Bewertung der durch Goldnanopartikel gehemmten Aktivität von Cytochrom P450 3A4 und der molekularen Mechanismen, die seiner zellulären Toxizität in der humanen hepatozellulären Karzinomzelllinie C3A . zugrunde liegen

Hintergrund

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eine der häufigsten Krebserkrankungen weltweit und die am schnellsten wachsende Krebsmortalität in den USA [1, 2]. Da HCC in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert wurde, umfassen die kurativen HCC-Behandlungen Lebertransplantation oder chirurgische Resektion in der frühen Tumorentwicklung und Chemo- und Strahlentherapie für einen fortgeschrittenen Tumorzustand. HCC entwickelt häufig eine hohe Resistenz gegenüber herkömmlichen antineoplastischen Mitteln, einem nicht selektiven zytotoxischen Molekül, das zu systemischen Nebenwirkungen führen kann. Die jüngsten Fortschritte in der Gentherapie, d. h. die auf RNA-Interferenz (RNAi) basierende Gentherapie, wurden in der aktuellen HCC-Behandlung genutzt [3, 4]. Die Wirksamkeit von RNAi erfordert, dass der Vektor in das Innere der Zielzelle transportiert wird [5]. Die Vektoren für eine erfolgreiche Genabgabe sind virale und nicht-virale Vektoren. Viren bieten eine größere Effizienz der Genabgabe, jedoch werden nicht-virale Vektoren aufgrund von Sicherheitsbedenken bei den viralen Vektoren bevorzugt. Nanopartikel (NP) als nicht-virale Vektoren für eine gezielte Genabgabe oder ein Wirkstoffabgabesystem haben große Aufmerksamkeit zur Verbesserung der therapeutischen Effizienz und zur Verringerung der Toxizität auf systemischer und/oder zellulärer Ebene bei der HCC-Behandlung gefunden [4, 6]. Daher wird es sehr wichtig, den molekularen Mechanismus und den biologischen Weg zu identifizieren, der der zellulären Störung und Toxizität von NP in Zielzellen und -geweben zugrunde liegt. Jüngste In-vitro-Studien haben gezeigt, dass die Erstellung von Genexpressionsprofilen in Kombination mit zellulären und biochemischen Reaktionen eine direkte Bewertung der zellulären Störung und der potenziellen NP-Toxizität ermöglicht [7,8,9,10].

Die Goldnanopartikel (AuNP) wurden aufgrund ihrer einzigartigen physikalisch-chemischen Eigenschaften und Oberflächenchemie als Transportvehikel für die zielgerichtete Abgabe von Gen-Silencing-Einheiten allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen verwendet [11, 12]. Die Wechselwirkung von AuNP mit Blutplasmaproteinen bildet eine Proteinkorona, die wiederum die NP-Oberflächenchemie verändert und die nachfolgenden biologischen Reaktionen wie die zelluläre Aufnahme und potenzielle Toxizität beeinflusst [13, 14]. Die zelluläre Aufnahme von AuNP in verschiedenen menschlichen Krebszelllinien und Primärzellen wurde unabhängig von Größe und Oberflächenladung kritisch durch die Proteinkoronabildung beeinflusst [7,8,9, 14,15,16,17].

Der größen- und oberflächenladungsabhängige oxidative Stress wurde auch in der humanen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231, dem hepatozellulären Karzinom HepG2 und humanen Leukämie-HL-60-Zellen als Reaktion auf AuNP beobachtet, die mit NP-Zytotoxizität assoziiert waren [18 , 19]. AuNP-induzierte Zytotoxizität trat in verschiedenen humanen Krebszelllinien und primären humanen Zellen zelltypspezifisch auf [7,8,9, 20, 21].

Cytochrom-P450 (CYP)-Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Bioaktivierung oder Inaktivierung zahlreicher zytotoxischer Medikamente und der Anfälligkeit des Wirts für die Karzinogenität von Krebsmedikamenten [22]. AuNP beeinflusste die katalytische Aktivität von CYP-Enzymen auf zellulärer und molekularer Ebene in vivo und in vitro [7, 23, 24, 25]. AuNP hat deutlich die unterschiedliche Genexpression gezeigt, die hauptsächlich an Markern für oxidativen Stress in der humanen Lungenfibroblasten-Zelllinie MRC-5 beteiligt ist, und eine mitochondriale Dysfunktion in humanen Nabelvenenzellen (HUVEC) und humanen Hepatozyten, die mit einer Erhöhung der Lipidperoxidproduktion korreliert und a hohe Zytotoxizität [8, 9, 26]. Während dieses Wissen reziprok nahelegt, dass AuNP in verschiedenen Zelltypen apoptotischen oder nekrotischen Zelltod verursacht und zelluläre und biochemische Funktionen in Kombination mit unterschiedlicher Genexpression in Stressreaktionswegen und Toxizität verändert, sind die spezifischen Wege, über die AuNP ihre toxischen Wirkungen innerhalb der Zelle oder biologischen System bleibt unbekannt.

Hierin untersuchte diese Studie die Auswirkungen von Proteinkorona, Größe und Oberflächenladung auf die AuNP-Wechselwirkung mit der menschlichen HCC-Zelle C3A. In erster Linie wurde die zeitabhängige zelluläre Aufnahme des mit kationischem BPEI, anionischer Liponsäure (LA) oder neutralem Polyethylenglykol (PEG) funktionalisierten 40 und 80 nm großen AuNP in C3A-Zellen mit und ohne menschliche Plasmaproteinkorona (PC) bestimmt. Zweitens wurden die durch AuNP induzierte Zytotoxizität und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)/reaktiven Stickstoffspezies (RNS) zusammen mit ihren hemmenden Wirkungen auf die CYP3A4-Aktivität überwacht. Schließlich wurde der mit der AuNP-Toxizität verbundene molekulare Wirkmechanismus mit dem Human Molecular Toxicology Pathway Finder und den Human Drug Transporters RT ² . charakterisiert Profiler™ PCR-Array.

Methoden

Gold-Nanopartikel-Synthese

Das kationische 40- und 80-nm-BPEI, das anionische LA und das neutrale PEG Biopure™ AuNP wurden kundenspezifisch aus nanoComposix (San Diego, CA) synthetisiert. Partikelgröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta (z)-Potential und spektrale Eigenschaften wurden mit dynamischer Lichtstreuung (DLS), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert. AuNP wurden durch Reduktion von Hydrogentetrachloroaurat (III)-Hydrat in wässriger Kaliumcarbonatlösung, gefolgt von Alterungsprozess und Tangentialflussfiltration (TFF) synthetisiert. Die AuNP-Oberfläche wurde mit LA oder PEG durch Zugabe von Dihydroliponsäure (0,2:1, w /w ) oder Thiol-Methoxy-terminiertes PEG (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /w ), gefolgt von TFF-Waschen und Sterilfiltration. BPEI-funktionalisierte Oberflächen von AuNP wurden mittels EDC-Chemie synthetisiert, indem die Carbonsäure von LA an freie Amine von BPEI gebunden wurde, gefolgt von TFF-Waschen und anschließender Zentrifugation, um ungebundenes BPEI zu entfernen.

Protein Corona-Vorbereitung

Gepooltes menschliches Blutplasma (n =5) wurden von der Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) erhalten. AuNP wurden in Humanplasma inkubiert (55%, v /v ) bei einer konstanten Drehzahl von 250 U/min bei 37 °C für 1 h, wie berichtet [7, 8]. Die ungebundenen und schwach assoziierten Proteine ​​wurden durch wiederholtes Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 20.000 × g . entfernt für 20 min bei 20 °C. Die endgültigen mit Humanplasmaprotein-Corona (PC) beschichteten AuNPs wurden in PBS dispergiert und dann zur weiteren physikalisch-chemischen Charakterisierung oder Dosierung in Zellkulturmedium verdünnt. Das detaillierte Protokoll finden Sie in der Zusatzdatei 1.

Physikochemische Charakterisierung von AuNP

Hydrodynamische Durchmesser (D _H ), PDI und Z-Potential des 40 und 80 nm bloßen (kein PC) AuNP, funktionalisiert mit BPEI, LA und PEG in deionisiertem (DI) Wasser, wurden bei 25 °C bei 0 h mit dem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instrumente, Worcestershire, Großbritannien); für PC-beschichtetes AuNP in PBS bei 25 °C bei 0 h; und für alle blanken und PC AuNP in komplettem Zellkulturmedium bei 37 °C bei 0 h und 24 h. Das komplette Zellkulturmedium enthielt Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM), ergänzt mit 10 % FBS (ATCC ^® , Manassas, VA). Eine Probe wurde 5-mal mit 11 Teilläufen von jeweils 10 s gemessen. Darüber hinaus wurden optische Absorptionsspektren mit dem Synergy H1-Hybrid-Multimode-Mikroplattenlesegerät (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT) bei Raumtemperatur bei 0 h gemessen.

Transmissionselektronenmikroskop

Die AuNP-Morphologie wurde mit TEM charakterisiert. Die gesamte blanke und PC-AuNP-Lösung (5 μl) wurde auf 200-Mesh-Kupfergitter gegeben, gefolgt von einer Lufttrocknung bei Raumtemperatur. Die Proben wurden auf einem Tecnai G2 Spirit BioTWIN mit einem Oxford-Detektor (FEI Company, Hillsboro, OR) bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV betrachtet. Die GATAN-Mikroskopie-Suite (GATAN Inc., Pleasanton, CA) maß AuNP-Durchmesser.

Zellkultur- und Lebensfähigkeitsmessung

Humane hepatozelluläre Karzinom C3A-Zellen (ATCC ^® CRL-10741™) wurden von ATCC ^® . gekauft (Manassas, VA), kultiviert in komplettem EMEM (ATCC ^® , Manassas, VA), ergänzt mit 10 % FBS, und expandiert auf etwa 80 % Konfluenz in T75-Kolben mit Mediumwechsel alle 4 Tage. Nach 0,25 % (w /v ) Trypsin–0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Verdau, Zellen wurden in 96-Well-Platten bei 8 × 10 ⁴ . ausplattiert Zellen pro Vertiefung und inkubiert bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % CO_2. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Zellen mit AuNP in Abwesenheit und Anwesenheit von PC dosiert. Für die Dosierung wurden die C3A-Zellen zwischen Passage 9 und 12 verwendet.

Die C3A-Lebensfähigkeit wurde mit dem alamarBlue ^® . bestimmt Lebensfähigkeitsassay (Thermo Sci., Waltham, MA) wie beschrieben [7, 27]. Zellen in den 96-Well-Platten wurden mit 40 und 80 nm BPEI-, LA- und PEG-AuNP mit und ohne PC im Bereich von 0 bis 250 μg/cm ² . behandelt . Nach 24 Stunden 10 % alamarBlue ^® Reagenz in vollständigem EMEM (v /v ) wurde der Zellkultur zugesetzt und 3 h bei 37 °C inkubiert. Das vollständige EMEM diente als Dispergiermittel. Die Wechselwirkungen von AuNP mit dem Wirkstoff von alamarBlue ^® Reagenz, Resazurin oder ein reduziertes Produkt, Resorufin wurden als Kontrollen gemessen. Als Hintergrundkontrollen dienten AuNP und Resazurin (keine Zellen) oder Erhaltungsmedium (keine Zellen). Die Fluoreszenz, proportional zur Lebensfähigkeit der Zellen, wurde auf Kontrollen normalisiert und als Prozentsatz relativ zur Kontrollzellgruppe ausgedrückt.

Zelluläre Aufnahmemessung mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie

Die Zellen wurden bei 8 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Well von 96-Well-Platten und dosiert mit einer ungiftigen Konzentration von 1,56 μg/cm ² von allen blanken und PC AuNP für 0,5, 1, 3, 6, 12 und 24 h. Der Ätzschritt wurde eingebaut, um zellmembrangebundenes AuNP und seine unspezifische Bindung an die Wells zu entfernen, wie zuvor berichtet [28]. Die Zellernte wurde getrocknet und in Königswasser verdaut und die intrazelluläre Au-Konzentration wurde mit dem NexION ^™ . quantifiziert 350X Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) (PerkinElmer, Waltham, MA). Die zelluläre Aufnahme von AuNP wurde wie zuvor berichtet berechnet und als Anzahl von AuNP pro Zelle ausgedrückt [29]. Das detaillierte Protokoll finden Sie in der Zusatzdatei 1.

Oxidative/nitrosative Stressmessungen

Die Zellen wurden bei 8 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Well von 96-Well-Platten und dosiert mit dem 40 nm bloßen BPEI- und PEG-AuNP bis zu 125 μg/cm ² für 1, 3 und 24 Stunden. Die direkte Messung von Sauerstoff/nitrosativem Stress wurde wie zuvor beschrieben mit dem Testkit für total reaktive Sauerstoffspezies (ROS)/Superoxid (SO) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) untersucht [30]. Die Fluoreszenz, proportional zum Anstieg der ROS/reaktiven Stickstoffspezies (RNS) (Ex488/Em520 nm) oder SO (Ex550/Em610 nm) wurde mit dem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Das detaillierte Protokoll finden Sie in der Zusatzdatei 1.

Cytochrom P450 3A4-Aktivität

Unerwünschte Wirkungen von 40 und 80 nm blankem und PC AuNP auf die CYP3A4-Aktivität wurden mit P450-Glo™-Assays (Promega Corp., Madison, WI) wie vollständig beschrieben charakterisiert [7]. C3A-Zellen in 96-Well-Platten wurden mit der mittleren letalen Konzentration (LC₅₀ ) Werte:127,3 μg/cm ² des 40 nm-BPEI-AuNP, 205,5 μg/cm ² des 80 nm BPEI-AuNP, 192,5 μg/cm ² des 40-nm-LA-AuNP und 129,5 μg/cm ² des 40 nm-PEG-AuNP. Seit LC₅₀ Werte von 80 nm LA- und PEG-AuNP wurden nicht bestimmt, Zellen wurden mit LC₅₀ . behandelt Werte der 40 nm LA- und PEG-AuNP (192,5 μg/cm ² und 129,5 μg/cm ² , bzw). Nach dem Ende der 24-stündigen Inkubation wurden die Zellen mit einem CYP3A4-Substrat (Luciferin-IPA) bei 37 °C für 3 h inkubiert. Das Lumineszenzsignal, proportional zu einer Enzymaktivität, wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen und dann auf Kontrollen normalisiert. Kontrollen wurden zugewiesen, um die Wechselwirkung von AuNP mit Ausgangssubstraten oder Metaboliten und zellfreien Substraten zu beurteilen. Die CYP-Aktivität wurde als Prozentsatz relativ zur Kontrollzellgruppe ausgedrückt.

Gene Expression Profiling

Da toxische 40 nm-PEG-AuNP bei der Hemmung der CYP3A4-Aktivität und der antioxidativen Aktivität in C3A-Zellen mit hoher zellulärer Aufnahme eingesetzt wurden, wurde es ausgewählt, um molekulare Wirkmechanismen zu charakterisieren, die seiner Toxizität und unterschiedlichen zellulären Reaktionen zugrunde liegen. Die Zellen wurden bei 2,5 × 10 ⁶ . ausgesät Zellen pro Well von 6-Well-Platten und dosiert mit LC₅₀ Wert des 40 nm PEG-AuNP für 24 h bei 37 °C. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen einer RNA-Isolierung unterzogen und dann wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung von Gesamt-RNA mit einem durchschnittlichen RNA-Integritätszahlen (RIN)-Wert von 7,8 wie zuvor beschrieben durchgeführt [7,8,9]. Die resultierende cDNA wurde mit RT ² . gemischt Grüner SYBR-Mastermix (Qiagen Inc., Valencia, CA) und dann auf den Human Molecular Toxicology Pathway Finder oder Human Drug Transporters RT ² . aufgetragen Profiler™ PCR-Arrays in Quantstudio™ 7 Flex (Applied BioSystem, Foster City, CA). Differenziell exprimierte Gene mit der Faltungsänderung <− 2 und> 2 und einem p <  0,05 repräsentiert die Herunter- und Hochregulierung des interessierenden Gens. So validieren Sie die RT ² PCR-Array-Daten, eine Expression von neun ausgewählten Genen wurde mit cDNA-Synthese und anschließender Real-Time-PCR ausgewertet. Primersequenzen sind in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 zusammengefasst. Alle PCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Das detaillierte Protokoll der Real-Time-PCR-Bedingungen und der Quantifizierung finden Sie in der Zusatzdatei 1.

Statistische Analyse

Mediane tödliche Konzentration (LC₅₀ ) wurden die AuNP-Werte in C3A-Zellen durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten (die Eingabe der AuNP-Konzentrationsniveaus und die entsprechende Zelllebensfähigkeit) unter Verwendung von GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA) wie beschrieben [7] geschätzt. Eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde unter Verwendung von SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) durchgeführt, um die Auswirkungen von AuNP auf die ROS/RNS-Produktion und die zelluläre Aufnahme in C3A-Zellen zu bewerten. Falls signifikant, wurde der Mehrfachvergleich mit Tukeys ehrlichem signifikantem Unterschied (HSD) bei einem p . durchgeführt < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Physikochemische Charakterisierung von reinem und menschlichem Plasma-PC-AuNP

Die Auswirkungen der NP-Größe, der Oberflächenladung und der PC-Bildung im menschlichen Plasma um AuNP auf den hydrodynamischen Durchmesser (D_H ), Polydispersitätsindex (PDI), Z-Potential und eine spektrale Eigenschaft sowie die Morphologie wurden mit DLS-, TEM- und UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert (Abb. 1). In TEM-Bildern waren alle bloßen (kein PC) AuNP in DI-Wasser monodispers mit der engen Größenverteilung und einzigartigen UV-Vis-Spektrumbereichen von 521–553 nm (Abb. 1a). PC-Bildungen um AuNP wurden mit Veränderungen der Größenverteilung und Rotverschiebungen der Absorptionsspektren beobachtet (Abb. 1b). Das D _H und PDI-Werte von 40 und 80 nm blankem und PC AuNP in vollständiger EMEM waren bis zu 24 h bei 37 °C kompatibel, mit Ausnahme des 40 und 80 nm PC BPEI-AuNP, das eine Abnahme der PDI-Werte (0,29 bzw. 0,32) zeigte ) bei 24 h bei 37 °C im Vergleich zu denen bei 0 h bei 37 °C (0,62 bzw. 1,0) (Tabelle 1). Die Z-Potentialwerte aller blanken und PC-AuNPs nahmen nach 24 h bei 37 °C im Vergleich zu denen nach 0 h bei 37 °C relativ ab. Es wurde eine Aggregation der 40- und 80-nm-PC-BPEI-AuNP in PBS und vollständigem EMEM beobachtet, die mit mehreren Peaks in einer Größenverteilung und Änderungen von D_H . korreliert und Rotverschiebungen der Absorptionsspektren relativ zu bloßem BPEI-AuNP (Abb. 1 und zusätzliche Datei 1:Abbildung S1, Tabelle 1). Diese Ergebnisse wurden durch die jüngsten Studien gestützt, in denen die koronabeschichteten BPEI-AuNP mit 40 und 80 nm PC und Humanserumalbumin in PBS und verschiedenen Zellkulturmedien aggregiert wurden [7,8,9].

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von a AuNP in entionisiertem Wasser und b PC AuNP in PBS bei 0 h bei 25 °C, UV-Vis-Spektrenwellenlänge (oberer Einschub) und dynamische Lichtstreuungsverteilung (unterer Einschub). Pfeile zeigen die PC-Bildung an. PC humane Plasmaproteinkorona, BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol

AuNP-Zytotoxizität

Die Zytotoxizität von AuNP wurde anhand der mittleren letalen Konzentration (LC₅₀ ) in C3A-Zellen. Die NP-Oberflächenladung, Partikelgröße und PC-Bildung um den NP-abhängigen LC₅₀ Analysen mit AuNP sind in Abb. 2 gezeigt. Alle 40 nm BPEI-, LA und PEG-AuNP und das 80 nm BPEI-AuNP waren für C3A-Zellen mit dem entsprechenden LC₅₀ . zytotoxisch reicht von 127,3 bis 205,5 μg/cm ² (Abb. 2a). Das nackte 80 nm-PEG-AuNP wies bei der höchsten Konzentration von 250 μg/cm ² . eine Zelllebensfähigkeit von 59 % auf , während die 80 nm LA-AuNP nicht zytotoxisch waren. PC reduzierte die AuNP-Toxizität als Funktion der Größen- und Oberflächenladungsmodifikation, mit Ausnahme des 80 nm BPEI-AuNP, das 51 % der Zelllebensfähigkeit bei 250 μg/cm ² . zeigte um 24 h (Abb. 2b). Jüngste Studien haben gezeigt, dass das 40 nm große bloße BPEI-AuNP für primäre menschliche Hepatozyten, HUVEC und menschliche proximale Tubuluszellen (HPTC) (LC₅₀ .) toxisch war Bereiche von 22,4–80,3 μg/cm ² ) [7,8,9]. Die PC-beschichteten BPEI-AuNP waren für menschliche Hepatozyten zytotoxisch, HSA-beschichtete AuNP waren jedoch nicht zytotoxisch [7]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass C3A-Zellen aufgrund einer hohen Proliferationsrate und metabolischen Aktivität der Krebszelllinie resistenter gegen AuNP-Toxizität sind als primäre menschliche Zellen [31].

C3A-Lebensfähigkeit und LC₅₀ Werte der 40 und 80 nm a AuNP und b PC AuNP. Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. (n = 3). PC Human Plasma Protein Corona, ND nicht bestimmt, BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglycol, LC₅₀ mittlere tödliche Konzentration

Intrazelluläre Aufnahme von AuNP

NP-Größe, Oberflächenladung und PC-abhängige zelluläre Aufnahme aller blanken und PC-AuNP wurden mit 1,56 μg/cm ² . bestimmt bis 24 Std. Die ANOVA zeigte signifikante Veränderungen mit Größe, PC und Zeit (p < 0,0001) und Interaktionen (PC × Größe, PC × Zeit, Größe × Zeit und PC × Größe × Zeit) (p < 0,001) für die gesamte AuNP-Aufnahme, abgesehen von einer unbedeutenden Wechselwirkung (PC × Größe) für die LA- und PEG-AuNP-Aufnahme (p = 0,2). Wie in Abb. 3a–f gezeigt, wurde ein linearer Anstieg der zellulären Aufnahme von 40 und 80 nm blankem und PC AuNP neben dem 40 nm nackten und PC BPEI-AuNP beobachtet, das die höchste zelluläre Aufnahme nach 6 h erreichte und danach abnahm ( Abb. 3a). Nach 24 h enthielt jedoch das 40 nm kationische BPEI-AuNP die höchste Aufnahme, gefolgt von neutralem 40 nm PEG-AuNP und dann anionischem 40 nm LA-AuNP, was mit der C3A-Zellzytotoxizität von AuNP in Verbindung gebracht wurde (Abb. 2a .). ). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Studien, wonach kationisches Poly(N-(2-aminoethyl)acrylamid)- und BPEI-AuNP die größte Zellaufnahme im Vergleich zu denen von anionischer Poly(acrylsäure)- und LA-AuNP und neutralem Poly( N-(2,3-Dihydroxypropyl)acrylamid- und PEG-AuNP in menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Caco-2-Zellen, HPTC und menschlichen Hepatozyten [9, 32]. Darüber hinaus schwächte der NP-PC-Komplex alle 40- und 80-nm-BPEI- und LA-AuNP und das 40-nm-PEG-AuNP in C3A-Zellen, beschleunigten jedoch die 80-nm-PEG-AuNP-Aufnahme (Abb. 3f). Diese Ergebnisse werden durch die neueren Studien gestützt, dass PC die AuNP-Aufnahme in HUVEC, HEK und HPTC hemmte. unabhängig von Größe und Oberflächenladung [8, 9, 33]. Im Gegensatz dazu verstärkten PC- und HSA-Coronas die 40-nm-PEG-AuNP-Aufnahme in menschlichen Hepatozyten, letztere induzierte jedoch die 80-nm-PEG-AuNP-Aufnahme in HEK [7, 33] .

Zeitabhängige zelluläre Aufnahme des 40-nm-a BPEI-AuNP, b LA-AuNP und c PEG-AuNP und 80 nm d BPEI-AuNP, e LA-AuNP und f PEG-AuNP in Abwesenheit und Anwesenheit von PC in C3A-Zellen bis zu 24 h. Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. (n = 3). Die Buchstaben unterschieden sich laut Tukeys HSD-Test signifikant. BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol, PC menschliche Plasmaproteinkorona, MSD minimaler signifikanter Unterschied. *p <0,05; ** p < 0,005; ***p < 0,0001

Oxidative und nitrosative Stressmessungen

Da das 40 nm große bloße BPEI- und PEG-AuNP im Vergleich zu anderen AuNPs die höhere Zytotoxizität und Zellaufnahme in C3A-Zellen aufwies, wurden sie ausgewählt, um AuNP-induzierten oxidativen/nitrosativen Stress zu untersuchen. Beide AuNP modulierten die ROS/RNS-Erzeugung in C3A-Zellen zeit- und konzentrationsabhängig (p < 0,0001) und durch Interaktion (Zeit × Konzentration, p < 0,0001). Wie in Abb. 4a gezeigt, nahm die ROS/RNS-Erzeugung bei den höheren Konzentrationen des 40 nm BPEI-AuNP (62,5 μg/cm ² .) ab und 125 μg/cm ² ) um 1 h bei 37 °C, jedoch bis 24 h erhöht. Im Gegensatz dazu unterdrückte das 40-nm-PEG-AuNP die ROS/RNS-Erzeugung bei 39,1 μg/cm ² . erheblich weiter mit Falzwechsel < 0,5 bis 24 h (Abb. 4b). Die Aktivierung des Zelltods trägt häufig zur NP-Toxizität bei und in den meisten Fällen ist eine Zunahme der ROS/RNS-Produktion, die zu oxidativem Stress führt, für die NP-Toxizität verantwortlich [34]. Die oberflächenladungsabhängige ROS/RNS-Produktion wurde mit dem 40 nm kationischen BPEI- und neutralen PEG-AuNP beobachtet. Das 40 nm BPEI-AuNP zeigte bei hohen Konzentrationen ein biphasisches Muster der ROS/RNS-Erzeugung (Antioxidans ab 1 h und Prooxidans ab 3 h), was mit seiner Zytotoxizität in C3A-Zellen in Verbindung stand (Abb. 2a). Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Studien überein, dass die 40- und 80-nm-BPEI-AuNP- und die 20-nm-Citrat-AuNP-induzierte ROS-Erzeugung mit ihren Zytotoxizitäten in humanen Hepatozyten bzw. HepG2-Zellen in zeit- und konzentrationsabhängiger Weise in Verbindung gebracht wurden [7, 35]. AuNP zeigte eine durch oxidativen Stress induzierte Zytotoxizität in humanen promyelozytären Leukämiezellen, HL-60 mit einer totalen Glutathionreduktion, unabhängig von der Größe [19]. Im Gegensatz dazu diente das 40-nm-PEG-AuNP als Antioxidans, was darauf hindeutet, dass oxidativer/nitrosativer Stress möglicherweise kein direkter Mechanismus der 40-nm-PEG-AuNP-induzierten Zytotoxizität in C3A-Zellen ist (Abb. 2b).

Zeit- und konzentrationsabhängige ROS/RNS-Produktion in C3A-Zellen, die a . ausgesetzt wurden die 40 nm-BPEI-AuNP und b die 40 nm PEG-AuNP bis zu 24 h. Die Daten repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. (n = 3). Die Buchstaben unterschieden sich laut Tukeys HSD-Test signifikant. BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol, CTRL Kontrolle, MSD ein minimaler signifikanter Unterschied, PCN Pyocyanin (ROS-Induktor). ** p < 0,005; ***p < 0,0001

CYP3A4-Aktivitätsmessung

Es wurden die hemmenden Wirkungen von 40 und 80 nm blankem und PC AuNP auf die CYP3A4-Aktivität charakterisiert. Wie in Abb. 5 gezeigt, die 40 nm BPEI-, LA- und PEG-AuNP und die 80 nm BPEI-AuNP bei LC₅₀ -Werte hemmten die katalytische Aktivität von CYP3A4 in C3A-Zellen mit der entsprechenden Aktivität von 20,1 bis 31,4 % relativ zu den Kontrollen, unabhängig von Größe und Oberflächenladung. Nichttoxische Konzentrationen des 80 nm LA- und PEG-AuNP unterdrückten ebenfalls seine Aktivität (31,4 bzw. 26,6%). PC verbesserte jedoch die 40- und 80-nm-AuNP-induzierte CYP3A4-Hemmung erheblich, neben der 40- und 80-nm-PEG-AuNP, die 63 und 46 % Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen zeigte. Dies steht im Einklang mit In-vitro-Studien mit menschlichem Lebergewebe und Hepatozyten, dass anionische Gerbsäure-AuNP und kationisches 40 und 80 nm BPEI-AuNP die katalytische Aktivität von CYP3A4 wesentlich hemmten [7, 25]. Im Gegensatz dazu induzierten kationisches PEI-AuNP und neutrales Polyvinylpyrrolidon-AuNP die mRNA-Expression von CYP1A2, CYP2C9 und CYP3A4 in HepG2-Zellen bzw. CYP2B und CYP3A in Rattenleberscheiben [36, 37]. Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtet, dass die nackte 40 und 80 nm und PC-BPEI-AuNP die CYP3A4-Aktivität in menschlichen Hepatozyten durch eine Konformationsänderung des Proteins oder die Blockierung der Substrattasche als reversible Hemmung erheblich unterdrückten [7].

Eine hemmende Wirkung von AuNP auf die CYP3A4-Aktivität in C3A-Zellen, die 24 h lang 40 und 80 nm BPEI-, LA- und PEG-AuNP in Abwesenheit und Anwesenheit von PC ausgesetzt waren. Die Werte repräsentieren den Mittelwert  ± S.D. (n = 3). BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol, PC menschliche Plasmaproteinkorona

Toxizitätspfad-fokussiertes Genexpressionsprofil des 40 nm-PEG-AuNP

Von den repräsentativen Genen, die 13 verschiedene Stress- und Toxizitätswege abdecken, wurden insgesamt 212 Gene (↓186 und ↑26 Gene) bei LC₅₀ . unterschiedlich exprimiert Wert des 40 nm PEG-AuNP (Abb. 6, Zusatzdatei 1:Tabellen S2–S7). Die 12,3% (26 Gene, ↓26, ↑0 Gene) der gesamten Gene (212 Gene) waren überwiegend an der mitochondrialen Fettsäure-β-Oxidation beteiligt; für Apoptose 11,3% (24 Gene, 18, ↑6 Gene); für DNA-Schädigung und Reparaturweg 11,3% (24 Gene, 18, ↑6 Gene); und für die Hitzeschockreaktion 11,3% (24 Gene, ↓22, ↑2).

Repräsentative Gene, die an a . beteiligt sind mitochondriale Fettsäure-β-Oxidation, b Apoptose, c oxidativer Stress und antioxidative Reaktionen und d hepatische Aufnahme- und Effluxtransporter bei LC₅₀ Wert von 40 nm PEG-AuNP. Alle Daten hatten eine Faltungsänderung <− 2 und> 2 bei p < 0,05. Die genetische Ontologieanalyse ist in Zusatzdatei 1:Tabellen S2–S7

. aufgeführt

Im mitochondrialen Fettsäure-β-Oxidationsweg kodieren Gene für drei verschiedene Enzyme, die an der Produktion von Acyl-CoA beteiligt sind und Äquivalente von NADH und FADH reduzieren₂ wurden hauptsächlich unterdrückt; ACAD11-, ACAD9-, ACADM- und ACADS-Gene in Acyl-CoA-Dehydrogenasen (2,0- bis 13,6-fach); ACAA1 und ACAA2 in Ketoacyl-CoA-Thiolasen (7,3- bis 14,9-fach); DECR1, ECHS1, EHHADH und HADHA (10,7- bis 18,9-fach) in Enoyl-CoA-Hydratase (Abb. 6a, Zusatzdatei 1:Tabelle S2). Mitochondriale Fettsäure-β-Oxidation spielt eine wichtige Rolle bei der Produktion von Acyl-CoA und reduzierten Äquivalenten von NADH und FADH₂ , das mit vier Hauptenzymen assoziiert ist (Acyl-CoA-Dehydrogenasen, Enoyl-CoA-Hydratasen, Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenasen und Ketoacyl-CoA-Thiolasen [38, 39]. Außerdem Elektronenüberträger, NADH und FADH₂ , sind am Tricarbonsäurezyklus (TCA) und der mitochondrialen Atmungskette beteiligt, was zur ATP-Produktion führt. In der aktuellen Studie induzierte das 40-nm-PEG eine mitochondriale Dysfunktion, einen Verlust der ATP-Erhaltung durch eine Abnahme der intrazellulären Spiegel von ATP und FADH₂ , wodurch seine Zytotoxizität in C3-Zellen definiert wird (Fig. 2a). Ein ähnliches Phänomen wurde bei menschlichen Hepatozyten, HUVEC und HPTC, berichtet, die 40 nm BPEI-AuNP ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass mitochondriale Dysfunktion ein häufiger Mechanismus der AuNP-Toxizität sein kann, unabhängig von Oberflächenladung und Zelltyp [7,8,9]. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat berichtet, dass eine mitochondriale Dysfunktion relevante Zytotoxizität in immortalisierten Prostatakrebs-Epithelzellen und Lungenkrebs-Epithelzellen als Reaktion auf einen Inhibitor der STAT3-Phosphorylierung, OPB-51602, beobachtet wurde [40].

Im Apoptoseweg wurden die sechs pro-apoptotischen Gene von CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A, TNFRSF10B und TNFSF10 hochreguliert, während die sechs anti-apoptotischen Gene von AKT1, ALB, BCL2, BCL2L1, MCL1 und XIAP herunterreguliert wurden (Abb 6b, Zusatzdatei 1:Tabelle S3), die mit dosisabhängiger Zytotoxizität in C3A-Zellen korreliert wurde (Abb. 2a). Im DNA-Schadens- und Reparatur-Checkpoint wurden Gene der Checkpoint-Kinasen (CHEK1/2), der DNA-Exzisionsreparaturgene (ERCC1/2/3) und der DNA-Ligase IV (LIG4) hochreguliert, aber andere Exzisionsreparaturgene (ERCC5/ 6, XRCC1/5), die Checkpoint-Kinase (CDKN1A) und Proteinkinasen (PRKDC) Gene wurden herunterreguliert (2- bis 19-fach). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die durch 40 nm PEG-AuNP induzierte Störung des Zellzyklus und des DNA-Reparatursystems mit einer Induktion des Zelltods in C3A-Zellen korrelieren kann (Abb. 2a, Zusätzliche Datei 1:Tabelle S3). Gene, die für zwei verschiedene Hitzeschockproteine ​​(HSP) (A1A und A1B) kodieren, wurden hochreguliert (10,2- bis 14,2-fach), aber die HSP40-Unterfamilie A, B und C; HSP90-Mitglied 1; und HSP60 wurden herunterreguliert (2- bis 16-fach) (Zusatzdatei 1:Tabelle S4).

Bei oxidativem Stress und antioxidativer Reaktion das 40 nm PEG-AuNP bei LC₅₀ -Wert induzierte Antioxidantien-Gene und unterdrückte Pro-Oxidantien, was mit einer Abnahme der ROS/RNS-Erzeugung verbunden war, die selbst antioxidativ ist ( 4b ). In antioxidativen Genen wurden Glutathionperoxidase (GPX) 1, GPX2, GPX4, PRDX1, PRDX2, PRDX6, Superoxiddismutase (SOD) 1 und CAT induziert (3,8- bis 18,1-fach). In prooxidativen Genen wurden TXNIP und PPP1R15B supprimiert (4,8- bzw. 17-fach) (Abb. 6c, Zusätzliche Datei 1:Tabelle S5). Dies steht im Einklang mit einer früheren Studie, in der AuNP unabhängig von der Größe eine durch oxidativen Stress induzierte Zytotoxizität in HepG2 und menschlichen Hepatozyten aufwies [7, 19].

Im Phase-I-Metabolismus wurden CYP3A4- und ESD-Gene umfassend (7-fach bzw. 12-fach) supprimiert. Insbesondere korrelierte die hemmende Wirkung von 40 nm PEG-AuNP auf die CYP3A4-Expression mit einer Abnahme der CYP3A4-Aktivität (Fig. 5). Jüngste Studien berichteten, dass das 40 nm BPEI-AuNP die Genexpression von CYP1A2, CYP2C9 und CYP3A4 in menschlichen Hepatozyten hemmte; ESD bei HUVEC; und CYP1A1 bei HPTC [7,8,9]. Eine epidemiologische Studie zeigte, dass CYP-Enzyme im Lebergewebe von HCC-Patienten durch den tumorigenen Prozess auf molekularer und funktioneller Ebene wesentlich gehemmt wurden [41].

Genexpressionsprofil der Wirkstoffaufnahme und des Effluxtransporters

Die Entwicklung einer Multidrug-Resistenz (MDR) durch Tumorzellen ist eine der Hauptursachen für das Versagen von Krebstherapien [42, 43]. Integrale Membrantransporter-vermittelte Abnahme der Medikamentenaufnahme und Zunahme des Medikamenten-Efflux, einschließlich P-Glykoprotein (P-gp) und Brustkrebs-Resistenzprotein (BCRP), ist einer der Hauptmechanismen der MDR.

Die differenzielle Genexpression von Wirkstoff-Efflux- und -Aufnahmetransportern in C3A-Zellen, die 40 nm PEG-AuNP ausgesetzt waren, zeigte, dass insgesamt 14 Gene von ABC-Transportern (↓12- und ↑2-Gene) und insgesamt 21 Gene von SLC-Transportern (↓21 und ↑0 Gene) wurden bei LC₅₀ . wesentlich moduliert Wert (Abb. 6d und 7, Zusatzdatei 1:Tabelle S7). In Arzneimittel-Efflux-Transportern der ABC-Familie waren Gene des Multidrug-Resistenz-assoziierten Proteins (MRP3/ABCC3), MRP4 (ABCC4) und des Cholesterin-Efflux-regulierten Proteins (CERP/ABCA1) in der basolateralen Membran (7,2- bis 10,4-fach) herunterreguliert. Die Gene, die P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), BCRP (ABCG2) und Sterolin 2 (ABCG8) in kanalikulären Effluxtransportern kodieren, wurden ebenfalls supprimiert (8,6- bis 13,8-fach). Im Gegensatz dazu waren die Multidrug-Resistenz (MDR4/ABCB4) in der kanalikulären Membran und der Mitochondrien-ABC-Transporter (MTABC3/ABCB6) in der äußeren mitochondrialen Membran stark hochreguliert (9,8-fach bzw. 5,8-fach). Bei Wirkstofftransportern wurden auch Gene des Kupfertransporterproteins (CTR1/SLC31A1) und in geringerem Maße der Transport organischer Anionen (OAT7/SLC22A9) gehemmt (18-fach bzw. 15-fach). Diese Ergebnisse stützen eine kürzlich durchgeführte Studie, dass das 40 nm BPEI-AuNP MDR3 in menschlichen Hepatozyten herunterreguliert, aber MRP3 in HUVEC hochreguliert, was auf eine Oberflächenladungs- und Zelltyp-abhängige Interaktion zwischen AuNP und Effluxtransportern hinweist [7, 8]. Eine epidemiologische Studie zeigte, dass beim HCC-Tumor eine hohe Expression von BCRP und eine niedrige Expression von OCT3 auftraten, die eng mit der Tumorprogression und ihrer Größe verbunden war [44]. Eine frühere Studie zeigte, dass der P-gp-Inhibitor Verapamil die Zytotoxizität von mit Doxorubicin konjugiertem Glutathion-AuNP in felinen Fibrosarkom-Zelllinien durch Erhöhung der intrazellulären Wirkstoffkonzentration verstärkt [45]. Die aktuelle Studie betont, dass die von Mechanismen abgeleiteten Informationen zum 40-nm-PEG-AuNP eine separate, aber immer noch komplementäre Wirkung auf die mitochondriale Fettsäure-β-Oxidation, den TCA-Zyklus und die Atmungskette, den Wirkstoff-Efflux und -Aufnahmetransporter sowie die CYP3A4-Aktivität in identifizierten C3A-Zellen (Abb. 7). Letztendlich wird dies die Interaktion von AuNP mit biologischen Schlüsselprozessen und dem zugrunde liegenden molekularen Mechanismus bei HCC hervorheben, was weiter an der Entwicklung eines wirksameren therapeutischen Ziels bei der HCC-Behandlung beteiligt sein könnte.

Eine schematische Darstellung der grundlegenden Wirkmechanismen von 40 nm PEG-AuNP bei der HCC-Behandlung. Grüne Balken (eine Hemmung) und rosa Dreiecke (eine Induktion) zeigen die 40 nm PEG-AuNP-modifizierten biologischen Marker und Signalwege an. Die genetische Ontologieanalyse ist in Zusatzdatei 1:Tabellen S2–S7

. aufgeführt

Zur Validierung der Genexpressionsanalyse von RT ² Array wurden die neun Gene für die Real-Time-PCR ausgewählt. In Zusatzdatei 1:Tabelle S1 wurden alle neun Gene bei LC₅₀ . moduliert des 40 nm-PEG-AuNP. Diese transkriptionellen Veränderungen stimmten mit denen bei der Genexpressionsanalyse mit PCR-Arrays überein (Abb. 6, Zusätzliche Datei 1:Tabellen S2–S7).

Schlussfolgerungen

Wir haben gezeigt, dass kationische BPEI-, anionische LA- oder neutrale PEG-AuNP-Wechselwirkung mit humaner Plasmaproteinkorona (PC) die Veränderungen in D . verursacht _H , PDI und das Z-Potential von AuNP und beeinflussten weiter die zellulären Antworten in C3A-Zellen. Alle nackten (kein PC) 40- und 80-nm-AuNP waren neben dem 80-nm-LA-AuNP für C3A-Zellen zytotoxisch, aber PC verbesserte ihre Zytotoxizität neben dem 80-nm-BPEI-AuNP vollständig. Das bloße 40 nm BPEI-AuNP zeigte die höchste zelluläre Aufnahme, gefolgt vom 40 nm PEG-AuNP und dann dem 40 nm LA-AuNP, während PC die AuNP-Aufnahme neben dem 80 nm PEG-AuNP unterdrückte. Das 40 nm BPEI-AuNP verursachte in C3A-Zellen zweiphasige Reaktionen auf oxidativen Stress (pro- und antioxidativ), während das 40 nm PEG-AuNP antioxidativ wirkte. Die CYP3A4-Aktivität wurde von allen bloßen AuNPs unabhängig von Größe und Oberflächenladung weitgehend unterdrückt, während PC seine hemmende Wirkung auf die Enzymaktivität neben dem 40- und 80-nm-PEG-AuNP erheblich verbesserte. Differenziell exprimierte Gene bei LC₅₀ -Wert von 40 nm PEG-AuNP waren hauptsächlich an der mitochondrialen Fettsäure-β-Oxidation und in geringerem Maße an hepatischen Efflux-/Aufnahmetransportern beteiligt. Das 40 nm-PEG-AuNP hemmte drei Hauptenzyme der β-Oxidation (Acyl-CoA-Dehydrogenase, Enoyl-CoA-Hydratase und Ketoacyl-CoA-Thiolase), andere Enzyme im TCA-Zyklus und die mitochondriale Atmungskette für die ATP-Produktion. Das 40-nm-PEG-AuNP erhöhte die Expression pro-apoptotischer Gene und verringerte anti-apoptotische Gene bei LC₅₀ Wert. In C3A-Zellen, die 40 nm PEG-AuNP ausgesetzt waren, wurde ein hoher Gehalt an Antioxidantien und ein niedriger Gehalt an prooxidativen Genen beobachtet. Darüber hinaus wurden die Gene des Wirkstoff-Efflux und der Aufnahmetransporter, die sich sowohl in der basolateralen als auch in der kanalikulären Membran befanden, wesentlich moduliert.

Abkürzungen

ANOVA:

Einseitige Varianzanalyse

AuNP:

Goldnanopartikel blank:kein PC

BPEI:

Verzweigtes Polyethylenimin

CYP:

Cytochrom P450

D _H :

Hydrodynamische Durchmesser

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

EMEM:

Eagles minimales essentielles Medium

HCC:

Humanes hepatozelluläres Karzinom

HPTC:

Menschliche proximale tubuläre Nierenzellen

HSD:

Tukeys ehrlicher signifikanter Unterschiedstest

HUVEC:

Menschliche Nabelvenenzellen

ICP-MS:

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma

LA:

Anionische Liponsäure

LC₅₀ :

Mediane letale Konzentration

MDR:

Mehrfachresistenz

NP:

Nanopartikel

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PC:

Humane Plasmaproteinkorona

PDI:

Polydispersitätsindex

PEG:

Neutrales Polyethylenglykol

RNAi:

RNA-Interferenz

RNS:

Reaktive Stickstoffspezies

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SO:

Superoxid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TFF:

Tangentialflussfiltration