DNA-Tetraedertransport verbessert die Doxorubicin-induzierte Apoptose von HT-29-Darmkrebszellen

Hintergrund

Doxorubicin (Dox) ist eines der am häufigsten verwendeten antineoplastischen Mittel, und zahlreiche klinische Studien haben gezeigt, dass Dox das Wachstum von Tumorzellen in verschiedenen Zellwachstumszyklen durch Hemmung der Synthese von RNA und DNA auffallend hemmen kann [1, 2]. Frühere Studien legten nahe, dass die Proliferation von Tumorzellen in der G1-Phase effektiv blockiert wurde und die Metastasierung ab einer bestimmten Konzentration auch durch Dox gehemmt wurde [3]. Darüber hinaus kann eine wirksame Hemmung im Vergleich zu anderen Krebsmedikamenten mit einer relativ geringeren Dosis erreicht werden [4]. Allerdings induzierten Dox-Nebenwirkungen in der Regel das Fehlen eines spezifischen Targetings für Tumorzellen und die nichtselektive Hemmung von DNA und RNA, was die klinische Anwendung stark einschränkte [5, 6]. Unterdessen reduziert die geringe zelluläre Aufnahmekapazität die Akkumulation von Dox in Tumorzellen [7]. Daher sollte ein effizientes Abgabesystem für Dox entwickelt werden, um Dox spezifischer und effektiver zu steuern, leichter einzukapseln und eine ausgezeichnete Aufnahmekapazität und Biokompatibilität zu haben.

Wirkstoffträger in Nanogröße, wie Liposomen und anorganische Nanopartikel, können das Eindringen von Dox in die Tumorzellmembran erleichtern und die Targeting-Effizienz verbessern [8]. Nichtsdestotrotz kann die Abgabe auf Liposomenbasis die Nebenwirkungen auf normale Zellen aufgrund des relativ schlechten Targetings nicht reduzieren; Anorganische Träger wie mesoporöse Siliciumdioxid-Nanopartikel können in vivo jedoch nicht vollständig biologisch abgebaut werden, was den Prozess der weiteren Wirkstoffaufnahme behindert und potenzielle Biotoxizität mit sich bringt. Für diese funktionellen Abgabesysteme behindern die Komplexität der Herstellung, die Inhomogenisierung von Nanopartikelstrukturen und die geringe Einkapselungseffizienz die klinische Expansion [9,10,11]. Als Wirkstoffträger in Nanogröße mit hervorragender Leistung bei der Wirkstoffabgabe können DNA-basierte Strukturen wie DNA-Tetraeder (DNA-Tetra) die Membran durchdringen, indem die Inkompatibilität zwischen elektronegativer DNA und Plasmamembran vermieden wird [12,13, 14,15,16,17]. Medikamente und Targeting-Moleküle können beide kovalent an DNA-Tetraeder gebunden werden. Darüber hinaus vermeiden die leichte Absorption und der biologische Abbau von tetraedrischen DNA-Sequenzen eine Langzeitretention. Guaninreiche Aptamer-Medikamente wie AS1411 wurden erfolgreich in A549-Tumorzellen eingebracht und als zielgerichtete Wirkstoffe und Inhibitoren eingesetzt [18]. Immunregulatorische Faktoren wie CpG und siRNA können auch über DNA-Tetra-Carrier an Tumorzellen abgegeben werden, um Immunantworten zu regulieren [19]. Mit den Vorteilen geringer Toxizität, geeigneter Biokompatibilität und einstellbarem Targeting zeigte DNA-Tetra biologische Sicherheit und Potenzial für die Abgabe von Dox.

In dieser Studie wurden funktionelle Partikel von DNA-Tetraedern entworfen, synthetisiert und charakterisiert, die mit Dox als Krebsmedikament und Folsäure als spezifische Erkennungsmoleküle [20] zusammengebaut wurden. Die Wirksamkeit gegen Krebs wurde an Dickdarmkrebszellen unter Berücksichtigung signifikant hochregulierter Folatrezeptoren auf der Oberfläche der Zellmembran bewertet. Insbesondere wurden der Grad der zellulären Aufnahme, der Grad der Dox-induzierten Apoptose und die Hemmung der Zellproliferation an HT-29-Zelllinien gemessen.

Methoden

Regenten und Ausrüstung

DNA-Oligonukleotidketten wurden von TAKARA in Dalian, China, bezogen. Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) und fötales Rinderserum wurden von Gibco in NY, USA, bezogen. Penicillin und Streptomycin wurden von Beyotime Biotechnology in Shanghai, China, bezogen. Folsäure, Doxorubicin, 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H -Tetrazoliumbromid (MTT) und Agarose wurden von Sigma-Aldrich in MO, USA bezogen. Alle Antikörper wurden von der Abcam Company in Shanghai, China, bezogen. Andere Reagenzien wurden von Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd. in Shanghai, China, bezogen.

UV-Vis-Spektrophotometer (Thermo Evolution 201) und ein Inkubator mit konstanter Temperatur wurden von Thermo Fisher in den USA bezogen; Zentrifugalmaschine (GT10-1) wurde von Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd. bezogen; Fluoreszenzspektrophotometer (UV-1800) wurde von Shimadzu Corporation bezogen. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (Visitech) wurde von Leica-Firmen gekauft; ein Polymerase-Kettenreaktionsgerät (PCR, T100), eine Proteinelektrophorese und ein Nukleinsäureelektrophoresegerät wurden von Bio-Rad Company bezogen; ein dynamischer Lichtteilchengrößenanalysator wurde von der Beckman Company bezogen; Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen oder 24 Vertiefungen wurden von Dow Corning Corporation bezogen. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, Agilent 1200) mit C18-Säule wurde von Agilent Technologies bezogen.

Die humane Dickdarmkrebszelllinie HT-29 wurde in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid bei 37 °C gehalten .

Synthese und Reinigung von DNA-Tetraedern

Bei dieser Untersuchung folgte die Synthese den schematischen Verfahren in Fig. 1, und die einzelsträngigen DNA-(ssDNA)-Sequenzen von DNA-Tetraedern sind ebenfalls in Fig. 1 bereitgestellt. Im Detail wurde jede ssDNA in 0,5 × TE-Puffer gelöst und der entsprechende Wert der optischen Dichte (OD) der DNA mit einem UV-Spektrophotometer bei 260 nm bestimmt. Zusätzlicher TE-Puffer wurde ergänzt, um vier Ketten mit der gleichen Konzentration herzustellen. Das Mischungsverhältnis von vier ssDNAs betrug 1:1:1:1 bei 1 μM in 100 μL. Die Reaktion wurde in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Zyklusbedingungen durchgeführt:95 °C, 10 min, natürlich auf 4 °C gekühlt. Die gesamte einzelsträngige DNA wurde durch HPLC mit 260 nm als charakteristischem Absorptionspeak gereinigt. Im HPLC-Spektrum war die Peakzeit von DNA-Tetra schneller als die von Einzelstrang, und das Produkt wurde zum entsprechenden Zeitpunkt gesammelt.

Schematische Darstellung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox, DNA-Tetra-Dox und Folsäure-DNA-Tetra. Die einzelsträngigen DNA-Sequenzen von DNA-Tetraedern wurden bereitgestellt. Der Prozess des Targeting auf Tumorzellen, das Durchdringen der Zellmembran und das Einfügen der DNAs wurden dargestellt

Synthese und Charakterisierung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox

Freie Wasserstoffgruppen von Dox und Folsäure wurden mit einer Azidgruppe modifiziert und dann über eine Click-Chemie-Reaktion mit 3′-OH der ssDNA gekoppelt [21]. Bei Zugabe einer anderen Menge an mit funktionellen Gruppen markierter ssDNA konnte das Verhältnis der funktionellen Gruppen durch spezifische Hybridisierung von Seitenketten stöchiometrisch gesteuert werden. Für die Synthese von Folsäure-DNA-Tetra wurde das Molverhältnis von Folsäure und DNA-Tetraeder auf 1:1 festgelegt. Für die Synthese von DNA-Tetra-Dox wurde das Molverhältnis von Dox und DNA-Tetraeder auf 4:1 eingestellt. Für die Synthese von Folsäure-DNA-Tetra-Dox wurde das Molverhältnis von Folsäure, DNA-Tetraeder und Dox jeweils auf 1:1:3 eingestellt. Die gesamte Synthese wurde auf mikromolarer Ebene bei 37 °C durchgeführt und dann bei 4 °C gelagert [22].

In dieser Studie wurde die Reihe von DNA-Tetrakomplexen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit 8% Trenngel (39% Acr-Bis) charakterisiert, um die Reinheit und die relativen Molekülgrößen zu überprüfen. Die Proben bestanden aus den unterschiedlichen DNA-Tetrastrukturen und 6x Ladepuffer mit einem Mischungsverhältnis von 2:1. Die Proben wurden gefärbt und nach einer Gelelektrophorese für 90 Minuten bei 110 V analysiert. Um die Unterschiede in den Partikelgrößen herauszufinden, wurden DNA-Tetra-Proben auch mit Dynamic Light Scattering (DLS)-Instrumenten mit dynamischem Licht gescannt.

DNA-tetra-erleichterte zelluläre Aufnahme

Für die verschiedenen Kopplungsstrukturen, die in dieser Forschung entworfen wurden, wurden die Aufnahmeraten durch HT-29-Zellen verglichen, um die Wirksamkeit der Wirkstoffabgabe zu ermitteln. Die zelluläre Aufnahmeeffizienz wurde unter Verwendung des charakteristischen Fluoreszenzspektrums von Dox bewertet und quantifiziert, d. h. Anregungslicht bei 470 nm und Emissionslicht bei 590 nm. Die HT-29-Zellen bei 2 × 10 ⁵ /ml wurden in 24-Well-Platten ausgesät und für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden weitere 24 h mit verschiedenen DNA-Tetrastrukturen bei 10 μM inkubiert. Das Medium wurde dann verworfen und die Zellen wurden dreimal mit PBS gespült. Zur Zellfixierung wurde bei Raumtemperatur sofort 4% Paraformaldehyd für eine 30-minütige Co-Inkubation zugegeben und die Zellen wurden erneut dreimal mit PBS gespült. Schließlich wurden die 24-Well-Platten mit einem konfokalen Lasermikroskop beobachtet, um die zelluläre Aufnahmeeffizienz basierend auf der Lichtintensität des Emissionslichts zu vergleichen.

Zytotoxizität und Wirksamkeit gegen Krebs

Zytotoxizität und Antikrebseffizienz wurden mit dem MTT-Assay bewertet, bei dem eine Redoxreaktion zwischen dem MTT in DMSO und der intrazellulären Succinatdehydrogenase auftritt. HT-29-Zellen wurden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert.

Für die Zytotoxizität von DNA-Tetra als Wirkstoffträger wurde Medium mit DNA-Tetra-Strukturen in einer Konzentration von 0–100 μM für eine weitere 24- oder 48-stündige Inkubation zugegeben. Dann wurden 100 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und die Mischung wurde 4 h bei 37 °C inkubiert. Die Flüssigkeit wurde dann entfernt und die Zellen wurden lysiert und mit 200 μl DMSO gelöst. Die Absorption des Überstands wurde bei 570 nm mit einem Microreader gemessen. Die unbehandelte HT-29-Probe wurde als Kontrollgruppe angesehen.

Für das mit Folsäure oder Dox gekoppelte DNA-Tetraeder konzentrierte sich die Forschung einerseits auf Stabilität, Biosicherheit und Hemmwirkung; auf der anderen Seite wurde auch untersucht, ob das Dox von DNA-Tetra-Dox vergleichbare Antitumoreigenschaften wie zuvor hat oder nicht. Daher wurden Zytotoxizität und Antitumoreffizienz von DNA-Tetrakomplexen bewertet. Komplexe mit jeweils 100 μM wurden mit HT-29-Zellen inkubiert. Zellproben wurden alle 6 h gesammelt und dann durch MTT-Assay nachgewiesen, um die Wirkung der Inkubationszeit zu bewerten. Besondere Aufmerksamkeit wurde dem Unterschied in der Antikrebseffizienz gewidmet, der sich aus den Variationen der Strukturen ergibt. Darüber hinaus wurden Konzentrationseffekte auf die Hemmung von HT-29 nach Behandlung mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 0–200 μM über MTT-Assays bewertet.

Western Blot und Durchflusszytometrie

Um die durch Dox induzierte zelluläre Apoptose zu charakterisieren, die durch DNA-Tetra-Transport erleichtert wird, wurden Proteinproben aus behandelten Zellen erhitzt und mit Pyrolyseflüssigkeit gecrackt, durch 12 % SDS-PAGE unter der Bedingung von 100 V bei konstantem Strom analysiert, um die Proben zu trennen, und dann geblottet auf PVDF-Membranen mit einem Durchmesser von 0,22 μm für 1 h. Die Proben wurden 1 h mit Magermilch blockiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die Proben über Nacht mit Kaninchen-Anti-Caspase-3 inkubiert. Dann wurden die Proben 1 h lang mit einem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Sekundärantikörper sondiert und dann mit PBST gewaschen und über das Bio-Rad-Protein-Imaging-System abgebildet. Außerdem wurde GAPDH wegen seiner stabilen Expression in Zellen als internes Referenzprotein gewählt.

Die Durchflusszytometrie wurde ferner verwendet, um die Apoptosespiegel bei der ausgewählten Konzentration und zum ausgewählten Zeitpunkt über MTT-Assays zu quantifizieren. HT-29-Zellen wurden mit Inhibitoren für einen bestimmten Zeitraum inkubiert und dann mittels quantitativer Durchflusszytometrie unter Verwendung der Annexin V-PI-Doppelfärbungsmethode gemessen.

Quantifizierung der Zellproliferation

Die Zellzählmethode wurde verwendet, um die Zellproliferation mit der Zeit zu quantifizieren. Im Detail wurden die Zellen nach Behandlung mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox für einen Zeitraum von 100 μM 30 s lang mit 0,25 % Trypsin verdaut und dann das gleiche Volumen des vollständigen Mediums zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Der Überstand wurde nach Zentrifugation bei 1000 U/min für 3 Minuten verworfen und die Zellen wurden mit vollständigem Medium resuspendiert. Die Anzahl der Zellen in jedem Nachweispunkt wurde unter einem optischen Mikroskop unter Verwendung von Zellzählplatten aufgezeichnet, um die Zellproliferationskurve zu zeichnen.

Statistische Analyse

In dieser Untersuchung wurden die Signifikanzen der Unterschiede mit dem t . von Student bestimmt Test (zweiseitig; bei zwei Stichproben gleiche Varianz). P < 0,05 bedeutet signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen.

Ergebnisse

Herstellung von Folsäure-DNA-Tetra-Dox

In einem spezifischen Syntheseprozess wurde Dox mit DNA-Tetraedern in verschiedenen Anteilen gemischt, um das Laden und Zusammensetzen von Dox abzuschließen (w _m = 543,52) und Folsäure (w _m = 441.4). Wie in Fig. 2a gezeigt, wiesen aufgrund dessen, dass Dox und Folsäure Monomere mit relativ niedrigem und ähnlichem Molekulargewicht sind, DNA in einem Tetraeder und die Konjugate mit einem funktionellen Molekül ungefähr äquivalente Molekulargewichte auf. Jedoch führte die Zusammenlagerung von Dox oder Folsäure mit allen vier DNA-Eckpunkten des Tetraeders dazu, dass die molekulare Größe des DNA-Tetras offensichtlich zunahm. Wie in Abb. 2b gezeigt, betrug die Größe der meisten tetraedrischen Monomere der DNA weniger als 15 nm. Mit der Zunahme der Kopplungsgruppen wurde die symmetrische Struktur von DNA-Tetra zerstört und das Medium der Partikelgrößen der Verbindungen deutlich erhöht. Insbesondere die Größenexpansion von Folsäure-DNA-Tetra-Dox verlängerte den mittleren Durchmesser auf 20 nm.

Charakterisierung von DNA-Tetra mit verschiedenen Bestandteilen. a Von links nach rechts:DNA-Leiter, DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox, abgebildet in 8% SDS-PAGE. b Die Größenverteilung von DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra, Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox, detektiert durch dynamische Lichtstreuung

Effizienz der Arzneimittelabgabe

Nach 24-stündiger Inkubation mit verschiedenen DNA-Tetrastrukturen wurde die intrazelluläre Effizienz von Dox mit Fluoreszenzbildgebung bewertet, wobei die intrazelluläre rote Fluoreszenz die charakteristische Fluoreszenz von Dox ist; daher zeigten mit DNA-Tetra inkubierte Zellen kein Fluoreszenzsignal, wie in Fig. 3a gezeigt, und die roten Signale von Zellen, die mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox- und DNA-Tetra-Dox-Komplexen inkubiert wurden, waren offensichtlich höher als die mit Dox, d die deutlich gesteigerte zelluläre Aufnahmeeffizienz von Dox, die aus dem DNA-Tetra resultiert, erleichterte die Penetration durch die Membran sowie die intrazelluläre Stabilität der Konjugate zwischen Dox und DNA-Tetra.

Die Aufnahmeeffizienz von HT-29-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Komplexen für 24 Stunden. a Konfokalmikroskopische Detektion (rot ist das Fluoreszenzanregungslicht von Dox, Maßstabsbalken = 10 μm). b Intensität der zellulären Fluoreszenz. **P < 0,05 im Vergleich zur Gruppe der DNA-Tetra

Die weitere quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität (Abb. 3b) belegte den visuellen Befund, und es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen Folsäure-DNA-Tetra-Dox- und DNA-Tetra-Dox-Komplexen (P < 0,05). Die Methodik der Co-Inkubation von Medikamenten und Zellen behindert die vollständige Darstellung der Targeting-Fähigkeit von Folsäure. Die relativ hohe Konzentration bestätigte die spezifische Erkennung von Folatrezeptoren, die theoretisch bei den in vivo-Anwendungen mit dem komplexen Kreislaufsystem offensichtlicher ist. Kurz gesagt, die DNA-Tetra-Lieferung garantierte die Anti-Krebs-Wirksamkeit von Dox.

Zytotoxizität und Wirksamkeit gegen Krebs

Zuerst wurde die Lebensfähigkeit von HT-29-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von DNA-Tetra koinkubiert wurden, unter Verwendung des MTT-Assays untersucht. Es gab keine offensichtliche Zytotoxizität der DNA-Tetra-Behandlung in HT-29-Zellen bei 0–100 μM für 24 und 48 h (Abb. 4a). Daher bot das DNA-Tetraeder in Nanogröße eine biosichere Plattform für Wirkstoffträger.

Die Zytotoxizität und Antitumoreffizienz von Dox-Komplexen und DNA-Tetra für HT-29-Zellen. a Die Lebensfähigkeit von HT-29-Zellen, die 24 oder 48 h lang mit DNA-Tetra in verschiedenen Konzentrationen inkubiert wurden. b Die Antitumoreffizienz von Dox-Komplexen bei 100 μM. c Die Lebensfähigkeit von HT-29-Zellen, die mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox in verschiedenen Konzentrationen für 24 oder 48 Stunden inkubiert wurden

Zweitens zeigten Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox aufgrund des Unterschieds in der Dox-Abgabeeffizienz innerhalb von 48 h eine signifikantere Hemmungseffizienz (Abb. 4b). Aufgrund des Fehlens wirksamer Antikrebskomponenten führte DNA-Tetrafolsäure zu einer vernachlässigbaren Abnahme (< 10%) der Lebensfähigkeit während der 48-stündigen Koinkubation. Da Dox die Membran objektiv nicht durchdringen kann, war die durch Dox induzierte Abnahme der zellulären Lebensfähigkeit geringer als bei den anderen Gruppen. Insbesondere zeigte das Folsäure-DNA-Tetra-Dox eine frühere und signifikantere Abnahme 6 h nach der Inkubation, was beweist, dass das Folsäure-Targeting den Medikamenten hilft, sich an der Membran zu lokalisieren und die Wirkung von Dox schneller zu bewirken. Im Gegensatz dazu begann DNA-Tetra-Dox offensichtlich 12 Stunden nach der Inkubation zu wirken, was die Bedeutung der Ausrichtung auf Gruppen zeigt.

Darüber hinaus wurden HT-29-Zellen mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 0–200 μM behandelt, um die effektive Konzentration zu bestimmen (Abb. 4c). Die zelluläre Lebensfähigkeit von HT-29-Zellen nahm mit steigender Konzentration (0–100 μM) des Komplexes schnell ab, aber es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Konzentration von 100 und 200 μM, was auf eine dosisabhängige Art der Folsäure-DNA-Tetra- Dox, wobei 100 μM als wirksame Konzentration für die Antitumorwirkung angesehen werden können. Darüber hinaus änderte sich die zelluläre Lebensfähigkeit signifikant von 24 auf 48 Stunden für die Gruppen von 10, 20 und 50 μM, was darauf hindeutet, dass die Inkubationszeit ebenfalls ein Faktor bei der Beeinflussung der Tetra-Dox-basierten Antikrebseffizienz auf Folsäure-DNA-Basis war.

Apoptose induziert durch Folsäure-DNA-Tetra-Dox

Dementsprechend gab es basierend auf den Western-Blot-Assays (Fig. 5a) eine signifikante Zunahme der Expression von Caspase-3, die durch Folsäure-DNA-Tetra-Dox und DNA-Tetra-Dox induziert wurde, was beweist, dass Apoptose der Hauptweg von Dox- war. induzierten Zelltod.

Die zelluläre Expression von Apoptose-assoziierter Caspase-3 nach Behandlung mit verschiedenen Komplexen (a ) und die Durchflusszytometrie von HT-29-Zellen nach Inkubation mit DNA-Tetra, Dox, DNA-Tetra-Dox und Folsäure-DNA-Tetra-Dox (b –e )

Die Durchflusszytometrie (Abb. 5b–e) bewies außerdem, dass eine 6-stündige Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 100 μM 68,7 % Apoptose induzierte. In der Zwischenzeit betrugen die durch Dox und DNA-Tetra-Dox induzierten Apoptosespiegel bei denselben Inkubationsbedingungen nur 32,8 bzw. 60,5%.

Hemmung der Zellproliferation

Basierend auf den MTT-Assays war 100 μM die wirksame Konzentration für die Apoptose-Induktion und wurde im Zellproliferationsexperiment ausgewählt. Wie durch die zelluläre Proliferationskurve (Fig. 6) gezeigt, wurde aufgrund des zeitaufwendigen Prozesses der zellulären Aufnahme die Hemmung der Zellproliferation während des frühen Stadiums der Co-Inkubation nicht vollständig gezeigt. Eine signifikante Hemmwirkung zeigte sich nach einer Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox für mehr als 6 Stunden, was die Existenz einer DNA-Tetra-verstärkten Endozytose bewies. Unterdessen ist 6 h ein Vergleichszeitraum mit dem in Fig. 4b erfassten effektiven Zeitraum.

Hemmung der Zellproliferation durch Inkubation mit Folsäure-DNA-Tetra-Dox bei 100 μM für verschiedene Zeiträume

Diskussion

Als gängiges Mittel zur DNA-Modifikation hatte die Click-Chemie-Reaktion den Vorteil einer hohen Reaktionseffizienz, einer guten Kontrolle und einer einfachen Bedienung [21]. Elektrophoretogramm mit einer einzigen Marke (Abb. 2a), was darauf hinweist, dass die Produkte mit hoher Reinheit durch kovalente Kopplung über eine Klick-Chemie-Reaktion erhalten wurden. Die fluoreszierende Eigenschaft von Dox macht es in vitro und in vivo verfolgbar; Die Fluoreszenz im Inneren der Tumorzellen bewies indirekt die Stabilität von Folsäure-DNA-Tetra-Dox während des Penetrationsprozesses durch die Zellmembran. Daher war das Folsäure-DNA-Tetra-Dox fähig und stabil für biomedizinische Anwendungen.

DNA-Tetra hat die Fähigkeit, Medikamente in Zellen zu transportieren. Alle DNA-Sequenzen, die in dieser Forschung verwendet wurden, wurden für keine genetische Information kodiert. Somit wurden in allen Untersuchungen keine Nebenwirkungen sowohl auf die Genexpression als auch auf den Zellstoffwechsel berichtet. Aufgrund der hohen Expression des Folatrezeptors auf der Oberfläche von Tumorzellen wird Folsäure als spezifische Zielmoleküle des Wirkstoffabgabesystems ausgewählt, um die Aufnahmeeffizienz von DNA-Tetrakomplexen zu erhöhen. Unter den Umständen von DNA-Tetra in relativ hoher Konzentration spiegelte sich der Vorteil des Folatrezeptor-Targetings jedoch in vitro nicht vollständig wider. Dementsprechend hatte die Folsäure für die In-vivo-Anwendung das Potenzial, die Targeting-Effizienz im komplexen Kreislaufsystem zu verbessern.

Gegenwärtig bringen Krebsmedikamente häufig unerwartete Nebenwirkungen mit sich, daher war die Forschung zur Verbesserung der Targeting-Fähigkeit und der Abgabeeffizienz von Tumorzellen ein heißes Thema [23,24,25]. Frühere Studien zeigten, dass die Fähigkeit des DNA-Tetraeders zum Tragen von Medikamenten auf seiner guten Verträglichkeit beruht. DNA-Tetraeder ist ein künstlicher Behälter mit günstiger Modifikation und angemessener Biokompatibilität. In dieser Studie erzielte die erfolgreiche Kopplung von Dox und Folsäure mit DNA-Tetraedern eine zufriedenstellende hemmende Wirkung und führte zu einer offensichtlichen Apoptose der HT-29-Zelle. Dadurch, dass DNA-Tetra modifiziert und mit Wirkstoffen und Targeting-Molekülen gekoppelt werden kann, wurde die Anreicherung der lokalen Wirkstoffkonzentration in Tumorzellen realisiert. Die obigen Ergebnisse bewiesen die gute Erkennung von Tumorzellen und die entsprechende verstärkte Hemmwirkung durch die DNA-Tetra-Lieferung, und dieses Arzneimittelabgabesystem in Nanogröße kann umfassender verwendet werden.

Schlussfolgerungen

Als neu entwickelte Drug-Delivery-Strategie sind DNA-Strukturen in Nanogröße von geringen Kosten, hoher Stabilität und Möglichkeit der Synthese; Inzwischen ist es aufgrund der fehlenden exogenen Immunaktivität biosicher. Die DNA-Tetraeder-Kopplungsstrategie erleichtert die gezielte Abgabe von Dox, verbessert die Antikrebseffizienz von Dox auf Dickdarmkrebszellen und liefert eine vielversprechende Inspiration und Idee für das Arzneimitteldesign.