Exosomales miR-326 aus M1-Makrophagen unterdrückt hepatozelluläres Karzinom durch Modulation der NF-κB-Signalgebung

Zusammenfassung

Zunehmende Evidenzen zeigen, dass microRNAs (miRs), die aus M1-Makrophagen-exosomen stammen, das Fortschreiten des hepatozellulären Karzinoms (HCC) regulieren können. Der Effekt von exosomalem miR-326 aus M1-Makrophagen auf HCC wurde jedoch bisher nicht berichtet. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, den Mechanismus von exosomalem miR-326 aus M1-Makrophagen bei der Regulation des HCC-Zellfortschreitens zu untersuchen. RT-qPCR detektierte die miR-326-Expression in HCC-Zelllinien. Die miR-326-Expression in HCC wurde durch Transfektion verändert, und der Effekt von miR-326 auf CD206- und NF-κB-Expression, Zellproliferation, Koloniebildung, Migration, Apoptose und Invasion wurde untersucht. Anschließend wurden Exosome aus M1-Makrophagen isoliert. RT-qPCR identifizierte die miR-326-Expression in M1-Makrophagen-exosomen. Die miR-326-Expression in M1-Makrophagen-exosomen wurde durch Transfektion verändert. M1-Makrophagen-exosome wurden mit HCC-Zellen ko-kultiviert, um ihre Auswirkungen auf den biologischen Fortschritt der HCC-Zellen zu bestimmen. Schließlich wurden In-vivo-Experimente durchgeführt, um die In-vitro-Ergebnisse zu verifizieren. miR-326 war in HCC-Zellen erniedrigt und in M1-Makrophagen-exosomen angereichert. Die Hochregulation von miR-326 hemmte HCC-Zellproliferation, Koloniebildung, Migration, Invasion sowie CD206- und NF-κB-Expression und förderte Apoptose und hemmte das Wachstum von HCC-Tumoren in vivo, während die Herunterregulation von miR-326 gegenteilige Effekte zeigte. M1-Makrophagen-exosome hemmten HCC-Zellproliferation, Koloniebildung, Migration, Invasion sowie CD206- und NF-κB-Expression und verstärkten Apoptose, während die Überexpression von miR-326 den Effekt von M1-Makrophagen-exosomen auf HCC-Zellen verstärkte. Es zeigt sich, dass M1-Makrophagen-exosomales miR-326 Proliferation, Migration und Invasion von HCC unterdrückt und Apoptose fördert, indem es die NF-κB-Expression herunterreguliert.

Einleitung

Hepatozelluläres Karzinom (HCC) ist weltweit der fünfthäufigste Krebs und der häufigste primäre Leberkrebs [1]. Laut Daten des China National Cancer Registry steht die Sterblichkeitsrate von primärem Leberkrebs an dritter Stelle, während die Inzidenz an vierter Stelle unter den häufigen Malignomen steht [2]. Haupt-Risikofaktoren für HCC sind chronische Infektionen mit Hepatitis-C- und Hepatitis-B-Virus, aflatoxinkontaminierte Lebensmittel, Adipositas, Rauchen, starker Alkoholkonsum und Typ-2-Diabetes [3]. Transarterielle Chemoembolisation ist eine etablierte Behandlung für HCC im intermediären Stadium, die das Überleben der meisten HCC-Patienten in intermediären oder fortgeschrittenen Stadien verbessert [4]. Derzeit hängt die Diagnose von HCC hauptsächlich von Serum-Biomarkern und Bildgebungstechniken ab [5]. Die HCC-bedingte 5-Jahres-Überlebensrate beträgt nur etwa 60 %, und die Inzidenz steigt in den letzten Jahren stetig an [6]. Angesichts dessen ist die Suche nach präzisen therapeutischen Zielen bei der HCC-Behandlung prioritär.

Makrophagen sind Effektorzellen und Hauptregulatoren des Immunsystems, üben enorme Funktionen bei Gewebsumbau und -reparatur aus und orchestrieren metabolische Funktionen in nahezu allen Geweben in vivo [7]. Es wurde gezeigt, dass M1-Makrophagen tumorfördernde Effekte ausüben und die Motilität von HCC-Zellen erhöhen [8]. Exosome sind scheibenförmige Vesikel mit einem Durchmesser von 40–150 nm [9]. Laut Xu et al. haben exosomale microRNAs (miRNAs) Funktionen bei Proliferation, Invasivität, Metastasierung und Medikamentenresistenz von HCC durch Modulation der Genexpression in Zielzellen [10]. Eine Studie zeigte, dass miR-326-haltige Exosome ein potenzielles klinisches Target bei Multipler Sklerose sein könnten [11]. miRNAs können als Onkogene oder Tumorsuppressoren wirken, indem sie die Expression einer großen Anzahl protein-codierender Gene durch mRNA-Degradation und Translationsblockade in einer spezifischen Sequenz modulieren [12]. Eine Studie diskutierte, dass miR-326 HCC-Zellwachstum durch Störung der Zellzyklusprogression und Förderung der Apoptose unterdrückt und zudem Zellinvasion durch Verringerung des epithelial-mesenchymalen Übergangsphänotyps hemmt [13]. Eine andere Studie berichtete, dass miR-326 ein potenzielles therapeutisches Target für HCC-Patienten sein könnte [14]. Daher untersuchte die vorliegende Studie den Mechanismus von exosomalem miR-326 bei der Regulation der Invasion und Migration von HCC-Zellen.

Materialien und Methoden

Ethikstatement

Alle Tierversuche entsprachen dem Leitfaden für die Haltung und Verwendung von Labortieren durch internationale Komitees. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care Use Committee des Dritten Krankenhauses der Jilin-Universität genehmigt.

Induktion und Identifizierung von Makrophagen

Die menschliche monozytäre Zelllinie THP-1 (Kunming Institute of Zoology, CAS, Kunming, China) wurde in RPMI-1640-Medium (Gibco, CA, USA; Thermo Fisher Scientific, MA, USA) mit 10 % hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS) kultiviert. THP-1-Zellen wurden mit 150 ng/mL Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, USA) behandelt und 24 h in RPMI-Medium inkubiert, um M0-Makrophagen zu erhalten. Anschließend wurde die Zellmorphologie vor und nach Induktion durch Wright-Färbung beobachtet. THP-1-Zellen und induzierte Makrophagen wurden in 5 μL PBS resuspendiert, auf Objektträger gegeben, mit Wright-Färbelösung gefärbt und im Verhältnis 1:2 mit Pufferlösung gemischt. Nach 10 min Färbung und Spülung mit fließendem Wasser wurden die Zellen mikroskopisch beobachtet. Zusätzlich wurden M0-Makrophagen-Marker (CD68 und CD206) durch reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) gemessen. Anschließend wurden Makrophagen durch Inkubation mit 20 ng/mL Interferon (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, USA) und 10 pg/mL LPS (#8630; Sigma-Aldrich) für 18 h zu M1-Makrophagen induziert. M1-Makrophagen-Marker (IDO1 und IL-12 p35) wurden durch RT-qPCR untersucht [15].

Extraktion von Exosomen

Die Exosome wurden mit einem Exosomen-Trennkit (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland) extrahiert. Makrophagen-Überstand wurde unter aseptischen Bedingungen in ein 15-mL-Zentrifugenröhrchen gesammelt und durch 0,8-μM-Filter filtriert. Der Zellüberstand jeder Gruppe wurde mit XBP-Puffer (1:1) versetzt und anschließend mit ExoEasy-Membran-Affinitätszentrifugationssäule bei 500 g zentrifugiert. Den Zellen wurden 10 mL XWP-Puffer zugegeben und bei 3000–5000 g zentrifugiert. Die ExoEasy-Membran-Affinitätszentrifugationssäule wurde mit 400 μL XE-Elutionspuffer bebrütet und bei 500 g zentrifugiert. Der Elutionspuffer wurde in die ExoEasy-Membran-Affinitätszentrifugationssäule überführt und bei 500 g zentrifugiert. Der Elutionspuffer wurde 24 h bei 4 °C gelagert und anschließend zur Identifizierung verwendet. Der Rest wurde bei −80 °C gelagert.

TEM-Beobachtung und Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)

Die erhaltenen Exosome wurden auf kohlenstoffbeschichteten Kupfergittern aufgebracht und mit 2 % Phosphorwolfram-säure versetzt. Das Präparat wurde unter einem TEM beobachtet und das optimale Bild gesammelt und analysiert.

Verunreinigungen und Partikel in PBS wurden durch einen 0,22-μM-Mikroporenfilter entfernt. Je nach Partikeldichte der Exosome wurde das gefilterte PBS auf die geeignete Konzentration verdünnt und mit einem Nanosight NS300 Nanopartikel-Detektor (Malvern, Westborough, MA, USA) detektiert.

Nach Identifizierung wurden makrophagen-abgeleitete Exosome, die mit miR-326-Inhibitor und miR-326-Inhibitor-Negativkontrolle (NC), miR-326-Mimic und miR-326-Mimic-NC transfiziert waren, mit einem Exosomen-Trennkit (Invitrogen) extrahiert.

RT-qPCR

Die Gesamtrna wurde mit Trizol-Reagenz (Thermo Fisher) extrahiert, und Echtzeit-PCR wurde mit SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) und dem ABI 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) durchgeführt. Die Primersequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Die quantitative Analyse erfolgte mit der 2⁻ΔΔCt-Methode.

Western-Blot-Analyse

Das Gesamtprotein von Zellen und Exosomen wurde extrahiert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Bicinchonsäure-(BCA)-Kit (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China) bestimmt. Das Protein wurde mit Probenpuffer versetzt und bei 95 °C gekocht; jeder Well wurde mit 30 µg beladen. Das Protein wurde mit 10 % Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Boster Biological Technology) getrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran elektroblottiert, gefolgt von Blockierung in 5 % bovinem Serumalbumin (BSA). Die Membran wurde mit Primärantikörpern gegen CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA, USA), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, USA) und mit Sekundärantikörper (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories) markiert mit Horseradish-Peroxidase inkubiert. Die Bilder wurden mit einem Odyssey Dual-Color-Infrarot-Fluoreszenz-Scanningsystem aufgenommen und die Grauwerte der Bänder mit der Quantity-One-Bildanalysesoftware gemessen.

Zellkultur und Screening

Normale Leberzelllinie HL-7702 und menschliche HCC-Zelllinien BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 und QGY-7703 wurden ausgewählt und in Gibco RPMI Media 1640 mit 10 % FBS, Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 mg/mL) kultiviert. Die miR-326-Expression wurde durch RT-qPCR detektiert, und geeignete Zelllinien wurden ausgewählt.

Exosomen-Markierung und Aufnahme von Exosomen

Die Exosome wurden mit 250 μL Diluent C resuspendiert und vorsichtig trituriert, um die Exosomenmembran nicht zu beschädigen. PKH67-Farbstoff (1 μL, Sigma-Aldrich) wurde zu 250 μL Diluent C gegeben, um 500 μL zu erreichen, und inkubiert. Die Lösung wurde mit 500 μL 1 % BSA versetzt und bei 37 °C für 1 min inkubiert. Die Exosome wurden durch Zentrifugation bei 120.000 g, 4 °C für 2 h gewonnen. Die mit PKH67 markierten Exosome wurden durch Zentrifugation bei 120.000 g, 4 °C für 2 h gewonnen. Die Exosome wurden in 6 mL RPMI-1640-Medium unter Lichtschutz resuspendiert. Anschließend wurden die markierten Exosome 12 h mit HCC-Zellen ko-kultiviert. Danach wurde das Kultivierungsmedium entfernt und 3-mal mit PBS für je 5 min gewaschen, und die nicht intern absorbierten fluoreszenzmarkierten Exosome wurden gründlich abgewaschen. Die Exosome wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol gefärbt. Nach Einbettung wurde die Fluoreszenzverteilung mit einem Laserkonfokalmikroskop beobachtet.

Zellgruppierung und Behandlung

HepG2- und SMMC-7721-Zellen wurden in 12-Well-Platten bei 0,5–1 × 10⁶ Zellen/Well ausgesät. Bei 50–60 % Konfluenz wurden Zellen mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) transfiziert. HepG2-Zellen wurden in miR-326-Mimic-Gruppe (transfiziert mit miR-326-Mimic) und NC-Mimic-Gruppe (transfiziert mit miR-326-Mimic-NC) eingeteilt. SMMC-7721-Zellen wurden in miR-326-Inhibitor-Gruppe (transfiziert mit miR-326-Inhibitor) und NC-Inhibitor-Gruppe (transfiziert mit miR-326-Inhibitor-NC) eingeteilt. miR-326-Mimic, miR-326-Inhibitor und ihre NCs wurden mit Lipofectamine 2000 für die Transfektion gemischt. Unbehandelte HepG2- und SMMC-7721-Zellen dienten als Blankogruppe. miR-326-Mimic, miR-326-Inhibitor und ihre NCs wurden von Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Guangzhou, China) entworfen und synthetisiert (Tabelle 1).

Ko-Kultur von M1-Makrophagen-exosomen mit HCC-Zellen

Die Proteinkonzentration der M1-Makrophagen-exosomen-Suspension wurde mit der BCA-Methode bestimmt, und das Volumen der entsprechenden Exosomen-Suspension mit 50 μg Protein berechnet. HepG2- und SMMC-7721-Zellen wurden in 12-Well-Platten bei 1 × 10⁵ Zellen/mL pro Well ausgesät. HepG2-Zellen wurden in 4 Gruppen eingeteilt: Kontrollgruppe (HepG2-Zellen nicht ko-kultiviert mit Exosomen), Exosomen-Gruppe (Exo) (HepG2-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen), Exo-miR-326-Mimic-Gruppe (HepG2-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen, transfiziert mit miR-326-Mimic), Exo-NC-Mimic-Gruppe (HepG2-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen, transfiziert mit miR-326-Mimic-NC). SMMC-7721-Zellen wurden ebenfalls in 4 Gruppen eingeteilt: Blankogruppe (SMMC-7721-Zellen nicht ko-kultiviert mit Exosomen), Exo-Gruppe (SMMC-7721-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen), Exo-miR-326-Inhibitor-Gruppe (SMMC-7721-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen, transfiziert mit miR-326-Inhibitor), Exo-NC-Inhibitor-Gruppe (SMMC-7721-Zellen ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen, transfiziert mit miR-326-Inhibitor-NC).

MTT-Assay

Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und in 96-Well-Platten mit einer Zelldichte von 4 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät. Das Kultivierungsmedium wurde nach 12, 24, 36, 48, 60 h Kultivierung verworfen. Die Zellen wurden mit 500 μL 0,5 g/L MTT-Lösung inkubiert, mit 200 μL Dimethylsulfoxid-Lösung versetzt, trituriert und bebrütet. Die optische Dichte (OD, 490 nm) wurde mit einem Mikroplattenleser gemessen.

Koloniebildungsassay

Nach 24 h Kultivierung und Ablösung mit Trypsin wurden die Zellen in 35-mm-Schälchen mit 300 Zellen/Schälchen ausgesät. Die Lösung wurde alle 3 Tage ersetzt. Nach 10 Tagen Kultivierung wurden die Zellen mit 40 g/L⁻¹ Paraformaldehyd fixiert und mit 1 g/L⁻¹ Kristallviolett-Lösung gefärbt und getrocknet. Kolonizahl (mehr als 50 Zellen) wurde mikroskopisch bestimmt.

Transwell-Assay

Zellen (1 × 10⁵) wurden in 200 μL serumfreiem Kultivierungsmedium suspendiert. Experimente wurden gemäß Anleitung der Transwell-Kammer (Corning Glass Works, Corning, N.Y., USA) durchgeführt (Matrigel war für Invasionsversuch erforderlich, nicht für Migrationsversuch). RPMI 1640 (10 % FBS, 600 μL) wurde in die untere Kammer gegeben. Ober- und Unterkammer wurden durch eine mit Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) vorbeschichtete Transwell-Membran getrennt. Nach 24 h Kultivierung wurde die Kammer mit 95 % Alkohol fixiert. Nach Färbung mit Kristallviolett-Lösung wurden Zellen in fünf Sichtfeldern mikroskopisch beobachtet.

Durchflusszytometrie

Zellzyklus: Zellen wurden mit Trypsin abgelöst. Zellen (1 × 10⁶) wurden in 0,5 mL PBS suspendiert und zu Einzelsuspension trituriert. Mit 4,5 mL vorgecoolter 70 % Ethanol auf Eis gemischt, bei 3000 g zentrifugiert, mit 5 mL PBS gespült und erneut bei 3000 g zentrifugiert. Anschließend wurden Zellen in 1 mL PI/Triton X-100-Färbelösung (20 μg PI/0,1 % Triton X-100) mit 0,2 mg RnaseA suspendiert. Zellzyklus wurde durch Durchflusszytometrie detektiert.

Zellapoptose: Trypisierte Zellen (1 × 10⁶) wurden in 1 mL PBS suspendiert, trituriert und bei 3000 g zentrifugiert. Zellen wurden nacheinander mit Inkubationspuffer (10 mmol/L Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 mmol/L NaCl, 5 mmol/L CaCl₂) gespült und bei 3000 g zentrifugiert. Anschließend wurden Zellen mit 100 μL Markierungslösung (FITC-Annexin V und PI wurden dem Inkubationspuffer zugegeben, um 1 μg/mL zu erreichen) inkubiert, bei 3000 g zentrifugiert, einmal mit Inkubationspuffer gewaschen und mit fluoreszierender (SA-FLOUS) Lösung bebrütet. Zellapoptose wurde durch Durchflusszytometrie detektiert. Die Wellenlänge der Durchflusszytometrie betrug 488 nm, FITC-Fluoreszenz wurde bei 515 nm durch Bandfilter detektiert, PI mit Wellenlänge > 560 nm. Die Ergebnisse wurden automatisch per Computer analysiert.

Tumor-Xenotransplantation in Nacktmäusen

Vierzig Mäuse (College of Animal Science, Jilin University, Jilin, China) im Alter von 4–6 Wochen wurden zufällig in 8 Gruppen mit je 5 Mäusen aufgeteilt. Die Mäuse wurden 1 Woche in einem spezifisch pathogenfreien Tierlabor gehalten, Futter, Einstreu und Wasserflaschen wurden rechtzeitig gewechselt. Der Gesundheitsstatus der Mäuse wurde täglich beobachtet. Eine Woche später wurden HCC-Zellen zu Zellsuspension vorbereitet und subkutan in Nacken und Rücken mit 0,1 mL Zellsuspension (1 × 10⁶) injiziert. Das Tumorwachstum wurde nach 3–5 Tagen beobachtet. Die Nacktmäuse wurden alle 4 Tage gewogen und das Tumorvolumen gemessen. Die Nacktmäuse wurden 20 Tage nach Injektion euthanasiert.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit SPSS 17.0 Software (SPSS Statistics, Chicago, IL, USA) interpretiert. Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit dem t-Test durchgeführt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit einseitiger Varianzanalyse (ANOVA). P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.

Ergebnisse

Identifizierung von M1-Makrophagen und Exosomen

Wright-Färbung wurde genutzt, um die Morphologie von THP-1-Zellen nach PMA-Induktion zu beobachten. Es zeigte sich, dass das Volumen der THP-1-Zellen vor Induktion klein war und der Kern-Plasma-Anteil höher; nach Induktion war die Morphologie unregelmäßig, das Volumen größer, der Kern-Plasma-Anteil verringert; das Zytoplasma war reicher und hellblau, mit reichlich Partikeln und wenigen Vakuolen; der Kern war purpurrot und oft zur Seite geneigt, was typische morphologische Merkmale von Makrophagen zeigte (Abb. 1a).

Identifizierung von M1-Makrophagen und Exosomen. a Wright-Färbung zur Beobachtung der Morphologie von THP-1-Zellen vor und nach PMA-Behandlung. b CD68- und CD206-Expression in THP-1-Zellen und PMA-behandelten THP-1-Zellen detektiert durch RT-qPCR; c Morphologie von Makrophagen und M1-Makrophagen. d Expression von IDO1 und IL-12 p35 in M0-Makrophagen und LPS- und INF-γ-behandelten M0-Makrophagen detektiert durch RT-qPCR. e TEM zur Exosomen-Beobachtung. f Detektion der Partikelgrößenverteilung von Exosomen durch NTA. g Proteinbänder von CD63 und CD181. In Panel b: *P < 0,05 versus THP-1-Zellen; In Panel d: *P < 0,05 versus M0-Makrophagen. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen zwei Gruppen durch t-Test.

Zur weiteren Verifizierung der erfolgreichen Makrophagen-Induktion wurde CD68- und CD206-Expression vor und nach Induktion durch RT-qPCR getestet. Es zeigte sich, dass CD68- und CD206-Expression durch PMA-Induktion erhöht waren, was die erfolgreiche Induktion von THP-1-Zellen zu M0-Makrophagen anzeigte (Abb. 1b). Anschließend wurden M0-Makrophagen durch LPS und INF-γ zu M1-Makrophagen polarisiert. Morphologie und M1-Makrophagen-Oberflächenmarker IDO1 und IL-12 p35 Expression wurden beobachtet und getestet. M0-Makrophagen zeigten verschiedene unregelmäßige adhärante Morphologien: rund, elliptisch oder spindelförmig. Die Morphologie von IFN-γ-stimulierten Makrophagen zeigte mehr Pseudopoden und Ausläufer und war spindelförmig (Abb. 1c). RT-qPCR zeigte (Abb. 1d), dass nach LPS- und INF-γ-Behandlung M1-Makrophagen eine Zunahme ihrer Marker (IDO1 und IL-12p35) aufwiesen.

Anschließend wurden makrophagen-abgeleitete Exosome durch TEM beobachtet. Es zeigte sich, dass die Exosome reichlich, rund oder oval, mit membranöser Struktur, einheitlicher Größe und wenigen Verunreinigungen waren (Abb. 1e). NTA zeigte, dass Exosome mit zentralisiertem Peak der MODE-Kurve und glatter Linearität konzentrierteren Durchmesser und weniger Verunreinigungen aufwiesen (Abb. 1f). Western-Blot-Analyse zeigte, dass im Vergleich zu Makrophagen die spezifischen Markerproteine CD63 und CD181 in makrophagen-abgeleiteten Exosomen erhöht waren (Abb. 1g). Diese Ergebnisse zeigen, dass wir erfolgreich Monozyten zu Makrophagen differenzierten und zu M1-Makrophagen polarisierten.

M1-Makrophagen-exosome liefern miR-326 an HCC-Zellen und beeinflussen miR-326-Expression in HCC-Zellen

Um zu verifizieren, ob Exosome aus M1-Makrophagen miR-326 an HCC-Zellen transportieren, wurden HepG2- und SMMC-7721-Zellen mit Exosomen ko-kultiviert. Es zeigte sich, dass nach 4 h Transfektion unter dem Fluoreszenzmikroskop eine große Anzahl von Exosomen von HepG2- und SMMC-7721-Zellen aufgenommen wurde (Abb. 2a, b).

M1-Makrophagen-exosome liefern miR-326 an HCC-Zellen und beeinflussen miR-326-Expression in HCC-Zellen. a Aufnahme von M1-Makrophagen-exosomen durch HepG2-Zellen. b Aufnahme von M1-Makrophagen-exosomen durch SMMC-7721-Zellen. c Vergleich der miR-326-Expression von Makrophagen-exosomen in jeder Gruppe vor und nach INF-γ- und LPS-Induktion. d miR-326-Expression in HCC-Zelllinien (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) und menschlicher normaler Hepatozyten-Linie HL-7702 detektiert durch RT-qPCR. e RT-qPCR detektierte den Effekt von miR-326-Mimic auf miR-326-Expression in HepG2-Zellen. f RT-qPCR detektierte den Effekt von miR-326-Inhibitor auf miR-326-Expression in SMMC-7721-Zellen. g RT-qPCR detektierte die Effekte von miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf miR-326-Expression in HepG2-Zellen. h RT-qPCR detektierte die Effekte von miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf miR-326-Expression in SMMC-7721-Zellen. In Panel c: *P < 0,05 versus M0-Makrophagen; In Panel d: *P < 0,05 versus HL-7702-Zellen; In Panel e: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel f: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel g: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel h: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

Anschließend wurde miR-326-Mimic/Inhibitor in Makrophagen transfiziert und die miR-326-Expression in deren Exosomen vor und nach Transfektion überprüft. Im Vergleich zu Exosomen aus M0-Makrophagen war die miR-326-Expression in M1-Makrophagen-exosomen erhöht. In M1-Makrophagen-exosomen mit miR-326-Mimic-Behandlung war eine erhöhte miR-326-Expression zu sehen. In M1-Makrophagen-exosomen mit miR-326-Inhibitor-Behandlung war die miR-326-Expression reduziert (Abb. 2c).

Dann wurde die miR-326-Expression in HCC-Zelllinien getestet. Wie gezeigt, war die miR-326-Expression in BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 und QGY-7703 im Vergleich zu HL-7702 erniedrigt, wobei HepG2 die niedrigste und SMMC-7721 die höchste Expression aufwies (Abb. 2d).

Anschließend wurden miR-326-Mimic und miR-326-Inhibitor in HepG2- bzw. SMMC-7721-Zellen transfiziert und deren Effekte auf miR-326-Expression untersucht. miR-326-Mimic erhöhte die miR-326-Expression in HepG2-Zellen, während miR-326-Inhibitor die miR-326-Expression in SMMC-7721-Zellen reduzierte (Abb. 2e, f).

Als Nächstes wurden Exosome aus M1-Makrophagen, transfiziert mit miR-326-Mimic und miR-326-Inhibitor, mit HepG2- bzw. SMMC-7721-Zellen ko-kultiviert. Es zeigte sich, dass Ko-Kultur mit Exosomen die miR-326-Expression in HCC-Zellen erhöhte, miR-326-Mimic-transfizierte M1-Makrophagen-exosome die miR-326-Expression in HepG2-Zellen weiter erhöhten, während miR-326-Inhibitor-transfizierte M1-Makrophagen-exosome die miR-326-Expression in SMMC-7721-Zellen degradierten (Abb. 2g, h). Es wird vermutet, dass M1-Makrophagen-exosome miR-326 an HCC-Zellen liefern und die miR-326-Expression in HCC-Zellen beeinflussen.

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 reduziert Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit in HCC-Zellen

Zur Untersuchung des Effekts von exosomalem miR-326 auf die Proliferation von HCC-Zellen wurden MTT- und Koloniebildungsassays durchgeführt. Es zeigte sich, dass in HepG2-Zellen die Wiederherstellung von miR-326 Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit beeinträchtigte (Abb. 3a, e, f). M1-Makrophagen-exosome hemmten die Proliferation und Koloniebildung von HepG2-Zellen. miR-326-Mimic-transfizierte M1-Makrophagen-exosome beeinträchtigten Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit weiter (Abb. 3c, i, j).

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 hemmt Zellproliferation und Koloniebildung in HCC-Zellen. a MTT-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Proliferation von HepG2-Zellen. b MTT-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Proliferation von SMMC-7721-Zellen. c MTT-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Proliferation von HepG2-Zellen. d MTT-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Proliferation von SMMC-7721-Zellen. e Koloniebildungsassay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Koloniebildungsfähigkeit von HepG2-Zellen. f Kolonizahlen von HepG2-Zellen. g Koloniebildungsassay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Koloniebildungsfähigkeit von SMMC-7721-Zellen. h Kolonizahlen von SMMC-7721-Zellen. i Koloniebildungsassay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Koloniebildungsfähigkeit von HepG2-Zellen. j Kolonizahlen von HepG2-Zellen, behandelt mit Exosomen. k Koloniebildungsassay detektierte den Effekt der Ko-Kultur von miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Koloniebildungsfähigkeit von SMMC-7721-Zellen. l Kolonizahlen von SMMC-7721-Zellen, behandelt mit Exosomen. In Panel a und f: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel b und h: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel c und j: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel d und l: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

In SMMC-7721-Zellen verstärkte miR-326-Knockdown Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit (Abb. 3b, g, h). In SMMC-7721-Zellen, behandelt mit M1-Makrophagen-exosomen, waren Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit verringert. miR-326-Inhibitor-transfizierte M1-Makrophagen-exosome förderten Zellproliferation und Koloniebildungsfähigkeit weiter (Abb. 3d, k, l). Es deutet sich an, dass miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen die Proliferation von HCC-Zellen hemmt.

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 unterdrückt Migration und Invasion von HCC-Zellen

Dann wurde der Effekt von exosomalem miR-326 auf Invasion und Migration von HCC-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass in HepG2-Zellen die Wiederherstellung von miR-326 Invasion und Migration einschränkte (Abb. 4a–c). M1-Makrophagen-exosome störten Invasion und Migration von HepG2-Zellen. Invasion und Migration verschlechterten sich weiter, wenn HepG2-Zellen mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen ko-kultiviert wurden (Abb. 4g–i).

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 hemmt Migration und Invasion von HCC-Zellen. a Transwell-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Invasion von HepG2-Zellen. b Transwell-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Migration von HepG2-Zellen. c Anzahl der Invasion und Migration von HepG2-Zellen. d Transwell-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Invasion von SMMC-7721-Zellen. e Transwell-Assay detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Migration von SMMC-7721-Zellen. f Anzahl der Invasion und Migration von SMMC-7721-Zellen. g Transwell-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Invasion von HepG2-Zellen. h Transwell-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Migration von HepG2-Zellen. i Anzahl der Invasion und Migration von HepG2-Zellen, ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen. j Transwell-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Invasion von SMMC-7721-Zellen. k Transwell-Assay detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Migration von SMMC-7721-Zellen. l Anzahl der Invasion und Migration von SMMC-7721-Zellen, ko-kultiviert mit M1-Makrophagen-exosomen. In Panel c: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel f: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel i: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel l: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

miR-326-Knockdown führte zu Verstärkungen in SMMC-7721-Zellinvasion und -migration (Abb. 4d–f). Bei Behandlung mit M1-Makrophagen-exosomen zeigten SMMC-7721-Zellen verringerte Invasion und Migration. Allerdings wurden SMMC-7721-Zellinvasion und -migration durch Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen gesteigert (Abb. 4j–l). Es wird impliziert, dass miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen Invasion und Migration von HCC-Zellen hemmt.

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 fördert Apoptose von HCC-Zellen

Bei Untersuchung des Effekts von exosomalem miR-326 auf Zellzyklus und Apoptose von HCC-Zellen wurden PI-Einfärbung und Annexin V-FITC/PI-Doppelfärbung angewendet. Es zeigte sich, dass miR-326-Überexpression Zellen in G0/G1-Phase anhäufte, Zellen in S- und G2/M-Phase reduzierte und Apoptose in HepG2-Zellen erhöhte (Abb. 5a–d). Ko-Kultur mit M1-Makrophagen-exosomen erhöhte Zellen in G0/G1-Phase, reduzierte Zellen in S- und G2/M-Phase und steigerte Zellapoptose von HepG2-Zellen. Ko-Kultivierung mit Exosomen von M1-Makrophagen, transfiziert mit miR-326-Mimic, verstärkte diese Effekte weiter (Abb. 5i–l).

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 fördert Apoptose von HCC-Zellen. a, b Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf HepG2-Zellzyklus; c, d Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf HepG2-Zellapoptose; e, f Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf SMMC-7721-Zellzyklus; g, h Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf SMMC-7721-Zellapoptose; i, j Durchflusszytometrie detektierte die Effekte der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf HepG2-Zellzyklus; k, l Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf HepG2-Zellapoptose; m, n Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf SMMC-7721-Zellzyklus; o, p Durchflusszytometrie detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf SMMC-7721-Zellapoptose. In Panel b und d: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel f und h: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel j und l: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel n und p: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

In SMMC-7721-Zellen reduzierte miR-326-Downregulation Zellen in G0/G1-Phase, erhöhte Zellen in S- und G2/M-Phase und verringerte Zellapoptose (Abb. 5e–h). Untransfizierte M1-Makrophagen-exosome erhöhten Zellen in G0/G1-Phase, reduzierten Zellen in S- und G2/M-Phase und steigerten Zellapoptose. miR-326-Inhibitor-transfizierte M1-Makrophagen-exosome degradierten Zellen in G0/G1-Phase, erhöhten Zellen in S- und G2/M-Phase und verringerten Zellapoptose (Abb. 5m–p). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen den Zellzyklus in G0/G1-Phase arrtiert und Zellapoptose in HCC induziert.

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 erniedrigt CD206- und NF-κB-Expression in HCC-Zellen

Anschließend wurde der potenzielle Mechanismus von miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen im biologischen Fortschritt von HCC-Zellen untersucht. NF-κB ist das zentrale Bindeglied zwischen Entzündung und Krebs. Viele regulatorische Proteine und miRNAs könnten die überaktivierte NF-κB-Signalgebung hemmen, um Krebs zu unterdrücken [16]. Ein solcher positiver Effekt könnte die Polarisation von M2- zu M1-Makrophagen einschließen. CD206- und NF-κB-Expression in HepG2- und SMMC-7721-Zellen wurde durch RT-qPCR getestet. Es zeigte sich, dass miR-326-Wiederherstellung CD206- und NF-κB-Expression in HepG2-Zellen verringerte, während miR-326-Knockdown CD206- und NF-κB-Expression in SMMC-7721-Zellen erhöhte (Abb. 6a, b). Zudem reduzierte Ko-Kultur mit M1-Makrophagen-exosomen CD206- und NF-κB-Expression in HepG2-Zellen signifikant, während Ko-Kultur mit miR-326-überexprimierenden M1-Makrophagen-exosomen CD206- und NF-κB-Expression weiter verringerte. Bei Behandlung mit untransfizierten M1-Makrophagen-exosomen war CD206- und NF-κB-Expression in SMMC-7721-Zellen verringert. Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen zeigte in SMMC-7721-Zellen erhöhte CD206- und NF-κB-Expression (Abb. 6c, d). Es wurde geschlossen, dass miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen als Tumorsuppressor durch Hemmung von NF-κB in HCC-Zellen wirkt.

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 erniedrigt CD206- und NF-κB-Expression in HCC-Zellen. a RT-qPCR detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Expression von CD206 und NF-κB in HepG2-Zellen; b RT-qPCR detektierte den Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Expression von CD206 und NF-κB in SMMC-7721-Zellen. c RT-qPCR detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Expression von CD206 und NF-κB in HepG2-Zellen; d RT-qPCR detektierte den Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Expression von CD206 und NF-κB in SMMC-7721-Zellen. In Panel a: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel b: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel c: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel d: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (N = 3), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen hemmt HCC-Tumorwachstum in vivo

Schließlich wurden die In-vivo-Ergebnisse durch Tumor-Xenotransplantationen validiert. Wie gezeigt, verringerte miR-326-Überexpression Volumen und Gewicht von Tumoren in HepG2-Zellen (Abb. 7a–c). In Mäusen, transplantiert mit HepG2-Zellen, ko-kultiviert mit Exosomen, reduzierte die Behandlung mit M1-Makrophagen-exosomen signifikant Tumorvolumen und -gewicht von HepG2-Zellen, während Behandlung mit miR-326-überexprimierenden M1-Makrophagen-exosomen Tumorvolumen und -gewicht weiter reduzierte (Abb. 7g–i).

M1-Makrophagen-exosomales miR-326 reduziert Volumen und Gewicht von HCC-Tumoren in vivo. a–c Effekt der Transfektion von miR-326-Mimic auf Tumorvolumen und Tumor von Nacktmäusen, xenotransplantiert mit HepG2-Zellen. d–f Effekt der Transfektion von miR-326-Inhibitor auf Tumorvolumen und Tumoren von Nacktmäusen, xenotransplantiert mit SMMC-7721-Zellen. g–i Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Mimic-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Tumorvolumen und Tumor von Nacktmäusen, xenotransplantiert mit HepG2-Zellen. j–l Effekt der Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen auf Tumorvolumen und Tumor von Nacktmäusen, xenotransplantiert mit SMMC-7721-Zellen. In Panel b und c: *P < 0,05 versus NC-Mimic-Gruppe; In Panel e und f: *P < 0,05 versus NC-Inhibitor-Gruppe; In Panel h und i: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Mimic-Gruppe; In Panel k und l: *P < 0,05 versus Kontrollgruppe, #P < 0,05 versus Exo-NC-Inhibitor-Gruppe. Messdaten als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 5), Vergleiche zwischen mehreren Gruppen durch einseitige ANOVA.

In SMMC-7721-Zellen erhöhte miR-326-Suppression Volumen und Gewicht von Tumoren (Abb. 7d–f). Untransfizierte M1-Makrophagen-exosome hemmten Tumorwachstum in Volumen und Gewicht von SMMC-7721-Zellen. Ko-Kultur mit miR-326-Inhibitor-transfizierten M1-Makrophagen-exosomen führte bei Injektion in Mäuse zu Erhöhungen von Tumorvolumen und -gewicht (Abb. 7j–l). Zusammenfassend unterdrückte miR-326 aus M1-Makrophagen-exosomen Tumorwachstum von HCC in vivo.

Diskussion

HCC ist ein häufiger Krebs, der durch hohe Morbidität und Mortalität, schwierige Früherkennung und -behandlung, schlechte Prognose und 5-Jahres-Überlebensrate gekennzeichnet ist [17]. Kürzlich zeigte eine Studie, dass die niedrig exprimierte lncRNA cox-2 die Fähigkeit von M1-Makrophagen verringert, HCC-Zellwachstum, Invasivität, Angiogenese, Migration zu unterdrücken und Apoptose zu fördern [18]. Hu et al. diskutierten, dass miR-326 in HCC-Geweben und Zelllinien offensichtlich herunterreguliert ist, während herunterreguliertes miR-326 mit TNM-Stadium, Lymphknotenmetastase und Differenzierung von HCC-Patienten verbunden ist [14]. Es wird allgemein angenommen, dass HCC-Zell-exosome eine fruchtbare Umgebung bilden können, um HCC-Zellwachstum, Invasivität, Metastasierung und Entwicklung von Medikamentenresistenz zu fördern [19]. Die vorliegende Studie wurde konzipiert, um den Mechanismus von exosomalem miR-326 bei der Regulation von Invasion und Migration von HCC-Zellen zu erforschen.

Unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-326-Expression in HCC-Zellen abnahm, aber in Exosomen zunahm. Eine aktuelle Studie wies darauf hin, dass miR-326-Expression in HCC-Geweben abnimmt [20]. Eine andere Studie zeigte, dass miR-326-Expression in HCC-Zelllinien und -Geweben signifikant reduziert ist und ihre Downregulation eine schlechte Prognose bei HCC vorhersagt [13]. Es wird berichtet, dass miR-326 eine tumorsuppressive Rolle spielt und in HCC-Zellen stark herunterreguliert ist [21]. Alle genannten Evidenzen stimmen mit unseren Ergebnissen überein. Eine Studie postulierte, dass im Vergleich zu Kontrollen miR-326-Expression in Tconv-exosomen erhöht ist, was bei schubförmig-remittierender Multipler Sklerose beobachtet wurde [11].

Weitere Ergebnisse unserer Daten zeigen, dass hoch exprimiertes exosomales miR-326 Zellproliferation, Koloniebildung, Migration und Invasion reduzierte sowie Apoptose von HCC-Zellen in vitro förderte und Volumen und Gewicht von HCC-Tumoren in vivo verringerte. Es wurde zuvor vorgeschlagen, dass HCC-Zellwachstum durch Überexpression von miR-326 unterdrückt werden kann und HCC-Zellmigration und -invasion durch Erhöhung von miR-326 markant abgeschwächt werden [21]. Es wird berichtet, dass hochregulierte miR-326-Expression HCC-Zellwachstum und Invasivität unterdrückt und Zellapoptose in vitro stimuliert [14]. Darüber hinaus verifizierte eine frühere Studie, dass Überexpression von miR-326 Tumorwachstum in vivo verringerte [13]. Eine Studie zeigte, dass ektopisch exprimiertes miR-326 Zellwachstum markant abschwächt und zelluläre Migration und Invasivität in nicht-kleinzelligen Lungenkrebszelllinien unterdrückt [22]. Zudem wurde gefunden, dass miR-326 profibrotische Gene wie MMP-9 verringert, was seine repressiven Funktion in Krebszellproliferation impliziert [23]. Auch wird dargestellt, dass miR-326 Bcl-2-Proteinexpression unterdrückt und Bax-Expression erhöht, um Apoptose zu beeinflussen [24]. Ähnlich wie unsere Ergebnisse gibt es einige miRNAs, die mit Exosomen interagieren, um eine Rolle in der HCC-Entwicklung zu spielen. Es wird gezeigt, dass hoch exprimiertes exosomales miR-638 die Proliferation von HCC-Zellen unterdrücken kann, mit potenziellem Einfluss auf Karzinogenese [25]. Eine andere Studie beweist, dass HCC-Zell-exosomales miR-451a Tumorangiogenese durch Störung endothelialer Funktionen wie Apoptose, Röhrenbildung, Migration und Permeabilität unterdrückt [26]. Eine frühere Forschung bestätigt allgemein, dass bei Behandlung mit Überexpression von miR-744-Exosomen die Proliferation von HCC-Zellen dramatisch unterdrückt wird [27].

Schlussfolgerung

Zusammenfassend liefert unsere Studie Evidenz, dass M1-Makrophagen-exosomales miR-326 Proliferation, Migration und Invasion von HCC-Zellen unterdrückt und Apoptose fördert, was einen neuen Einblick in eine neuartige Target-Therapie für HCC bietet. Aufgrund begrenzter Probengröße und begrenzter bekannter Forschungen ist der genaue Mechanismus von miR-326 nicht vollständig aufgeklärt, daher sind weitere groß angelegte Studien erforderlich, um den zugrundeliegenden Mechanismus zu illustrieren.

Abkürzungen

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

miRNAs:

MicroRNAs

FBS:

Fötales Kälberserum

M/CSF:

Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor

PBS:

Phosphat-gepufferte Salzlösung

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

PPAR:

Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

NTA:

Nanopartikel-Tracking-Analyse

NC:

Negative Kontrolle

RT-qPCR:

Reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion

BCA:

Bicinchonsäure

BSA:

Bovines Serumalbumin

Exo:

Exosome

ANOVA:

Einseitige Varianzanalyse