of surface morphology by sonication of the polyvinyl alcohol with Ag-NP, GO, and GO-Ag NP solutions on the foils. Pure polyurethane foil was used as a reference foil in relation to foils coated by the ultrasonic method. The images in Fig. 8 are the AFM phase contrast images made in AC; additionally, cross sections of the GO flakes are attached under the corresponding images. Figure 8a is an image of pure polyurethane film; Fig. 7b depicts the Ag-NP-coated film, where characteristic and homogeneous grid structures are observable, being similar to those in Fig. 8e, f. Figure 8c, d shows GO-Ag-NP-coated film. Figure 8e shows the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil. It was noticed that the morphology of the foils has changed after Ag-NP coating comparing to the not-coated foils. The GO-Ag-NP coating differs from the previous one because it contains also small amounts of GO flakes seen as small black spots on the image, as it was mentioned earlier. Figure 8f depicts magnification of one GO flake made in LFM. The reduced friction confirms that it is, in fact, a GO flake.

AFM phase contrast images and cross sections topographic images of graphene flakes:a non-coated foil polyurethane foil; b Ag-NPs coated foil where characteristic and homogeneous grid structures are observed; c , d GO-Ag-coated foil; e GO-coated foil, the surface of the foil almost entirely covered with GO flakes; the phase contrast image helps to observe these two phases, the darker area is GO and the lighter area is polymer foil; f LFM image of graphene flake. Red marks, area of cross section

The polar component for the GO-coated foil increased in relation to pure foil, from 2.3 ± 0.6 to 68.9 ± 2.8 mJ/m ² , while the dispersion component decreased from 34.4 ± 1.3 to 8.2 ± 1.2 mJ/m ² . SFE increased from 36.7 ± 1.4 to 77.0 ± 3.4 mJ/m ² . A similar effect was not observed on foil surfaces coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture. SFE of foil samples coated with Ag-NPs and GO-Ag mixture does not differ statistically (Table 4).

Antibacterial Properties

The antibacterial activity of the different foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag were tested with E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans. Results showed that after co-incubation with bacteria at 37 °C for 24 h, foils inhibited the growth of all tested microorganisms but to various degrees. The maximum antibacterial effect against all tested microorganisms was with foil coated with the GO-Ag nanocomposite. The bacterial growth of the cells treated with foils coated with GO and Ag-NPs was slightly lower than that of cells in the control group whereas the growth of bacterial cells treated with foils coated with GO-Ag was greatly inhibited, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans (Figs. 9, 10, and 11).

Antimicrobial properties of GO-Ag coated foils. The growth of E . coli (b , c ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g –i ) colonies is reduced after co-incubation with GO-Ag-coated foils at 37 °C for 24 h. a Representative agar plate with GO-Ag-coated foils. Notes:Black arrows point to GO-Ag coated foils; arrowheads point to colonies of microorganisms

Morphology of microorganisms after co-incubation with GO-Ag-coated foils. Scanning electron microscopy images of bacteria and yeast in the control foils (a , c , e , g ) and foils coated with GO-Ag (b , d , f , h ) after incubation at 37 °C for 24 h. E . coli (a , b ), S . aureus (c , d ), S . epidermidis (e , f ), and C . albicans (g , h ) show decreased growth and deformed morphology after co-incubation with GO-Ag-coated foils

Foils coated with nanomaterials decrease E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans viability. Viability of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with Presto Blue assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.001); error bars are standard deviations

Membrane Integrity

In cases where the cell membrane is damaged, intracellular LDH molecules could be released into the culture medium. The LDH level outside the cells demonstrates the cell membrane integrity. Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between control groups and the Ag-NPs and GO-Ag groups (Fig. 12). The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans .

Foils coated with nanomaterials decreased E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans membrane integrity. Membrane integrity of bacteria and yeast after incubation on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h was assessed with LDH assay. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–c) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.000); error bars are standard deviations

ROS Production

Low levels (or optimum levels) of ROS play an important role in signaling pathways. However, when ROS production increases and overwhelms the cellular antioxidant capacity, it can induce macromolecular damage (by reacting with DNA, proteins, and lipids) and disrupt thiol redox circuits. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag (P  < 0.05) increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. Foils coated with GO only increased the ROS production of C . albicans . The highest ROS production was observed in the GO-Ag group (Fig. 13).

Effect of foils coated with nanomaterials on the production of reactive oxygen species. E . coli , S . aureus , S . epidermidis , and C . albicans were cultured on foils coated with Ag-NPs, GO, and GO-Ag at 37 °C for 24 h. Production of reactive oxygen species was assessed with DCFDA, Cellular Reactive Oxygen Species Detection Assay Kit. C control group (foil without nanoparticles), Ag foil coated with silver nanoparticles, GO foil coated with graphene oxide, GO-Ag foil coated with composite of graphene oxide and silver nanoparticles. Note:The columns with different letters (a–d) indicate significant differences between the concentrations (P  = 0.000); error bars are standard deviations

Discussion

The discovery of antibiotics, natural products produced by microorganisms that are able to prevent the growth of bacteria and thus cure infectious diseases, revolutionized medical therapy; however, the overuse and misuse of antibiotics have been key factors contributing to antibiotic resistance. Now, the era of antibiotics is coming to an end, and new antibacterial agents are needed. In recent years, studies have reported nanoparticles as a promising alternative to antibacterial reagents because of their antibacterial activity in several biomedical applications [19, 45]. Nanoparticles can be an effective way to control many pathogenic and antibiotic-resistant microorganisms. Among many metal nanoparticles, Ag-NPs have been intensely studied because of the distinct properties of their antibacterial activity [7]. Ag-NPs have been proved effective against over 650 microorganisms including bacteria (both gram-positive and negative), fungi, and viruses; however, the precise mechanism of antimicrobial action is not understood completely [46]. Ag-NP exposure to microorganisms could cause adhesion of nanoparticles to the peptidoglycan and the cell membrane [47], penetration inside the cell [48], induction of ROS [49], and damaging of intracellular structures [50]. However, bare Ag-NPs aggregate when they come into contact with bacteria; thus, they lose their active surface area and show weaker antibacterial activity [51]. To overcome this problem, nanocomposites composed of graphenic materials and Ag-NPs or other metal nanoparticles could be fabricated. GO with oxygen-containing functional groups is water soluble and therefore more biocompatible than pristine graphene. As a result, Ag-based GO nanocomposites may be used as antibacterial agents. However, the information about antimicrobial properties of graphene-based composites is limited, and mechanisms of toxicity or lack of toxicity are not fully explained.

The aim of this work was to study the action of graphene oxide-based nanocomposites decorated with Ag nanoparticles on S . aureus , S . epidermidis , E . coli , and C . albicans growth; membrane integrity; and ROS production. After co-incubation with the bacterial and yeast cells for 24 h, foils coated with GO-Ag nanocomposite inhibited the growth of all tested microorganisms with varying degrees, 88.6% of E . coli , 79.6% of S . aureus , 76.5% of S . epidermidis , and 77.5% of C . albicans . This action is most probably due to an increase in cell membrane and wall penetration by the nanoparticles. Some researchers suggest that the antimicrobial activity of graphene-based nanocomposites may be due to the disruption of cell membrane integrity and oxidative stress [52].

Foils coated with GO, Ag-NPs, and GO-Ag disrupted cell membrane functionality and integrity with significant differences between the control group and the Ag-NPs and GO-Ag groups. The highest disruption of cell membranes was observed in the GO-Ag groups, 66.3% of E . coli , 59.4% of S . aureus , 54.8% of S . epidermidis , and 48.5% of C . albicans . However, foils coated with bare Ag-NPs also disrupted cell membranes. It has been proposed that Ag-NPs are able to interact with bacterial membranes by increasing permeability and changing the structure of membranes, which finally leads to cell death [50]. Ag-NPs can cause direct damage to the bacterial cell membrane. Bacteria may be killed by the combined bactericidal effects of the released Ag ⁺ ions and Ag nanoparticles. Additionally, the antimicrobial potential of Ag-NPs is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms [53]. The wall of gram-positive cells contains a thick layer (20–80 nm) of peptidoglycan, which is attached to teichoic acids. In gram-negative bacteria, the cell wall comprises a thin (7–8 nm) peptidoglycan layer and contains an outer membrane. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus und S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag.

Many studies have sought to establish a mechanism of action of antibacterial activity exhibited by silver in both its colloidal and ionic form. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag ⁺ ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately causes damage to the cell due to oxidative stress. Additionally, Ag ⁺ ions could cause dysfunction of the respiratory electron transport chain by uncoupling it from oxidative phosphorylation by inhibiting respiratory chain enzymes [54]. Foils coated with Ag-NPs and GO-Ag increased the ROS production of all tested microorganisms compared to the control group. The biological targets are DNA, RNA, proteins, and lipids. Lipids are one major target during oxidative stress. Free radicals can directly attack polyunsaturated fatty acids in bacterial and yeast membranes and activate peroxidation of lipids. A fundamental effect of lipid peroxidation is a decrease in membrane fluidity, which can significantly disrupt membrane-bound proteins. DNA is also a main target. Mechanisms of DNA damage involve abstractions and addition reactions by free radicals leading to carbon-centered sugar radicals and OH- or H-adduct radicals of heterocyclic bases. The sugar moieties producing single- and double-strand breaks in the backbone, adducts of base and sugar groups, and cross-links to other molecules can block replication. Foils coated with GO increased the ROS production at very low levels. However, Hu et al. [55] demonstrated that GO had a detrimental effect on E . coli due to decreased production of ATP and increased ROS production. Zhao et al. [56] reported the antibacterial activity of GO and reduced GO. Also, Gurunathan et al. [57] presented that GO and reduced GO showed significant antibacterial activity in a concentration- and time-dependent manner. Their results demonstrated that oxidative stress is a key mechanism for the antibacterial activity of GO and reduced GO through ROS generation. Nanda et al. [53] reported the effect of cystamine-conjugated GO against E . coli , S . typhimurium , E . faecalis , and B . subtilis with ROS production and high antibacterial activity.

Kurantowicz et al. [20] confirmed that bacteria could adhere to the GO surface, which results in the highest antibacterial activity. GO is characterized by a high degree of oxygenated functional groups:carbonyl, carboxylate, and hydroxyl. We hypothesize that these groups can be attractive groups for bacterial and yeast attachment. These groups are present on a large range of nutrients (amino acids, fatty acids) which are commonly recognized by microorganisms. In the present study, foils coated with GO induced membrane disruption and ROS production at a lower level than the Ag-NP and Ag-GO groups; however, cell viability was decreased, which is likely connected to the smaller active surface of GO after ultrasonic modifications.

Conclusions

Ag-NPs, GO, and Ag-GO nanocomposites demonstrated the antibacterial activity that is stronger against gram-negative bacteria (E . coli ) versus gram-positive bacteria (S . aureus und S . epidermidis ) and yeast (C . albicans ). The results showed that the decoration of GO with Ag-NPs promotes a synergistic effect and reduces dramatically the concentrations required to inhibit all tested bacterial and yeast strains. The antimicrobial potential of Ag-GO is also influenced by the thickness of the cell wall of the microorganisms. The thicker peptidoglycan layer in gram-positive bacteria, such as S . aureus und S . epidermidis , may explain why these bacteria are more resistant to the antibacterial effects of GO-Ag. A disruption of membrane functionality from an interaction between released Ag nanoparticles/Ag ⁺ ions and the cell membrane and extensive cell membrane damage caused by the formation of ROS ultimately caused damage to the cell due to oxidative stress. In order to explain the mechanism of ROS production, additional studies are needed. Our research indicates the potential applicability of GO-Ag as an antimicrobial agent.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

Ag-NPs:

Silver nanoparticles

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

GO:

Graphenoxid

GO-Ag:

Graphene oxide decorated with silver nanoparticles

LDE:

Laser Doppler electrophoresis

LDH:

Lactate dehydrogenase

ROS:

Reactive oxygen species

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

XRD:

Röntgenbeugung