Hydrogel-unterstütztes Elektrospinnen für konforme Nanofaserbeschichtung auf 3D-Ohrknorpel-Hydrogel-Kollektoren

Zusammenfassung

Elektrospinnen ist ein gängiges und vielseitiges Verfahren zur Herstellung von Nanofasern und deren Ablagerung auf einem Kollektor als zweidimensionale Nanofasermatte oder dreidimensionale (3D) makroskopische Anordnung. Allerdings erschweren 3D elektrokonduktive Kollektoren mit komplexen Geometrien – einschließlich vorstehender, gekrümmter und vertiefter Bereiche – allgemein eine konforme Abscheidung und führen zu unvollständiger Bedeckung mit elektrogesponnenen Nanofasern. In dieser Studie schlagen wir eine konforme Fertigung einer elektrogesponnenen Nanofasermatte auf einem 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektor vor, basierend auf hydrogel-unterstütztem Elektrospinnen. Um den Einfluss der komplexen Geometrien zu verringern, wurden die vorstehenden Teile des 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektors durch Ausnutzen der Flexibilität des Hydrogels abgeflacht. Numerische Simulationen zeigten, dass die vorgeschlagene Fertigungstechnik das ungleichmäßig fokussierte elektrische Feld, verursacht durch die komplexen Geometrien des 3D-Kollektors, signifikant verringern konnte, indem die Standardabweichung um mehr als 70 % reduziert wurde. Experimentell wurde bestätigt, dass eine elektrogesponnene Nanofasermatte den abgeflachten Hydrogel-Kollektor konform mit gleichmäßiger Dicke bedeckte, was mit dem ursprünglichen Hydrogel-Kollektor nicht erreicht wurde. Da diese Studie die konforme Elektrospinn-Technik auf 3D elektrokonduktiven Kollektoren etabliert, wird sie zu verschiedenen elektrospinnbezogenen Forschungsbereichen beitragen, einschließlich Gewebetechnik, Medikamenten-/Zellabgabe, Umweltfilter und Bekleidung.

Einleitung

Elektrospinnen ist eine effektive und vielseitige Technik zur Herstellung von Nanofasern und ihren Assemblies, die in den vergangenen Jahrzehnten intensiv untersucht wurde [1]. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften wie hoher Porosität, hohem Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis und extrazellulärer Matrix-nachahmender Struktur [2] haben elektrogesponnene Nanofasern und ihre Assemblies großes Interesse in verschiedenen Forschungsfeldern geweckt, darunter Bekleidung [3], Umweltfilter [4,5,6], Batterien [7] und gewebetechnische Scaffolds [8,9,10]. Die chaotische Bewegung elektrogesponnener Nanofasern aufgrund von Biegeinstabilität hat jedoch die präzise Kontrolle beim Aufbau von Nanofaser-Assemblies erschwert und allgemein zufällig verwobene 2D-Nanofasermatten erzeugt [11]. Neuere Fortschritte im Elektrospinn-Prozess haben den Bereich der Nanofaser-Assemblies von 2D-flachen Matten auf 3D-nanofibröse Makrostrukturen erweitert [12,13,14,15]. Mit 3D-nanofibrösen Scaffold-Fertigungstechniken, einschließlich 3D-Template-Elektrospinnen, Nanofasern-Film-Stapeln und Zentrifugalelektrospinnen [13,14,15,16], wurden verschiedene 3D-nanofibröse Makrostrukturen hergestellt, darunter hohle Röhrenstrukturen [17], geformte 3D-komplexe Geometrien [18] und nativ-gewebegeformte nanofibröse Scaffolds [19]. Solche 3D-nanofibrösen Makrostrukturen sind insbesondere in der Gewebetechnik von wachsendem Interesse, da sie nicht nur eine biomimetische nanofibröse Struktur besitzen, sondern auch die 3D-Makrostruktur nativen Gewebes nachahmen [20, 21]. Dies führte zu Verbesserungen der ästhetischen und funktionalen Eigenschaften von 3D-Nanofaser-Assemblies [22, 23].

Unter verschiedenen 3D-Elektrospinn-Techniken, einschließlich Hydrolyse, Gasbildungsverfahren, Rollen, Falten und 3D elektrokonduktiven Kollektoren, bietet das Elektrospinnen auf einem 3D elektrokonduktiven Kollektor einen einfachen Weg, elektrogesponnene Nanofasern ohne Nachbearbeitung in eine 3D-nanofibröse Makrostruktur zu assemblieren [24,25,26,27]. Die komplexen Geometrien des 3D elektrokonduktiven Kollektors, wie starke Biegungen oder vertiefte Formen, ermöglichen die Herstellung ausgerichteter Nanofasermatten oder flauschiger 3D-nanofibröser Makrostrukturen [28]. Gleichzeitig behindern jedoch solche komplexen Geometrien die Ablagerung elektrogesponnener Nanofasern in den vertieften Bereichen des Kollektors und verursachen eine unvollständige Bedeckung. Daher ist es sehr schwierig, die komplexen Geometrien eines 3D elektrokonduktiven Kollektors in eine 3D-Nanofasermatte zu replizieren. Da eine unvollständige Bedeckung zu einer Verschlechterung von Funktionalitäten wie Filtrationseffizienz und mechanischen Eigenschaften führen kann, ist es notwendig, eine Technik zu entwickeln, die die Form eines hochkomplexen 3D elektrokonduktiven Kollektors in eine 3D-nanofibröse Makrostruktur repliziert, um die Anwendung elektrogesponnener Nanofaser-Assemblies zu erweitern.

In dieser Studie schlagen wir eine konforme Fertigung einer elektrogesponnenen Nanofasermatte vor, die die Form eines 3D elektrokonduktiven Kollektors mit komplexen Geometrien repliziert. Als repräsentatives Beispiel wählten wir einen 3D ohrknorpelförmigen Kollektor aufgrund seiner komplexen Geometrien. In einer früheren Studie schlugen wir ein Hydrogel vor, das ausreichend mobile Ionen besitzt, um ein elektrisches Feld wie ein Metallkollektor zu erzeugen, als elektrokonduktiven Kollektor für Elektrospinnen vor [29]. Hier nutzen wir die Flexibilität eines Hydrogel-Kollektors, um elektrogesponnene Nanofasern konform und gleichmäßig auf dem 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektor abzuscheiden. Im Gegensatz zu einem Metallkollektor kann der Hydrogel-Kollektor aufgrund seiner Flexibilität abgeflacht werden und dadurch ein gleichmäßiges elektrisches Feld erzeugen, das Nanofasern gleichmäßig auf der gesamten Oberfläche des 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektors ablagert. Darüber hinaus kann die mechanische Festigkeit des Hydrogels durch Auswahl eines geeigneten Hydrogels an die des nativen Gewebes angepasst werden. Wir wählten Alginat und Gelatin als Hydrogel-Materialien aufgrund ihrer ausgezeichneten Biokompatibilität [30, 31]. Durch Mischen von Alginat und Gelatin konnten wir mechanische Eigenschaften erreichen, die dem nativen Ohrknorpel ähnlich sind [32]. Wir untersuchten numerisch den Einfluss der Abflachung des 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektors auf die konforme Fertigung einer elektrogesponnenen Nanofasermatte. Schließlich bestätigten wir die konforme Fertigung, indem wir die Dicke der elektrogesponnenen Nanofasermatte an mehreren Positionen – Helix, Antihelix, Scapha und Antitragus – maßen.

Materialien und Methoden

Materialien

Sylgard® 184 Silikon-Elastomer-Basis (PDMS-Monomer) und Sylgard® 184 Silikon-Elastomer-Härter (Vernetzungsmittel) wurden von Dow Corning (USA) bezogen. Polylactid (PLA)-Filamente stammten von Snapmaker (USA). Gelatin aus Rinderhaut, Natriumsalz der Alginic-Säure, Calciumchlorid-Dihydrat (≥ 99 %), Polycaprolacton (PCL, Mw 80.000) und Chloroform (≥ 99,5 %) wurden von Sigma Aldrich (USA) bezogen. Deionisiertes Wasser und Methylalkohol (≥ 99,5 %) wurden von Samchun Chemical Co., Ltd. (Südkorea) bezogen. Alle Materialien wurden ohne zusätzliche Reinigung verwendet.

Herstellung einer PDMS-Negativform des 3D Ohrknorpel-Templates

Die CAD-Datei des 3D ohrknorpelförmigen Templates mit den Abmessungen 70 (Länge) × 20 (Breite) × 1,1 mm (Dicke) wurde über die Turbosquid-Website bezogen und in 3DS Max modifiziert. Das Template wurde mit einem 3D-Drucker (A150, Snapmaker, USA) gedruckt. PDMS-Monomer und Härter wurden im Verhältnis 10:1 gemischt. Die unvernetzte PDMS-Mischung wurde 5 Minuten manuell gerührt und anschließend in einer Vakuumkammer entgast, bis alle sichtbaren Luftblasen verschwunden waren. Die Mischung wurde in eine Einweg-Wiegschale gegossen, das Template vollständig eingetaucht und bei 50 °C für 24 Stunden ausgehärtet. Nach dem Aushärten wurde die Schale halbiert und das Template entfernt, um die PDMS-Negativform zu erhalten.

Herstellung eines Alginat-Gelatin-Hydrogels

Vier Alginat-Gelatin-Hydrogele wurden mit unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen hergestellt (Tabelle 1). Gelatin wurde in 50 °C Wasser unter magnetischem Rühren (300 rpm) für 1 Stunde gelöst. Alginat wurde hinzugefügt und 5 Minuten manuell gemischt. Die Lösung wurde in die PDMS-Negativform gegossen und 2 Stunden in 10 % (Gew.-%) Calciumchlorid-Lösung ionisch vernetzt. Anschließend wurde das Hydrogel aus der Form entnommen und als elektrokonduktiver Kollektor für Elektrospinnen verwendet.

Mechanische Prüfung des Alginat-Gelatin-Hydrogels

Die Hydrogele wurden als ASTM D638 Typ IV Probekörper für Zugversuche hergestellt. Jeder Probekörper wurde auf einer Universalprüfmaschine (QM100S, QMESYS, Südkorea) bei konstanter Verschiebungsgeschwindigkeit von 10 mm/min geprüft. Elastizitätsmodul und Zugfestigkeit (UTS) wurden aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve berechnet.

Konforme Fertigung einer elektrogesponnenen Nanofasermatte

PCL (7,5 %, Gew./Vol.) wurde in Chloroform-Methanol (3:1) unter Rühren über 6 Stunden gelöst. Die Lösung wurde in eine 3-mL-Plastikspritze gefüllt und mit einer Spritzpumpe (NE-1000, New Era Pump Systems, USA) durch eine Metallnadel (0,6 mm Innendurchmesser) mit 0,4 mL/h extrudiert. Der 3D ohrknorpelförmige Hydrogel-Kollektor (Alginat-Gelatin-Verhältnis 25:75, A25G75) wurde auf einem flachen PMMA-Substrat platziert, 20 cm unter der Nadel. Für das Elektrospinnen wurde eine Hochspannung von 19 kV (HV30, NanoNC Co., Ltd., Südkorea) zwischen Nadel und Kollektor bei Raumtemperatur und 40–50 % Luftfeuchtigkeit angelegt. Um die Nanofasermatte konform auf der gesamten Oberfläche abzuscheiden, wurden die vorstehenden Teile des Hydrogel-Kollektors abgeflacht. Nach der Beschichtung einer Seite wurde der Kollektor gewendet, um die andere Seite zu beschichten.

Charakterisierung der elektrogesponnenen Nanofasermatte

Die Nanostruktur wurde mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM; Supra 25, Carl Zeiss, Deutschland) untersucht, Faserdurchmesser mittels ImageJ gemessen. Für Dickenmessungen wurde die Nanofasermatte mit dem Hydrogel-Kollektor in PDMS-Monomer/Härter-Mischung (10:1) eingetaucht, bei 50 °C für 24 Stunden ausgehärtet, quergeschnitten und die Dicke mittels Mikroskop (Olympus BX53F2, Olympus, Japan) an den Querschnittsaufnahmen gemessen.

Numerische Simulation

Das elektrische Feld zwischen Metallnadel und Kollektor wurde mit COMSOL Multiphysics v5.0 simuliert. Drei Modellsammler aus Kupfer, PLA und Hydrogel wurden verwendet. Der 3D-Kollektor wurde als 2D-Querschnittsgeometrie vereinfacht. Ein Metall-Erddraht war mit dem Kollektor verbunden. Geometrische Parameter entsprachen den tatsächlichen Prozesswerten: Nadel-Kollektor-Abstand 20 cm, angelegte Spannung 19 kV. Das Hydrogel wurde basierend auf der Raumladungsdichte der Interstitialflüssigkeit modelliert. Mobile Ionen werden durch die Boltzmann-Gleichung beschrieben, was zur Raumladungsdichte ρ(x) führt [33]. Die Dielektrizitätskonstante des Hydrogels wurde auf 70 gesetzt [34]. Zur Darstellung der Feldrichtung wurde eine Referenzlinie l(x) von 10 mm Länge 10 mm über dem vertieften Bereich gezeichnet.

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit einseitiger ANOVA mittels MINITAB v17.1.0 (MINITAB, USA) durchgeführt. Signifikanz wurde bei p < 0,05 angenommen.

Ergebnisse und Diskussion

Hydrogel-unterstütztes Elektrospinnen

Abbildung 1 schematisiert den konformen Fertigungsprozess. Abb. 1a zeigt den 3D-Druck des Templates (FDM). Durch 3D-Druck kann die Struktur frei gestaltet und an hochkomplizierte Formen wie Ohrknorpel angepasst werden. Höhere Auflösung liefern SLA- oder DLP-Drucker durch Photopolymerisation. Abb. 1b zeigt die PDMS-Negativform. Abb. 1c den Hydrogel-Kollektor in Ohrform. Abb. 1d den konformen Fertigungsprozess. Wird der Hydrogel-Kollektor auf ein flaches Substrat gelegt, berührt die Helix das Substrat nicht aufgrund der komplexen Geometrie, was Höhenunterschiede zwischen Helix, Scapha und Antihelix erzeugt. Generell verhindert der vorstehende Teil eines 3D-Kollektors eine konforme Abscheidung, da er die meisten Nanofasern anzieht und die Ablagerung in tieferen Bereichen behindert [35, 36]. Um den Einfluss zu reduzieren, wurde der vorstehende Teil durch Ausnutzen der Hydrogel-Flexibilität auf das Substrat abgeflacht. Anschließend wurde elektrogesponnen, wobei die Nanofasermatte konform auf der gesamten Oberfläche abgelagert wurde. Schließlich kehrte der abgeflachte Kollektor mit der Nanofasermatte in seine ursprüngliche Ohrform zurück, da die Abflachung im elastischen Verformungsbereich erfolgte und die Nanofasermatte aufgrund ihrer geringen Dicke im Vergleich zum Hydrogel keinen nennenswerten Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften hat.

Herstellung und mechanische Charakterisierung des Alginat-Gelatin-Hydrogels

Abb. 2a zeigt das PLA-gedruckte Template. PLA eignet sich aufgrund ausreichender mechanischer Eigenschaften und hoher Schmelztemperatur (~130 °C) für die PDMS-Formgebung bei Beibehaltung der Ohrform. Abb. 2b die PDMS-Negativform, gewählt wegen ihrer Flexibilität für das Entformen komplexer Geometrien. Abb. 2c der Hydrogel-Kollektor mit komplexer Ohrstruktur (Helix, Scapha, Antihelix). Um den weiten Bereich mechanischer Eigenschaften zu demonstrieren, wurden 4 Proben mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen geprüft. Abb. 2d, e zeigen Spannungs-Dehnungs-Kurven und Young'sche Moduln. Reines Gelatin (A0G100) zeigte die geringste Festigkeit (0,04 ± 0,01 MPa) und war während des Elektrospinnens forminstabil. Reines Alginat (A100G0) hatte den höchsten Modul (5,53 ± 0,77 MPa). Die Mischungen A50G50 (2,10 ± 0,45 MPa) und A25G75 (1,35 ± 0,03 MPa) lagen dazwischen. Der A25G75-Modul fiel in den Bereich des nativen Ohrknorpels (1–2 MPa, grauer Bereich in Abb. 2e), weshalb dieses Verhältnis für den Kollektor gewählt wurde.

Herstellung der Nanofasermatte auf dem Alginat-Gelatin-Hydrogel-Kollektor

Zur Untersuchung des Abscheideverhaltens führten wir numerische Simulationen des elektrischen Feldes mit drei Kollektortypen durch: Kupfer, PLA und Alginat-Gelatin-Hydrogel. Die Abscheidung wird durch die Wechselwirkung zwischen Nanofaserladung und elektrischem Feld bestimmt. Die Simulation mit dem PLA-Kollektor (Abb. S1b) zeigte, dass sich das Feldmostly zum Erddraht konzentrierte, sodass keine Ablagerung auf der Kollektoroberfläche erwartet wurde. Im Gegensatz dazu zeigte das Alginat-Gelatin-Hydrogel (Abb. S1c) eine Feldfokussierung über die gesamte Oberfläche, ähnlich wie Kupfer (Abb. S1a). Dies liegt an der ausreichenden elektrischen Leitfähigkeit des Hydrogels durch mobile Ionen. Der PLA-Kollektor als dielektrisches Material konnte das Feld nicht ausreichend anziehen. Diese Simulationsergebnisse wurden experimentell bestätigt: Auf PLA lagerten sich Nanofasern hauptsächlich auf dem Erddraht und der Helix ab, ansonsten nur im Mikrometerbereich. Auf dem Hydrogel betrug die Dicke an der Helix 33,24 ± 2,43 µm vs. 3,09 ± 0,37 µm auf PLA (Abb. S1d). Das Hydrogel ist somit ein effektiver Kollektor.

Abb. 3a zeigt die Nanofasermatte auf dem Hydrogel-Kollektor mit unvollständiger Bedeckung, besonders in der Scapha (vertiefter Bereich zwischen Helix und Antihelix). Abb. 3b (SEM-Vergrößerung) zeigt hochwertige Nanofasern mit hohem Aspektverhältnis (Nanometer-Dicke, Mikrometer-Länge), ohne Defekte wie Blasen. Der durchschnittliche Faserdurchmesser betrug 564 ± 153 nm, die meisten Fasern 400–600 nm (Abb. 3c). Der Prozess lief kontinuierlich ab.

Wie Abb. 3a zeigt, war die Bedeckung unvollständig, besonders in der Scapha. Nanofasern waren nicht konform abgelagert, sondern hingen als ausgerichtete Konfiguration, ähnlich der "inclined gap"-Methode [28]. Komplexe Geometrien wie Vorstülpungen oder hohe Krümmung verursachen generell unvollständige Bedeckung.

Numerische Simulation der konformen Fertigung

Um konforme Fertigung zu erreichen, nutzten wir die Hydrogel-Flexibilität, die bei Metallkollektoren nicht möglich ist. Die Flexibilität ermöglicht Formänderung, Höhenunterschiedsreduktion und Abflachung. Abb. 4a-(i) zeigt die Prozesskonfiguration, 4a-(ii) den vertieften Bereich (Scapha) im 2D-Querschnitt. Die Helix war ca. 60° zum Substrat geneigt. Um den vertieften Bereich zu verringern, bogen wir die Helix durch Ausnutzen der Flexibilität. Simulationsergebnisse für Biegewinkel 0°, 30°, 60° sind in Abb. 4b-(i)–(iii) gezeigt. Abb. 4b-(iv) zeigt den Feldwinkel entlang der Referenzlinie. Die durchschnittlichen Winkel betrugen 79,56°, 79,39°, 77,26° – eine systematische Abweichung, da der vertiefte Bereich links liegt. Die Winkelsabweichung (Standardabweichung) betrug bei 0° Biegewinkel 8,23°, bei 60° nur 2,36° – eine Reduktion um >70 %. Die große Abweichung bei 0° resultiert aus der Feldfokussierung auf die vorstehende Helix, was konzentrierte Ablagerung dort und behinderte konforme Abscheidung verursacht. Die Reduktion durch Biegen lindert diese Fokussierung und ermöglicht konforme Abscheidung.

Konforme Fertigung auf dem 3D Ohrknorpel-Hydrogel-Kollektor

Basierend auf der Simulation wurde der Hydrogel-Kollektor abgeflacht (Abb. S2b: Helix und äußere Teile mit Metallklammern fixiert). Der nanofaserbeschichtete Kollektor kehrt in seine ursprüngliche Form zurück, da die Verformung im elastischen Bereich erfolgte und die Nanofasermatte die mechanischen Eigenschaften nicht nennenswert beeinflusst. Elektrospinnen wurde auf originalem und abgeflachtem Kollektor durchgeführt. Querschnittsaufnahmen sind in Abb. 5a-(i), (ii).

Beim originalen Kollektor waren Nanofasern zwischen Helix und Antihelix gespannt, nicht auf der Scapha abgelagert. Beim abgeflachten Kollektor bedeckte die Nanofasermatte Helix, Scapha und Antihelix vollständig. Besonders in der Scapha (vertiefter Bereich) war Ablagerung nun möglich. Abb. 5b zeigt den dramatischen Dickenunterschied: Beim originalen Kollektor war die Dicke minimal (verzögerte Ablagerung), beim abgeflachten Kollektor ausreichend. Damit wurde konforme Abscheidung auch bei komplexen Geometrien erreicht.

Abb. 6 bestätigt die Gleichmäßigkeit auf dem abgeflachten Kollektor. Abb. 6a: Vollständige Bedeckung ohne Hohlräume. Abb. 6b: Dicken an Helix (54,58 ± 3,99 µm), Antihelix (55,40 ± 1,17 µm), Antitragus (53,05 ± 1,39 µm), Scapha (51,49 ± 1,24 µm) – wobei Scapha beim originalen Kollektor keine Ablagerung zeigte. Die Nanofasermatte wurde konform und gleichmäßig abgelagert. Basierend auf früheren Hydrogel-Elektrospinn-Studien kann die Dicke durch Ausnutzen des Hydrogel-Kollektors kontrolliert werden. Als Ausblick: Da der 3D Hydrogel mit Nanofasermatte mechanische Eigenschaften wie nativer Ohrknorpel besitzt und eine biomimetische Nanostruktur aufweist, könnte er als künstliches Ohrknorpel-Implantat dienen. Für Gewebetechnik-Anwendungen darf die Restladung in der Nanofasermatte nicht vernachlässigt werden, da sie Zellverhalten beeinflussen könnte. Diese konforme Fertigung ist Pionierarbeit für 3D-Nanofasermembranen und könnte breit genutzt werden: 3D nativ-gewebe-nachahmende Scaffolds, 3D poröse Membranen für effiziente Filtration.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend entwickelten wir die konforme Fertigung einer elektrogesponnenen Nanofasermatte auf einem 3D ohrknorpelförmigen Hydrogel-Kollektor mit vertieften Bereichen. Die Nanofasermatte replizierte die Kollektorform vollständig. Entscheidend war die Nutzung der Hydrogel-Flexibilität zur Anpassung des vertieften Bereichs, wodurch konforme Abscheidung mit gleichmäßiger Dicke auf der gesamten Oberfläche erreicht wurde – unmöglich mit konventionellem Elektrospinnen. Da die Technik mit verschiedenen Hydrogel-Materialien kompatibel ist, ist sie vielseitiger und effektiver für konforme Nanofasermatten in Gewebetechnik, Medikamenten-/Zellabgabe, Bekleidung und Batterien.