Die potenzielle Leber-, Gehirn- und Embryotoxizität von Titandioxid-Nanopartikeln bei Mäusen

Hintergrund

Nanoskaliges Titandioxid (Nano-TiO₂ .) ) ist in der Lebensmittelindustrie weit verbreitet. Es wurde zur Herstellung von überzogenen Süßigkeiten, Obstkonserven, Kaugummi, kohlensäurehaltigen Getränken, Getränkepulver (in ungesüßter Darreichungsform oder konzentriert), Milch und Milchprodukten und anderen Lebensmittelkategorien verwendet [1, 2]. Die Konzentration von Nano-TiO₂ in Lebensmitteln erreicht bis zu 0,5–9 g/kg [1, 3], und viele Lebensmittel, die angeblich nano-TiO2-frei sind, enthalten nano-TiO2 [2]. Nano-TiO₂ ist auch in der Biomedizin, der Behandlung organischer Schadstoffe, der Werkstofftechnik und der Kosmetik weit verbreitet [4,5,6]. Die Sicherheit von Nano-TiO₂ Exposition bleibt unklar.

Studien haben gezeigt, dass Nano-TiO₂ können nach Aufnahme in den Körper durch verschiedene Methoden, wie Verabreichung über die Bauchhöhle oder Inhalation, in mehreren Organen angereichert und toxisch werden [7, 8]. Nano-TiO₂ kann für verschiedene Zelltypen toxisch sein, wie menschliche lymphoblastoide Zellen und Hepatomzellen [9, 10]. Es kann in Gliazellen des Mausgehirns eine akute Stressreaktion auslösen, die zu Neuronenschäden und -dysfunktionen führt [11]. Die Überlebensrate von Neuronenzelllinien, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt wurden Partikel wird in einer typischen zeit- und dosisabhängigen Weise signifikant verringert [12].

Studien haben mehrere Mechanismen aufgedeckt, durch die diese Nanopartikel Toxizität verursachen. Nano-TiO₂ Partikel können eine genetische Toxizität verursachen, indem sie die Struktur des Molekülkomplexes und die Permeabilität der Zellmembran verändern [13,14,15]. Nano-TiO₂ kann oxidativen Stress erzeugen. Während des oxidativen Stresses werden reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wie Hydroxylradikale, erzeugt und verursachen eine DNA-Oxidation, wodurch 8-OHG erzeugt wird, was zu Fehlern und Mutationen in der DNA-Replikation führt [16, 17]. Darüber hinaus können ROS Entzündungen und gegenseitige Feed-Forward-Interaktionen zwischen oxidativem Stress und Entzündungen auslösen, was zu DNA-Schäden und Zellapoptose führt [18, 19]. Die umfassenden systematischen Daten zur Toxizität von Nano-TiO₂ bleibt begrenzt. Unser Ziel war es, die Wirkung und den zugrunde liegenden Mechanismus von Nano-TiO₂ . aufzudecken Belastung der menschlichen Gesundheit.

In dieser Studie haben wir die Wirkung und den zugrunde liegenden Mechanismus von Nano-TiO₂ . untersucht Exposition mit Mausmodellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Nano-TiO₂ können angereichert sein und in mehreren Organen wie Leber, Niere, Milz, Herz, Lunge und Gehirn Toxizität verursachen, indem sie ein Oxidations-Reduktions-Ungleichgewicht und Störungen der Genexpression erzeugen. Dies kann auch die Embryonalentwicklung schädigen. Unsere Studie könnte Daten liefern, um das potenzielle Risiko für die menschliche Gesundheit von Nano-TiO₂ . zu bewerten Belichtung.

Methoden

Chemikalien und Reagenzien

TiO₂ . im Mikromaßstab (Mikro-TiO₂ ) und 5 nm TiO₂ in Form von Anatas wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) und 10, 60 und 90 nm TiO₂ . bezogen (Anatas) wurden von Run He Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Formaldehyd, Salpetersäure, Wasserstoffperoxid und Heparinnatrium waren von Reagensqualität und wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen. Phosphatpuffer (PBS), Penicillin und Streptomycin wurden von Gibco (San Diego, USA) bezogen. Gesamt-RNA-Extraktionskits wurden von Takara (Dalian, China) bezogen. Testkits für reaktive Sauerstoffspezies wurden von Jianchen Ltd. (Nanjing, China) bezogen. Vorrat TiO₂ Suspension (1%) in Hank-Lösung wurde 30 min bei 121 °C sterilisiert. Die Suspension wurde kurz vor der Verwendung beschallt und auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

Tiere und Modelle

Für die Untersuchung der Leber- und Hirntoxizität wurden ICR-Mäuse (imprinting control region) (22 ± 3 g, halb männlich und halb weiblich) vom Tierzentrum der China Medical University gekauft. Alle experimentellen Verfahren mit Tieren wurden von der Institutionellen Ethikkommission der Tianjin University of Science and Technology vorab genehmigt und in Übereinstimmung mit den internationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Für die Untersuchung der Toxizität von Mausembryonen wurden ICR-Mäuse (45 Weibchen, 20–35 g; 15 Männchen, 35–40 g) von Beijing Weitong Lihua Ltd. (Beijing, China) gekauft. Alle Mäuse waren gesund und geschlechtsreif. Fünf Tage vor der Behandlung wurden die Mäuse in getrennten Käfigen in einem Stall mit guter Belüftung, einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, 20 ± 2 °C, 60 ± 10 % relativer Luftfeuchtigkeit und freiem Zugang zu Futter und Wasser aufgezogen.

Dosierungsschema 1 wurde für einen allgemeinen Toxizitäts- und Hirntoxizitätstest entwickelt. Die Mäuse wurden zufällig in sechs Gruppen und eine zusätzliche Kontrollgruppe mit 10 Mäusen/Gruppe eingeteilt. Ein nanoskaliges TiO₂ (Nano-TiO₂ ) wurde 14 Tage lang einmal täglich eine Suspension injiziert (intraperitoneal (i.p.), 5, 10, 50, 100, 150 und 200 mg/kg). Den Mäusen der Kontrollgruppe wurde Kochsalzlösung injiziert. Die Mäuse wurden jeden Tag beobachtet und kein Tier starb während der Studie. Am 15. Tag wurden Blutproben aus dem Sinus orbitalis entnommen. Alle Mäuse wurden einzeln gewogen, mit 2% Phenobarbital (60 ml/kg, i.p.) anästhesiert und dann durch zervikale Dislokation getötet. Alle Gewebeproben wurden gesammelt (aus Kortex und Hippocampus isoliertes Hirngewebe) und bei -80 °C gelagert. Jedes Herz, jede Leber, Milz, Lunge und Niere wurde in zwei Portionen geschnitten. Eine Portion wurde zur pathologischen Untersuchung in Formalin (10 %)-Lösung bei 4 °C eingeweicht. Der andere Teil wurde zur Bestimmung des Titangehalts bei -20 °C gelagert.

Dosierungsschema 2 wurde für den Lebertoxizitätstest entwickelt. Die Mäuse wurden in drei experimentelle Gruppen und eine Kontrollgruppe eingeteilt. Nano-TiO₂ (5, 10, 50 mg/kg) wurde 60 Tage lang einmal täglich über eine Sonde verabreicht. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,5% CMC (Carboxymethylcellulose). Die Mäuse wurden jeden Tag beobachtet und kein Tier starb während der Studie. Am 60. Tag wurden die Mäuse mit 2% Phenobarbital (60 ml/kg, ip) anästhesiert und dann durch zervikale Dislokation getötet, die Lebern wurden sofort gesammelt und zur Untersuchung mittels Elektronenmikroskopie, ROS-Bestimmung und Lipidoxidation aufbereitet , und Analyse der Genexpression.

Bestimmung des Titangehalts in Zielgeweben

Ein Stück von 0,1–0,5 g gefrorener Gewebeprobe wurde geschnitten und bei Raumtemperatur aufgetaut und dann in HNO₃ . verdaut (0,5 ml) und H₂ O₂ (0,5 ml) bei 160 °C. Nach Verdünnung auf 3 ml mit 3 % Salpetersäure wurde die Titankonzentration in der Lösung mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) bestimmt. Der Titangehalt im Zielgewebe wurde dann berechnet.

Blutbiochemische Tests und Berechnung des Organ-/Körpergewichtsverhältnisses

Die Enzymspiegel in Serumproben wurden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät (TBA-2000FR, Toshiba, Tokio, Japan) analysiert. Diese Enzyme sind Biomarker, die mit der Funktion von Leber und Niere zusammenhängen.

Das Verhältnis Organ/Körpergewicht wurde basierend auf den Gewichten des Organs und des Körpers berechnet. Die Körpergewichte wurden vor der Narkose und der Tötung gemessen. Die Organe wurden nach der Isolierung von anästhesierten und getöteten Mäusen gewogen.

Pathologische Untersuchung und Transmissionselektronenmikroskopie

Eine pathologische Untersuchung des in Formalin getränkten Leber- oder Hirngewebes wurde nach Hämatoxylin-Färbung unter einem Lichtmikroskop durchgeführt. Für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde das Lebergewebe in Epoxidharz EPON 812 eingebettet und nach Glutaraldehyd- und Osminsäurefixierung in <500 μM dünne Abschnitte geschnitten. Die Schnitte wurden mit gesättigter Essigsäure-Uranlösung (pH 3,5) und Bleicitrat (pH 12) für 1–2 h gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden mit TEM untersucht.

Bestimmung des Gehalts an reaktiven Sauerstoffspezies, der Aktivitäten ihrer Stoffwechselenzyme und des Gehalts an Neurotransmittern

Für das Lebergewebe ist das Superoxidanion (O₂ ^– ) wurden mit XTT bestimmt. Die Aktivität der Katalase (CAT) wurde anhand von OD-Werten bei 240 nm nach veröffentlichten Verfahren bestimmt [20]. Das Niveau der Lipidperoxidation wurde durch den Gehalt an Malondialdehyd (MDA) nach veröffentlichten Verfahren bestimmt [21].

Hirngewebe wurden nach der Isolierung mit vorgekühlter 1%iger Polyvinylpolypyrrolidonlösung (50 mM in pH 7,6 PBS) homogenisiert. Die Überstände wurden nach Zentrifugation bei 15.000 U/min für 20 Minuten (Eppendorf 5418, Hamburg, Deutschland) gesammelt und für die anschließende Analyse der Aktivitäten von Superoxidenzym (SOD), CAT, Ascorbatperoxidase (APX) und Glutathionperoxidase (GSHPx) verwendet. Die SOD-Aktivität wurde mit NBT (Nitrotetrazoliumchlorid-Blau-Test) bestimmt. Die Katalaseaktivität wurde unter Verwendung eines Kits (CAT Assay Kit, A007-2, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) bestimmt. Die Aktivität von APX wurde unter Verwendung eines Kits gemessen (APX Assay Kit, A123, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). Die GSHPx-Aktivität wurde unter Verwendung eines Kits (GSHPx-Assay-Kit, A005, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) bestimmt. Die Aktivitäten der konstitutiven Stickoxid-Synthase (cNOS), der induzierbaren Stickoxid-Synthase (iNOS) und der Acetylcholinesterase (AChe) wurden mit kommerziellen Kits (AChe Assay Kit, A024, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) bestimmt.

Die ROS-Spiegel im Hirngewebe wurden durch Zugabe von 2′, 7′ Dichlorfluorescindiacetat zu einer Endkonzentration von 10 μM in Hirngewebehomogenat und durch Inkubation bei 37 °C für 30 Minuten bestimmt; die Gewebe wurden dann einer Analyse mittels Durchflusszytometrie unterzogen.

Bestimmung des relativen mRNA-Spiegels

Gesamt-RNA wurde aus Lebergewebeproben unter Verwendung eines kommerziellen Kits (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767, Takara, Dalian, China) extrahiert. Komplementäre DNA wurde unter Verwendung von reverser Transkription mit Zufallsprimer synthetisiert. Die relativen mRNA-Spiegel von SOD, CAT, GSHPx, MT, HSP70, CYPA, P53, GST und TF wurden mit einem quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR)-Kit (One Step SYBR® PrimeScript™ RT-PCR-Kit, PR066A, Takara, Dalian, China). Alle Primer (Tabelle 1) wurden synthetisiert und von Shanghai Sangon Ltd. gekauft.

Ex-vivo-Embryo-Toxizitätstest

Embryonen von 8,5 Embryonaltagen wurden von weiblichen Mäusen nach zervikaler Dislokation isoliert und dann in 50,0 ml Hank-Lösung mit 3 ml sofort zentrifugiertem Serum (ICS) von Ratten, Mikro-TiO₂ . kultiviert , oder Nano-TiO₂ (0,0, 50,0, 100,0 und 200,0 μg/ml) mit 3 Embryonen in jeder Flasche für 48 Stunden.

Um die Wirkung von Mikro-TiO₂ . zu bestimmen oder Nano-TiO₂ Expositionszeit an Embryonen, die Embryonen wurden in 50,0 ml Hank-Lösung mit 3 ml ICS von Ratten, Mikro-TiO₂ . kultiviert , oder Nano-TiO₂ (200,0 μg/ml) mit 3 Embryonen in jeder Flasche für 16, 26 und 48 h und wurden dann 48 h lang mit vorgewärmter Hank-Lösung auf 37 °C gewaschen und in 50,0 ml Hank-Lösung mit 3 ml ICS aus . kultiviert Ratten.

Die embryonale Entwicklung wurde mit dem Maele-Fabry Van-Score bewertet [22]. Der Dottersackdurchmesser, die embryonale Scheitel-Steiß-Länge, die Kopflänge und die Anzahl der Körperschnitte wurden unter einem Präpariermikroskop untersucht. Die Fehlbildungsrate der sich entwickelnden Embryonen wurde auf der Grundlage der Bewertungen der morphologischen Veränderungen des Vorderhirns, Mittelhirns, Hinterhirns, der Vordergliedmaßenknospe, der Hintergliedmaßenknospe, des Hör- und Sehsystems und des Herzens bewertet. Mehr als 10 Embryonen von 2 ICR-Mäusen am embryonalen Tag 10.5 wurden zur Kontrolle isoliert.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mit SPSS 13 (IBM, Illinois, USA) analysiert. Der Unterschied zwischen der Behandlungsgruppe und der Kontrollgruppe wurde mit einem Dunnett-t . analysiert Prüfung. Der Unterschied zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung von ANOVA analysiert. Der Vergleich zwischen zwei von mehreren Proben wurde mit den LSD- und SNK-Tests analysiert. Kategoriale Daten wurden unter Verwendung des Chi-Quadrat-Tests und des Rangsummentests analysiert. Wenn P < 0,05, der Unterschied wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Gewebeverteilung von Titan in Mäusen nach nanoskaliger Titandioxid-Exposition

Wir haben Mäuse mit Nano-TiO₂ . behandelt (i.p., 5, 10, 50, 100, 150 und 200 mg/kg) für 14 Tage und bestimmte Titangehalte in den Organen von Mäusen. Die Ergebnisse zeigten, dass sich Titan in den Organen von Mäusen anreicherte, die mit unterschiedlichen Dosen von Nano-TiO₂ . behandelt wurden (Abb. 1). Das Ausmaß der Akkumulation war dosisabhängig (Abb. 1). Die Leber war das Organ, in dem Titan am meisten angereichert wurde, gefolgt von der Niere. Das Ausmaß der Titanakkumulation war in Milz, Lunge, Gehirn und Herz ungefähr gleich (Abb. 1). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nano-TiO₂ kann über den Magen-Darm-Trakt aufgenommen und über das Kreislaufsystem in das Gewebe verteilt und in den Organen Leber, Niere, Milz, Lunge, Gehirn und Herz abgelagert werden.

Titan wurde in Organen von Mäusen angesammelt, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0.05, # im Vergleich zur Kontrolle, P < 0.01

Allgemeine Toxizität von nanoskaligem Titandioxid bei Mäusen

Wir haben Mäuse mit unterschiedlichen Dosen von Nano-TiO₂ . behandelt für 14 Tage und stellte fest, dass es keinen Unterschied in der Körpergewichtszunahme zwischen Gruppen von Mäusen gab, die mit unterschiedlichen Dosen behandelt wurden (Daten nicht gezeigt). Niedrige Dosen von Nano-TiO₂ (5 und 10 mg/kg) veränderte das Verhältnis Organ/Körpergewicht von Leber, Niere, Milz, Lunge, Herz und Gehirn bei Mäusen nach i.p. Exposition für 14 Tage (Abb. 2). Die hohen Dosen von Nano-TiO₂ (50, 100, 150 und 200 mg/kg) erhöhte das Verhältnis Organ/Körpergewicht von Leber, Niere, Milz und Herz signifikant und verringerte das von Lunge und Gehirn bei Mäusen in dosisabhängiger Weise (Abb. 2 .). ).

Verhältnis von Organ-/Körpergewicht bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05; # im Vergleich zur Kontrolle, P < 0.01

Niedrigere Dosen (5, 10, 50 und 100 mg/kg) von Nano-TiO₂ änderte keinen Blutbiochemieindex (Abb. 3). Hohe Dosen von Nano-TiO₂ (150 bis 200 mg/kg) erhöhte Leberfunktionsbiomarker alkalische Phosphatase (ALP) und Alaninaminotransferase (ALT), Albumin (ALB), Leucinaminopeptidase (LAP), Butyrylcholinesterase (PChe), Gesamtbilirubin (TBIL) und Gesamtprotein ( TP) Niveaus (Abb. 3). Hohe Dosen senkten die Serumharnsäure- (UA) und die Blut-Harnstoff-Stickstoff-(BUN)-Werte, die Biomarker für die Nierenfunktion sind. Sie erhöhten die Serum-Aspartat-Aminotransferase (AST), Kreatinkinase (CK), Laktat-Dehydrogenase (LDH) und Alpha-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (HBDH), die Indizien für eine Myokardschädigung sind (Abb. 3).

Blutbiochemieindex bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05; # im Vergleich zur Kontrolle, P < 0.01. a Biochemie-Index für Leberfunktions-Biomarker. b Biochemieindex für Nierenfunktionsbiomarker. c Biochemischer Index für Myokardschädigungs-Biomarker

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hohe Dosen von TiO₂ kann dosisabhängig schwere Schäden an Leber, Niere, Herz und anderen Organen verursachen.

Lebertoxizität von Nano-TiO₂ in Mäusen

Wir haben die Lebertoxizität von Nano-TiO₂ . weiter untersucht . Unter Verwendung von Lichtmikroskopie fanden wir keine signifikanten Veränderungen in der Leber von Mäusen, die einer niedrigen Dosis (i.p. für 14 Tage, 5 mg/kg) nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (Abb. 4a, b). Wir beobachteten eine deutliche Gefäßobstruktion und -erweiterung (Abb. 4c, 50 mg/kg), eine Zunahme der Basophilen (Abb. 4d, 100 mg/kg), eine partielle Ischämie in der Leber (Abb. 4e, 150 mg/kg) und eine Obstruktion der zentralen Venen (Abb. 4f, 200 mg/kg) bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (i.p.).

Histologie der Leber von Mäusen, die mit Nano-TiO₂ . behandelt wurden Nano-TiO₂ . ausgesetzt . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. a Kontrolle. b TiO₂ , 5 mg/kg. c TiO₂ , 50 mg/kg. d TiO₂ , 100 mg/kg. e TiO₂ , 150 mg/kg. f TiO₂ , 200 mg/kg

Mit TEM fanden wir jedoch eine leichte Schwellung der Mitochondrien in Hepatozyten und das Vorhandensein von kondensiertem Chromatin und apoptotischen Zellen im Lebergewebe bei Mäusen, die einer niedrigen Dosis von Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (Schlundsonde für 60 Tage, 5 mg/kg) (Abb. 5a, b). Wir haben Nano-TiO₂ . beobachtet in den Mitochondrien von Hepatozyten, geschwollene Mitochondrien und Vakuolen in Mitochondrien der Leberzellen von Mäusen, die mit 10 mg/kg Nano-TiO₂ . behandelt wurden (Schlundsonde für 60 Tage, Abb. 5c). Darüber hinaus beobachteten wir in den Leberzellen von Mäusen, die mit 50 mg/kg Nano-TiO₂ . behandelt wurden, einen Nukleoluskollaps, verstreutes Chromatin, offensichtliche Apoptose und/oder apoptotische Körper (Schlundsonde für 60 Tage, Abb. 5d). Die Ergebnisse zeigten, dass Nano-TiO₂ kann zu pathologischen Schäden in Leberzellen auf subzellulärer und zellulärer Ebene führen.

Ultramikroskopische Struktur von Hepatozyten bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt wurden . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt wie durch eine Magensonde einmal täglich für 60 Tage angezeigt. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,5% CMC (Carboxymethylcellulose). a Kontrolle (×8000). b TiO₂ (5 mg/kg) (×8000). c TiO₂ (10 mg/kg) (×10.000). Pfeile zeigen Mitochondrien und Vakuolen in Mitochondrien an. d TiO₂ (50 mg/kg) (× 10.000)

Die Behandlung von Mäusen mit 5 mg/kg Nano-TiO₂ 60 Tage lang haben sich die ROS-Werte wie O ²⁻ . nicht geändert , H₂ O₂ , Stickstoffmonoxid (NO) und MDA (Fig. 6) oder die mRNA-Spiegel von SOD-, CAT-, GSHPx-, MT-, GST-, HSP70-, P53- und TF-Genen in Lebergeweben (Fig. 7). Behandlung von Mäusen mit 10 oder 50 mg/kg Nano-TiO₂ für 60 Tage führte zu einem signifikanten Anstieg des O ²⁻ .-Spiegels , H₂ O₂ , NO und MDA (Fig. 6) verringert die mRNA-Spiegel der SOD-, CAT-, MT-, GST-, HSP70-, P53-, TF- und GSHPx-Gene und erhöht die mRNA-Spiegel der CYP1A-Gene in der Leber von Mäusen ( Abb. 7). Die Ergebnisse zeigten, dass hohe Dosen von Nano-TiO₂ -induzierter oxidativer Stress und Veränderungen der Expression von Schutzgenen in der Leber exponierter Mäuse.

ROS-Produktionsraten und Lipidperoxidationswerte in Lebern von Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt wie durch eine Magensonde einmal täglich für 60 Tage angezeigt. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,5% CMC (Carboxymethylcellulose). * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05, normalisiert auf Gesamtprotein

Relative Expressionsraten von Genen in Lebern von Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt wie durch eine Magensonde einmal täglich für 60 Tage angezeigt. Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,5% CMC (Carboxymethylcellulose). * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05; # im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,01, normalisiert auf β-Aktin

Gehirntoxizität von nanoskaligem Titandioxid bei Mäusen

Wir haben die Hirntoxizität von Nano-TiO₂ . weiter untersucht . Wir untersuchten zunächst das Verhältnis von Gehirn/Körpergewicht bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (i.p. für 14 Tage). Niedrige Dosen (5, 10, 50 mg/kg) veränderten das Verhältnis von Gehirn/Körpergewicht nicht, und höhere Dosen (100, 150, 200 mg/kg) verringerten das Verhältnis von Gehirn/Körpergewicht in einem dosisabhängigen Weise (Abb. 2). Die Konzentration von Ti im Hirngewebe war dosisabhängig signifikant erhöht (Abb. 1).

Wir haben auch die histologischen Veränderungen im Gehirn von Mäusen untersucht, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (i.p. für 14 Tage) mit Hämatoxylin-Färbung. Wir haben beobachtet, dass niedrige Dosen von Nano-TiO₂ (50 mg/kg) veränderte die Histologie des Hirngewebes bei Mäusen nach i.p. Exposition für 14 Tage (Abb. 8a, b). Behandlung von Mäusen mit 100 mg/kg Nano-TiO₂ führte zu geplatzten und rissigen Nervenzellen im Hirngewebe (Abb. 8c). Behandlung von Mäusen mit 150 mg/kg Nano-TiO₂ führte zur Invasion von Entzündungszellen in das Hirngewebe (Fig. 8d). Die Ergebnisse zeigten, dass hohe Dosen von Nano-TiO₂ kann morphologische Schäden am Hirngewebe verursachen, was zu einer Entzündungsreaktion führt.

Pathologische Veränderungen im Hirngewebe von Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. a Kontrolle. b 50 mg/kg. c 150 mg/kg. d 200 mg/kg

Wir haben die Auswirkungen von Nano-TiO₂ . bestimmt über den Redoxzustand und Signalmoleküle im Hirngewebe von Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren (i.p. für 14 Tage). Wir haben beobachtet, dass eine niedrige Dosis (5 mg/kg) Nano-TiO₂ hat O ²⁻ . nicht geändert , H₂ O₂ und MDA-Spiegel, die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme APX, CAT, GSHPx und SOD oder die Spiegel der nicht-enzymatischen Antioxidantien ASA/DASA und GSH/GSSG nicht veränderten. Es änderte auch nicht die Aktivität der Stickoxidsynthase (NOS) und die NO-Spiegel im Hirngewebe (Fig. 9 und 10). Höhere Dosen von Nano-TiO₂ erhöhter O ²⁻ , H₂ O₂ und MDA-Spiegel, verringerten die Aktivitäten der antioxidativen Enzyme APX, CAT, GSHPx und SOD, verringerten die Spiegel der nicht-enzymatischen Antioxidantien ASA/DASA und GSH/GSSG, erhöhten die NO-Spiegel und die Aktivitäten von NOS und verringerten sich die Konzentrationen von AchE und Blutzucker (GLU) in den Hirngeweben (Abb. 9 und 10). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Nano-TiO₂ kann bei Mäusen nach i.p. Belichtung.

ASA/DASA- und GSH/GSSG-Verhältnisse im Gehirn bei Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage

Veränderungen der ROS-, antioxidativen Enzyme, NO-Signalübertragung, Glutamat- und AchE-Aktivitäten im Gehirn von Mäusen, die Nano-TiO₂ . ausgesetzt waren . Mäuse wurden mit Nano-TiO₂ . behandelt Suspension oder Kochsalzlösung wie angegeben durch intraperitoneale Injektion einmal täglich für 14 Tage. N = 10, * im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05; # im Vergleich zur Kontrolle, P < 0.01. a Veränderung von ROS (O2-, H2O2 und MDA) im Gehirn von Mäusen, die Nano-TiO2 ausgesetzt waren. b Veränderung der antioxidativen Enzyme (SOD, CAT, APX und GSHPx) im Gehirn von Mäusen, die Nano-TiO2 ausgesetzt waren. c Veränderung der NO-Signalisierungskomponenten (cNOS, iNOS und NO) im Gehirn von Mäusen, die Nano-TiO2 ausgesetzt waren. d Änderung des Glutamatgehalts und der AchE-Aktivität im Gehirn von Mäusen, die Nano-TiO2 ausgesetzt waren

Toxische Wirkung von Nano-TiO₂ auf Ex-Vivo-Mausembryonen

Bewertung der Entwicklungstoxizität von Nano-TiO₂ , verglichen wir zunächst das Wachstum und die Entwicklung von in vivo Embryonen und ex vivo Embryonen. Die Ergebnisse zeigten, dass das Wachstum und die Entwicklung von ex vivo Embryonen denen von in vivo Embryonen ähnlich waren (Daten nicht gezeigt). Daher haben wir ex vivo Embryonen verwendet, um die toxischen Wirkungen von Nano-TiO₂ . zu untersuchen auf Embryonen.

Wir haben die Auswirkungen unterschiedlicher Dosierungen (Endkonzentrationen 0,0, 50,0, 100,0 und 200,0 μg/ml) und unterschiedlicher Expositionszeiten von Mikro-TiO₂ . untersucht /nano-TiO₂ auf embryonales Wachstum und Entwicklung sowie die Morphologie von Geweben und Organen durch Untersuchung des embryonalen VXY-Durchmessers, der Scheitel-Steiß-Länge, der Kopflänge und der Anzahl der Körperabschnitte. Die Ergebnisse zeigten, dass das Mikro-TiO₂ änderten diese Indikatoren bei keiner Dosis (Tabelle 2).

Für verschiedene Größen von Nano-TiO₂ , Behandlung von Embryonen von 5–10 nm, 60 nm, 90 nm mit 50,0 μg/mL TiO₂ hatte keinen Einfluss auf den VXY-Durchmesser des Embryos, die Scheitel-Steiß-Länge, die Kopflänge und die Anzahl der Körperabschnitte (Tabelle 2). Höhere Dosen (100,0 und 200,0 μg/ml) verringerten den VXY-Durchmesser, die Scheitel-Rumpf-Länge, die Kopflänge und die Anzahl der Körperabschnitte und erhöhten die Fehlbildungsrate (Tabelle 2). Bei gleicher Dosis gab es keinen offensichtlichen Unterschied zwischen den Gruppen, die mit Nano-TiO₂ . unterschiedlicher Größe behandelt wurden , 50,0 oder 100 μg/ml. Behandlung von Embryonen mit 200 μg/ml nano-TiO₂ VXY-Durchmesser, Scheitel-Steiß-Länge, Kopflänge und die Anzahl der Körperabschnitte von Mäuseembryonen wurden mit zunehmender Größe von Nano-TiO₂ . signifikant verringert Partikel (Tabelle 2).

Behandlung von Mäuseembryonen mit Mikro-TiO₂ (200,0 μg/ml) für 16, 24 und 48 h änderten den VXY-Durchmesser, die Scheitel-Steiß-Länge, die Kopflänge und die Anzahl der Körperabschnitte nicht (Tabelle 3). Behandlung von Mäuseembryonen mit Nano-TiO₂ (5–10 nm und 60 nm, 90 nm, 200,0 μg/ml) für 16 h änderten auch den VXY-Durchmesser, die Scheitel-Rumpf-Länge, die Kopflänge und die Anzahl der Körperabschnitte nicht (Tabelle 3). Die Behandlung von Mäuseembryonen mit Nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm, 90 nm, 200.0 μg/mL) for 24 and 48 h decreased VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, and increased the malformation rate (Table 3). For the same exposure time, there was no difference in VXY diameter, crown–rump length, head length, the number of body sections, or malformation rate among groups of different sizes of nano-TiO₂ particles (Table 3).

In summary, these results indicate that nano-TiO₂ had toxic effects on the growth and development of mouse embryos in dose-dependent and time-dependent manners. The sizes of the nano-TiO₂ particles may affect toxicity with a trend of increasing toxicity associated with larger nano-TiO₂ particles.

Discussion

Nano-TiO₂ has been widely used in industry and medicine. However, the safety of nano-TiO₂ exposure remains unclear. In the present study, we investigated the potential toxicity of nano-TiO₂ , using mice models. We find that nano-TiO₂ accumulates in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after exposure (i.p. injection) in a dose-dependent manner. High doses of nano-TiO₂ significantly increase the organ/body weight ratios of the liver, kidney, spleen, and heart, and decrease those of the lung and brain in a dose-dependent manner. Moreover, high doses of nano-TiO₂ significantly increase the levels of ALT, ALP, LAP, PChE, TP, ALB, and TBIL, which are indices for liver function. They decrease the levels of UA and BUN, which are renal function indicators. Further, high doses significantly increase the activities of CK, LDH, AST, and HBDH, and significantly increase the levels of GLU, trigylceride, total cholesterol, and high-density lipoprotein. Low doses of nano-TiO₂ do not change these biochemical parameters. Our data support that nano-TiO₂ may be toxic and may affect the liver, kidney, heart, GLU, and lipid metabolism at high doses in a dose-dependent manner.

In the present study, we investigated the mechanism of liver toxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ may cause swelling of hepatocytes with obvious vacuoles in cells, and nuclear condensation in hepatocytes, and apoptosis and necrosis of hepatocytes in liver tissues. This is consistent with previous studies [7, 23, 24]. After the treatment of mice with high doses of nano-TiO₂ , we find that the levels of CAT, GSHPx, and SOD are significantly decreased, and there is nano-TiO₂ in the mitochondria of hepatocytes, revealed by TEM. This is consistent with previous studies [7, 25,26,27,28] suggesting that nano-TiO₂ generates excess ROS and reduces the antioxidant capacity of the cells through damaging the mitochondria. This is further supported by observation that nano-TiO₂ can significantly decrease the mRNA levels of SOD, CAT, GSHPx, MT and HSP70, CYP1A1, p53, GST, and TF genes in the mouse liver. SOD, CAT, GSH PX, and MT are involved in liver cell detoxification, CYP1A1 is involved in toxic-substance metabolism and defense against invasion from harmful substances, and HSP70 and p53 are involved in repairing liver cell DNA damage [10, 29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39]. These findings support that the mechanisms for nano-TiO₂ liver toxicity are damaging mitochondria, generating ROS, and causing expression disorders of protective genes.

In the present study, we investigated the mechanism of brain neurotoxicity of nano-TiO₂ . We find that high doses of nano-TiO₂ can produce lipid peroxidation and decrease antioxidant capacity, including SOD, CAT, APX, and GSHPx activities, resulting in oxidative stress, which may damage unsaturated fatty acids and brain tissue [24, 26, 37, 40]. We observed rupture and cracking in nerve cells and the infiltration of inflammatory cells in the brain. We further found that the activities of cNOS and iNOS are increased, and NO is excessively released. Glutamic acid levels and AChe activity are decreased in the brain. This is consistent with the effect of Fe₂ O₃ nanoparticles on olfactory bulb cells [40] and the effect of nano-TiO₂ on mouse hippocampal neurons [31, 41]. Glutamate is the most abundant amino acid in excitatory neurotransmitters of the nervous system. It is critical for the brain’s development and function [42]. Acetylcholinesterase is a key enzyme for levels of acetylcholine, which is critical for the function of the peripheral and central nervous systems. Nitric oxide regulates many central nervous functions, such as synaptic plasticity, the sleep–wake cycle, and hormone secretion [43]. Therefore, nano-TiO₂ may cause oxidative stress and may disrupt orders of neurochemical metabolism in brain tissue and therefore have neurotoxicity in the central nervous system.

We find that the micro-TiO₂ and low doses of nano-TiO₂ (5–10 nm and 60 nm and 90 nm) do not exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, while high doses of nano-TiO₂ (100–200.0 μg/ml) exhibit toxicity on ex vivo mouse embryos, as revealed by evaluation of morphology of exposed embryos. Whole embryo culture is a useful tool to assess the developmental toxicity of chemicals [44, 45]. Previous studies show that exposure of 14-day pregnant mice to a single dose of nano-TiO₂ in the nasal cavity increase the sensitivity of inflammatory response in F1 generation [46, 47]. Nano-TiO₂ does not affect white pregnant Kunming mice but inhibits growth, increases the rate of stillbirth, and exhibits developmental toxicity [48]. These studies indicate the presence of the developmental and genetic toxicity of nano-TiO₂ . This is further supported by studies that show cleavage and oxidative damage of DNA by nano-TiO₂ , for example, in Zebra fish [16, 49, 50]. Additionally, another shows an increase in the sister chromatid exchange rates in Chinese hamster ovary cells [51]. Nano-TiO₂ may also prevent chromosome formation during metaphase in the ovary when TiO₂ concentration is high [51]. These studies consistently show that exposure to high doses of nano-TiO₂ is linked with developmental and genetic toxicity. Furthermore, our data indicated that the size of nano-TiO₂ particles may affect its toxicity, with the trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles (Table 2).

In the current study, we found that titanium accumulates in a dose-dependent manner in the heart, liver, kidney, spleen, lung, and brain of mice after i.p. injection of nano-TiO₂ . This is consistent with published reports that absorption and distribution of nano-TiO₂ is dependent on blood circulation. Nanoparticles can be absorbed in mesenchymal cells through being ingested by airway epithelial cells; they can then penetrate into the blood or lymph, thus gradually being distributed to the whole body [52, 53]. It is worth noting that nano-TiO₂ in the abdomen cavity can be absorbed and transported to the brain by the circulatory system, and nano-TiO₂ can enter directly into the central nervous system without crossing the blood–brain barrier. This is consistent with previous studies [41, 54]. Nanoparticles can also be absorbed by the terminal nerve cell in the respiratory tract and then be transferred to the ganglion through the axon, eventually entering central nervous cells [8, 55]. Nano-TiO₂ can be absorbed in the nasal cavity through the olfactory epithelium, and then be transported to other parts of the brain, such as the hippocampus, through the olfactory nerve [41, 54]. Therefore, the brain may be directly exposed to nano-TiO₂ . Damage in the brain may be caused directly or indirectly by nano-TiO₂ .

Conclusions

Ingested nano-TiO₂ can be distributed to and accumulated in the heart, brain, spleen, lung, and kidney. It exhibits toxicity and causes disorders of the GLU and lipid metabolism. Nano-TiO₂ causes liver and brain toxicity mainly through increasing oxidative stress, decreasing antioxidant levels, and changing the expression of the protective genes in the liver. In addition, nano-TiO₂ has adverse effects on the growth and development of mouse embryos and the morphology of the tissues and organs. The size of nano-TiO₂ particles may affect their toxicity, with a trend of increasing toxicity being associated with larger nano-TiO₂ particles. These toxic effects are dose-dependent. Our study may provide data for the assessment of the risk of nano-TiO₂ exposure on human health.

Abbreviations

ALB:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartate aminotransferase

BUN:

Blood urea nitrogen

CK:

Creatine kinase

cNOS:

Constitutive nitric oxide synthases

HBDH:

Hydroxybutyrate dehydrogenase

ICR:

Imprinting control region

iNOS:

Inducible NOS

LAP:

Qleucine aminopeptidase

LDH:

Lactate dehydrogenase

Nano-TiO₂ :

Nanoscale titanium dioxide

PChe:

Butyrylcholinesterase

ROS:

Reactive oxygen species

TBIL:

Total bilirubin

TP:

Total protein

UA:

Uric acid