MicroRNA-499-5p stellt Lungenfunktion bei sepsis-induzierter Verletzung durch Targeting von Sox6 wieder her

Zusammenfassung

Hintergrund

MicroRNAs (miRs) sind bekannt dafür, an Sepsis teilzunehmen; daher zielen wir darauf ab, den schützenden Effekt von miR-499-5p, das das sex-bestimmende Region Y-verwandte High-Mobility-Group-Box 6 (Sox6) targetet, auf sepsis-induzierte Lungenverletzung bei Mäusen zu diskutieren.

Methoden

Das sepsis-induzierte Lungenverletzungsmodell wurde durch Caecum-Ligation und -Punktion etabliert. Das Nass-/Trocken-Gewichts-Verhältnis (W/D), miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 und Caspase-9 Expression in Lungengeweben von Mäusen wurden getestet. Lungenverletzungsscore, Kollagenfasern und der Grad der Lungenfibrose in Lungengeweben wurden bestimmt. Weiterhin wurde die Zellapoptose in Lungengeweben gemessen. Die Entzündungsfaktoren und oxidativen Stressindizes in bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BALF) und Lungengeweben wurden mittels Loss-of-Function- und Gain-of-Function-Assays detektiert. Die Targeting-Beziehung zwischen miR-499-5p und Sox6 wurde verifiziert.

Ergebnisse

W/D-Verhältnis und Sox6 waren erhöht, während miR-499-5p in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung verringert war. Wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 linderten die Lungengewebspathologie, reduzierten Lungenverletzungsscore, Kollagenfasern, Grad der Lungenfibrose, TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression sowie Entzündungsfaktoren in BALF und Lungengeweben sowie die oxidative Stressantwort in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung. miR-499-5p targetete Sox6.

Schlussfolgerung

Hohe Expression von miR-499-5p kann Zellapoptose in Lungengeweben abschwächen und Entzündung bei sepsis-induzierter Lungenverletzung bei Mäusen durch Depletion von Sox6 inhibieren, und es ist ein potenzieller Kandidat-Marker und therapeutisches Ziel für sepsis-induzierte Lungenverletzung.

Einleitung

Sepsis ist eine systemische Entzündung, die als Folge einer Infektion auftritt und multiple Organdysfunktionen verursacht, einschließlich akutem Atemnotsyndrom [1]. Sie ist durch tiefen Hypotonie, progressive Hypoxämie, Gewebeschäden und entzündliche Veränderungen gekennzeichnet [2]. Die Lunge ist das kritischste und vulnerabelste Organ bei Sepsis, und akute Lungenverletzung (ALI) ist eine häufige sepsis-induzierte Entzündungskrankheit [3]. Die Schwere der sepsis-induzierten ALI kann auf die beeinträchtigte Permeabilität des alveolokapillären Netzwerks zurückgeführt werden, was zu verminderter Sauerstoffversorgung führt [4]. Lungenzellapoptose ist ein kritischer Faktor bei sepsis-induzierter Lungenverletzung [5]. Die Pathophysiologie der sepsis-induzierten ALI ist unbekannt, unterstützende Maßnahmen und Antibiotika sind die einzigen verfügbaren Behandlungen für Sepsis- und ALI-Patienten, und ihre Auswirkung auf die hohen Mortalitätsraten durch Sepsis ist begrenzt [6].

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende Segmente endogen exprimierter RNAs, bestehend aus ca. 18–24 Nukleotiden, die eine Vielzahl zellulärer Funktionen kontrollieren und an Zielregionen eines bestimmten Gens binden können, um deren Expression durch Inhibierung oder Aktivierung von mRNA-Translation/Transkription zu kontrollieren [7]. MiR-499-5p ist ein kürzlich entdecktes Mitglied der Myosin-kodierten miRNAs [8]. Eine Studie berichtete, dass die Serumspiegel von miR-499-5p zur Anzeige von Organversagen bei Sepsis-Patienten genutzt werden könnten [9]. Eine andere Studie zeigte, dass miR-499-5p-Expression an sepsis-induzierter kardialer Apoptose beteiligt ist [10]. Die Sex-determinierende Region Y (SRY)-verwandte High-Mobility-Box (HMG) (SOX) Familie wird durch eine Gruppe von Genen definiert, die eine HMG-Klasse DNA-Bindungsdomäne enthalten, deren Sequenzidentität mit SRY größer als 50 % ist [11]. Der Sox6-Transkriptionsfaktor ist Teil der SRY-verwandten HMG-Box-Familie und in mehreren Geweben während der Entwicklung exprimiert, wo er eine kritische Rolle beim Übergang von proliferierenden Vorläuferzellen zu funktional reifen Zellen spielt [12]. Es gibt eine Studie, die berichtet, dass erhöhtes Sox6 an sepsis-induzierter kardialer Apoptose beteiligt ist [10]. Studien haben gezeigt, dass Sox2- und Sox4-Expression in humanem Kleinzell-Lungenkrebs erhöht sind [13, 14]. Die Beziehung zwischen Sox6 und sepsis-induzierter Lungenverletzung bedarf jedoch weiterer Untersuchung. Daher zielte unsere Studie darauf ab, den schützenden Effekt von miR-499-5p auf sepsis-induzierte Lungenverletzung bei Mäusen durch Targeting von Sox6 zu erforschen.

Materialien und Methoden

Einhaltung ethischer Standards

Alle Tierversuche entsprachen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Laboratorientieren der National Institutes of Health. Das Protokoll wurde vom Ethikkomitee für Tierversuche des Weihai Municipal Hospital, Cheeloo College of Medicine, Shandong University genehmigt.

Versuchstiere

Gesunde männliche spezifisch pathogenfreie BABL/c-Mäuse (6–8 Wochen alt, 18–22 g) wurden vom Versuchstierzentrum der Shandong University (Shandong, China) bezogen. Die Umgebung wurde auf 24 ± 2 °C mit 12-stündigem Hell-Dunkel-Zyklus eingestellt. Mäuse hatten freien Zugang zu keimfreiem Futter und sterilem Wasser. Experimente begannen nach 7-tägiger Anpassungsfütterung.

Etablierung des Sepsis-induzierten Lungenverletzungsmodells durch Caecum-Ligation und -Punktion (CLP) bei Mäusen

Mäuse wurden zufällig in 2 Gruppen aufgeteilt: Sham-Gruppe (n = 8) und Modellgruppe. Mäuse wurden 12 h vor der Operation gefastet und dann mit 1 % Pentobarbital-Natrium (70 mg/kg) intraperitoneell anästhesiert. Der Anästhesieeffekt wurde beobachtet; Atmung und Herzschlag der Mäuse wurden notiert. Kopf und Gliedmaßen der Mäuse wurden in Rückenlage fixiert, und die Bauchhaut wurde mit Jodophor-Wattebällchen präpariert und desinfiziert. Mäuse in der Modellgruppe erhielten einen Längsschnitt (1,0 cm) im mittleren Segment der Bauchmittellinie, die Bauchhöhle wurde geöffnet, und der Blinddarm wurde aus der Bauchhöhle gezogen, ohne die Mesenterialgefäße zu verletzen. Er wurde mit einem 1-0-Seidenfaden an 1/2 des Blinddarmendes ligiert, und der Blinddarm wurde an der kontralateralen Seite des Mesenteriums mit einer Injektionsnadel Nr. 16 punktiert. Eine angemessene Menge an Darminhalt wurde extrudiert, der Blinddarm zurückgelegt und der Schnitt genäht. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurde bei Mäusen in der Sham-Gruppe nur der Blinddarm herausgezogen und wieder zurückgelegt. Mäuse erhielten postoperativ 1 ml 0,9 % NaCl-Lösung subkutan, wurden in Käfige getrennt und routinemäßig gefüttert.

In-vivo-Transfektion

Vor der Modellierung wurden Mäuse in 7 Gruppen (n = 8) eingeteilt: Modellgruppe, miR-499-5p-Agomir-Gruppe, Agomir-Negativkontrollgruppe (NC), kleine interferierende RNA (si)-Sox6-Gruppe, si-NC-Gruppe, miR-499-5p-Agomir + Überexpression (oe)-Sox6-Gruppe und miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe. Eine Stunde vor der Modellierung wurden Mäuse gemäß Gruppenzuordnung behandelt. Mäuse wurden mit 1 % Pentobarbital-Natrium intraperitoneell anästhesiert, dann in 45° schräger Rückenlage fixiert, und die Zunge wurde zur Seite des Mundes bewegt, um Atemwegsdurchgängigkeit zu gewährleisten. Die vordere Halshaut wurde desinfiziert und durchtrennt, um die Luftröhre freizulegen. Transfektionskomplex (50 µl) wurde mit einem Mikrosampler aufgenommen (entsprechend der Gruppe getropft, gleiche Menge Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Modellgruppe getropft) und langsam in die Luftröhre getropft. Nach der Transfektion wurden die Mäuse vertikal gedreht, und der Transfektionskomplex wurde vollständig in die Lungen verteilt [15]. Während des Transfektionsprozesses wurden Atmung und Herzschlag der Mäuse beobachtet. Wenn Atem- und Herzstillstand auftraten, wurde die Transfektion sofort gestoppt, und der Atemweg freigegeben. Die Transfektion wurde fortgesetzt, wenn Atmung und Herzschlag stabil waren. MiR-499-5p-Agomir und dessen NC sowie die entsprechenden Plasmide von Sox6 wurden von Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Nach Transfektion wurden Mäuse in Käfige getrennt und 1 Tag gefüttert, dann euthanasiert. Mäuse wurden mit 1 % Pentobarbital-Natrium intraperitoneell anästhesiert, in Rückenlage fixiert und durch Aortenschnitte euthanasiert. Die Haut wurde lokal desinfiziert, der Brustkorb geöffnet, die Luftröhre und der rechte Hauptbronchus ligiert, der rechte Hauptbronchus durchtrennt, und die rechte Lunge entfernt. Der untere Lappen der rechten Lunge wurde in 10 % neutralem Formalin für pathologische Untersuchung gelegt, der mittlere Lappen schnell gewogen, um das Nassgewicht (W) zu berechnen, und bei 56 °C getrocknet; das Trockengewicht (D) wurde nach 72 h berechnet, woraus das W/D-Verhältnis ermittelt wurde. Der obere rechte Lappen wurde in flüssigem Stickstoff für mRNA- und Protein-Detektion gelagert. Die linke Lunge wurde dreimal mit 0,4 ml Kochsalzlösung gespült, und ca. 1 ml bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) wurde gesammelt, in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen (EP) überführt und auf Eis gelegt. BALF wurde bei 1500 U/min für 5 min zentrifugiert und in ein neues EP-Röhrchen überführt, dann bei -80 °C für Entzündungsfaktor-Detektion gelagert.

Zusätzlich wurden Mäuse in 3 Gruppen (n = 10/Gruppe) unterteilt: Sham-Gruppe, Modellgruppe und miR-499-5p-Agomir-Gruppe (50 µl miR-499-5p-Agomir wurde 1 h vor Operation in die Luftröhre instilliert). Die Überlebensrate wurde alle 12 h, insgesamt 7 Tage, überwacht. Der Überlebensstatus der Mäuse innerhalb von 7 Tagen wurde beobachtet, und die Toxizität von miR-499-5p bestimmt [16].

Hämatoxylin-Eosin (H&E) Färbung und Verletzungsscore

Lungengewebe wurden in Paraffinschnitte hergestellt, mit H&E gefärbt und unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Die Lungenverletzung wurde bewertet (alveoläre Kongestion, Blutung, Neutrophileninfiltration oder -aggregation in der Alveolhöhle oder Gefäßwand, alveoläre Wandverdickung und/oder Hyalinmembranbildung) nach dem pathologischen Bewertungssystem für Lungenverletzung der American Thoracic Society. 0 Punkte bedeuteten keine oder sehr milde Läsionen; 1 Punkt milde Läsionen; 2 Punkte moderate Läsionen; 3 Punkte schwere Läsionen; 4 Punkte sehr schwere Läsionen. Die Gesamtpunktzahl der vier Items repräsentierte den Gesamtverletzungsscore [17].

Masson-Färbung und Score

Lungengewebe wurden in Paraffinschnitte (4 µm) hergestellt und mit Masson-Färbung behandelt [18]. Kollagenfasern, Schleim und Knorpel waren blau, Zytoplasma, Muskeln, Zellulose und Gliazellen rot, Zellkerne schwarzblau. Im semiquantitativen Ashcroft-Bewertungssystem [19]: 0 Punkte normales Lungengewebe; 1 Punkt milde fibrotische Verdickung der alveolären oder bronchiellen Wand; 3 Punkte moderate Verdickung ohne Schädigung der Lungenstruktur; 5 Punkte verschlechternde Fibrose mit Schädigung der Lungenstruktur, Bildung von Faserbändern oder -massen; 7 Punkte schwere Lungenstrukturschädigung und große Fibrosebereiche, Bildung von Faserbändern oder -klumpen; 8 Punkte vollständige faserige Packung aller Regionen.

TUNEL-Färbung

Die Apoptose von Lungengeweben wurde mit TUNEL-Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) getestet und unter einem Lichtmikroskop beobachtet. Apoptotische Zellen wurden im Kern braun gefärbt. Der Apoptoseindex gab den Prozentsatz der TUNEL-positiven Zellen an [20].

Immunhistochemie

Die Lungengewebeschnitte wurden mit Xylol entparaffiniert, mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert und mit Ziegenserum blockiert. Dann wurden Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) und SOX6 (ab30455, 1:500, alle von Abcam, MA, USA) als Antikörper zur Immunfärbung der Schnitte verwendet. Ein Lichtmikroskop (Leica Microsystems, IL, USA) wurde zur Bildaufnahme genutzt, die anschließend mit Image Pro Plus 6.0 Software (Media Cybernetics, Rockville, MA, USA) analysiert wurden [21].

Reverse-Transkriptions-Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Das OMEGA-Kit (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China) wurde für die Extraktion von Gesamt-RNA in Lungengeweben und Bestimmung der RNA-Konzentration verwendet. Die komplementäre DNA (cDNA) wurde durch Reverse-Transkription gemäß RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) synthetisiert. Die Primer wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) entworfen, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die PCR-Reaktion wurde gemäß FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) Kit (Roche) durchgeführt. Das Experiment wurde quantitativ mit der 2⁻ΔΔCt-Methode analysiert. U6 war die Ladekontrolle für miR-499-5p, und GAPDH der interne Parameter für andere Gene [22].

Western-Blot-Analyse

Gesamtprotein wurde durch Behandlung von Lungengeweben mit Radioimmunpräzipitation-Assay-Lysepuffer gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit der Bicinchonsäure-Methode bestimmt. Die Proteinprobe (30 µg) wurde durch 10 % Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verarbeitet, auf Polyvinylidenfluorid-Membran transferiert, mit 5 % Magermilchpulver blockiert und mit primären Antikörpern Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), Interleukin-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) und GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) inkubiert. Dann wurde die Membran mit dem Sekundärantikörper (1:2000) inkubiert und durch verstärkte Chemilumineszenz entwickelt [23].

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Die Spiegel von IL-1β, IL-6 und TNF-α in BALF wurden durch ELISA-Kit (Boster, Hubei, China) bestimmt. Die farbimetrische Bestimmung erfolgte bei 450 nm.

Detektion von oxidativen Stressindizes

Die Lungengewebe in flüssigem Stickstoff wurden gewogen und in einem bestimmten Anteil Kochsalzlösung unter niedrigen Temperaturen verdünnt, dann homogenisiert und bei 4 °C, 3000 U/min für 20 min bei niedriger Temperatur zentrifugiert, und der Überstand wurde zur Bestimmung entnommen. Die Aktivität von Myeloperoxidase (MPO) wurde mit MPO-Nachweis-Kit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) getestet, und Malondialdehyd (MDA), Superoxiddismutase (SOD), Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Katalase (CAT) wurden mit Kits des JianCheng Bioengineering Institute getestet.

Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Sox6 könnte das Target-Gen von miR-499-5p sein, vorhergesagt durch eine biologische Website (https://www.targetscan.org/vert_72/). Es gab vier Bindungsstellen zwischen miR-499-5p und Sox6 mRNA 3′-untranslatierter Region (UTR). Die pmiR-RB-REPORT-Sox6 Wildtyp (WT) und pmiR-RB-REPORT-Sox6 Mutanttyp (MUT) Vektoren wurden von Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China) konstruiert, und die entsprechenden Luciferase-Reporter-Plasmide generiert. TC-1-Zellen (maus Lungenepithelzellen, 1 × 10⁵ Zellen/Well, Shanghai Yiyan Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China) wurden in einer 24-Well-Platte ausgesät und mit miR-499-5p-Agomir oder Agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT oder pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000 transfiziert. Das Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay-System (Promega, WI, USA) wurde angewendet, um die Luciferase-Aktivität zu messen.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) Software analysiert. Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden mit t-Test durchgeführt, Vergleiche zwischen mehreren Gruppen mit einseitiger Varianzanalyse (ANOVA), und Tukeys Post-hoc-Test wurde für paarweise Vergleiche nach ANOVA verwendet. Die Überlebenskurve wurde mit der Kaplan-Meier-Methode erstellt. P-Wert < 0,05 zeigte statistisch signifikante Unterschiede an.

Ergebnisse

W/D-Verhältnis und Sox6 sind erhöht, während miR-499-5p in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung verringert ist

Die Toxizität von miR-499-5p wurde an Mäusen getestet, um die Überlebenszeit septischer Mäuse zu detektieren. Die Ergebnisse zeigten (Abb. 1a), die Überlebensrate innerhalb von 7 Tagen der Mäuse in der Sham-Gruppe betrug 100 %, und die von septischen Mäusen war reduziert. Die Überlebensrate septischer Mäuse nach miR-499-5p-Behandlung war verbessert. Die Ergebnisse des W/D-Verhältnisses der Lungengewebe demonstrierten (Abb. 1b): im Vergleich zur Sham-Gruppe war das W/D-Verhältnis in der Modellgruppe erhöht (P < 0,05). Im Vergleich zur Agomir-NC-Gruppe und der si-NC-Gruppe war das W/D-Verhältnis in der miR-499-5p-Agomir-Gruppe und der si-Sox6-Gruppe reduziert (beide P < 0,05). Das W/D-Verhältnis war in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe im Vergleich zur miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe markant erhöht (P < 0,05).

MiR-499-5p- und Sox6-Expression wurden detektiert, und wir fanden (Abb. 1c–f): im Gegensatz zur Sham-Gruppe war miR-499-5p reduziert und Sox6 erhöht in der Modellgruppe (beide P < 0,05). In Bezug auf die Agomir-NC-Gruppe war miR-499-5p erhöht und Sox6 verringert in der miR-499-5p-Agomir-Gruppe (beide P < 0,05). Gegenüber der si-NC-Gruppe war Sox6 in der si-Sox6-Gruppe erniedrigt (P < 0,05). Im Vergleich zur miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe war Sox6 in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe dramatisch erhöht (P < 0,05).

Der Proteingehalt von Sox6 in Lungengeweben septischer Mäuse wurde durch Immunhistochemie bestimmt (Abb. 1g). Es wurde beobachtet, dass im Vergleich zur Sham-Gruppe die Sox6-Proteinexpression in der Modellgruppe erhöht war (P < 0,05); verglichen mit der Agomir-NC-Gruppe und si-NC-Gruppe wurde niedrigere Sox6-Proteinexpression in der miR-499-5p-Agomir-Gruppe und der si-Sox6-Gruppe untersucht (beide P < 0,05); relativ zur miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe war die Sox6-Proteinexpression in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe erhöht (P < 0,05).

Wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 lindert Lungengewebspathologie, reduziert Lungenverletzungsscore, Kollagenfasern und Grad der Lungenfibrose bei Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung

HE-Färbungsergebnisse zeigten (Abb. 2a): in der Sham-Gruppe war die Lungengewebestruktur intakt, das alveoläre Septum war im Wesentlichen ohne Ödem oder Entzündung manifestiert, und die Alveolhöhle war klar. In der Modell-, Agomir-NC-, si-NC- und miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe waren Exsudation, Ödem und Blutung in den meisten Alveolhöhlen des Lungengewebes zu sehen, und massive Infiltration von Entzündungszellen zeigte sich im Lungeninterstitium. In der miR-499-5p-Agomir-, si-Sox6- und miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe war die Läsion des Lungengewebes im Vergleich zur Modellgruppe reduziert.

Mäuse-Lungenverletzungsscore und semiquantitativer Ashcroft-Score zeigten (Abb. 2b, d): in Bezug auf die Sham-Gruppe waren Lungenverletzungsscore und Grad der Lungenfibrose in der Modellgruppe offensichtlich erhöht (P < 0,05). Gegenüber der Agomir-NC-Gruppe und si-NC-Gruppe waren Lungenverletzungsscore und Grad der Lungenfibrose in der miR-499-5p-Agomir- und der si-Sox6-Gruppe reduziert (beide P < 0,05). Im Gegensatz zur miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe waren Lungenverletzungsscore und Grad der Lungenfibrose in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe markant erhöht (P < 0,05).

Die Masson-Färbungsergebnisse zeigten (Abb. 2c): in der Sham-Gruppe enthielten Mäuse-Lungengewebe eine kleine Menge blauer Kollagenfasern. In der Modell-, Agomir-NC-, si-NC- und miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe waren die Kollagenfasern erhöht. In der miR-499-5p-Agomir-Gruppe, si-Sox6-Gruppe und miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe waren die Kollagenfasern im Vergleich zur Modellgruppe verringert.

Wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 reduziert TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung

Western Blot, TUNEL-Färbung und Immunhistochemie-Ergebnisse zeigten (Abb. 3a–f): normaler Kern war blau und apoptotischer Kern braun in verschiedenen Schattierungen. Im Vergleich zur Sham-Gruppe waren TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression in der Modellgruppe erhöht (alle P < 0,05). Gegenüber der Agomir-NC- und si-NC-Gruppe waren TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression in der miR-499-5p-Agomir- und der si-Sox6-Gruppe reduziert (alle P < 0,05). Gegenüber der miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe waren TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe erhöht (alle P < 0,05).

Wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 verringert TNF-α, IL-1β und IL-6 Gehalte in BALF und Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung

ELISA- und Western-Blot-Assay-Ergebnisse zeigten (Abb. 4a–g): TNF-α, IL-1β und IL-6-Gehalte waren in der Modellgruppe im Vergleich zur Sham-Gruppe erhöht (alle P < 0,05). Gegenüber der Agomir-NC- und der si-NC-Gruppe waren TNF-α, IL-1β und IL-6-Gehalte in der miR-499-5p-Agomir- und der si-Sox6-Gruppe verringert (alle P < 0,05). Gegenüber der miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe waren TNF-α, IL-1β und IL-6-Gehalte in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe erhöht (alle P < 0,05).

Wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 erhöht SOD, CAT und GSH-Px Aktivitäten sowie reduziert MDA und MPO Gehalte in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung

Die Ergebnisse der oxidativen Stressindizes-Detektion zeigten (Abb. 5a–e): im Vergleich zur Sham-Gruppe waren SOD-, CAT- und GSH-Px-Aktivitäten beeinträchtigt, während MDA- und MPO-Gehalte in der Modellgruppe erhöht waren (alle P < 0,05). Gegenüber der Agomir-NC- und der si-NC-Gruppe waren SOD-, CAT- und GSH-Px-Aktivitäten erhöht, während MDA- und MPO-Gehalte in der miR-499-5p-Agomir- und der si-Sox6-Gruppe reduziert waren (alle P < 0,05). Gegenüber der miR-499-5p-Agomir + oe-NC-Gruppe waren SOD-, CAT- und GSH-Px-Aktivitäten unterdrückt, während MDA- und MPO-Gehalte in der miR-499-5p-Agomir + oe-Sox6-Gruppe erhöht waren (alle P < 0,05).

miR-499-5p targetet direkt Sox6

Wir sagten durch die Bioinformatik-Website TargetScan voraus, dass es gezielte Bindungsstellen zwischen miR-499-5p und SOX4/6 gab. Mittels RT-qPCR fand sich, dass im Vergleich zur Sham-Gruppe SOX2/4/6-Expression in der Modellgruppe erhöht war, und SOX6-Expression am stärksten zunahm (alle P < 0,05); gegenüber der Agomir-NC-Gruppe zeigte die miR-499-5p-Agomir-Gruppe keine Veränderung in SOX2-Expression, während reduzierte SOX4-Expression, meist verringerte SOX6 (Zusatzdatei 1: Abb. S1a, b). Daher wählten wir schließlich SOX6 als Target-Gen von miR-499-5p. Die biologische Vorhersage-Website (https://www.targetscan.org/vert_72/) zeigte, dass miR-499-5p Sox6 targeten könnte (Abb. 6a). Der Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay demonstrierte (Abb. 6b), dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Luciferase-Aktivität nach Co-Transfektion von pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT Vektor und miR-499-5p-Agomir in TC-1-Zellen offensichtlich zerstört wurde (P < 0,05), während die Luciferase-Aktivität nach Co-Transfektion von miR-499-5p-Agomir mit pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT Vektor oder Agomir-NC mit pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT Vektor keinen deutlichen Unterschied zeigte (P > 0,05), was suggeriert, dass miR-499-5p direkt an Sox6 3′UTR WT binden und dann die Luciferase-Aktivität inhibieren kann.

Diskussion

Sepsis ist eine kritische Ursache für Schock und Multi-Organ-Dysfunktions-Syndrom, wobei ALI die häufigste und bedeutendste Organkomplikation ist [24]. Sepsis-induzierte ALI tritt nicht nur am frühesten und mit der höchsten Inzidenz auf, sondern schreitet auch schnell fort, die Letalitätsrate ist hoch, und es gibt derzeit keine effektive Therapie [25]. Eine frühere Studie postulierte, dass die Hochregulation von miR-218 die Sekretion von Entzündungsfaktoren abschwächte und sepsis-induzierte Lungenverletzung verhinderte [26]. Auch die Förderung der miR-146a-Spiegel konnte Entzündungen bei ALI reduzieren [27], und die Wiederherstellung von miR-125b verbesserte das Überleben von Mäusen mit ALI und unterdrückte Entzündungen [28]. Obwohl Studien die Rolle von miRNAs bei Lungenverletzung hervorgehoben haben, wurde der detaillierte Mechanismus von miR-499-5p bei sepsis-induzierter Lungenverletzung kaum untersucht, daher fokussierten wir uns auf miR-499-5p, um sein therapeutisches Potenzial bei sepsis-induzierter ALI zu entdecken. Auch eine Studie lieferte den Beweis, dass erhöhtes Sox6 an sepsis-induzierter kardialer Apoptose beteiligt war [10]. Anstrengungen sollten unternommen werden, um sepsis-induzierte Lungenverletzung tiefgreifend zu verstehen. Wir zielen darauf ab, den schützenden Effekt von miR-499-5p durch Targeting von Sox6 auf sepsis-induzierte Lungenverletzung bei Mäusen zu diskutieren.

Das W/D-Verhältnis der Lungengewebe wurde in unserer Studie berechnet, und die Expression von Sox6 und miR-499-5p in Maus-Lungengeweben bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass W/D-Verhältnis und Sox6 erhöht waren, während miR-499-5p in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung verringert war. Eine kürzliche Studie schlug vor, dass miR-499-5p-Expression bei Patienten mit milder Sepsis, schwerer Sepsis und septischem Schock im Vergleich zu Normalkontrollen dramatisch verringert war [9]. Eine andere Studie präsentierte, dass miR-499-5p-Expression in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Geweben markant erniedrigt war und mit schlechten klinischen Outcomes verknüpft war [29]. Es wird berichtet, dass Sox6-Expression in Lungenkrebsgeweben im Vergleich zu Normalgeweben erhöht war [30]. Ebenso zeigte eine frühere Studie, dass die Expression von Sox6 in Nierengeweben von Mäusen mit diabetischer Nierenerkrankung bemerkenswert erhöht war [31]. Unsere Studie präsentierte auch, dass miR-499-5p direkt Sox6 targetete. Ein wichtiges Ergebnis war, dass Sox6 ein Target-Gen von miR-499 ist [10]. Eine andere Studie lieferte Daten, dass Sox6 ein Target-Gen von miR-499-5p war, und Wiederherstellung von miR-499-5p die Expression von Sox6 unterdrückte [32]. Die Target-Beziehung von miR-499-5p und Sox6 in Lungengeweben von sepsis-induzierten Mäusen wurde jedoch noch nicht aufgedeckt.

Zusätzlich wurde enthüllt, dass wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 die Lungengewebspathologie linderte, Lungenverletzungsscore, Kollagenfasern und Grad der Lungenfibrose reduzierte, und TUNEL-positive Zellen, Caspase-3- und Caspase-9-Proteinexpression in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung reduzierte. Es wurde zuvor vorgeschlagen, dass Hochregulierung von miR-499-5p Zellproliferation unterdrückt und Apoptose in vivo und in vitro von NSCLC fördert [29]. Eine andere Studie verifizierte, dass Wiederherstellung von miR-499-5p und Depletion von Sox6 hypoxie/reoxygenations-induzierte Zellapoptose abschwächte und Caspase-3-Expression reduzierte [32]. Es wurde präsentiert, dass Down-Regulierung von Sox6 die pathologische Verletzung lindert und neuronale Apoptose in hippocampalen Geweben der Alzheimer-Krankheit unterdrückt [33]. Zudem zeigte eine Studie, dass Depletion von Sox6 hochglukose-induzierte Zellapoptose und renale interstitielle Fibrose in Maus-Nieren-Mesangialzellen inhibierte [31]. Eine andere Studie demonstrierte, dass niedrige Sox6-Expression die Aktivität von Caspase-3 und den Prozentsatz apoptotischer Zellen in Maus-P19CL6-Zellen verringerte [34]. Außerdem verifizierten wir, dass wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 TNF-α, IL-1β und IL-6-Gehalte in BALF und Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung verringerte. Xia et al. beleuchteten, dass TNF-α- und IL-6-Spiegel in Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung dramatisch erhöht waren [35]. Eine Studie demonstrierte, dass niedrige Sox6-Expression die entzündliche Reaktion in hippocampalen Geweben der Alzheimer-Krankheit abschwächte [33]. Ein weiteres Ergebnis dieser Studie implizierte, dass wiederhergestellte miR-499-5p oder depletiertes Sox6 SOD-, CAT- und GSH-Px-Aktivitäten erhöhte sowie MDA- und MPO-Gehalte in Lungengeweben von Mäusen mit sepsis-induzierter Lungenverletzung reduzierte. Es wurde präsentiert, dass CLP-induzierte ALI durch Entzündung in Morphologie, erhöhtes W/D-Verhältnis, erhöhte Proteinkonzentration in BALF, höhere MPO- und MDA-Gehalte sowie niedrigere SOD-, GSH-Px- und CAT-Aktivitäten in Lungen nach CLP charakterisiert war [36]. Es wurde vorgeschlagen, dass die Aktivität von SOD und CAT in Mäusen mit sepsis-induzierter ALI verringert war [37]. Darüber hinaus berichtete eine Studie, dass überexprimierte miR-499-5p und niedrig exprimierte Sox6 den MDA-Spiegel verringerten [32].

Schlussfolgerung

Zusammenfassend fanden wir, dass hohe Expression von miR-499-5p die Apoptose von Lungengewebszellen abschwächen und Entzündung bei sepsis-induzierter Lungenverletzung bei Mäusen durch Depletion von Sox6 inhibieren kann, was wichtige therapeutische Implikationen für die Behandlung von sepsis-induzierter Lungenverletzung haben könnte. Dennoch sind klinische Forschungen erforderlich, um die Wirksamkeit für die Behandlung von sepsis-induzierter Lungenverletzung zu detektieren.