Exosomales miR-18b-3p aus humanen Nabelschnur-MSCs senkt Präeklampsie-Risiko durch Targeting von Leptin

Zusammenfassung

Exosome, die von humanen Nabelschnur-Mesenchymalen Stammzellen (hucMSCs) stammen und microRNAs exprimieren, wurden in menschlichen Erkrankungen hervorgehoben. Der detaillierte molekulare Mechanismus von hucMSCs-abgeleiteten exosomalen miR-18b-3p auf Präeklampsie (PE) bedarf jedoch weiterer Untersuchung. Wir zielten darauf ab, den Effekt von Exosomen und miR-18b-3p/Leptin (LEP) auf das Auftreten von PE zu untersuchen. Die Morphologie der hucMSCs und hucMSC-Exosome (Exos) wurde identifiziert. Die Exosome wurden mit verschiedenen Lentiviren, die miR-18b-3p exprimieren, infiziert, um die Rolle von miR-18b-3p bei PE zu erforschen. Das PE-Rattenmodell wurde durch intraperitoneale Injektion von N-Nitro-L-Arginin-Methylester etabliert. Die Expression von LEP und miR-18b-3p wurde in PE-Ratten-Plazentageweben getestet. Auch der Effekt von Exosomen auf LEP- und miR-18b-3p-Expression wurde detektiert. Der systolische Blutdruck (SBP), Proteinurie, Entzündungsfaktoren, das Gewicht von Feten und Plazenta sowie Zellapoptose bei PE-Ratten wurden bestimmt. Schließlich wurde die Beziehung zwischen miR-18b-3p und LEP mittels Dual-Luciferase-Reportergen-Assay und RNA-Pull-Down-Assay verifiziert. Exosome, die Wiederherstellung von miR-18b-3p oder die Inhibition von LEP reduzierten SBP und Proteinurie von PE-Ratten, erhöhten das Gewicht von Feten und Plazenta, verringerten Serumspiegel entzündlicher Faktoren und unterdrückten apoptotische Zellen von PE-Ratten, was einen suppressiven Effekt auf die PE-Progression ausübte. miR-18b-3p war erniedrigt und LEP erhöht in Plazentageweben von PE-Ratten. LEP war das direkte Zielgen von miR-18b-3p. Die Hochregulation von miR-18b-3p oder die Behandlung mit Exosomen unterdrückte LEP-Expression und reduzierte das PE-Auftreten, während die Downregulation von miR-18b-3p gegenteilige Effekte hatte. Die Downregulation von LEP kehrte den Effekt der miR-18b-3p-Reduktion auf PE-Ratten um. hucMSCs-abgeleitetes exosomales miR-18b-3p targetet LEP, um am Auftreten und der Entwicklung von PE teilzunehmen. Diese Studie könnte eine neue theoretische Basis für den Mechanismus und die Untersuchung von PE liefern.

Einleitung

Präeklampsie (PE), gekennzeichnet durch Proteinurie und Hypertonie [1], ist eine Hauptursache für fetale und mütterliche Mortalität und Morbidität in der menschlichen Schwangerschaft [2]. Ätiologie und Pathogenese von PE sind unklar [3], was mit abnormaler Trophoblasteninvasion in Verbindung gebracht wird, was zu mütterlicher Endothelfunktionsstörung, chronischer Plazentamalperfusion und Hypertonie mit ungünstigen Ergebnissen führt [4]. Mit Ausnahme der fetalen und plazentaren Entbindung gibt es keine spezifische Therapie für PE [5]. Daher ist es dringend, therapeutische Targets zu erforschen, um die Prognose dieser Erkrankung zu verbessern.

Die menschliche Nabelschnur (huc) ist eine geeignete Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs), die eine Vielzahl von trophischen Faktoren und Zytokinen sezernieren sowie starke entzündungshemmende und immunmodulatorische Kapazitäten zeigen [6]. Eine Studie verifizierte, dass PE die Neuroglia-Marker-Expression in aus Whartons Gelee der Nabelschnur stammenden MSCs beschleunigt [7]. Ein protektiver Effekt von hucMSCs-Exosomen (Exos) auf Plazentamorphologie und Angiogenese bei PE-Ratten wurde ebenfalls berichtet [8]. Exosome sind kleine (50–100 nm) sekretorische Vesikel, die die Kommunikation zwischen Zellen in der Tumormikroumgebung vermitteln, indem sie kanzerogene Faktoren einkapseln und an entfernte Orte oder umliegende Zellen über die Zirkulation übertragen [9]. Eine Studie enthüllte die Schädigung vaskulärer Funktionen und Komplikationen, induziert durch den effektiven Transfer von sFlt-1 und sEng in Endothelzellen bei PE-Patienten durch Exosome [10]. MicroRNAs (miRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von 18–25 Nukleotiden, die die Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene regulieren [11]. Daten einer Studie berichteten, dass miR-18b-Expression Zellinvasion, Vitalität und Migration von Trophoblastenzellen bei PE beeinflusst [12]. Darüber hinaus schlugen Wu et al. vor, dass miR-18b Proliferation in humanen retinalen Endothelzellen, induziert durch hohen Glukosespiegel, attenuiert, was neue Einblicke in das Verständnis des Mechanismus der diabetischen Retinopathie-Pathogenese bieten könnte [13]. Die Rolle von hucMSC-abgeleitetem exosomalem miR-18b-3p bei PE bleibt jedoch unbekannt. Leptin (LEP) hat pleiotrope Effekte auf Zelldifferenzierung/Proliferation und Immunität physiologischer Zustände und stammt hauptsächlich von Adipozyten, zusätzlich zu anderen Geweben, einschließlich Plazenta [14]. Eine Studie verifizierte, dass abnormale LEP-Promoter-Methylierung an der PE-Progression beteiligt ist [15]. Eine andere Studie schlug vor, dass die Plazenta eine Hauptstelle der LEP-Expression in der Schwangerschaft ist [16]. Dennoch bleibt die Bindungsbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP unklar. Daher zielten wir darauf ab, die Rolle von hucMSC-abgeleitetem exosomalem miR-18b-3p bei PE mit Einbeziehung von LEP zu erforschen, und wir schlossen, dass hucMSC-abgeleitetes exosomales miR-18b-3p die PE-Progression durch Targeting von LEP inhibieren könnte.

Materialien und Methoden

Ethikgenehmigung

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des People's Hospital of Wuhan University genehmigt. Alle Teilnehmer unterschrieben ein Dokument der informierten Einwilligung. Alle Tierexperimente entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch internationale Komitees des People's Hospital of Wuhan University.

Isolierung, Kultur und Identifizierung von hucMSCs

Die von gesunden Wöchnerinnen entbundene fetale Nabelschnur wurde gesammelt, zerkleinert und durch ein Sieb filtriert, dann mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) vermischt. Das Nabelschnurgewebe wurde bei 1500 min⁻¹ für 5 min mit 10 cm Zentrifugenradius zentrifugiert. Die Gewebe wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) suspendiert und in eine Kulturflasche übertragen. Die Flüssigkeiten wurden nach 4 Tagen gewechselt und dann alle 3 Tage einmal gewechselt. Zellen wurden subkultiviert, wenn die Konfluenz etwa 90 % erreichte. Das anhaftende Wachstum und die Morphologie der hucMSCs wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Die Zellen wurden mit Öl-Rot-O-Färbelösung (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) gefärbt, um die osteogene Differenzierung der hucMSCs zu detektieren, und mit alkalischer Phosphatase (ALP)-Färbelösung (Beyotime) gefärbt, um die adipogene Differenzierung der hucMSCs zu detektieren. Ein Durchflusszytometer (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) wurde eingesetzt, um CD73, CD166 (beide 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) und CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, UK) zu testen.

Extraktion und Identifizierung von hucMSC-Exos

Gut wachsende hucMSCs wurden kultiviert. Der Überstand wurde gesammelt und bei 28.500 min⁻¹ für 1 h mit 10 cm Zentrifugenradius zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen mit 2 % Glutaraldehyd und 1 % Osmiumsäure fixiert, mit Ethanol dehydratisiert, in Propylenoxid getaucht, 2 h getrocknet, in Epon812 eingebettet und geschnitten. Die Schnitte wurden mit Uran und Blei jeweils gefärbt. Schließlich wurden die Exosome unter dem Elektronenmikroskop beobachtet. Ein Nanosight-Detektor (Malvern Instruments, Malvern, UK) wurde genutzt, um Brownsche Bewegungsbildgebung von Exosom-Nanopartikeln und deren Größe zu detektieren. Die Oberflächenmarker von hucMSC-Exos wurden durch Western-Blot-Assay identifiziert, und die Ergebnisse zeigten, dass hucMSC-Exos CD9, CD81 und CD63 exprimierten.

Lentivirus-Infektionsmethode

HucMSCs wurden mit Lentivirus infiziert, das niedrige Expression von miR-18b-3p-Vektor und niedrige Expression von miR-18b-3p-Vektor-Negativkontrolle (NC) enthielt (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, China). Schließlich wurden stabil exprimierende hucMSC-antagomir NC und hucMSC-miR-18b-3p antagomir erhalten. Zellen wurden 48 h kultiviert, und der Überstand wurde gesammelt und per Ultrazentrifugation zentrifugiert, um die entsprechenden Exos-antagomir NC und Exos-miR-18b-3p antagomir zu erhalten.

Versuchstiere

Wistar-Ratten (Gewicht 200–250 g, Alter 8 Wochen, unabhängig vom Geschlecht) in gesundem Reinheitsgrad und geschlechtsreif wurden ausgewählt (Versuchstierzentrum der Wuhan University, Wuhan, China). Die Ratten wurden in einem Barriersystem mit einer Temperatur von 18–28 °C, relativer Luftfeuchtigkeit von 40–70 % und adäquater Diät und Wasser gehalten.

Etablierung von Ratten-PE-Modellen

Das Ratten-PE-Modell wurde durch intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Stickoxid-Synthase-Inhibitor, N(G)-Nitro-L-Arginin-Methylester (L-NAME, Beyotime) mit Bezug auf einen Artikel [17] etabliert. Die erfolgreiche Etablierung des PE-Modells basierte auf erhöhtem Blutdruck um 20 mmHg und höher als 115 mmHg sowie verstärkter Proteinurie.

Tiergruppierung

Weibliche und männliche Ratten wurden zufällig im Verhältnis 1:1 zusammengeführt, und die beiden Ratten wurden am Vortag um 17–18 Uhr in einen individuellen Spezialkäfig gehalten. Das Sperma in den vaginalen Sekreten der weiblichen Ratten wurde am nächsten Tag durch Vaginalpfropf und Mikroskop beobachtet. War das Ergebnis gleichzeitig positiv, wurde der Tag als 0. Tag der Trächtigkeit aufgezeichnet. Ab dem 13. Tag der Trächtigkeit wurden Ratten in 6 Gruppen eingeteilt (10 Ratten pro Gruppe): Normalgruppe (gleiche Menge Kochsalzlösung wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert), PE-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL Kochsalzlösung wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + miR-NC-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL 4 nmol miR-NC wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + miR-18b-3p Agomir-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL 4 nmol miR-18b-3p Agomir wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + miR-18b-3p Antagomir-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL 4 nmol miR-18b-3p Antagomir wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + miR-18b-3p Antagomir + small interfering RNA (si)-LEP-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL 4 nmol miR-18b-3p Antagomir und si-LEP wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert) und PE + si-LEP-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL 4 nmol si-LEP wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert). Ratten wurden mit Exosomen und Exosomen, die Lentiviren tragen, behandelt. Die Ratten wurden in 5 Gruppen eingeteilt (10 Ratten pro Gruppe): Normalgruppe (gleiche Menge Kochsalzlösung wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert), PE-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL Kochsalzlösung wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + Exos-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL Exos (80 µg Exosome suspendiert in 20 µL Kochsalzlösung) wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert), PE + Exos-antagomir NC-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL Exos-antagomir NC (80 µg Exosome suspendiert in 20 µL Kochsalzlösung) wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert) und PE + Exos-miR-18b-3p antagomir-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde intraperitoneell vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag injiziert, und 20 µL Exos-miR-18b-3p antagomir (80 µg Exosome suspendiert in 20 µL Kochsalzlösung) wurde in die Plazenta vom 16. bis 19. Trächtigkeitstag injiziert).

Detektion des systolischen Blutdrucks (SBP) und Bestimmung der 24-h-Proteinurie

Der Druck der Ratten wurde durch Ratten-Schwanzarterien-Blutdruckmessung gemessen. Der Schwanzmanschetten-SBP aller trächtigen Ratten wurde am 10., 13., 16. und 19. Trächtigkeitstag mit dem Ratten-Schwanzarterien-Druckdetektor (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, USA) gemessen. Der Druck wurde in kurzer Zeit 3-mal gemessen; dann wurde der Mittelwert als Blutdruck genommen.

Bei freier Diät und Wasser wurde der 24-h-Urin trächtiger Ratten am 10., 13., 16. und 19. Trächtigkeitstag gesammelt, und der Proteingehalt wurde in der Nephrologieabteilung des People's Hospital of Wuhan University detektiert.

Probenentnahme

Die trächtigen Ratten wurden am 21. Trächtigkeitstag mit 3 % Pentobarbitalnatrium narkotisiert. Das periphere Blut der Ratten wurde aufbewahrt, zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen, und bei –20 °C im Kühlschrank für Standby gelagert. Dann wurden Feten und Plazenta per Kaiserschnitt entnommen, die fetale Membran und die verbundene Nabelschnur entfernt, und die mit dem Feten verbundene Nabelschnur durchtrennt. Plazenta und Feten wurden auf aseptischer Gaze getrocknet, um Blut und Fruchtwasser jeweils zu entfernen, und dann auf der Analysewaage gewogen. Ein Teil des Plazentagewebes wurde mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit Ethanol dehydratisiert, mit Xylol geklärt, in Paraffin eingebettet und kontinuierlich quergeschnitten (5 µm) für Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Terminal-Desoxynucleotidyl-Transferase-vermittelte Desoxyuridin-Triphosphat-Biotin-Nick-End-Labeling (TUNEL)-Färbung. Der Rest wurde bei -80 °C für Reverse-Transkriptions-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)-Detektion, Western-Blot-Analyse und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) gelagert.

ELISA

Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin (IL)-1β und IL-6 Gehalte im Serum wurden per ELISA getestet. Die Konzentrationen von TNF-α, IL-1β und IL-6 wurden gemäß den Anweisungen des Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) bestimmt. Optische Dichte (OD) Werte (490 nm) wurden mit einem Mikroplattenleser (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) getestet. Die entsprechende Standardkurve wurde unter Verwendung des OD-Werts als Abszisse und der Konzentration des entsprechenden Standardproben als Ordinate erhalten. TNF-α, IL-1β und IL-6 Konzentrationen wurden aus der Standardkurve berechnet.

HE-Färbung

Die Paraffinproben von Plazentageweben wurden in Xylol geklärt, durch konventionellen Gradientalkohol dehydratisiert, mit Hämatoxylin gefärbt, durch 1 % Salzsäurealkohol differenziert und durch 1 % Ammoniakwasser wieder blau gefärbt. Dann wurden die Gewebe mit 1 % Eosin-Lösung gegengefärbt, dehydratisiert (75 %, 90 %, 95 % Ethanol, jeweils absoluter Ethylalkohol) und mit Xylol geklärt, getrocknet, deckglasiert und unter dem Elektronenmikroskop betrachtet.

TUNEL-Färbung

Paraffin-eingebettete Schnitte wurden routinemäßig entwaxt und dehydratisiert gemäß Anweisungen, und dann wurde Apoptose durch TUNEL-Kit (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China) detektiert. 4,6-Diamino-2-phenylindol (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) wurde verwendet, um TUNEL-positive Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) zu beobachten [18].

RT-qPCR

Plazentagewebe wurden gewogen. Pro 50–100 mg Plazentagewebe wurden 1 mL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) zugegeben und vollständig gelöst. Die Gewebe wurden mit 200 µL Chloroform versetzt und bei 4 °C, 12.000 min⁻¹ zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu extrahieren. Konzentration und Reinheit der RNA wurden mit einem DU-800 Protein-Nukleinsäure-Spektrophotometer (Beckman) bestimmt. U6 und β-Actin wurden als Ladekontrollen genutzt. PCR-Primer wurden von Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China) entworfen und synthetisiert. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. RNA wurde basierend auf den Anweisungen des RNA-Reverse-Transkriptionskits (Sangon) in cDNA reverse transkribiert. PCR wurde amplifiziert und Produkte durch Agarosegelelektrophorese verifiziert. Die Daten wurden nach der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet.

Western-Blot-Assay

Das Gesamtprotein von Plazentageweben wurde durch Radio-Immunpräzipitationsassay-Zelllysepuffer (Beyotime) extrahiert. HucMSC-Exo wurde verwendet, um Puffer abzutrennen, welcher bei 14.000 min⁻¹ zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde für die Testung der Proteinexpression von exosomalen Markerproteinen (CD81, CD63 und CD9) im Serum aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wurde durch Bicinchonsäure-Kit (Beyotime, P0010) bestimmt. Die Probe wurde gemäß den quantitativen Ergebnissen des Proteins beladen, mit 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese behandelt und auf Membran transferiert. Die Membran wurde mit 5 % entrahmter Milch blockiert, mit Primärantikörpern gegen LEP, CD63, CD81, CD9 und β-Actin (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA) inkubiert, mit 4 mL Sekundärantikörper Ziegen-anti-Kaninchen IgG/Peroxidase nachgewisen, exponiert und entwickelt. β-Actin wurde als interne Referenz genutzt. Der Grauwert wurde mit der Gelbildanalyse-Software Image Lab analysiert.

Dual-Luciferase-Reportergen-Assay

Online-Vorhersagesoftware https://cm.jefferson.edu/ wurde genutzt, um die Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP sowie die Bindungsstelle von miR-18b-3p und LEP 3′untranslatierter Region (UTR) vorherzusagen. Die LEP 3′UTR-Promotorregion-Sequenz, die die miR-18b-3p-Bindungsstelle enthält, wurde zusammengesetzt. Das LEP 3′UTR-Wildtyp (WT)-Plasmid und LEP 3′UTR-Mutantentyp (MUT) wurden konstruiert. Die rekombinanten Plasmide wurden als LEP 3′UTR-WT und LEP 3′UTR-MUT benannt. Die kultivierten 293T-Zellen wurden mit miR-18b-3p-Mimik und LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p-Mimik und LEP 3′UTR-MUT, Mimik-NC und LEP 3′UTR-WT, Mimik-NC und LEP 3′UTR-MUT für 30 h co-transfiziert. Dann wurden 293T-Zellen gesammelt. Firefly- und Renilla-Luciferase-Aktivität in Zellen wurden durch Lumineszenzmessungen gemäß Dual-Luciferase-Reportergen-Nachweis-Kit (Promega, Madison, WI, USA) gemessen.

RNA-Pull-Down-Assay

Biotinylierte RNA-Sonden (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p und Bio-miR-18b-3p-Mut) wurden mit dem Lysat von 293T-Zellen inkubiert und mittels magnetischer Perlen, konjugiert mit Antibiotikum Streptomycin, extrahiert. Das Experiment wurde basierend auf den Anweisungen der Pierce magnetischen RNA-Pull-Down-Kits (Pierce, IL, USA) durchgeführt. Die RNA wurde eluiert und mit TRIzol (Pierce) gereinigt. Die Anreicherung von LEP im RNA-Komplex wurde mittels RT-qPCR quantifiziert, wie zuvor beschrieben [19].

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit SPSS 21.0 Software (IBM Corp. Armonk, NY, USA) ausgewertet. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Daten wurden durch unabhängigen Stichproben-t-Test für Zweigruppenvergleiche durchgeführt, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test bewertet wurden. Das Kriterium für statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 gesetzt.

Ergebnisse

Morphologie und Identifizierung der hucMSC und hucMSC-Exos

Die Nabelschnur-Gewebemassen wurden unter einem Inversmikroskop beobachtet. Man konnte sehen, dass Zellen am Tag 3 aus der Gewebemasse herauskrochen; Zellen zeigten Spindelform und Fadenförmigkeit sowie kolonieartiges Wachstum ab etwa 5 Tagen. Als sie bis Passage 3 kultiviert waren, war die Morphologie der Zellen einheitlich lang spindelförmig und ähnlich Fibroblastenmorphologie, und die Anordnung war regelmäßig (Abb. 1a). Nach 2 Wochen adipogener Differenzierung von hucMSC bildeten sich Lipidtröpfchen im Zytoplasma, und die Lipidtröpfchen zeigten Kranz-Struktur unter dem Inversmikroskop (Abb. 1b), was darauf hindeutete, dass die isoliert kultivierten hucMSCs die Fähigkeit zur adipogenen Differenzierung besaßen. Nach 2 Wochen osteogener Differenzierung konnten große Mengen brauner Kalziumknötchen unter einem Inversmikroskop gesehen werden (Abb. 1c), was anzeigte, dass isoliert kultivierte hucMSCs die Fähigkeit zur osteogenen Differenzierung besaßen. Ein Durchflusszytometer wurde eingesetzt, um den Immunphänotyp der Zellen zu testen, und die Ergebnisse umfassten, dass Zellen Oberflächenmarker CD73, CD105 und CD166 von MSCs überexprimierten (Abb. 1d).

Abb. 1: Morphologie und Identifizierung der hucMSC und hucMSC-Exos. a Morphologie der hucMSC unter dem Inversmikroskop, b hucMSC getestet durch Öl-Rot-O-Färbung. c hucMSC getestet durch ALP-Färbung. d Durchflusszytometrie zur Detektion des Immunphänotyps. e Form und Größe von hucMSC-Exos beobachtet durch TEM. f Detektion der Partikelgrößenverteilung von Exosomen mittels Nanosight-Analyse. g Proteinexpression von CD9, CD81 und CD63 in hucMSC-Exos detektiert durch Western-Blot-Assay.

Die Morphologie von hucMSC-Exos wurde per TEM beobachtet, und die Ergebnisse zeigten, dass die Exosome rund oder oval mit geringer Zentraldichte und starker Färbung an beiden Seiten waren (Abb. 1e). Nanosight-Analyse wurde genutzt, um die Partikelgröße von Exosomen zu analysieren, und die Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße hauptsächlich zwischen 40 und 100 nm verteilt war, stärker konzentriert um 80 nm (Abb. 1f). Western-Blot-Assay enthüllte, dass alle Oberflächenmarker CD81, CD63 und CD9 in hucMSC-Exos exprimiert waren (Abb. 1g).

Wiederherstellung von miR-18b-3p lindert pathologische Charakteristika von PE-Ratten

Die Ergebnisse von SBP und 24-h-Proteinurie zeigten: Es gab keinen signifikanten Unterschied in SBP und 24-h-Proteinurie in 6 Gruppen vor Verabreichung (Trächtigkeitstag 10). SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 19 zeigten keinen offensichtlichen Unterschied bei normalen Ratten. Bei PE-Ratten oder PE-Ratten, behandelt mit miR-NC, miR-18b-3p Agomir, miR-18b-3p Antagomir, miR-18b-3p Antagomir + si-LEP, si-NC oder si-LEP, begannen SBP und 24-h-Proteinurie ab Trächtigkeitstag 13 anzusteigen. Es gab keinen deutlichen Unterschied von SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 16 und 19 bei PE-Ratten, behandelt mit miR-18b-3p Agomir und si-LEP. PE-Ratten hatten erhöhte SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 19; dieser Anstieg wurde durch miR-18b-3p-Elevation reduziert, aber durch miR-18b-3p-Inhibition weiter verstärkt; LEP-Reduktion hob die Rolle der miR-18b-3p-Downregulation in SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 19 bei PE-Ratten auf (Abb. 2a, b).

Abb. 2: Wiederherstellung von miR-18b-3p lindert pathologische Charakteristika von PE-Ratten. a Ergebnisse von SBP bei Ratten. b Ergebnisse von 24-h-Proteinurie bei Ratten. c Gewichtsveränderungen von Feten. d Veränderungen des Plazentagewichts bei Ratten. e Veränderungen entzündlicher Faktoren im Serum detektiert mittels ELISA. n = 10, *p < 0,05 vs. Normalgruppe. ^p < 0,05 vs. PE + miR-NC-Gruppe. @p < 0,05 vs. PE + miR-18b-3p Antagomir-Gruppe. &p < 0,05 vs. PE + si-NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet.

Das Gewicht von Feten und Plazenta reduzierte sich bei PE-Ratten; upreguliertes miR-18b-3p oder downreguliertes LEP erhöhte, während downreguliertes miR-18b-3p das Gewicht von Feten und Plazenta bei PE-Ratten verringerte; LEP-Silencing kehrte den Effekt der miR-18b-3p-Inhibition auf das Gewicht von Feten und Plazenta bei PE-Ratten um (Abb. 2c, d).

Entzündungsfaktoren im Serum von PE-Ratten wurden detektiert. Es zeigte sich, dass TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte in PE-Ratten erhöht waren; miR-18b-3p-Elevation oder LEP-Inhibition unterdrückten, während miR-18b-3p-Reduktion die Gehalte von TNF-α, IL-1β und IL-6 förderte; der Effekt von inhibiertem miR-18b-3p auf TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte wurde durch LEP-Depletion aufgehoben (Abb. 2e).

Überexprimiertes miR-18b-3p verbessert histopathologische Veränderungen von Plazentageweben bei PE-Ratten

Bei normalen Ratten war die plazentare Zotte reich an Blutgefäßen und hatte eine klare Struktur, Synzytiotrophoblasten waren die Haupttrophoblasten in plazentaren Zotten, und es gab weniger Zytotrophoblasten. Bei PE-Ratten oder PE-Ratten, behandelt mit miR-NC, miR-18b-3p Antagomir, si-NC oder miR-18b-3p Antagomir + si-LEP, nahm die Anzahl der plazentaren Zotten ab, die Struktur war verschwommen und atrophiert, einige Zotten wiesen Fibrinoidnekrose auf, und die Anzahl der Synzytiotrophoblastenknötchen in plazentaren Zotten nahm zu, und die meisten Zotten waren unreif. Die Anzahl der Trophozyten war reduziert, und die pathologischen Veränderungen wurden bei PE-Ratten, behandelt mit miR-18b-3p Agomir und si-LEP, gelindert (Abb. 3a).

Abb. 3: Überexprimiertes miR-18b-3p verbessert pathologische Veränderungen und unterdrückt apoptotische Zellen von Plazentageweben bei PE-Ratten. a HE-Färbung wurde genutzt, um pathologische Merkmale von Plazentageweben zu testen. b TUNEL-Färbung wurde implementiert, um apoptotische Zellen von Plazentageweben bei PE-Ratten zu bestimmen. c Zellapoptoserate wurde durch TUNEL-Färbung detektiert. n = 10, *p < 0,05 vs. Normalgruppe. ^p < 0,05 vs. miR-NC-Gruppe. @p < 0,05 vs. miR-18b-3p Antagomir-Gruppe. &p < 0,05 vs. si-NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet.

TUNEL-Färbung legte nahe, dass eine kleine Anzahl apoptotischer Zellen gesehen werden konnte. PE-Ratten hatten erhöhte apoptotische Zellen, die durch miR-18b-3p-Elevation und LEP-Silencing reduziert wurden, und durch miR-18b-3p-Inhibition weiter verstärkt wurden; LEP-Silencing kehrte auch den Effekt der miR-18b-3p-Inhibition auf die Anzahl apoptotischer Zellen bei PE-Ratten um (Abb. 3b, c).

Zusammenfassend hatten Ratten mit upreguliertem miR-18b-3p oder inhibiertem LEP einen verringerten Grad der PE-Progression in der Histologie, und silenciertes LEP konnte den therapeutischen Effekt von inhibiertem miR-18b-3p aufheben.

miR-18b-3p ist downreguliert, während LEP upreguliert in PE-Ratten-Plazentageweben ist und miR-18b-3p targetet LEP

Basierend auf den obigen Ergebnissen kehrte LEP-Downregulation den therapeutischen Effekt der Downregulation von miR-18b-3p auf PE-Ratten in Pathologie und Histologie um; somit hypothesierten wir, dass miR-18b-3p mit LEP in Verbindung stehen könnte.

Western-Blot-Assay und RT-qPCR enthüllten, dass PE-Ratten erniedrigte miR-18b-3p- und erhöhte LEP-Expressionsniveaus hatten; die Behandlung mit miR-18b-3p Agomir upregulierte miR-18b-3p und downregulierte LEP bei PE-Ratten, während die Behandlung mit miR-18b-3p Antagomir LEP-Expression erhöhte; LEP-Silencing kehrte den promotiven Effekt der miR-18b-3p-Reduktion auf LEP-Expression bei PE-Ratten um (Abb. 4a–c).

Abb. 4: miR-18b-3p ist downreguliert und LEP upreguliert in Plazentageweben von PE-Ratten. a Expression von miR-18b-3p und LEP mRNA in Plazentageweben detektiert mittels RT-qPCR. b Proteinband von LEP in Plazentageweben. c Western-Blot-Assay durchgeführt zur Detektion von LEP-Protein-Expression in Plazentageweben. d Expression von miR-18b-3p und LEP mRNA in Plazentageweben nach Exosomen-Behandlung detektiert mittels RT-qPCR. e Proteinband von LEP in Plazentageweben nach Exosomen-Behandlung. f Western-Blot-Assay durchgeführt zur Detektion von LEP-Protein-Expression nach Exosomen-Behandlung. g Bindungsstellen von miR-18b-3p und LEP vorhergesagt durch Online-Software. h Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP verifiziert durch Dual-Luciferase-Reportergen-Assay. i Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP verifiziert durch RNA-Pull-Down-Assay. n = 10, *p < 0,05 vs. Normalgruppe. ^p < 0,05 vs. miR-NC-Gruppe. @p < 0,05 vs. miR-18b-3p Antagomir-Gruppe. &p < 0,05 vs. si-NC-Gruppe. #p < 0,05 vs. PE-Gruppe. $p < 0,05 vs. PE + Exos-antagomir NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet.

Western-Blot-Assay und RT-qPCR wurden verwendet, um die Rolle von Exosomen bei PE-Ratten zu erforschen. Die Ergebnisse zeigten, dass Exosome miR-18b-3p upregulierten und LEP in PE-Ratten downregulierten, was den suppressiven Effekt von Exosomen auf die PE-Entwicklung anzeigte. Zudem induzierten Exosome, die miR-18b-3p Antagomir transportierten, miR-18b-3p-Downregulation und LEP-Upregulation bei PE-Ratten (Abb. 4d–f).

Die Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP wurde durch Bioinformatik-Online-Vorhersagesoftware https://cm.jefferson.edu/ vorhergesagt (Abb. 4g). Dual-Luciferase-Reportergen-Assay legte nahe, dass miR-18b-3p-Mimik die Luciferase-Aktivität von LEP 3′UTR-WT verringerte, während sie keine Auswirkungen auf die von LEP 3′UTR-MUT hatte (Abb. 4h). Darüber hinaus enthüllte der RNA-Pull-Down-Assay, dass LEP-Anreicherung durch WT-biotinyliertes miR-18b-3p erhöht wurde (Abb. 4i). Diese Befunde wiesen darauf hin, dass LEP ein Zielgen von miR-18b-3p ist.

hucMSC-Exos attenuieren pathologische Charakteristika von PE-Ratten

Die Ergebnisse von SBP und 24 h zeigten, dass es keinen signifikanten Unterschied in SBP und 24-h-Proteinurie in 5 Gruppen vor Verabreichung (Trächtigkeitstag 10) gab. SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 19 zeigten keinen deutlichen Unterschied bei normalen Ratten. Bei PE-Ratten begannen SBP und 24-h-Proteinurie ab Trächtigkeitstag 13 anzusteigen. Es gab keinen deutlichen Unterschied von SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 16 und 19 bei PE-Ratten, behandelt mit hucMSC-Exos und hucMSC-Exos, die Antagomir NC transportierten. SBP und 24-h-Proteinurie stiegen am Trächtigkeitstag 19 in der PE-Gruppe an, während der Anstieg durch Injektion von hucMSC-Exos reduziert wurde. Die Inhibition von miR-18b-3p kehrte den Effekt von hucMSC-Exos auf SBP und 24-h-Proteinurie am Trächtigkeitstag 19 bei PE-Ratten um (Abb. 5a, b).

Abb. 5: hucMSC-Exos attenuieren pathologische Charakteristika von PE-Ratten. a Ergebnisse von SBP bei Ratten nach Exosomen-Behandlung. b Ergebnisse von 24-h-Proteinurie bei Ratten nach Exosomen-Behandlung. c Gewichtsveränderungen von Feten nach Exosomen-Behandlung. d Veränderungen des Plazentagewichts bei Ratten nach Exosomen-Behandlung. e Veränderungen von Entzündungsfaktoren nach Exosomen-Behandlung im Serum bestimmt mittels ELISA. n = 10, *p < 0,05 vs. Normalgruppe. #p < 0,05 vs. PE-Gruppe. $p < 0,05 vs. PE + Exos-antagomir NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet.

Das Gewicht von Feten und Plazenta wurde gemessen, und wir fanden, dass PE-Ratten verringertes Gewicht von Feten und Plazenta hatten; miR-18b-3p-Downregulation hob die Rolle von hucMSC-Exos im Gewicht von Feten und Plazenta bei PE-Ratten auf (Abb. 5c, d).

Entzündungsfaktoren im Serum wurden mittels ELISA detektiert. TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte stiegen bei PE-Ratten bemerkenswert an. Exosomen-Behandlung verringerte TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte im Serum von PE-Ratten, welche durch Injektion von Exosomen, die miR-18b-3p inhibierten, verstärkt wurden (Abb. 5e).

Exosome lindern pathologische Veränderungen und inhibieren Apoptose von Plazentageweben bei PE-Ratten

Bei normalen Ratten war die plazentare Zotte reich an Blutgefäßen mit klarer Struktur, Synzytiotrophoblasten waren der Haupttrophoblast in plazentaren Zotten, und es gab weniger Zytotrophoblasten. In der PE-Gruppe und PE-Ratten, behandelt mit hucMSC-Exos-miR-18b-3p-Antagomir, nahm die Anzahl der plazentaren Zotten ab, die Struktur war verschwommen und atrophiert, einige Zotten wiesen Fibrinoidnekrose auf, und die Anzahl der Synzytiotrophoblastenknötchen in plazentaren Zotten nahm zu, und die meisten Zotten waren unreif. Die pathologische Veränderung war in der PE-Gruppe, behandelt mit hucMSC-Exos oder hucMSC-Exos-Antagomir NC, im Vergleich zur PE-Gruppe und PE-Ratten, behandelt mit hucMSC-Exos-miR-18b-3p-Antagomir, verbessert (Abb. 6a).

Abb. 6: Exosome lindern pathologische Veränderungen und verringern apoptotische Zellen von Plazentageweben bei PE-Ratten. a HE-Färbung wurde genutzt, um pathologische Merkmale von Plazentageweben bei PE-Ratten nach Exosomen-Behandlung zu testen. b TUNEL-Färbung wurde implementiert, um apoptotische Zellen von Plazentageweben bei PE-Ratten nach Exosomen-Behandlung zu bestimmen. c Zellapoptoserate wurde durch TUNEL-Färbung detektiert. n = 10, *p < 0,05 vs. Normalgruppe. #p < 0,05 vs. PE-Gruppe. $p < 0,05 vs. PE + Exos-antagomir NC-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet.

TUNEL-Färbung zeigte an, dass bei normalen Ratten eine kleine Anzahl apoptotischer Zellen gesehen werden konnte. PE-Ratten hatten verstärkte apoptotische Zellen, und reduziertes miR-18b-3p kehrte die Auswirkungen von hucMSC-Exos auf die Anzahl apoptotischer Zellen in Plazentageweben von PE-Ratten um (Abb. 6b, c).

Diskussion

PE ist eine multisystemische Schwangerschaftsstörung, gekennzeichnet durch Proteinurie und entweder hohen Blutdruck oder andere ungünstige Bedingungen und verbunden mit einer breiten Palette mütterlicher Endothelfunktionsstörungen [20]. Es wurde berichtet, dass hucMSC-Exo die Morphologie von Plazentagewebe bei PE-Ratten durch Unterdrückung von Zellapoptose und Förderung von Angiogenese in Plazentagewebe in dosisabhängiger Weise verbesserte [8]. Eine Studie berichtete, dass miR-18b-Expression Zellmigration, Vitalität und Invasion bei PE beeinflusste [12]. Zudem wurde verifiziert, dass erhöhte mütterliche LEP-Konzentration und Hypomethylierung des LEP in Plazenta bei früh einsetzender PE vorlagen [21]. Die aktuelle Studie wurde entworfen, um den Effekt von Exosomen und miR-18b-3p targetiertem LEP auf das Auftreten von PE zu erforschen. Die Befunde dieser Studie enthüllten, dass hucMSC-abgeleitetes exosomales miR-18b-3p die PE-Progression durch Reduktion von LEP inhibierte.

Basierend auf unseren Befunden war miR-18b-3p reduziert und LEP erhöht in Plazentageweben von PE-Ratten. Ähnlich wie in unserer Studie war die mRNA-Expression von miR-18b in PE-Plazentageweben im Vergleich zu normalen Plazentageweben markant supprimiert [12]. Zusätzlich enthüllte eine Studie, dass miR-18b-Gehalt in malignen Melanomgeweben im Vergleich zu ihren passenden adjacenten Nicht-Tumor-Geweben dramatisch reduziert war [22]. Eine andere Studie verifizierte, dass plazentare LEP-Expression in präterm PE im Vergleich zu Kontrollen erhöht war [23]. Zudem zeigte eine Studie, dass LEP-Expression in präeklamptischen Plazentas offensichtlich erhöht war [15]. Diese Literatur bot eine theoretische Basis für uns, die abnormale Expression von miR-18b-3p und LEP bei PE zu erforschen. Zudem wurde mittels bioinformatischer Software vorhergesagt, dass LEP durch miR-18b-3p targetet wurde, und diese Zielbeziehung wurde in unserer Forschung durch Dual-Luciferase-Reportergen-Assay weiter bestätigt. Eine Studie berichtete, dass LEP ein Target für alle drei miRNAs (miR-1301, miR-223 und miR-224) bei früh einsetzender PE ist [16]. Eine andere Studie zeigte, dass LEP miR-93-Expression in Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis verringerte [24]. Die Bindung zwischen miR-18b-3p und LEP in menschlichen Erkrankungen, insbesondere bei PE, bleibt jedoch knapp untersucht, was die Neuheit dieser Studie darstellt. Darüber hinaus berichtete ein Ergebnis aus unserer Studie, dass Exosome miR-18b-3p erhöhten und LEP in Plazentageweben von PE verringerten. Es wurde früher dokumentiert, dass die Expression von miR-18b-5p in kolorektalen Krebs-Plasma-Exosomen bemerkenswert erhöht war [25], während die Beziehung zwischen hucMSC-Exos und miR-18b-3p/LEP bei PE weitere Studien bedarf.

Zusätzlich zeigte das Ergebnis unserer Untersuchung, dass restauriertes miR-18b-3p SBP und 24-h-Proteinurie von PE-Ratten reduzierte, das Gewicht der Plazenta erhöhte, TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte im Serum und Plazentageweben verringerte sowie Zellapoptose unterdrückte. Diese Daten wiesen darauf hin, dass miR-18b-3p-Elevation zur Linderung der Symptome und pathologischen Veränderungen bei PE beitrug. Es wurde demonstriert, dass stabile Upregulation von miR-18b effektive Tumorsuppressor-Aktivität produzierte, wie Inhibition von Melanomzellvitalität, Induktion von Apoptose und Reduktion von Tumorwachstum in vivo [26]. Ein weiteres Ergebnis unserer Studie war, dass hucMSC-Exos SBP und 24-h-Proteinurie von PE-Ratten reduzierten, das Gewicht der Plazenta erhöhten, TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte im Serum und Plazentageweben verringerten sowie Zellapoptose unterdrückten. Die Befunde der aktuellen Studie enthüllten, dass exosomen-behandelte PE-Rattenmodelle eine Zunahme der Anzahl und Qualität von Feten, der Qualität der Plazenta, aber signifikant reduzierte Zellapoptose aufwiesen [8]. Interessanterweise hat eine frühere Forschung demonstriert, dass die Zugabe fötaler boviner Exosome die Gehalte von Makrophagen-TNF-α und IL-6 verringerte [27]. Eine Studie enthüllte, dass gereinigte Exosome die Produktion von IL-1β in Lipopolysaccharid/Nigericin-stimulierten Makrophagen unterdrückten [28]. Darüber hinaus schlugen Nong et al. vor, dass Entzündungsmarker wie TNF-α und IL-6 nach Verabreichung von Exosomen, produziert durch human-induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete MSCs, dramatisch verringert waren [29]. Ein Artikel fand, dass der SBP in der Gruppe von Frauen, die später PE entwickelten, markant erhöht war [30, 31]. Es wurde gezeigt, dass PE-Patientinnen positiv assoziiert waren mit SBP und diastolischem Blutdruck und Proteinurie [32]. Auch eine kürzliche Studie lieferte den Beweis, dass Proteinurie mit fortschreitender Trächtigkeit bei PE-Frauen zunahm [33]. Ein wichtiger Befund war, dass Ratten aus der PE-Gruppe erhöhte TNF-α im Vergleich zur normalen trächtigen Gruppe hatten [34]. Eine andere Studie verifizierte, dass Serum-IL-6 und IL-1β bei Frauen mit PE im Vergleich zu Kontrollen offensichtlich erhöht waren [35]. Die obigen Befunde legten nahe, dass PE-Patientinnen üblicherweise hohe SBP, Proteinurie und Entzündungsfaktor-Spiegel zeigten. Somit konnte aus unseren Ergebnissen geschlossen werden, dass hucMSC-abgeleitetes exosomales miR-18b-3p einen therapeutischen Effekt auf PE hatte.

Fazit

Zusammenfassend liefert unsere Studie Belege, dass hucMSCs-abgeleitete Exosome miR-18b-3p upregulieren, welches LEP targetet, um die Gehalte entzündlicher Faktoren und die Zellapoptoserate in PE-Ratten-Plazentageweben zu unterdrücken, wodurch das Auftreten von PE inhibiert wird. Somit könnte exosomales miR-18b-3p ein potenzieller Kandidat für die Behandlung von PE durch Targeting von LEP sein. Diese Forschung identifizierte erstmals die Rolle von hucMSC-abgeleitetem exosomalem miR-18b-3p, das LEP während der PE-Entwicklung targetet, was einen neuen Einblick für die PE-Behandlung bot. Aufgrund der Limitation bekannter Forschungen muss die Studie jedoch in zukünftigen klinischen Studien rigoros überwacht und angemessen berichtet werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht anwendbar.