Antiproliferatives und Apoptose-auslösendes Potenzial von Paclitaxel-basierten Targeted-Lipid-Nanopartikeln mit verbesserter zellulärer Internalisierung durch Transferrinrezeptoren – eine Studie in Leukämiezellen

Hintergrund

Leukämie ist ein typischer Blutkrebs, der durch die zahlreiche Verdoppelung und Vermehrung weißer Blutkörperchen gekennzeichnet ist [1]. Die Leukämie beeinträchtigt daher das Lymphsystem und das Knochenmark stark und führt bei mehreren Patienten zu einer hohen Mortalität. Die abnormalen hämatopoetischen Stammzellen verursachen eine unkontrollierte Vermehrung im Knochenmark und führen zur Produktion von unreifen Leukozyten [2, 3]. Chemotherapie ist die am meisten bevorzugte Wahl der Behandlung dieser Krankheit; die meisten Chemotherapeutika führten jedoch nicht zu einer Behandlungswirksamkeit und verursachen eine schwere Toxizität für das normale Gewebe [4, 5]. Daher ist eine sofortige Behandlung von Leukämie für Krebspatienten überlebenswichtig. Eine neue Verabreichungsstrategie, die die Wirksamkeit des Medikaments erhöhen und gleichzeitig seine toxische Wirkung reduzieren könnte, ist das Gebot der Zeit [6].

Paclitaxel (PTX) gilt als eines der wirksamsten Medikamente bei der Behandlung mehrerer Krebsarten, einschließlich Leukämie [7]. Die potenzielle klinische Wirkung von PTX wird durch systemische Nebenwirkungen wie Myelosuppression auf gesundes Gewebe stark behindert. Darüber hinaus wurde berichtet, dass freie Arzneimittel schnell aus dem systemischen Kreislauf eliminiert werden, ohne ihre therapeutische Wirkung hervorzurufen [8]. Daher ist es wichtig, das geeignete Abgabesystem zu konzipieren, um die Stabilität und die therapeutische Wirkung des Antikrebsarzneimittels zu verbessern. Lipid-Nanopartikel weisen unter multiplen Trägersystemen eine ausgezeichnete systemische Stabilität auf [9, 10]. Genauer gesagt sind feste Lipid-Nanopartikel (SLN) eine einzigartige Klasse attraktiver Nanoträgersysteme, die den chemischen Abbau des verkapselten Wirkstoffs verhindern und die Bioverfügbarkeit erhöhen [11]. Zu den herausragenden Merkmalen von SLN gehören ausgezeichnete Stabilität, kontrollierte Wirkstofffreisetzung, stabil bei Raumtemperatur, Verwendung eines biokompatiblen und biologisch abbaubaren Lipidsystems und hohe Einschlusseffizienz von lipophilen Wirkstoffen wie Paclitaxel. Es wird erwartet, dass sich die Nanopartikel-Verkapselung des Arzneimittels aufgrund des verstärkten Permeations- und Retentionseffekts (EPR) bevorzugt im Tumor anreichert [12,13,14]. Obwohl Nanopartikel die Wirksamkeit von verkapselten Arzneimitteln erhöhen könnten; die Zielspezifität für den Tumor ist jedoch immer noch eine Frage. Um dieses Problem anzugehen, könnten Nanopartikel mit dem Targeting-Liganden dekoriert werden, der spezifisch auf die in Krebszellen überexprimierten Rezeptoren abzielen und die Akkumulation und Wirksamkeit von Medikamenten erhöhen könnte [15, 16]. In dieser Studie haben wir Transferrin verwendet, das spezifisch an den Transferrinrezeptor bindet, der in Leukämiezellen überexprimiert wird. Es ist bekannt, dass Leukämie eine große Anzahl von Transferrinrezeptoren überexprimiert. Die Transferrin-konjugierten Nanopartikel reichern sich in den Krebszellen rezeptorvermittelt an [17].

In dieser Studie haben wir ein multifunktionales Nanopartikel entwickelt, das aus Transferrin-dekorierten festen Lipid-Nanopartikeln besteht, die mit Paclitaxel verkapselt sind. Um das Transferrin in das SLN einzubauen, haben wir ein T_f . synthetisiert -PEG-Ölsäure-Konjugat durch die Konjugation von PEG und Ölsäure, die dann mit dem Transferrin konjugiert wurde. Das Vorhandensein von PEG wird die Stabilität von Nanocarriern in der in vitro- und systemischen Umgebung erhöhen. Außerdem erhöht die Anwesenheit von PEG auf der äußeren Oberfläche des Trägers das Kreislaufpotential des Trägersystems und dadurch die therapeutische Wirksamkeit.

Insgesamt war das Hauptziel dieser Studie, PTX-beladene multifunktionale Nanopartikel zu entwickeln und auf Leukämiezellen abzuzielen. Der physikalisch-chemische Aspekt von Nanopartikeln wurde untersucht. Die zytotoxische Wirkung von freiem Wirkstoff und Wirkstoff-beladener Formulierung wurde in Leukämie-Krebszellen getestet. Ein zelluläres Aufnahmeexperiment wurde durchgeführt, um die Zielspezifität des Transferrinliganden darzustellen. Die überlegene krebshemmende Wirkung der gezielten Nanopartikel wurde mit dem Hoechst 33342 Apoptose-Assay weiter untersucht und dann mit einem Durchflusszytometer nach Färbung mit Annexin V und PI quantitativ untersucht.

Methoden

Materialien

Compritol 888 ATO (Glycerolbehanat) wurde freundlicherweise von Gattefosse (China) zur Verfügung gestellt. Cholesterin, Ölsäure und Paclitaxel wurden von Sigma-Aldrich, China, bezogen. Humanes Transferrin (Tf) wurde von Sigma-Aldrich, China, bezogen. Alle anderen Chemikalien waren von Reagenzqualität und wurden als solche verwendet.

Herstellung von Paclitaxel-beladenen Transferrin-konjugierten festen Lipid-Nanopartikeln

Das Transferrin-PEG-Ölsäure (Tf-PEG-OA)-Konjugat wurde basierend auf der Amidbindungswechselwirkung synthetisiert [18]. Kurz gesagt wurden Ölsäure, NHS und DCC in einem Molverhältnis von 1:2:2 in organischem Lösungsmittel gelöst und 16 h gerührt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Getrennt davon wurde NH2-PEG-COOH in DMSO gelöst und mit Triethylamin versetzt und bis 12 h unter Inertatmosphäre reagieren gelassen. Das so gebildete PEG-OA wurde durch Dialyse und Gefriertrocknungsverfahren gesammelt. Nun wurden PEG-OA, DCC und NHS in einem Molverhältnis von 1:2:2 in DMSO gelöst und Transferrin (zusammen mit TEA) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt und die Reaktion wurde 12 h in einer inerten Atmosphäre durchgeführt. Die so gebildete Tf-PEG-OA-haltige Formulierung wurde 48 h dialysiert und dann lyophilisiert und zur weiteren Verarbeitung von Experimenten gelagert.

Das SLN wurde durch Lösungsmittelverdampfungsverfahren hergestellt [19]. Kurz gesagt wurden PTX, Compritol 888 ATO, Cholesterin und Tf-PEG-OA in einer organischen Mischung bestehend aus Ethanol/Chloroform (1:5) gelöst und 30 Minuten gerührt. Die resultierende organische Lösung wurde langsam in eine wässrige Phase, die 1% Polyvinylalkohol enthielt, zugegeben und sofort unter Verwendung eines T25-Homogenisators (IKA, Bangalore, Indien) bei 12.000 U/min homogenisiert. Die Lösung wurde dann 3 Minuten lang mit einer Sonde beschallt. Die Dispersion wurde 12 h gerührt, bis alle organischen Lösungsmittel verdampft waren. Der nicht eingeschlossene freie Wirkstoff wurde von den Wirkstoff-beladenen Nanopartikeln dreimal durch Wasser unter Verwendung eines Amicon Ultra-4-Zentrifugalfilters (Millipore Corporation, Bedford, USA) getrennt. Die Einschlusseffizienz (EE) und Beladungseffizienz (LE) wurde durch das HPLC-Verfahren bestimmt. Das arzneimittelbeladene Nanopartikel war Methanol und wurde 30 Minuten gerührt und mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt. Die beladene Arzneimittelmenge wurde durch Injektion in die HPLC-Säule berechnet. Das arzneimittelbeladene Lipid-Nanopartikel wurde bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Physische Charakterisierung von Nanopartikeln

Die Partikelgröße und Verteilung der verschiedenen Nanopartikel wurde durch das dynamische Lichtstreuungsverfahren (DLS) unter Verwendung von Zetasizer ZS Nano Malvern Instruments, UK, bewertet. Die Partikel wurden mit destilliertem Wasser verdünnt und für die Analyse verwendet. Die Studie wurde bei Raumtemperatur in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Die Morphologie der Nanopartikel wurde unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) unter Verwendung von JEM-2000EX (JEOL, Japan) beobachtet. Die Nanopartikel wurden mit Phosphotungistinsäure gefärbt und 15 Minuten bleiben gelassen. Die Partikel wurden dann vom Wasser abgelassen und 5 Minuten lang in Infrarotlicht getrocknet. Die Partikel wurden mit TEM abgebildet.

In-vitro-Studie zur Wirkstofffreisetzung

Die in-vitro-Wirkstofffreisetzungseigenschaften von zwei Nanopartikeln wurden unter Verwendung der Dialysemethode untersucht. Kurz gesagt, 1 ml Nanopartikel-Dispersionen wurden in einen Dialysemembranbeutel (MWCO:3500) gepackt, wobei beide Enden der Membran richtig versiegelt waren. Das Freisetzungsexperiment wurde eingeleitet, indem der endversiegelte Dialysebeutel in 10 ml Freisetzungsmedium in einen automatischen Schüttler mit einer Geschwindigkeit von 100 U/min gegeben wurde. Zu einem bestimmten Zeitpunkt wurde 1 ml Probe entnommen und mittels HPLC auf die Wirkstofffreisetzung analysiert. Perkin Elmer HPLC-System (Norwalk, USA) ausgestattet mit einer Pumpe (Serie 200), Online-Vakuumentgaser (Serie 200), Autosampler (Serie 200), Säulenofen (Serie 200), einem UV/VIS-Detektor (Serie 200 .) ) wurde benutzt. Es wurde eine C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) verwendet, die mit der Vorsäulen-Schutzkartusche RP18 (30  × 4,6 mm, 10 μm; Norwalk, USA) geschützt war. Es wurde ein linearer Gradient angewendet; 0 min, 10 % Acetonitril; 30 min, 90 % Acetonitril und analysiert bei 214 nm.

Zytotoxizitäts-Assay

Die Zytotoxizität von freiem Wirkstoff und Wirkstoff-beladenen Nanopartikeln wurde durch 4,5-(Dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet. Die HL-60-Zellen mit einer Aussaatdichte von 8000 Zellen pro Well wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit freien Arzneistoff- und Arzneistoff-beladenen Formulierungen in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt und weitere 24 h bei 37 °C in befeuchtetem CO₂ . inkubiert (5%) Inkubator. Die Zellen wurden dann 4 h lang mit 10 μl MTT-Lösung (5 mg/ml) behandelt. Die Zellen wurden dann DMSO ausgesetzt und 20 Minuten inkubiert. Die Formazankristalle wurden dann mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Multiskan GO, USA) bei 570 nm auf ihre Extinktion untersucht. Die Formazan-Absorption ist direkt proportional zur Menge an lebensfähigen Zellen, die in jeder Vertiefung vorhanden sind.

Zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln

Die Targeting-Effizienz von Nanopartikeln auf die Leukämiezellen wurde durch das zelluläre Aufnahmeexperiment auf In-vitro-Ebene bewertet. Kurz gesagt wurden HL-60-Zellen in einer 6-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 3 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro Vertiefung. Die Zellen wurden vor der Behandlung 24 h inkubiert. Um die Fluoreszenz und das Nanopartikel-Tracking zu beobachten, wurde Rhodamin B als Fluoreszenzfarbstoff mit Nanopartikel beladen. Das farbstoffbeladene Nanopartikel wurde den Krebszellen ausgesetzt und 3 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und auf einem Glasobjektträger befestigt. Die Zellen wurden dann unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM, Nikon, Japan) beobachtet.

Hoechst 33342 Assay

Der qualitative Apoptose-Assay wurde unter Verwendung von Hoechst 33342-Färbung durchgeführt. Kurz gesagt wurden HL-60-Zellen in einer 6-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 3 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro Vertiefung. Die Zellen wurden vor der Behandlung 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit entsprechenden Formulierungen behandelt und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehydlösung für 10 Minuten fixiert. Die Apoptose in Zellen wurde dann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops beobachtet.

Durchflusszytometer-basierter Apoptose-Assay

Die quantitative Apoptose wurde mittels Durchflusszytometer durch Färbung mit Annexin V und PI bewertet. Kurz gesagt wurden HL-60-Zellen in einer 6-Well-Platte mit einer Aussaatdichte von 3 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro Vertiefung. Die Zellen wurden vor der Behandlung 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit freiem Wirkstoff und mit Wirkstoff beladenen Formulierungen in verschiedenen Konzentrationen behandelt und weitere 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten CO2-Inkubator (5 %) inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen richtig gewaschen und die Zellen wurden vorsichtig extrahiert. Die Zellen wurden zentrifugiert und das Pellet wurde mit 2,5 μl Annexin V bzw. 2,5 μl PI behandelt und für 15 Minuten inkubiert. Das Volumen wurde dann auf 1 ml aufgefüllt und die Zellsortierung wurde mit einem Durchflusszytometer (BD FACS, Biosciences, USA) durchgeführt.

Kolonie-Bildungs-Assay

Die 1000 Zellen/Well wurden in eine 6-Well-Platte mit einem auf 2 ml eingestellten Medienvolumen ausgesät. Die Zellen durften 2 Tage lang eine Kolonie bilden. Die Zellen wurden mit verschiedenen Formulierungen mit einer PTX-Dosis von 0,1 μg/ml behandelt und 10 Tage inkubiert. Die Platten werden mit PBS gewaschen und in Methanol fixiert und mit Hämatoxylin gefärbt und gewaschen und luftgetrocknet. Die Koloniedichte wurde unter Verwendung der MultimageTM Lichtkammer (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) mit Hilfe der AlphaEaseFCTM Software gezählt.

Statistische Analyse

Die Signifikanz der Unterschiede wurde mit dem zweiseitigen Student-t . bewertet Tests oder Einweg-ANOVA. Die Unterschiede wurden auf einem Niveau von p . als signifikant angesehen < 0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Leukämie ist ein typischer Blutkrebs, der durch die zahlreiche Verdoppelung und Vermehrung weißer Blutkörperchen gekennzeichnet ist. In dieser Studie haben wir ein multifunktionales Nanopartikel entwickelt, das aus Transferrin-dekorierten festen Lipid-Nanopartikeln besteht, die mit Paclitaxel verkapselt sind. Um das Transferrin in das SLN einzubauen, haben wir ein Tf-PEG-Ölsäure-Konjugat durch Konjugation von PEG und Ölsäure synthetisiert, das dann mit dem Transferrin konjugiert wurde (Abb. 1). Die PEG-Ölsäure-Tf wird für mehrere Zwecke bei der Partikelherstellung verwendet. Die Anwesenheit des Tf-Liganden auf der Partikeloberfläche wird die Zielspezifität der Partikel gegenüber den Rezeptor-überexprimierten Krebszellen erhöhen. Das Vorhandensein von PEG auf der äußeren Oberfläche wird das dringend benötigte sterische Gleichgewicht bereitstellen, das den einzelnen Partikeln Stabilität verleiht. Wir haben diese Notiz zum Manuskript hinzugefügt.

Schematische Darstellung der Herstellung von PTX-beladenen Transferrin-dekorierten festen Lipid-Nanopartikeln

Physikochemische Charakterisierung von Nanopartikeln

Das arzneimittelbeladene Nanopartikel wurde durch ein Lösungsmittelverdampfungsverfahren gefolgt von einer Homogenisierung hergestellt. Die durchschnittliche Partikelgröße von PTX-beladenen Lipid-Nanopartikeln (PLN) betrug ~ 140 nm, während die endgültige Partikelgröße von Transferrin-dekorierten PTX-beladenen Lipid-Nanopartikeln (TPLN) ~ 160 nm betrug (Abb. 2a). Die leichte Zunahme der Partikelgröße wurde der Konjugation von Transferrin an die Nanopartikeloberfläche zugeschrieben. Es wurde berichtet, dass Partikeleigenschaften, einschließlich Größe und Ladung, wichtige Faktoren für seine systemische Leistung sind. Die Größe und Ladung spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Aufnahme und der toxischen Wirkung auf die Zellen. Eine Partikelgröße von weniger als 200 nm, wie sie in der vorliegenden Studie beobachtet wurde, gilt als am günstigsten für das Krebs-Targeting, da sie aufgrund des verstärkten Permeations- und Retentionseffekts (EPR) die spezifische Anreicherung der Partikel im Krebsgewebe ermöglicht [ 9, 20, 21]. In ähnlicher Weise bestimmt die Oberflächenladung von Nanopartikeln die kolloidale Stabilität der Partikelwechselwirkung mit der Zelloberfläche. Die mittlere Oberflächenladung von TPLN betrug − 22,5 ± 1,56 mV, was auf sein Potenzial für die Krebsbekämpfung hindeutet. Die Morphologie des Partikels wurde wiederum durch TEM untersucht (Abb. 2b). Die Partikel waren perfekt kugelförmig und gleichmäßig im TEM-Gitter verteilt. Die gleichmäßige Verteilung der Partikel zeigt den Erfolg der Präparationsmethodik.

a Partikelgrößenverteilung von TPLN, gemessen durch dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS). b Partikelformmessung durch Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Die DLS-Experimente wurden dreifach durchgeführt (n = 3)

Drug Loading und In-vitro-Drug-Release

Die Einschlusseffizienz von PTX in Nanopartikeln betrug 92,5 ± 1,35 % mit einer aktiven Beladungseffizienz von 8,6 % w /w . Die in-vitro-Wirkstofffreisetzungseigenschaften von PLN und TPLN wurden durch das Dialyseverfahren untersucht. PLN und TPLN zeigten eine anhaltende Freisetzung des Arzneimittels aus dem Trägersystem, was auf seine Eignung für Krebs-Targeting-Anwendungen hindeutet. Zum Beispiel werden ~ 30 % des Wirkstoffs aus beiden Nanopartikeln am Ende des 24-Stunden-Studienzeitraums freigesetzt (Abb. 3). In ähnlicher Weise wurde die Wirkstofffreisetzung bis zum Ende von 75 Stunden aufrechterhalten, wobei eine durchschnittliche Freisetzung von etwa ~ 65 % beobachtet wurde. Es sollte beachtet werden, dass TPLN im Vergleich zu PLN eine weitaus länger anhaltende Freisetzung von Medikamenten zeigte. Die etwas geringere Wirkstofffreisetzung wurde hauptsächlich der Konjugation des Transferrinliganden an die Oberfläche des Nanopartikels zugeschrieben. Das hohe Molekulargewicht von Transferrin könnte die Wirkstofffreisetzung stark hemmen. Insgesamt zeigt eine anhaltende und verlängerte Freisetzung des Arzneimittels aus dem Nanopartikel an, dass das Arzneimittel gut mit der Lipidmatrix dispergiert ist, wodurch das anfängliche Freisetzungsstoß oder das zweiphasige Freisetzungsmuster vermieden wurde. Insgesamt könnte eine kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels aus dem Trägersystem die Krebsbehandlung potenzieren.

In-vitro-Wirkstofffreisetzungseigenschaften von PTX aus PLN und TPLN aus phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4). Die Wirkstofffreisetzung wurde durch ein Dialyseverfahren untersucht und das Arzneimittel wird durch ein HPLC-Verfahren quantifiziert. Die Messung wurde n . durchgeführt = 3

Zelluläre Aufnahme der Nanopartikel

Das Targeting-Potenzial der Nanopartikel auf die Leukämie-Krebszelle wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) getestet. Die Nanopartikel wurden den Krebszellen ausgesetzt und 3 h lang inkubiert. Rhodamin B wurde als Fluoreszenzfarbstoff verwendet, um die Nanopartikelverteilung in den Krebszellen zu verfolgen. Wie in Abb. 4 gezeigt, war die rote Fluoreszenzintensität in PLN relativ geringer als in TPLN. Die Ergebnisse zeigten deutlich die bemerkenswert höhere Fluoreszenz im Zellzytoplasma im Vergleich zu der des PLN, was auf das überlegene Targeting-Potenzial von TPLN auf die Krebszellen hindeutet. Eine bemerkenswert höhere Fluoreszenzintensität wurde hauptsächlich der Konjugation von Transferrin an die Nanopartikeloberfläche zugeschrieben. Das Tf band vorzugsweise an die in den Krebszellen überexprimierten Tf-Rezeptoren und führte zu einer höheren Anreicherung der Nanopartikel in den Krebszellen [22].

Zelluläre Aufnahmeanalyse von TPLN und PLN mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop (CLSM) bei 37 °C. Rhodamin B wurde als Fluoreszenzfarbstoff verwendet und für 3 h inkubiert. Die zelluläre Aufnahmeanalyse wurde nach 3 h Inkubation der Nanopartikel bei 37 °C im Brutschrank durchgeführt. Maßstabsleiste ist 20 μm

In-vitro-Zytotoxizitäts-Assay

Die in vitro zytotoxische Wirkung von freiem PTX, PLN und TPLN in HL-60-Zellen wurde durch MTT-Assay bewertet. Wie in Abb. 5 gezeigt, zeigten alle Formulierungen eine typische dosisabhängige zytotoxische Wirkung in den Leukämie-Krebszellen. Es ist ersichtlich, dass PTX zwar eine dosisabhängige Wirkung zeigte, PLN jedoch eine relativ höhere zytotoxische Wirkung zeigte, was auf die höhere intrazelluläre Aufnahme und die anhaltende Freisetzung des Wirkstoffs aus den Nanopartikeln zurückzuführen sein könnte. Genauer gesagt zeigte TPLN eine signifikant höhere zytotoxische Wirkung in den Krebszellen im Vergleich zu PLN, was auf die überlegene Targeting-Effizienz des Tf-dekorierten Nanopartikelsystems hinweist. Der IC50-Wert von TPLN betrug 0,45 μg/ml im Vergleich zu 2,8 μg/ml für PLN. Eine sechsfache Abnahme des IC50-Wertes wurde hauptsächlich der höheren intrazellulären Aufnahme von TPLN in die Tf-Rezeptor-überexprimierten Krebszellen zugeschrieben. Ein höheres Abgabepotential von TPLN im Vergleich zu PLN und eine anhaltende Freisetzung des Arzneimittels an das nukleäre Zielmolekül könnten der Hauptgrund für die stärkere zytotoxische Wirkung in den Krebszellen sein. Tf-dekorierte Nanoträger wurden als Angriffsziel für die Zufuhr von Krebsmedikamenten in Krebszellen untersucht, wodurch die wirksame Konzentration des verabreichten Medikaments verringert und die mit Multidrug Resistance (MDR) verbundenen Faktoren überwunden werden [23].

Zytotoxizitätsanalyse von freiem Wirkstoff und Wirkstoff-beladenem Nanopartikel durch MTT-Assay. Nach Behandlung der Zellen mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen und Inkubation für 24 Stunden wurden die Zellen durch MTT-Assay und mit einem Plattenlesegerät analysiert. Die Messung wurde n . durchgeführt = 6.*p < 0,05 ist die statistische Differenz zwischen TPLN und PTX

Hoechst 33342 Apoptose-Assay

Das zytotoxische Potenzial von Nanopartikeln wurde mit dem Hoechst 33342 Apoptose-Assay weiter untersucht. Die Zellen wurden nach Behandlung mit der jeweiligen Formulierung mit Hoechst 33342 gefärbt und 15 min inkubiert. Wie aus Abb. 6 ersichtlich, waren unbehandelte Kontrollzellen kugelförmig mit typischen Merkmalen für gesunde Zellen. Die mit PTX behandelten Zellen zeigten jedoch Unregelmäßigkeiten in der Zellform. In der mit PLN behandelten Gruppe konnte eine typische Zellschädigung und Apoptose beobachtet werden, die auf die erhöhte Aufnahme in die Krebszellen zurückzuführen sein könnte. TPLN induzierte eine höchst bemerkenswerte Apoptose der Krebszellen und viele der Zellen wurden mit großer Präsenz der apoptotischen Körperbildung verzerrt. Die bemerkenswerte Zellspaltung und Apoptose-Induktion stimmte mit den Zelllebensfähigkeitspatenten überein, wie im vorhergehenden Absatz beschrieben.

Hoechst 33342-basierter Apoptose-Assay. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt und die Apoptose wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Die Zellen wurden mit den jeweiligen Formulierungen 24 h lang inkubiert. Maßstabsleiste ist 50 μm

Durchflusszytometer-basierter Apoptose-Assay

Die quantitative Analyse des Apoptose-Assays wurde mit einem Durchflusszytometer nach der Färbung mit dem Annexin V- und PI-Färbekit durchgeführt. Die Zellen wurden mit entsprechenden Formulierungen behandelt und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Annexin V und PI gefärbt. Wie in Fig. 7 gezeigt, waren unbehandelte Kontrollzellen lebensfähig, wobei mehr als 99% der Zellen in der lebensfähigen Kammer vorhanden waren. Die PTX-Behandlung reduzierte den Anteil lebensfähiger Zellen auf 90% mit etwa ~ 9% der Apoptose. Der PLN zeigte etwa ~ 10% Apoptosezellen mit ~ 7% nekrotischer Zellen. Wichtig ist, dass TPLN eine signifikante (p < 0,05) Reduktion des Anteils der lebensfähigen Zellen auf ~ 65% mit etwa ~ 30% Apoptosezellen (frühe und späte Apoptose). Das bemerkenswerte Apoptosepotenzial von TPLN wurde der rezeptorvermittelten zellulären Aufnahme und der höheren Akkumulation von Krebsmedikamenten in den Krebszellen zugeschrieben, die die Antikrebswirkung in den Tumorzellen verstärken könnten [24, 25].

Apoptose-Assay auf Durchflusszytometer-Basis. Die Zellen wurden mit der entsprechenden Formulierung behandelt und nach 24 h wurden die Zellen mit Annexin V und PI für 15 gefärbt. Die Zellen wurden dann mit einem Durchflusszytometer sortiert. Die Zellen wurden 24 h mit den jeweiligen Formulierungen inkubiert. Die Messung wurde n . durchgeführt = 3.*p < 0,05 ist die statistische Differenz zwischen TPLN und PTX

Kolonie-Bildungs-Assay

Die Fähigkeit zur Koloniebildung in Gegenwart der jeweiligen Formulierung wurde durch einen Koloniebildungstest getestet. Fig. 8. Wie gezeigt, besitzen PTX und PLN ein geringes Potenzial, die Fähigkeit von Krebszellen zur Koloniebildung zu hemmen. Wichtig ist, dass TPLN eine bemerkenswerte Fähigkeit zeigte, die Koloniebildungsfähigkeit der Krebszellen zu kontrollieren. TPLN zeigte ~~20% Koloniebildung im Vergleich zu ~~70% Koloniebildung bei PTX, was auf die überlegene Antikrebswirkung von TPLN hinweist. Die Aufrechterhaltung einer akuten myeloischen Leukämie hängt von einer kleineren Population leukämischer Stammzellen und Vorläuferzellen ab, die die Fähigkeit zur Koloniebildung haben; Es ist wichtig zu testen, ob TPLN in der Lage ist, auf den Pool von koloniebildenden Zellen abzuzielen. Wie die Ergebnisse zeigen, kann es das Risiko von Leukämiekrebs signifikant reduzieren, was auf eine Fähigkeit hindeutet, die Entwicklung von Krebs zu verhindern und/oder bösartige Zellen im Frühstadium zu eliminieren. Daher liefert der Koloniebildungstest entscheidende Informationen über die potenzielle Antikrebswirksamkeit der Formulierungen.

Koloniebildungstest. Die Zellen wurden nach der jeweiligen Behandlung einem Koloniebildungstestprotokoll unterzogen. Die Zellen wurden 24 h mit den jeweiligen Formulierungen inkubiert. **p < 0,001 ist die statistische Differenz zwischen PTX und PTLN

Schlussfolgerung

Insgesamt wurde ein Transferrin-dekorierter Paclitaxel-beladener Lipid-Nanopartikel mit dem Ziel hergestellt, die chemotherapeutische Wirksamkeit in den Leukämiezellen zu erhöhen. Die Ergebnisse zeigten eindeutig das überlegene Targeting-Potenzial von TPLN auf die Krebszellen im Vergleich zu PLN. Genauer gesagt zeigte TPLN eine signifikant höhere zytotoxische Wirkung in den Krebszellen im Vergleich zu PLN, was auf die überlegene Targeting-Effizienz des Tf-dekorierten Nanopartikelsystems hinweist. Wichtig ist, dass TPLN eine bemerkenswerte Apoptose von Krebszellen zeigte und eine starke Anti-Tumor-Fähigkeit auf beiden HL-60-Zellen zeigte. Insgesamt zeigten die Ergebnisse eindeutig das Targeting-Potenzial des Liganden-konjugierten Lipid-Nanopartikel-Systems auf die Leukämiezellen, das den Weg für eine erfolgreiche Krebsbehandlung ebnen könnte. Die therapeutische Wirksamkeit von Formulierungen im klinischen Tiermodell und ihre Bioverteilung werden Teil unserer nächsten Arbeiten sein.

Abkürzungen

EPR:

Verbesserte Permeations- und Retentionswirkung

OA:

Ölsäure

PEG:

Polyethylenglykol

PLN:

PTX-beladene Lipid-Nanopartikel

PTX:

Paclitaxel

SLN:

Feste Lipid-Nanopartikel

Tf:

Transferrin

TPLN:

Tf-konjugiertes PLN