Aus mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur stammende exosomale MicroRNA-18b-3p hemmt das Auftreten von Präeklampsie durch gezieltes LEP

Einführung

Präeklampsie (PE), gekennzeichnet durch Proteinurie und Hypertonie [1], ist eine der Hauptursachen für die fetale und mütterliche Mortalität und Morbidität in der Schwangerschaft [2]. Die Ätiologie und Pathogenese der PE ist nicht klar [3], die mit einer abnormalen Trophoblasteninvasion in Verbindung gebracht wurde, die zu einer endothelialen Dysfunktion der Mutter, chronischer Malperfusion der Plazenta und Bluthochdruck mit unerwünschten Ergebnissen führt [4]. Mit Ausnahme der fetalen und plazentaren Entbindung gibt es keine spezifische Therapie der LE [5]. Daher ist es dringend erforderlich, die therapeutischen Ziele zu erforschen, um die Prognose dieser Krankheit zu verbessern.

Humane Nabelschnur (huc) ist eine geeignete Quelle für mesenchymale Stammzellen (MSCs), die eine Vielzahl von trophischen Faktoren und Zytokinen sezernieren sowie starke entzündungshemmende und immunmodulatorische Fähigkeiten aufweisen [6]. Eine Studie hat bestätigt, dass PE die Expression neuroglialer Marker in Nabelschnur-Wharton-MSCs aus Gelee beschleunigt [7]. Ein protektiver Effekt von hucMSCs-Exosomen (Exos) auf die Morphologie und Angiogenese der Plazenta bei PE-Ratten wurde ebenfalls berichtet [8]. Exosomen sind kleine (50–100 nm) sekretorische Vesikel, die die Kommunikation zwischen Zellen in der Tumormikroumgebung über die Einkapselung und Übertragung kanzerogener Faktoren an entfernte Stellen oder an umgebende Zellen durch den Kreislauf vermitteln [9]. Eine Studie hat die Schädigung von Gefäßfunktionen und Komplikationen gezeigt, die durch den effektiven Transfer von sFlt-1 und sEng in Endothelzellen bei Patienten mit PE durch Exosomen induziert werden [10]. MicroRNAs (miRNAs) sind endogene, nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von 18–25 Nukleotiden und regulieren die Expression von Genen auf posttranskriptioneller Ebene [11]. Die Daten einer Studie haben berichtet, dass die Expression von miR-18b die Zellinvasion, Lebensfähigkeit und Migration von Trophoblastzellen in PE beeinflusst [12]. Darüber hinaus haben Wu et al. haben vorgeschlagen, dass miR-18b die durch hohe Glukose induzierte Proliferation in menschlichen retinalen Endothelzellen abschwächt, was einen neuen Einblick in das Verständnis des Mechanismus der Pathogenese der diabetischen Retinopathie bieten könnte [13]. Die Rolle von hucMSC-abgeleitetem exosomalem miR-18b-3p bei PE bleibt jedoch unbekannt. Leptin (LEP) hat pleiotrope Wirkungen auf die Zelldifferenzierung/-proliferation und die Immunität von physiologischen Zuständen und stammt hauptsächlich aus Adipozyten, zusätzlich zu anderen Geweben, einschließlich Plazenta [14]. Eine Studie hat bestätigt, dass die abnormale Methylierung des LEP-Promotors an der PE-Progression beteiligt ist [15]. Eine andere Studie hat vorgeschlagen, dass die Plazenta ein Hauptort der Expression von LEP in der Schwangerschaft ist [16]. Trotzdem ist die Bindungsbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP immer noch schwer fassbar. Daher wollten wir die Rolle von hucMSC-abgeleitetem exosomalem miR-18b-3p bei LE mit Beteiligung von LEP untersuchen und folgerten, dass hucMSC-abgeleitetes exosomales miR-18b-3p die PE-Progression durch gezieltes LEP hemmen kann.

Materialien und Methoden

Ethische Genehmigung

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Volkskrankenhauses der Universität Wuhan genehmigt. Alle Teilnehmer unterschrieben eine Einverständniserklärung. Alle Tierversuche stimmten mit dem Leitfaden zur Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Internationalen Komitees des Volkskrankenhauses der Universität Wuhan überein.

Isolation, Kultur und Identifizierung von HucMSCs

Die von einem gesunden Wöchner abgegebene fötale Nabelschnur wurde gesammelt und in Hackfleisch geschnitten und mit einem Sieb filtriert, dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vermischt. Die Nabelschnurgewebe wurden bei 1500 U/min für 5 Minuten mit einem Zentrifugalradius von 10 cm zentrifugiert. Die Gewebe wurden mit modifiziertem Eagle-Medium (DMEM)/F12 von Dulbecco, das 10 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt, suspendiert und in eine Kulturflasche überführt. Die Flüssigkeiten wurden nach 4 Tagen und dann alle 3 Tage gewechselt. Die Zellen wurden subkultiviert, wenn die Konfluenz etwa 90% erreichte. Das adhärente Wachstum und die Morphologie von hucMSCs wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Die Zellen wurden mit ölroter O-Färbelösung (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) gefärbt, um die osteogene Differenzierung von hucMSCs nachzuweisen, und mit alkalischer Phosphatase (ALP)-Färbelösung (Beyotime) gefärbt, um die adipogene Differenzierung von hucMSCs nachzuweisen. Ein Durchflusszytometer (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) wurde verwendet, um CD73, CD166 (beide 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) und CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, Großbritannien).

Extraktion und Identifizierung von HucMSC-Exos

Die gut wachsenden hucMSCs wurden kultiviert. Der Überstand wurde gesammelt und bei 28.500 U/min für 1 h mit einem Zentrifugenradius von 10 cm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen mit 2% Glutaraldehyd und 1% Osminsäure fixiert, mit Ethanol dehydratisiert, in Propylenoxid eingetaucht, 2 h getrocknet, in Epon812 eingebettet und in Scheiben geschnitten. Die Schnitte wurden mit Uran bzw. Blei gefärbt. Schließlich wurden die Exosomen unter dem Elektronenmikroskop beobachtet. Der Nanosight-Detektor (Malvern Instruments, Malvern, UK) wurde verwendet, um die Brownsche Bewegungsbildgebung von Exosomen-Nanopartikeln und deren Größe zu erkennen. Die Oberflächenmarker von hucMSC-Exos wurden durch Western-Blot-Assay identifiziert und die Ergebnisse zeigten, dass hucMSC-Exos CD9, CD81 und CD63 exprimierte.

Lentivirus-Infektionsmethode

HucMSC wurde mit Lentivirus infiziert, das eine geringe Expression des miR-18b-3p-Vektors und eine geringe Expression der miR-18b-3p-Vektor-Negativkontrolle (NC) enthielt (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, China). Schließlich wurden das stabil exprimierte hucMSC-Antagomir NC und hucMSC-miR-18b-3p-Antagomir erhalten. Die Zellen wurden 48 h lang kultiviert, und der Überstand wurde gesammelt und durch Ultrazentrifugation zentrifugiert, um das entsprechende Exos-Antagomir NC und Exos-miR-18b-3p-Antagomir zu erhalten.

Versuchstiere

Wistar-Ratten (Gewicht 200–250 g, Alter von 8 W, unabhängig vom Geschlecht) in einem gesundheitlich einwandfreien Zustand und Geschlechtsreife wurden ausgewählt (Experimental Animal Center der Wuhan University, Wuhan, China). Die Ratten wurden in einem Barrieresystem mit einer Temperatur von 18–28 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40–70 % und ausreichender Nahrung und Wasser gefüttert.

Etablierung von Ratten-PE-Modellen

Das Ratten-PE-Modell wurde durch intraperitoneale Injektion von 50 mg/kg Stickoxid-Synthetase-Inhibitor, N(G)-Nitro-l-arginin-methylester (L-NAME, Beyotime) unter Bezugnahme auf einen Artikel erstellt [17]. Die erfolgreiche Etablierung des PE-Modells basierte auf einem erhöhten Blutdruck mit 20 mmgHg und höher als 115 mmHg sowie einer verstärkten Proteinurie.

Tiergruppierung

Die weibliche Ratte und die männliche Ratte wurden nach dem Zufallsprinzip 1:1 zusammengewohnt und die beiden Ratten wurden von 17–18 Uhr in einem individuellen Spezialkäfig gehalten. Der vorherige Tag. Die Spermien im Vaginalsekret der weiblichen Ratten wurden am nächsten Tag mittels Vaginalpfropfen und Mikroskop beobachtet. War das Ergebnis gleichzeitig positiv, wurde der Tag als 0. Trächtigkeitstag erfasst. Ab dem 13. ^. Tag der Trächtigkeit wurden die Ratten in 6 Gruppen eingeteilt (10 Ratten in jeder Gruppe):normale Gruppe (die gleiche Menge normaler Kochsalzlösung wurde vom 13. bis zum 20. Tag der Trächtigkeit intraperitoneal injiziert), PE-Gruppe (L-NAME [50 mg/ kg pro Tag] wurde vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag intraperitoneal injiziert, und vom 16. bis 19. /kg pro Tag] wurde von Tag 13 bis Tag 20 der Trächtigkeit intraperitoneal injiziert, und 20 μl 4 nmol miR-NC wurden am Tag 16 bis Tag 19 der Trächtigkeit in die Plazenta injiziert), PE + miR-18b-3p-Agomir-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde vom 13. bis 20. Schwangerschaftstag intraperitoneal injiziert, und am 16. bis 19. Gestationstag wurden 20 μl 4 nmol miR-18b-3p-Agomir in die Plazenta injiziert.) , PE + miR-18b-3p-Antagomir-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde vom 13. bis 20 P Lacenta am Tag 16 bis Tag 19 der Trächtigkeit), PE + miR-18b-3p Antagomir + kleine interferierende RNA (si)-LEP-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg pro Tag] wurde von Tag 13 bis Tag 20 intraperitoneal injiziert Schwangerschaftswoche und 20 μl 4 nmol miR-18b-3p-Antagomir und si-LEP wurden am Tag 16 bis 19 der Schwangerschaft in die Plazenta injiziert) und PE + si-LEP-Gruppe (L-NAME [50 mg/kg per Tag] wurde von Tag 13 bis Tag 20 der Trächtigkeit intraperitoneal injiziert, und 20 &mgr;l 4 nmol si-LEP wurden am Tag 16 bis Tag 19 der Trächtigkeit in die Plazenta injiziert. Ratten wurden mit Exosomen und Lentiviren tragenden Exosomen behandelt. Die Ratten wurden in 5 Gruppen eingeteilt (10 Ratten in jeder Gruppe):normale Gruppe (die gleiche Menge an normaler Kochsalzlösung wurde vom 13. bis 20. Trächtigkeitstag intraperitoneal injiziert), PE-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag ) wurde von Tag 13 bis Tag 20 der Trächtigkeit intraperitoneal injiziert und 20 μl physiologische Kochsalzlösung wurden am Tag 16 bis Tag 19 der Trächtigkeit in die Plazenta injiziert), PE + Exos-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde von Tag 13 bis Tag 20 der Schwangerschaft intraperitoneal injiziert und 20 μl Exos (80 μg Exosomen wurden in 20 μl normaler Kochsalzlösung suspendiert) wurden von Tag 16 bis Tag 19 der Schwangerschaft in die Plazenta injiziert), PE + Exos-antagomir NC Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde vom 13. bis 20. Schwangerschaftstag intraperitoneal injiziert und 20 μl Exos-Antagomir NC (80 μg Exosomen wurden in 20 μl normaler Kochsalzlösung suspendiert) wurden in die Plazenta injiziert an Tag 16 bis Tag 19 der Trächtigkeit) und PE + Exos-miR-18b-3p-Antagomir-Gruppe (L-NAME (50 mg/kg pro Tag) wurde ab Tag 13 . intraperitoneal injiziert bis zum 20. Trächtigkeitstag und 20 μl Exos-miR-18b-3p-Antagomir (80 μg Exosomen wurden in 20 μl normaler Kochsalzlösung suspendiert) wurden am 16. bis 19. Gestationstag in die Plazenta injiziert.

Nachweis des systolischen Blutdrucks (SBP) und Bestimmung der 24-h-Proteinurie

Der Druck von Ratten wurde durch Messung des Blutdrucks der Schwanzarterie der Ratte gemessen. Der SBP der Schwanzmanschette aller trächtigen Ratten wurde am 10., 13., 16. und 19. Trächtigkeitstag unter Verwendung des Rattenschwanzarteriendruckdetektors (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, USA) gemessen. Der Druck wurde dreimal in kurzer Zeit gemessen; dann wurde der Durchschnittswert als Blutdruck genommen.

Bei freier Nahrung und Wasser wurde der 24-h-Urin trächtiger Ratten am 10., 13., 16. und 19. Tag der Trächtigkeit gesammelt und der Proteingehalt in der nephrologischen Abteilung des Volkskrankenhauses der Universität Wuhan nachgewiesen.

Beispielsammlung

Die trächtigen Ratten wurden am 21. Trächtigkeitstag mit 3% Pentobarbital-Natrium anästhesiert. Das periphere Blut der Ratten wurde konserviert, zentrifugiert, um das Serum zu entnehmen, und im Kühlschrank bei – 20 °C für den Standby-Modus aufbewahrt. Dann wurden fötale Ratten und Plazenta per Kaiserschnitt entnommen, die fötale Membran und die verbundene Nabelschnur wurden entfernt und die mit der fötalen Ratte verbundene Nabelschnur wurde abgeschnitten. Die Plazenta und die fötale Ratte wurden auf aseptische Gaze gelegt, um Blut bzw. Fruchtwasser zu trocknen, und dann auf die Analysenwaage gelegt, um das Gewicht zu wiegen. Ein Teil des Plazentagewebes wurde mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit Ethanol dehydratisiert, mit Xylol geklärt, mit Paraffin eingebettet und kontinuierlich gekreuzt (5 μm) für Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte Desoxyuridintriphosphat-Biotin Nick-End-Labeling (TUNEL)-Färbung. Der Rest wurde bei -80 °C für den Nachweis der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) durch die reverse Transkription, die Western-Blot-Analyse und den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) aufbewahrt.

ELISA

Der Gehalt an Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin (IL)-1β und IL-6 im Serum wurde durch ELISA getestet. Die Konzentrationen von TNF-α, IL-1β und IL-6 wurden gemäß den Anweisungen des Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) bestimmt. Die Werte der optischen Dichte (OD) (490 nm) wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) getestet. Die entsprechende Standardkurve wurde unter Verwendung des OD-Wertes als Abszisse und der Konzentration der entsprechenden Standardprobe als Ordinate erhalten. Die Konzentrationen von TNF-α, IL-1β und IL-6 wurden aus der Standardkurve berechnet.

HE-Färbung

Die Paraffinproben von Plazentagewebe wurden in Xylol geklärt, mit herkömmlichem Gradientenalkohol entwässert, mit Hämatoxylin gefärbt, mit 1% Salzsäurealkohol differenziert und mit 1% Ammoniakwasser wieder blau gemacht. Dann wurden die Gewebe mit 1 % Eosinlösung gegengefärbt, entwässert (75 %, 90 % bzw. 95 % Ethanol, absoluter Ethylalkohol) und mit Xylol geklärt, getrocknet, blockiert und unter dem Elektronenmikroskop untersucht.

TUNEL-Färbung

In Paraffin eingebettete Schnitte wurden gemäß den Anweisungen routinemäßig entwachst und entwässert, und dann wurde Apoptose mit dem TUNEL-Kit (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China) nachgewiesen. 4,6-Diamino-2-phenylindol (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) wurde verwendet, um TUNEL-positive Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Nikon, Tokio, Japan) zu beobachten [18].

RT-qPCR

Die Plazentagewebe wurden gewogen. Pro 50–100 mg wurde Plazentagewebe mit 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) versetzt und vollständig aufgelöst. Die Gewebe wurden mit 200 μl Chloroform versetzt und bei 4 °C, 12.000 U/min zentrifugiert, um die Gesamt-RNA zu extrahieren. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurden mit dem DU-800 Protein-Nukleinsäure-Spektrophotometer (Beckman) bestimmt. U6 und β-Actin wurden als Beladungskontrollen verwendet. PCR-Primer wurden von Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China) entworfen und zusammengesetzt. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet. RNA wurde auf der Grundlage der Anweisungen des RNA-Reverse-Transkriptions-Kits (Sangon) in cDNA reversiert. Die PCR wurde amplifiziert und die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese verifiziert. Die Daten wurden mit 2 ^−ΔΔCt . berechnet Methode.

Western Blot Assay

Das Gesamtprotein des Plazentagewebes wurde durch Zelllysepuffer (Beyotime) des Radioimmunpräzipitationsassays extrahiert. HucMSC-Exo wurde verwendet, um Puffer zu extrahieren, der bei 14.000 U/min zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde zum Testen der Proteinexpression des exosomalen Markerproteins (CD81, CD63 und CD9) im Serum aufbewahrt. Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bicinchoninsäure-Kit (Beyotime, P0010) bestimmt. Die Probe wurde gemäß den quantitativen Ergebnissen des Proteins geladen, mit 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese behandelt und auf eine Membran übertragen. Die Membran wurde mit 5% Magermilch blockiert, mit den primären Antikörpern LEP, CD63, CD81, CD9 und β-Aktin (4 ml, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA) sondiert, erneut getestet mit 4 ml Sekundärantikörper Ziege-Anti-Kaninchen-IgG/Meerrettichperoxidase, exponiert und entwickelt. Als interne Referenz wurde β-Actin verwendet. Der Grauwert wurde mit der Gelgrafik-Analysesoftware Image Lab analysiert.

Dual-Luciferase-Reportergen-Assay

Die Online-Vorhersagesoftware https://cm.jefferson.edu/ wurde verwendet, um die Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP sowie die Bindungsstelle von miR-18b-3p und LEP 3′untranslated region (UTR .) vorherzusagen ). Die Sequenz der LEP-3'UTR-Promotorregion, die die miR-18b-3p-Bindungsstelle enthält, wurde zusammengestellt. Das LEP 3'UTR Wildtyp (WT) Plasmid und der LEP 3'UTR Mutantentyp (MUT) wurden konstruiert. Die rekombinanten Plasmide wurden als LEP 3'UTR-WT bzw. LEP 3'UTR-MUT bezeichnet. Die kultivierten 293T-Zellen wurden mit miR-18b-3p-Mimic und LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p-Mimic und LEP 3′UTR-MUT, mimic NC und LEP 3′UTR-WT, mimic NC und . cotransfiziert LEP 3′UTR-MUT für 30 h. Dann wurden 293T-Zellen gesammelt. Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivität in Zellen wurde durch Lumineszenzmessungen gemäß dem Dual-Luciferase-Reportergen-Nachweiskit (Promega, Madison, WI, USA) gemessen.

RNA-Pull-Down-Assay

Biotinylierte RNA-Sonden (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p und Bio-miR-18b-3p-Mut) wurden mit dem Lysat von 293T-Zellen inkubiert und unter Verwendung von mit Antibiotikum Streptomycin konjugierten Magnetkügelchen extrahiert. Das Experiment wurde basierend auf den Anweisungen von Pierce magnetischen RNA-Pulldown-Kits (Pierce, IL, USA) durchgeführt. Die RNA wurde eluiert und mit TRIzol (Pierce) gereinigt. Die Anreicherung von LEP im RNA-Komplex wurde mit RT-qPCR quantifiziert, wie zuvor beschrieben [19].

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit der Software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) expliziert. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die Daten wurden von einer unabhängigen Stichprobe t . durchgeführt Test für Zweigruppenvergleiche, während Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test bewertet wurden. Das Kriterium für die statistische Signifikanz wurde auf p . festgelegt < 0.05.

Ergebnisse

Morphologie und Identifizierung von HucMSC und HucMSC-Exos

Die Gewebemassen der Nabelschnur wurden unter einem umgekehrten Mikroskop beobachtet. Es war zu sehen, dass am Tag 3 Zellen aus der Gewebemasse herauskrochen; Zellen zeigten Spindelform und Fädigkeit und wuchsen nach etwa 5 Tagen wie eine Kolonie. Bei Kultivierung bis Passage 3 war die Morphologie der Zellen einheitlich lang spindelförmig und ähnlich der Morphologie von Fibroblasten, und die Anordnung war regelmäßig (Abb. 1a). Nach 2 W adipogener Differenzierung von hucMSC wurden Lipidtröpfchen im Zytoplasma gebildet, und die Lipidtröpfchen zeigten unter dem inversen Mikroskop eine Kranz-Struktur (Abb. 1b), was darauf hindeutet, dass die isolierte kultivierte hucMSC die Fähigkeit zur adipogenen Differenzierung hatte. Nach 2 w osteogener Differenzierung war unter einem umgekehrten Mikroskop eine große Anzahl brauner Kalziumknötchen zu sehen (Abb. 1c), was darauf hindeutet, dass isolierte kultivierte hucMSC die Fähigkeit zur osteogenen Differenzierung besaßen. Ein Durchflusszytometer wurde verwendet, um den Immunphänotyp von Zellen zu testen, und die Ergebnisse beinhalteten, dass die Zellen die Oberflächenmarker CD73, CD105 und CD166 von MSCs überexprimierten (Abb. 1d).

Morphologie und Identifizierung der hucMSC und hucMSC-Exos. a Die Morphologie der hucMSC unter dem inversen Mikroskop, b hucMSC wurde durch Ölrot-O-Färbung getestet. c hucMSC wurde durch ALP-Färbung getestet. d Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um den Immunphänotyp zu erkennen. e Die Form und Größe von hucMSC-Exos, beobachtet durch ein TEM. f Nachweis der Partikelgrößenverteilung von Exosomen mittels Nanosight-Analyse. g Die Proteinexpression von CD9, CD81 und CD63 in hucMSC-Exos wurde durch Western-Blot-Assay nachgewiesen

Die Morphologie von hucMSC-Exos wurde durch das TEM beobachtet, und die Ergebnisse zeigten, dass die Exosomen rund oder oval mit geringer zentraler Dichte und dicker Färbung auf beiden Seiten waren (Abb. 1e). Die Nanosight-Analyse wurde verwendet, um die Partikelgröße von Exosomen zu analysieren, und die Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße hauptsächlich zwischen 40 und 100 nm verteilt war, konzentrierter um 80 nm (Abb. 1f). Der Western-Blot-Assay zeigte, dass alle Oberflächenmarker CD81, CD63 und CD9 in hucMSC-Exos exprimiert wurden (Abb. 1g).

Wiederherstellung von miR-18b-3p lindert pathologische Merkmale von PE-Ratten

Die Ergebnisse von SBP und 24-h-Proteinurie zeigten Folgendes:Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen SBP und 24-h-Proteinurie in 6 Gruppen vor der Verabreichung (Tag 10 der Trächtigkeit). SBP und 24-Stunden-Proteinurie am 19. Trächtigkeitstag zeigten bei normalen Ratten keinen offensichtlichen Unterschied. Bei PE-Ratten oder PE-Ratten, die mit miR-NC, miR-18b-3p-Agomir, miR-18b-3p-Antagomir, miR-18b-3p-Antagomir + si-LEP, si-NC oder si-LEP, SBP und 24-h . behandelt wurden Die Proteinurie begann am 13. Trächtigkeitstag zuzunehmen. Bei PE-Ratten, die mit miR-18b-3p-Agomir und si-LEP behandelt wurden, gab es keinen deutlichen Unterschied zwischen SBP und 24-h-Proteinurie an Tag 16 und Tag 19 der Trächtigkeit. PE-Ratten hatten am Tag 19 der Trächtigkeit einen erhöhten SBP und eine 24-Stunden-Proteinurie; dieser Anstieg wurde durch die Erhöhung von miR-18b-3p verringert, aber durch die Hemmung von miR-18b-3p weiter verstärkt; Die LEP-Reduktion hob die Rolle der miR-18b-3p-Herunterregulierung beim SBP und der 24-Stunden-Proteinurie am 19. Trächtigkeitstag bei PE-Ratten auf (Abb. 2a, b).

Die Wiederherstellung von miR-18b-3p lindert pathologische Eigenschaften von PE-Ratten. a Ergebnisse von SBP bei Ratten. b Ergebnisse der 24-h-Proteinurie bei Ratten. c Gewichtsveränderungen fetaler Ratten. d Veränderungen des Plazentagewichts bei Ratten. e Veränderungen von Entzündungsfaktoren im Serum wurden mittels ELISA nachgewiesen. n = 10, *p < 0,05 gegenüber der Normalgruppe. ^p < 0,05 gegenüber der PE + miR-NC-Gruppe. ^@ p < 0,05 gegenüber der PE + miR-18b-3p-Antagomir-Gruppe. ^& p < 0,05 gegenüber der PE + si-NC-Gruppe. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung dargestellt, und Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet

Das Gewicht der fötalen Ratte und der Plazenta verringerte sich bei den PE-Ratten; hochreguliertes miR-18b-3p oder herunterreguliertes LEP erhöht, während herunterreguliertes miR-18b-3p das Gewicht der fötalen Ratte und der Plazenta bei PE-Ratten verringert; LEP-Silencing kehrte die Wirkung der miR-18b-3p-Hemmung auf das Gewicht der fötalen Ratte und der Plazenta bei PE-Ratten um (Abb. 2c, d).

Im Serum von PE-Ratten wurden Entzündungsfaktoren nachgewiesen. Es wurde gefunden, dass die TNF-&agr;-, IL-1&bgr;- und IL-6-Gehalte in den PE-Ratten erhöht waren; miR-18b-3p-Erhöhung oder LEP-Hemmung unterdrückt, während miR-18b-3p-Verringerung den Gehalt an TNF-&agr;, IL-1&bgr; und IL-6 förderte; die Wirkung von inhibiertem miR-18b-3p auf die TNF-α-, IL-1β- und IL-6-Gehalte wurde durch LEP-Verarmung aufgehoben (Abb. 2e).

Überexprimiertes miR-18b-3p verbessert die histopathologische Veränderung des Plazentagewebes von PE-Ratten

Bei normalen Ratten war die Plazentazotte reich an Blutgefäßen und hatte eine klare Struktur, Syncytiotrophoblasten waren die Haupttrophoblasten in Plazentazotten, und es gab weniger Zytotrophoblasten. Bei PE-Ratten oder PE-Ratten, die mit miR-NC, miR-18b-3p-Antagomir, si-NC oder miR-18b-3p-Antagomir + si-LEP behandelt wurden, nahm die Anzahl der Plazentazotten ab, die Struktur war verschwommen und atrophiert, einige Zotten wurden fibrinoide Nekrose durchgeführt, und die Anzahl der Syncytiotrophoblasten-Knötchen in den Plazentazotten nahm zu, und die meisten der Zotten waren unreif. Bei PE-Ratten, die mit miR-18b-3p-Agomir und si-LEP behandelt wurden, wurde die Anzahl der Trophäen reduziert und die pathologischen Veränderungen wurden gelindert (Abb. 3a).

Überexprimiertes miR-18b-3p verbessert pathologische Veränderungen und unterdrückt apoptotische Zellen von Plazentagewebe bei PE-Ratten. a Die HE-Färbung wurde verwendet, um pathologische Merkmale von Plazentagewebe zu testen. b Die TUNEL-Färbung wurde implementiert, um apoptotische Zellen von Plazentagewebe in PE-Ratten zu bestimmen. c Die Zellapoptoserate wurde durch TUNEL-Färbung nachgewiesen. n = 10, *p < 0,05 gegenüber der Normalgruppe. ^p < 0,05 gegenüber der miR-NC-Gruppe. ^@ p <  0,05 gegenüber der miR-18b-3p-Antagomir-Gruppe. ^& p < 0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung dargestellt, und Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet

Die TUNEL-Färbung deutete darauf hin, dass eine kleine Anzahl apoptotischer Zellen zu sehen war. PE-Ratten wiesen vermehrt apoptotische Zellen auf, die durch miR-18b-3p-Erhöhung und LEP-Silencing reduziert und durch miR-18b-3p-Hemmung weiter verstärkt wurden; LEP-Silencing kehrte auch die Wirkung der miR-18b-3p-Hemmung auf die Anzahl apoptotischer Zellen bei PE-Ratten um (Abb. 3b, c).

Zusammengenommen wiesen Ratten mit hochreguliertem miR-18b-3p oder gehemmter LEP einen geringeren Grad der PE-Progression in der Histologie auf, und eine stummgeschaltete LEP könnte die therapeutische Wirkung von gehemmtem miR-18b-3p aufheben.

miR-18b-3p ist herunterreguliert, während LEP in PE-Ratten-Plazentagewebe hochreguliert ist und miR-18b-3p auf LEP abzielt

Basierend auf den obigen Ergebnissen kehrte die LEP-Herunterregulierung die therapeutische Wirkung der Herunterregulierung von miR-18b-3p bei PE-Ratten in der Pathologie und Histologie um; Daher stellten wir die Hypothese auf, dass miR-18b-3p mit LEP in Verbindung stehen könnte.

Western-Blot-Assay und RT-qPCR zeigten, dass PE-Ratten miR-18b-3p verringert und LEP-Expressionsniveaus erhöht hatten; die Behandlung von miR-18b-3p-Agomir erhöhte miR-18b-3p und herunterregulierte LEP bei PE-Ratten, während die Behandlung von miR-18b-3p-Antagomir die LEP-Expression erhöhte; LEP-Silencing kehrte die fördernde Wirkung der miR-18b-3p-Reduktion auf die LEP-Expression bei PE-Ratten um (Abb. 4a–c).

In Plazentageweben von PE-Ratten wird miR-18b-3p herunterreguliert und LEP hochreguliert. a Die Expression von miR-18b-3p- und LEP-mRNA in Plazentagewebe wurde mittels RT-qPCR nachgewiesen. b Proteinbande von LEP in Plazentagewebe. c Western-Blot-Assay wurde durchgeführt, um die LEP-Proteinexpression in Plazentagewebe nachzuweisen. d Die Expression von miR-18b-3p- und LEP-mRNA in Plazentagewebe nach Exosomenbehandlung wurde mittels RT-qPCR nachgewiesen. e Proteinbande der LEP in Plazentagewebe nach Exosomenbehandlung. f Western-Blot-Assay wurde durchgeführt, um die LEP-Proteinexpression nach Exosomenbehandlung nachzuweisen. g Die Bindungsstellen von miR-18b-3p und LEP werden von einer Online-Software vorhergesagt. h Die Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP wurde durch einen Dual-Luciferase-Reportergen-Assay bestätigt. ich Targeting-Beziehung zwischen miR-18b-3p und LEP, verifiziert durch RNA-Pull-Down-Assay. n = 10, *p < 0,05 gegenüber der Normalgruppe. ^p < 0,05 gegenüber der miR-NC-Gruppe. ^@ p <  0,05 gegenüber der miR-18b-3p-Antagomir-Gruppe. ^& p < 0,05 gegenüber der si-NC-Gruppe. ^# p < 0,05 gegenüber der PE-Gruppe. ^$ p < 0.05 gegenüber der PE + Exos-Antagomir-NC-Gruppe. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± ± Standardabweichung dargestellt, und Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden durch eine einfache ANOVA gefolgt von Tukeys Test bewertet

Western-Blot-Assay und RT-qPCR wurden verwendet, um die Rolle von Exosomen bei PE-Ratten zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass Exosomen bei PE-Ratten miR-18b-3p hochregulierten und LEP herunterregulierten, was auf die unterdrückende Wirkung von Exosomen auf die PE-Entwicklung hindeutet. Darüber hinaus induzierten Exosomen, die miR-18b-3p-Antagomir transportierten, eine miR-18b-3p-Herunterregulierung und eine LEP-Hochregulierung bei PE-Ratten (Abb. 4d–f).

Die Zielbeziehung zwischen miR-18b-3p und LEP wurde von der bioinformatischen Online-Vorhersagesoftware https://cm.jefferson.edu/ vorhergesagt (Abb. 4g). Der Dual-Luciferase-Reportergen-Assay deutete darauf hin, dass miR-18b-3p-Mimetik die Luciferase-Aktivität von LEP 3′UTR-WT verringerte, während sie die von LEP 3′UTR-MUT nicht beeinflusste (Abb. 4h). Darüber hinaus zeigte der RNA-Pull-Down-Assay, dass die LEP-Anreicherung durch WT-biotinyliertes miR-18b-3p erhöht wurde (Abb. 4i). Diese Ergebnisse zeigten, dass LEP ein Zielgen von miR-18b-3p ist.

hucMSC-Exos schwächen pathologische Merkmale von PE-Ratten ab

Die Ergebnisse von SBP und 24 h zeigten, dass es in 5 Gruppen vor der Verabreichung (10. Trächtigkeitstag) keinen signifikanten Unterschied zwischen SBP und 24-h-Proteinurie gab. SBP und 24-h-Proteinurie am 19. Trächtigkeitstag zeigten bei normalen Ratten keinen deutlichen Unterschied. In PE rats, SBP and 24-h proteinuria began to raise at day 13 of gestation. There was no distinct difference of SBP and 24-h proteinuria in day 16 and day 19 of gestation in PE rats treated with hucMSC-Exos and hucMSC-Exos transmitting antagomir NC. SBP and 24-h proteinuria heightened in day 19 of gestation in the PE rats, while the increase was reduced by injection of hucMSC-Exos. Inhibiting miR-18b-3p reversed the effect of hucMSC-Exos on SBP and 24-h proteinuria in day 19 of gestation in PE rats (Fig. 5a, b).

hucMSC-Exos attenuate pathological characteristics of PE rats. a Results of SBP in rats after exosome treatment. b Results of 24-h proteinuria in rats after exosome treatment. c Weight changes of fetal rats after exosome treatment. d Changes of placental weight in rats after exosome treatment. e Changes of inflammation factors after exosome treatment in serum were determined using ELISA. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

The weight of fetal rat and placenta was measured, and we found that the PE rats had decreased weight of fetal rat and placenta; miR-18b-3p downregulation abolished the role of hucMSC-Exos in the weight of fetal rat and placenta in PE rats (Fig. 5c, d).

Inflammatory factors in serum were detected using ELISA. TNF-α, IL-1β and IL-6 contents remarkably increased in PE rats. Exosomes treatment decreased TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum of PE rats, which were enhanced by injection of exosomes inhibiting miR-18b-3p (Fig. 5e).

Exosomes Alleviates Pathological Change and Inhibit Apoptosis of Placenta Tissues of PE Rats

In normal rats, the placental villus was abundant in blood vessels with a clear structure, syncytiotrophoblasts were the main trophoblast in placental villi, and there were fewer cytotrophoblasts. In the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, the number of placental villi reduced, the structure was blurred and atrophied, some villi were presented fibrinoid necrosis, and the number of syncytiotrophoblast nodules in placental villi enhanced, and most of the villi were immature. The pathological change was improved in the PE rats treated with hucMSC-Exos or hucMSC-Exos-antagomir NC versus the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).

Exosomes alleviate pathological change and decrease apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. a HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

TUNEL staining indicated that in normal rats, a small number of apoptotic cells could be seen. PE rats had enhanced apoptotic cells, and reduced miR-18b-3p reversed the impacts of hucMSC-Exos on the number of apoptotic cells in placenta tissues from PE rats (Fig. 6b, c).

Discussion

PE is a multisystem pregnancy disorder characterized by proteinuria and either high blood pressure or other adverse conditions and is linked to a wide range of maternal endothelial dysfunction [20]. It was reported that hucMSC-Exo improved the morphology of placental tissue in PE rats through suppressing cell apoptosis and facilitating angiogenesis in placental tissue in a dose-dependent manner [8]. A study has reported that miR-18b expression affected cell migration, viability and invasion in PE [12]. Moreover, it was verified increased maternal LEP concentration and hypomethylation of the LEP in placenta in early onset PE [21]. The current study was designed to explore the effect of exosomes and miR-18b-3p targeted LEP on the occurrence of PE. The findings in this study revealed that hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p inhibited PE progression by reducing LEP.

Based on our findings, miR-18b-3p reduced and LEP elevated in placenta tissues of PE rats. Similar to our study, the mRNA expression of miR-18b was markedly suppressed in PE placental tissues relative to that in normal placental tissues [12]. In addition, a study revealed that miR-18b content was dramatically reduced in malignant melanoma tissues in comparison with their matched adjacent non-tumor tissues [22]. Another study has verified that placental LEP expression was raised in preterm PE compared with controls [23]. Moreover, a study showed that LEP expression was obviously heightened in preeclamptic placentas [15]. This literature provided a theoretical basis for us to explore the abnormal expression of miR-18b-3p and LEP in PE. Moreover, it was predicted using a bioinformatic software that LEP was targeted by miR-18b-3p, and this targeting relationship was further confirmed with dual-luciferase reporter gene assay in our research. A study reported that LEP is a target for all three miRNAs (miR-1301, miR-223 and miR-224) in early-onset PE [16]. Another study has displayed that LEP decreased miR-93 expression in osteoarthritis and rheumatoid arthritis [24]. However, the binding between miR-18b-3p and LEP in human diseases, especially in PE, remains scarcely studied, which is the novelty of this study. Furthermore, a result emerging from our study reported that exosomes increased miR-18b-3p and decreased LEP in placenta tissues of PE. It was formerly documented that the expression of miR-18b-5p was notably raised in colorectal cancer plasma exosomes [25], while the relationship between hucMSC-Exos and miR-18b-3p/LEP in PE needs further study.

Additionally, the finding from our investigation showed that restored miR-18b-3p reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. These data indicated that miR-18b-3p elevation contributes to alleviating the symptoms and pathological changes in PE. It was demonstrated that stable upregulation of miR-18b produced effective tumor inhibitor activity, such as inhibiting melanoma cell viability, inducing apoptosis and reducing tumor growth in vivo [26]. Another result in our study was that hucMSC-Exos reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. The findings of the current study revealed that exosomes treated PE rat models presented an increase of the number and quality of fetuses, the quality of placenta, but cell apoptosis was significantly reduced [8]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the addition of fetal bovine exosomes declined contents of macrophage TNF-α and IL-6 [27]. A study has revealed that purified exosomes suppressed production of IL-1β in lipopolysaccharide/nigericin-stimulated macrophages [28]. Furthermore, Nong et al. have suggested that inflammatory markers, such as TNF-α and IL-6, were dramatically decreased after administration of exosomes produced through human-induced pluripotent stem cell-derived MSCs [29]. There is a article finding that the SBP was markedly elevated in the group of women who later developed PE [30, 31]. It was displayed that PE patients were positively associated with SBP and diastolic blood pressures and proteinuria [32]. Also, a recent study has provided a proof that proteinuria heightened with advancing gestation in PE women [33]. A important finding was that rats from the PE group had increased TNF-α relative to the normal pregnant group [34]. Another study has verified that serum IL-6 and IL-1β were obviously elevated in women with PE in relation to controls [35]. The above findings suggested that PE patients usually showed high SBP, proteinuria and levels of inflammatory factors. Thus, it could be inferred from our results that the hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p had a therapeutic effect on PE.

Conclusion

In conclusion, our study provides evidence that hucMSCs-derived exosomes upregulate miR-18b-3p, which targets LEP to suppress the contents of inflammatory factors and reduce cell apoptosis rate in PE rat placenta tissues, thereby inhibiting the occurrence of PE. Thus, exosomal miR-18b-3p may be a potential candidate for treatment of PE via targeting LEP. This research identified the role of hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p targeting LEP during PE development for the first time, which provided a novel insight for PE treatment. However, due to the limitation of known researches, the study needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend.