Kostengünstige grüne fluoreszierende Kohlenstoffpunkte: Verbesserte Bioimaging & gezielte Wirkstofffreisetzung

Zusammenfassung

Doxorubicin-beladene Kohlenstoffpunkte (DOX-CDs) wurden für Bioimaging und verbesserte intrazelluläre Wirkstofffreisetzung hergestellt. Die CDs wurden via hydrothermaler Methode unter Verwendung von Citrat und Harnstoff bei 200 °C für 1 Stunde synthetisiert. Anschließend wurde DOX erfolgreich über physikochemische Wechselwirkungen an den CDs konjugiert. Die DOX-CDs wiesen gute Kristallstruktur, bemerkenswerte wässrige Stabilität, exzellente Photolumineszenzeigenschaften und einen hohen Quantenausbeute von 93 % auf. Fluoreszenzbilder zeigten, dass DOX-CDs leicht von Krebszellen für Zellmarkierung aufgenommen werden konnten. Darüber hinaus wurde ein endo-lyosomaler pH-unterstützter DOX-Freisetzungsmechanismus von DOX-CDs beobachtet, und die Zytotoxizität von DOX-CDs wurde durch MTS-Test an HO-8910 Eierstockkrebszellen bestätigt. Zusätzlich zeigten die CDs helle Fluoreszenzsignale im Tierimaging-Test und demonstrierten geringe Toxizität nach Verabreichung über 7 und 21 Tage. Daher könnten die hergestellten CDs ein vielversprechender Imaging-Sonde für biomedizinisches Imaging und intrazelluläre Wirkstofffreisetzung sein.

Einleitung

Doxorubicin (DOX) ist ein Anthrazyklin-Chemotherapeutikum, das breit in der Behandlung verschiedener Krebsarten einschließlich Brust-, Lungen-, Magen-, Eierstock-, Schilddrüsenkrebs, multiplem Myelom, Sarkom und pädiatrischen Krebserkrankungen eingesetzt wird. Der antikrebs-Wirkmechanismus von DOX wird als Störung der DNA-Synthese und -Reparatur betrachtet. Daher muss DOX die Zellmembran überwinden und in den Zellkern gelangen, um die DNA-Synthese während der Krebstherapie zu stören. Freies DOX kann jedoch den Zellkern nicht leicht erreichen und würde schwere in-vivo-Kardiotoxizität induzieren, was seine Anwendung als Krebstherapie behindert [1, 2].

In jüngster Zeit haben multifunktionale Nanoträger wie Liposomen, Mizellen, Nanoemulsionen, polymerische Nanopartikel und andere Nanopartikel enorme Aufmerksamkeit für ihre Bedeutung in der antikrebs-Wirkstofffreisetzung erregt [3]. Unter ihnen hat als neue Art der Quantenpunkt-Familie der Kohlenstoffquantenpunkt (CD) seit seiner Entdeckung 2004 weltweit enormes Interesse geweckt [4]. Insbesondere fluoreszierende CDs sind aufgrund ihrer überlegenen Eigenschaften in quasi-null Gewicht und Größe (< 10 nm), hoher Photostabilität, breiter und kontinuierlicher Anregungsspektren, einstellbarer Wellenlänge, zufriedenstellender Biokompatibilität, geringer Toxizität und exzellenter Fluoreszenzleistung in Zellimaging², Photokatalyse, Wirkstofffreisetzung, Schadstoff- und Schwermetallionendetektion sowie fotoelektrischen Geräten zur Präferenz geworden [5–14]. Zum Beispiel haben Yang et al. DOX erfolgreich an CDs gekoppelt für verbesserte antikrebs Behandlung, was impliziert, dass CDs große Bedeutung für kernzielgerichtete Wirkstofffreisetzung haben [1].

Zuvor wurden verschiedene Techniken zur Herstellung von CDs vorgeschlagen, einschließlich zahlreicher Biomasse-Materialien, Karbonisierung, Passivierung und Oberflächenfunktionalisierung [14, 15]. Im Detail lassen sich zwei Hauptmethoden klassifizieren. Eine ist der „Top-down“-Ansatz: Lichtbogenentladung, Laserablation, elektrochemisches Ätzen und Oxidationsmethode, was das Zerbrechen großer Kohlenstoffstrukturen in Kohlenstoffnanopartikel bezeichnet [16–20]. Die andere Methode ist der „Bottom-up“-Ansatz, der Kohlenstoffpunkte aus molekularen Vorstufen synthetisiert, hauptsächlich einschließlich hydrothermalem Ansatz, Ultraschallmethode und wellenunterstützter Synthese [21–24]. Xu et al. erhielten Kohlenstoffpunkte durch Lichtbogenentladung, Oxidation, Extraktion und Gelelektrophorese. Ming et al. gewannen Kohlenstoffpunkte durch Elektrolyse. Yang et al. optimierten die ursprüngliche hydrothermale Methode zur Synthese von Kohlenstoffpunkten mit unterschiedlichen Fluoreszenzen [21]. Allerdings sind diese Methoden aufgrund ihres komplizierten Syntheseprozesses, zeitaufwendiger Verfahren, strenger Fertigungsanforderungen und teurer Rohstoffe limitiert [25]. Zudem kann die Verwendung organischer Lösungsmittel als Passivierungsmittel die Toxizität von CDs erhöhen [26]. Außerdem emittierten die meisten berichteten CDs blaue Fluoreszenz unter UV-Lichtanregung, was ihr Potenzial im Bereich biomedizinisches Imaging stark behinderte, zugeschrieben der starken Gewebeautofluoreszenz-Interferenz.

Hier synthetisierten wir grüne fluoreszierende CDs via einer grünen und effizienten einstufigen kontrollierten thermischen Pyrolyse von Natriumcitrat-Dihydrat und Harnstoff. DOX wurde nicht-kovalent auf der Oberfläche der hergestellten CDs für Wirkstofffreisetzung durch hydrophobe Wechselwirkung, elektrostatische Wechselwirkung sowie π-π-Stapelwechselwirkung konjugiert [27–29]. Die Morphologie und Struktur der CDs wurden durch Transmissionelektronenmikroskopie (TEM) und Röntgenbeugungsanalyse untersucht. Die optischen Eigenschaften wurden durch UV-Vis-Spektrometer und Photolumineszenz (PL) Emissionsspektren bewertet. Die nachhaltige Wirkstofffreisetzung wurde durch Dialysemethode durchgeführt. Die zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Verteilung von DOX-CDs wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Der antikrebs-Effekt von DOX-CDs wurde durch standardisierten MTS-Test bewertet. Das in-vivo-Imaging der CDs wurde an Balb/c-Nacktmäusen durchgeführt. Schließlich wurde die Langzeittoxizität der CDs durch histologische Analyse untersucht. Daher wären die hergestellten CDs ein potenzielles Agens für in-vivo-Imaging und gezielte Wirkstofffreisetzung.

Materialien und Methoden

Materialien

Natriumcitrat-Dihydrat, Harnstoff, L-Arginin, Ethylendiamin-Aceton, Chininsulfat, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Essigsäure, Dinatriumhydrogenphosphat und Paraformaldehyd wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai, China) bezogen. MTS Zellproliferations-Farbmess-Assay-Kit (MTS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM/hoher Glucose), Penicillin-Streptomycin-Lösung und Trypsin-EDTA-Lösung wurden von Beyotime Biotechnology Co. Ltd (Shanghai, China) gekauft. Fetales Rinderserum (FBS) wurde von Tianhang Biotechnology Co. Ltd (Hangzhou, China) bezogen. HO-8910 Eierstockkrebszellen und EA.hy926 menschliche Nabelschnur-Endothelzellen wurden vom Shanghai Institute of Nutrition and Health, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) erhalten. Doxorubicin-Hydrochlorid (DOX) wurde von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) gekauft. Dialysetaschen (MWCO = 1000 Da) wurden von SpectrumLabs (Los Angeles, CA, USA) bezogen.

Synthese von CDs und DOX-CDs

Kurz gesagt, Natriumcitrat-Dihydrat (0,2 mmol) und Harnstoff (5 mmol) wurden zunächst in 1 ml DI-Wasser gelöst. Dann wurde das Gemisch in ein Glasgefäß überführt und bei 200 °C für 1 Stunde karbonisiert. Anschließend wurden 1 ml DI-Wasser und Aceton (v/v, 1/3) zugegeben und 10 Minuten bei 10000 rpm für drei Mal zentrifugiert.

DOX wurde durch nicht-kovalente Wechselwirkung an den CDs konjugiert. Kurz gesagt, DOX·HCl (0,5 mg) wurde zu 5 ml CDs (5 mg/ml) gegeben und 48 Stunden im Dunkeln gerührt. Die resultierende Lösung wurde 24 Stunden gegen DI-Wasser in einer Dialysetasche (MWCO = 1000 Da) dialysiert, um DOX-CDs zu erhalten. Schließlich wurden die DOX-CDs gefriertrocknet und bei 4 °C gelagert.

Charakterisierung von CDs und DOX-CDs

Die Größenmorphologie der CDs wurde durch Transmissionelektronenmikroskopie (TEM, FEI Tecnai G2 Spirit) charakterisiert. PL-Emissionsmessungen wurden an einem LS55 Fluoreszenzspektrophotometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Der Quantenausbeute (QY) der CDs wurde mittels Chininsulfatlösung in H₂SO₄ als Referenz bestimmt. Die Kristallstruktur wurde mit einem Bruker Tensor27 Fourier-Transform-Infrarotspektrophotometer (Pike Corporation, Madison, Wisconsin) beobachtet. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde mit einem ESCALAB250Xi-Spektrometer (Thermo, USA) durchgeführt. Zetapotential wurde mit einem Zetapotentiometer (Malvern Panalytical, Malvern, UK) gemessen.

In-vitro-Wirkstofffreisetzungsstudie

Die in-vitro-Wirkstofffreisetzung von DOX aus DOX-CDs wurde mittels Dialysetasche untersucht. Kurz gesagt, DOX-CDs wurden in die Dialysetasche geladen und in PBS (pH 7,4 und 5,0) eingetaucht, dann in einem Schüttelinkubator (37 °C, 100 rpm) platziert. Zu vorgegebenen Zeitpunkten wurden 0,5-ml-Proben entnommen und durch gleiches Volumen PBS ersetzt. Das freigesetzte DOX wurde durch Fluoreszenzintensität bei 590 nm aufgezeichnet.

In-vitro-Zytotoxizitätstest

Die Zellzytotoxizität von DOX-CDs wurde durch MTS-Test an HO-8910 Eierstockkrebszellen und EA.hy926 Nabelschnur-Endothelzellen bestimmt [30, 31]. Kurz gesagt, Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Konzentration von 0,5 × 10⁵ Zellen/ml ausgesät, 24 Stunden gehalten, um Zelladhäsion zu ermöglichen. Dann wurden DOX-CDs in verschiedenen Konzentrationen in jedes Well gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation wurde das Medium aspiriert, und 90 µl Medium und 10 µl MTS wurden zu jedem Well gegeben. Nach 4 Stunden wurde die Absorption bei 490 nm mit einem Mikroplattenleser (BioTek Epoch, Service Card) gemessen. Die Zellviabilitäten wurden als Prozentsatz überlebender Zellen ausgedrückt und als Mittelwerte von Tripel-Messungen berichtet.

In-vitro-Zellimaging-Studie

HO-8910 Eierstockkrebszellen wurden auf 6-Well-Platten inkubiert und 24 Stunden bei 37 °C für Zelladhäsion inkubiert. Dann wurden die Zellen mit DOX-CDs inkubiert, um zelluläre Aufnahme zu ermöglichen. Nach 4-stündiger Inkubation wurde das Medium entfernt, Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert. Schließlich wurden Morphologie und Fluoreszenzverteilung der Zellen durch ein Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Deutschland) visualisiert.

In-vivo-Imaging

Tierversuche wurden vom Tierschutzkomitee der Xuzhou Medical University genehmigt [32]. Balb/c-Nacktmäuse wurden verwendet, um das Potenzial von CDs in fluoreszierendem Imaging zu bewerten. Kurz gesagt, Balb/c-Nacktmäuse wurden subkutan mit CDs wässriger Lösung (50 µl, 6 mg/ml) an der Injektionsstelle nach intraperitonealer Injektion von 2% Pentobarbital zur Anästhesie injiziert. Darüber hinaus wurde die Biodistribution der CDs im Mäuse-Körper durch Injektion der CDs (5 mg/kg) über den Schwanzvene untersucht. Verschiedene Organe (Herz, Niere, Milz, Leber, Blase) wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für Fluoreszenzbewertungen entnommen. Das Tier-Fluoreszenz-Imaging wurde auf einem Tanon-5200Multi Gel Imaging System aufgenommen, und die Belichtungszeit betrug 1,0 s für alle Fluoreszenzbilder.

In-vivo-Toxizitätsstudie

Kunming-Mäuse (weiblich, 7 Wochen) wurden verwendet, um die in-vivo-Langzeittoxizität von CDs zu untersuchen. Kunming-Mäuse wurden zufällig in 2 Gruppen aufgeteilt: CDs und Kontrollgruppe. Die Mäuse wurden mit PBS und CDs über die Schwanzvene (6 mg/kg) injiziert. Dann wurden die Hauptorgane einschließlich Herz, Lunge, Niere, Leber und Milz nach 7 und 21 Tagen nach Injektion entnommen. Anschließend wurden die Organe mit 4% Paraformaldehyd fixiert, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Schließlich wurden die histologischen Schnitte unter einem optischen Mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Hessen, Deutschland) beobachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von CDs und DOX-CDs

CDs wurden durch Ein-Schritt-Strategie mit Natriumcitrat-Dihydrat und Harnstoff (Natriumcitrat-Dihydrat/Harnstoff = 1/25) bei 200 °C für 1 Stunde hergestellt. DOX wurde kovalent auf der Oberfläche der hergestellten CDs für Wirkstofffreisetzung konjugiert (Schema 1). Wie im TEM-Bild (Abb. 1a) gezeigt, wiesen die CDs eine gleichmäßige kugelförmige Morphologie mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 2,75 nm und relativ enger Größenverteilung auf. Zusätzlich konnte die Kristallstruktur der CDs durch das hochaufgelöste TEM-Bild (Abb. 1a Inset) beobachtet werden, was gut kristallin mit bemerkenswerten Gitterstreifen anzeigte.

Die chemische Struktur der CDs wurde durch FTIR-Spektroskopie charakterisiert. Wie in Abb. 1d gezeigt, wurden die scharfen Peaks bei 3499 cm⁻¹ und 1729 cm⁻¹ jeweils –OH und –COOH zugewiesen, während jene bei 780 cm⁻¹ und 1372 cm⁻¹ auf N–H zurückgeführt werden konnten. Es kann geschlossen werden, dass sowohl Carboxyl- als auch Aminogruppen als Funktionsgruppen auf der Oberfläche der Kohlenstoffpunkte existieren und biologische Makromoleküle mit spezifischen Funktionen modifizieren, was die Möglichkeit für weitere Anwendungsforschung der Kohlenstoffpunkte bietet.

Des Weiteren wurden die optischen Eigenschaften der CDs mittels UV-Vis-Absorption und PL-Spektroskopie untersucht. Wie in Abb. 1c gezeigt, wiesen die CDs einen Absorptionspeak bei 410 nm auf, und DOX zeigte einen Absorptionspeak bei 500 nm. Dagegen behielten die DOX-CDs die Absorptionspeaks von CDs und DOX bei 410 nm bzw. 500 nm bei, was die erfolgreiche Konjugation von DOX auf CDs anzeigte. Zudem zeigte die DOX-CDs-wässrige Lösung im Inset-Bild von Abb. 1c unter Natürlicht hellgelb und transparent und unter UV-Anregung hellgrün. Der Fluoreszenz-Quantenausbeute wurde mit Chininsulfat als Referenz (QY = 54 %) auf 93 % berechnet. Als CDs bei Wellenlängen von 340 bis 440 nm angeregt wurden, zeigte der PL-Peak nahezu keine Verschiebung, was die anregungsunabhängigen Emissionseigenschaften der CDs anzeigte. Die maximale Anregungswellenlänge und der PL-Peak der CDs betragen 400 bzw. 525 nm. Das anregungsunabhängige PL-Verhalten kann von den einheitlichen Oberflächenzuständen der CDs resultieren [33].

Zusätzlich wurde die elementare Zusammensetzung der CDs durch XPS bestimmt. Wie in Abb. 1f demonstriert, hat das XPS-Spektrum bestimmt, dass die CDs hauptsächlich aus Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und Sauerstoff (O) bestehen und das entsprechende Atomverhältnis 78,39 %, 7,52 % und 14,1 % betrug. Drei typische Peaks von C₁s, N₁s und O₁s konnten bei 284,8, 399,5 und 532,6 eV beobachtet werden. Spezifisch zeigte das C₁s-Spektrum 3 Peaks bei 284,8, 286,7 und 288,3 eV, die das Vorhandensein von C–C, C–N, C–O oder C=O Bindungen darstellen (Abb. S1A). Das hochauflösende Spektrum für N₁s zeigte einen Peak bei 399,5 eV, der C–N zugewiesen wurde. Zudem bestätigte das O₁s-Spektrum das Vorhandensein von C=O und C–O Bindungen bei 531,9 bzw. 532,6 eV (Abb. S1B).

Die Fluoreszenzintensität der CDs zeigte wunderbare Stabilität sowohl bei 4 °C als auch bei Raumtemperatur (Abb. S2A). Der Rückgang der Fluoreszenzintensität bei 4 °C in 2 Wochen um weniger als 10 % kann vernachlässigt werden. Daher wird erwartet, dass die Kohlenstoffpunkte eine langfristige Stabilität besitzen, um als biomedizinischer Imaging-Agent verwendet zu werden.

Abb. S2B illustrierte, dass PL-Intensitäten der CDs in wässrigen Lösungen mit hohem (> 10) oder niedrigem (< 3) pH abnahmen. Dennoch war die PL-Intensität in einem pH 3–10 wässrigen Lösung stabil. Die hergestellten CDs, die in Biomarkierung und Bioimaging angewendet werden, müssen mit Zellen ko-inkubiert werden, wo der pH-Wert nahe neutral (pH = 6–8) liegt, was die PL-Stabilität garantiert. Theoretisch zeigte dies an, dass die hergestellten CDs Fluoreszenz mit hoher Stabilität in Zellen für Biomarkierung und Bioimaging emittieren können.

Um die fluoreszente Stabilität der CDs zu klären, wurde ein Fluoreszenz-Anti-Photobleaching-Test durchgeführt. Wie in Abb. S2C gezeigt, zeigten die Kohlenstoffpunkte im Vergleich zu Quantenpunkten (CdTe) und traditionellen Fluoreszenzfarbstoffen (DAPI) nicht nur höhere Fluoreszenzintensität, sondern auch ausgezeichnete Photobleaching-Resistenz. Außerdem waren die CDs auch gut in verschiedenen Lösungen wie DI-Wasser, PBS, FBS-Medium, DMEM-Medium und CM1-1-Medium dispergiert, was eine ausgezeichnete Stabilität im Blutsystem erwarten lässt (Abb. S3).

Die CDs wiesen einen Zetapotentialwert von –31,1 mV auf (Abb. S4), was auf das Vorhandensein von Sauerstoff- und Carboxylfunktionsgruppen auf der Oberfläche dieser Partikel zurückgeführt werden kann. Das potenziell positiv geladene DOX kann physikalisch an der Oberfläche der CDs über elektrostatische Wechselwirkung mit der Carboxylgruppe und hydrophobe Wechselwirkung adsorbiert werden. DOX-CDs zeigen einen Zetapotentialwert von –9,7 mV, was die Herstellung der DOX-CD-Komplexe bestätigt. Darüber hinaus enthalten die CDs ein sp²-Kohlenstoffnetzwerk, das die aromatische Struktur von DOX über starke π-π-Wechselwirkungen laden kann. Die optimale Einkapselungseffizienz und Wirkstoffbeladungseffizienz wurden durch verschiedene DOX-Konzentrationen untersucht. Wie in Abb. S5 demonstriert, wurde die maximale Einkapselungseffizienz als 50,82 % mit entsprechender Beladungseffizienz von 6,82 % bei 0,1 mg/ml DOX berechnet.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung von DOX-CDs

Die in-vitro-DOX-Freisetzung aus DOX-CDs wurde in PBS durchgeführt, um die pH-sensitive DOX-Freisetzung zu untersuchen. Dazu wurden DOX-CDs bei verschiedenen pH-Werten (pH 7,4, 6,0 und 5,0) inkubiert und die DOX-Freisetzung überwacht. Wie in Abb. 2 gezeigt, wiesen DOX-CDs anhaltende Freisetzungsprofile bei pH 7,4, 6,0 und 5,0 während der Ruheperiode auf. Die Ergebnisse zeigten, dass die DOX-Freisetzung pH-abhängig war. Nur 13 % DOX wurden innerhalb von 8 Stunden freigesetzt, als DOX-CDs bei pH 7,4 inkubiert wurden. Bei Absenkung des pH-Werts auf 6,0 oder 5,0 wurden jedoch mehr als 35 % bzw. 65 % DOX aus den DOX-CDs freigesetzt, was die Empfindlichkeit von DOX-CDs gegenüber niedrigem pH demonstrierte. Es zeigte sich, dass die Menge des freigesetzten DOX bei niedrigerem pH zunahm, was auf erhöhte Protonierung von –NH₂-Gruppen an DOX in saurer Umgebung zurückzuführen war. Daher können DOX-CDs die vorzeitige Leckage von DOX während der Blutkreislauf verhindern und die intrazelluläre Wirkstofffreisetzung verstärken. Dies ist von großem Nutzen für die effektive Krebsbehandlung.

In-vitro-Zytotoxizitätstest

Die Biokompatibilität ist kritisch für CDs für die Anwendung in biomedizinischem Imaging und Wirkstofffreisetzung. Die Zytotoxizität von CDs bei verschiedenen Konzentrationen wurde an HO-8910 Eierstockkrebszellen und EA.hy926 Nabelschnur-Endothelzellen durchgeführt. Wie in Abb. 3a dargestellt, wiesen sowohl HO-8910 als auch EA.hy926 Zellen hohe Viabilität über 85 % sogar bei hoher Konzentration von 5 mg/ml auf, was die ausgezeichnete Biokompatibilität und geringe Zytotoxizität der CDs anzeigte.

Bei Kopplung mit DOX zeigten DOX-CDs DOX-konzentrationsabhängige Zellviabilität gegen HO-8910 Eierstockkrebszellen. Wie in Abb. 3b gezeigt, war die Zellviabilität der DOX-CDs signifikant niedriger als die von DOX-freien CDs, besonders wenn die DOX-Konzentration über 0,05 mg/ml lag, was den ausgezeichneten antikrebs-Effekt von DOX-CDs anzeigte.

In-vitro-Zellaufnahme- und Markierungsstudie

Um die intrazelluläre Aufnahmefähigkeit von DOX-CDs zu bewerten, wurde zelluläres Imaging an HO-8910-Zellen untersucht. Wie in Abb. 4 illustriert, wurden lebendige grüne und rote Fluoreszenz innerhalb der Krebszellen beobachtet, attribuiert dem Vorhandensein von CDs bzw. DOX. Besonders intensiv war das grüne Fluoreszenzsignal hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert, was die intrazelluläre Verteilung der CDs anzeigte. Im Gegensatz dazu war das rote Signal im Zellkern signifikant stärker als im Zytoplasma, was darauf hindeutete, dass DOX sich von den CDs lösen und direkt in den Zellkern wandern könnte, attribuiert seiner hohen Affinität zur DNA. Dies könnte erklärt werden, dass der niedrige pH-Wert (5,0) in Endosom und Lysosom die DOX-Freisetzung aus DOX-CDs unterstützen könnte. Daher könnten DOX-CDs ein vielversprechendes Agens für Zellmarkierung und intrazelluläre Wirkstofffreisetzung sein.

In-vivo-Tierimaging-Studie

Eine Nacktmaus wurde subkutan mit CDs wässriger Lösung (50 µl, 6 mg/ml) appliziert. Die Maus wurde dann durch intraperitoneale Injektion von 1% Pentobarbital anästhesiert und mit einem Tanon-5200Multi Gel Imaging System unter 488 nm Anregungslicht und 535 nm Emissionsfilter abgebildet. Wie in Abb. 5a gezeigt, wurde starke grüne Fluoreszenz an der applizierten Stelle beobachtet, was implizierte, dass die CDs-Fluoreszenz effektiv Haut und Gewebe von Mäusen durchdringen konnte. Zudem blieb die Maus nach Injektionen gesund, was anzeigte, dass CDs ausgezeichnete Biokompatibilität und geringe Toxizität für Tiere aufwiesen. In Anbetracht aller Ergebnisse waren CDs als herausragende Lumineszenz-Sonde für Bioimaging in vitro und in vivo fähig.

Des Weiteren wurden Biodistribution und Ausscheidungspfad der CDs durch Injektion des Nanoprobens über die Schwanzvene durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 0,5, 1, 3 h) wurden verschiedene Organe für Fluoreszenz-Imaging disseziert. Wie in Abb. 5b gezeigt, zeigten Niere und Blase viel stärkere Fluoreszenzsignale im Vergleich zu anderen Organen einschließlich Herz, Milz und Leber nach Injektion. Zusätzlich stieg das Fluoreszenzsignal in der Niere innerhalb von 0,5 h post-Injektion signifikant an und nahm nach 1 h allmählich ab. Dann stieg das Fluoreszenzsignal in der Blase allmählich von 0,5 h bis 1 h an, was anzeigte, dass die CDs von der Niere in die Blase transportiert wurden. Das Ergebnis zeigte, dass die CDs über das Nieren-Blasen-System ausgeschieden und gecleart werden konnten.

In-vivo-Langzeittoxizitätstest

Zusätzlich wurde eine in-vivo-Langzeittoxizitätsstudie durchgeführt, um das Potenzial der Verwendung von CDs in klinischer Forschung vollständig zu untersuchen. Kunming-Mäuse wurden über die Schwanzvene mit PBS und CDs injiziert, und Hauptorgane (Herz, Lunge, Niere, Leber, Milz) wurden nach 7 und 21 Tagen für histologische Analyse entnommen. Anschließend wurden histologische Gewebebilder mit einem Mikroskop abgebildet, um pathologische Unterschiede zwischen Experimentalgruppen und Kontrollgruppe zu bewerten. Wie in Abb. 6 gezeigt, wurden keine bemerkenswerten Organschäden und entzündlichen Läsionen in den Hauptorganen der CDs-applizierten Tiere beobachtet, was darauf hindeutete, dass die hergestellten CDs für klinische Verwendung und in-vivo-Studien sicher waren. Daher waren die synthetisierten grünen CDs als Biomarker und Bioimaging-Sonde biokompatibel.

Fazit

Zusammenfassend hat diese Arbeit eine kosteneffiziente Herstellung grüner fluoreszierender CDs mit hohem QY von 93 % für Bioimaging und verbesserte intrazelluläre Wirkstofffreisetzung demonstriert. DOX wurde erfolgreich an CDs konjugiert, um DOX-CDs mit guter Kristallstruktur, bemerkenswerter wässriger Stabilität und exzellenter Photolumineszenzeigenschaft zu bilden. DOX-CDs konnten auf intrazelluläre pH-Umgebungen reagieren, um säuregetriggerte intrazelluläre Freisetzung zu fördern. Attribuiert der pH-Sensitivität zeigten DOX-CDs effektive Inhibition der Proliferation von HO-8910-Zellen. DOX-CDs wiesen ausgezeichnete Zellmarkierungsfähigkeit auf und reagierten auf endo-/lysosomalen pH, um DOX innerhalb der Zellen freizusetzen. CDs fungierten als fluoreszierende Sonden sowohl in vitro als auch in vivo. Schließlich wurde kein bemerkenswerter toxischer Effekt von den CD-behandelten Mäusen durch histologische Analyse beobachtet. Dennoch demonstrierte die Arbeit, dass CDs, hergestellt durch die kosteneffiziente Methode, großes Potenzial in biomedizinischem Imaging und intrazellulärer Wirkstofffreisetzung haben könnten.