Magnetischer Goldnanopartikel-markierter monoklonaler Heparanase-Antikörper und seine anschließende Anwendung für die Tumor-Magnetresonanztomographie

Hintergrund

Tumormetastasen sind ein bösartiges Verhalten, das die Haupttodesursache bei Tumorpatienten ist. Derzeit gibt es keine wirksamen Strategien zur Erkennung von Tumormetastasen im Frühstadium. Typ-B-Ultraschall, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) sind derzeit die Standardinstrumente für die Diagnose von Tumormetastasen, können aber nur metastasierende Tumoren bestimmter Größe unterscheiden, wenn die meisten Patienten bereits an Fernmetastasen leiden [1 , 2]. Daher ist es dringend erforderlich, neue Strategien zu entwickeln, um eine frühe Tumormetastasierung zu erkennen.

Die molekulare Bildgebung, wie die molekulare MR-Bildgebung, hat sich in den letzten Jahren aufgrund ihrer guten räumlichen Auflösung und durchschnittlichen Kontrastmittelempfindlichkeit zu einer neuen Option für die Früherkennung und Behandlung von Tumoren entwickelt [3, 4]. Die Entwicklung neuer Kontrastmittel, die mehr bieten als eine Verbesserung der Bildgebung, ist eine der Hauptmotivationen in der MRT-Entwicklung. In letzter Zeit hat die Verwendung superparamagnetischer molekularer Sonden als starkes Signalverstärkungssystem die Empfindlichkeit von MR-zielenden Kontrastmitteln stark erhöht. Paramagnetische Ionenkomplexe oder Magnetpartikel-konjugierte mAbs wurden verwendet, um die Tumorrelaxationszeit zu verändern [5]. Die molekulare Bildgebung mit einer Kombination aus magnetischen Nanomaterialien und mAbs gegen tumorassoziierte Antigene (TAAs) ist ein Schwerpunkt der neueren Forschung. Die meisten der bisher entdeckten TAAs wie AFP, PSA und CEA sind tumorgewebespezifisch [6]. Daher ist die Kombination von mAbs gegen diese TAAs mit magnetischen Nanomaterialien für Tumore nützlich, die diese spezifischen Antigene exprimieren. Daher ist die Identifizierung eines gemeinsamen Tumorantigens, das für eine Reihe von Tumoren geeignet ist, und die Markierung von mAbs gegen ein solches Antigen mit magnetischen Nanomaterialien für die molekulare Bildgebung von Tumoren nützlich.

Heparanase (HPA) ist ein mit Tumormetastasen assoziiertes Gen, das 1999 von vier Labors gleichzeitig kloniert wurde [7,8,9,10]. Nur endogene Endoglykosidase kann Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG), den Hauptbestandteil der Proteoglykane in der extrazellulären Matrix (ECM), abbauen. HPA wird ubiquitär in metastasierenden malignen Tumoren exprimiert, und ihr Expressionsniveau ist eng mit der Tumormetastasierung verbunden. HPA kann die Integrität der ECM und der Basalmembran (BM) durch Spaltung von HSPG in der ECM und BM stören, was zur Freisetzung und Aktivierung von in der ECM verankerten Molekülen führt und dann die Tumorangiogenese und -metastasierung fördert [11, 12]. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass HPA als TAA für die Tumorimmuntherapie verwendet werden kann [13,14,15,16]. Hier wollten wir evaluieren, ob HPA als gängiges TAA für die molekulare Bildgebung von Tumormetastasen und ihre potenzielle Anwendung in der molekularen Bildgebung von Tumoren verfügbar ist.

In dieser Studie verwendeten wir magnetische Goldnanopartikel (30 nm) als Kontrastmittel und HPA-mAbs als Targeting-Vektoren, um HPA- und GoldMag-Molekülsonden zu konstruieren, und wir untersuchten die Durchführbarkeit und Bedeutung dieser Sonden in der molekularen MR-Bildgebung für die Frühdiagnose von Tumoren Metastasierung. Die biologischen In-vitro-Antitumorwirkungen von HPA-Antikörpern wurden ebenfalls bewertet, um eine experimentelle Grundlage für die Anwendung von HPA-mAbs in der Tumorbehandlung bereitzustellen.

Methoden

Zelllinien und Mäuse

Sieben Zelllinien wurden in dieser Studie verwendet. Heparanase-positive Zelllinien, einschließlich der Leberkrebszelllinie HepG2, der menschlichen Magenkrebszelllinien MKN45 und SGC-7901, der Dickdarmkrebszelllinie SW480 und der menschlichen Osteosarkomzelllinie U2OS, wurden von der American Type Culture Collection erworben. Heparanase-negative Zelllinien, die menschliche Brustkrebszelllinie MCF-7 und die menschliche primäre embryonale Fibroblastenzelllinie HF wurden von Dr. Liang (Burn Research Institute, Third Military Medical University, Chongqing, China) bereitgestellt. HepG2-Zellen wurden in DMEM kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum enthielt. SGC-7901-, SW480-, U2OS- und HF-Zellen wurden in RPMI 1640 kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum enthielt. MKN45- und MCF-7-Zellen wurden in RPMI 1640 kultiviert, das 15% fötales Rinderserum enthielt. Alle Zellen wurden in 5 % CO₂ . kultiviert Inkubator bei 37 °C und wurden alle 24–48 h passagiert. Fünfzehn BALB/c-Nacktmäuse (4 bis 5 Wochen alt) wurden von der Tierabteilung der Third Military Medical University gekauft. Tierversuche wurden in Absprache mit der lokalen Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität durchgeführt. Alle Nacktmäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gehalten.

Western Blot

Western Blot wurde durchgeführt, um die Hpa-Proteinexpression nach dem in unserer vorherigen Studie beschriebenen Verfahren zu detektieren [17]. Jede Zelllinie wurde mit dem M-PER-Extraktionsreagenz (Pierce Co.) lysiert. Proteinkonzentrationen wurden durch BCA-Assay (Bio-Rad, CA, USA) bestimmt. Dreißig Mikrogramm Proteine ​​wurden durch 10 % SDS-PAGE fraktioniert und dann auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Roche, Rotkreuz, Schweiz) übertragen. Die Membran wurde mit 5% (w /v ) Magermilch in TBST (20 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl und 0,1 % [v ." /v ] Tween-20) für 2 h bei Raumtemperatur. Dann wurde die Membran mit einer 1:200-Verdünnung von Anti-HPA-Antikörper (Insight, Israel) in Blockierungspuffer bei 4 °C über Nacht sondiert. Die Membran wurde viermal mit TBST gewaschen und mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörper gegen Maus-IgG für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde dann mit TBST gespült und die Proteinbanden wurden mit ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare, NJ, USA) sichtbar gemacht. Die Bilder wurden mit der Software Quantity One 4.1 (Bio-Rad) analysiert. Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Immunhistochemische Färbung

Die Hpa-Expression in den obigen Zelllinien wurde durch Immunzytochemie nachgewiesen. Kurz gesagt, die obigen Zellen wurden auf sterilen Deckgläsern bei 37 °C in einem 5 % CO₂ . kultiviert Inkubator für 48 h. Nachdem die endogene Peroxidaseaktivität durch Behandlung mit 0,3 % H₂ . blockiert wurde O₂ -Methanollösung für 20 Minuten, Zellen wurden mit dem primären Hpa-Antikörper (die Verdünnung des Antikörpers war 1:100) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit PBS, das 0,1% Triton X-100 enthielt, wurden die Objektträger mit einem sekundären Antikörper für 20 Minuten bei 20 °C inkubiert. Schließlich wurden die Objektträger 15 Minuten lang mit einem Avidin-Biotin-Enzymreagenz inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger in eine 3,3′-Diaminobenzidin/H2O2-Lösung getaucht. Als Negativkontrolle wurde PBS verwendet.

Konstruktion der HPA&GoldMag Molekularsonde und Rasterkraftmikroskopie

Die Konstruktion der molekularen Sonde wurde unter Verwendung des GoldMagTM-CS-Kits (Xi’an Gold magnetische Nano-Biotechnologie-Firma, GNK0202, Xi’an, China) gemäß der Bedienungsanleitung durchgeführt. Die Konzentration des HPA-Antikörpers beträgt 1 mg/ml. Eine Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurde verwendet, um die Form, Größe und Oberflächenerscheinung der Nanopartikel zu bewerten. Die nicht markierten magnetischen Goldnanopartikel oder die markierten magnetischen Goldnanopartikel wurden auf das Deckglas gelegt und bei Raumtemperatur 24 h lang luftgetrocknet. Die getrockneten Proben wurden unter Verwendung eines Rasterkraftmikroskops (AFM, Nanoscope, Digital Instruments, Santa Barbara, CA) analysiert.

Immunfluoreszenz

Kurz gesagt, die Zellen wurden auf sterilen Deckgläsern bei 37 °C in 5 % CO₂ . kultiviert Inkubator für 48 h. Dann wurden die Zellen mit 4% fixiert (w /v ) Formaldehyd in PBS für 30 Minuten und permeabilisiert mit 0,2 % (v /v ) Triton X-100 für 5 min bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden durch Inkubieren der Deckgläser mit 10 % (v /v ) Ziegenserum in PBS für 30 Minuten. Dann wurden die Zellen mit HPA&GoldMag-Molekularsonden oder normalen Maus-IgG&GoldMag-Sonden in einer Verdünnung von 1:50 gefärbt, gefolgt von Cy3-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG in einer Verdünnung von 1:100. Die Zellen wurden dann mit 0,4 mg/ml DAPI (Sigma-Aldrich) für 10 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Mikroskopische Bilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops aufgenommen. Als Negativkontrolle wurden normale Maus-IgG- und GoldMag-Sonden verwendet.

Durchflusszytometrie

Die Aktivität der HPA&GoldMag-Sonde wurde durch Durchflusszytometrie bestimmt. Die Zellen wurden 1 h lang mit Ziegenserum blockiert. Dann wurden die Zellen mit einer 10-μg HPA&GoldMag-Sonde oder normalem Maus-IgG&GoldMag bei 4 °C über Nacht gefärbt, viermal mit PBS gewaschen und dann mit einem FITC-markierten Antikörper gegen Maus-IgG 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Durchflusszytometer (Becton Dickinson) gemessen.

In-vitro-Studie von magnetischen Gold-Nanopartikeln für die MR-Bildgebung

Die magnetische Goldnanopartikellösung (5 mg/ml) wurde mit einer 1%igen Agaroselösung seriell zweimal (1:20–1:1280) verdünnt. Die Lösungen wurden in EP-Röhrchen verfestigt. MR-Scans wurden unter Verwendung eines 1% Agarosegels als Blindwertkontrolle durchgeführt. Die Scanparameter waren wie folgt:T1WI; TR600 ms/TE12 ms; Dicke 2,0 mm; Sichtfeld, 150 mm; und T2WI; TR6000 ms/TE92 ms; Dicke 2,0 mm; Sichtfeld, 150 mm. HPA&GoldMag MR-Molekularsonden wurden unter Verwendung von HPA-mAbs konstruiert, die mit 30 nm magnetischen Goldpartikeln markiert waren. Die Zellen wurden routinemäßig in 100-mm-Kulturschalen kultiviert, und HPA&GoldMag-Sonden oder negative IgG&GoldMag-Sonden wurden dann zu den Zellkulturen gegeben und 90 min bei 37 °C inkubiert. Ungebundene Sonden wurden durch Zugabe einer geeigneten Menge Ziegenserum blockiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Trypsin verdaut. Die Zellen wurden dann gesammelt, mit einer 1%igen Agaroselösung gemischt und in 1,5-ml-EP-Röhrchen überführt. Die MR-Untersuchung wurde mit einem 3,0 T-MRT-Scanner (die Scanparameter waren die gleichen wie oben beschrieben) unter Verwendung der spezifischen Magnetresonanzspule für Tiere durchgeführt. Vor dem Scannen wurden die Mäuse mit 1% Pentobarbital anästhesiert und in ein Scanbett gelegt.

In-vivo-Studie von magnetischen Gold-Nanopartikeln für die MR-Bildgebung

Vier bis sechs Wochen alten männlichen Nacktmäusen (26–30 g) wurden 200 μl MKN45-Zellen subkutan in die Hüfte injiziert. Jeder Nacktmaus wurden ungefähr 2,0 × 10 ⁶ . injiziert Zellen. Nach 2 Wochen sind die Tumoren sichtbar und werden für die MR-Bildgebung verwendet. Vor der Injektion und 2 h nach der Injektion wurde eine MRT-Untersuchung mit einem 3,0-T-MRT-Scanner durchgeführt. Die Parameter waren T2WI, TR6000 ms/TE92 ms; Dicke 1,5 mm; und Sichtfeld, 120 mm. Danach wurden Tumor-, Milz-, Leber-, Nieren-, Milz-, Herz- und Lungengewebe gesammelt, um eine Preußisch-Blau-Fe-Färbung durchzuführen.

Statistische Analyse

Alle Daten werden als mittlere ± ± Standardabweichung dargestellt. Die ANOVA-Analyse wurde mit der Software SPSS13.0 durchgeführt. A P value <  0.05 zeigte an, dass der Unterschied signifikant war.

Ergebnisse

HPA wurde in verschiedenen Krebszellen unterschiedlich exprimiert

Sowohl Western-Blot- als auch immunhistochemische Färbeanalysen wurden verwendet, um die Expression von Hpa in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, MCF-7-, SW480- und U2OS-Zellen zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Hpa-Expression in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, SW480- und U2OS-Zellen viel höher war, während in MCF-7-Zellen eine viel geringere Hpa-Expression nachgewiesen wurde (Abb. 1).

Expression von Hpa-Proteinen in verschiedenen Zelllinien. a Western-Blot wurde verwendet, um die HPA-Proteinexpression (65 kDa) in verschiedenen Tumorzelllinien nachzuweisen. Spur 1, HepG2; Spur 2, SGC-7901; Spur 3, MKN45; Spur 4, MCF-7; Spur 5, SW480; Spur 5, U2OS. b Immunhistochemische Analyse der HPA-Expression in HepG2-, SGC-7901-, MKN45-, MCF-7-, SW480- und U2OS-Zelllinien

Konstruktion und Nachweis der HPA&GoldMag Molekularsonde

Die molekulare Sonde HPA&GoldMag wurde hergestellt, indem die HPA-mAbs mit magnetischen Goldnanopartikeln unter Verwendung der Kopplungsreaktion zwischen den Oberflächen magnetischer Goldnanopartikel gekoppelt wurden. Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurde verwendet, um die Oberflächenstruktur der Sonde direkt zu beobachten. Wir zeigten, dass der durchschnittliche Durchmesser magnetischer Goldnanopartikel 13,78 nm ohne Markierung mit HPA-mAbs betrug (Abb. 2a); die Partikelgrößen waren homogen. Nach der Markierung mit HPA-mAbs betrug der durchschnittliche Durchmesser etwa 24,80 nm (Abb. 2b). Diese Ergebnisse legten nahe, dass magnetische Goldnanopartikel für die Kopplung mit HPA-mAbs geeignet sind.

a Modell der Kopplung magnetischer Goldnanopartikel mit HPA-mAbs. b Rasterkraft-Scanning von magnetischen Gold-Nanopartikeln

HPA&GoldMag Molekularsonden können spezifisch an HPA binden

Zuerst wurde die Spezifität der Bindung zwischen der molekularen Sonde und HPA durch Immunfluoreszenz bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass im Zytoplasma von HepG2-, MKN45-, SW480- und U2OS-Zellen eine große Menge roter Fluoreszenz nachgewiesen wurde, während in MCF-7-Zellen nur eine geringe Menge roter Fluoreszenz und in HF-Zellen keine Fluoreszenz nachgewiesen wurde . Negatives Maus-IgG&GoldMag zeigte jedoch in keiner Zelllinie irgendeine Wechselwirkung mit HPA (Abb. 3). Wir verwendeten außerdem Durchflusszytometrie, um die Spezifität der HPA&GoldMag-Molekularsonde zu testen. Wir zeigten eine negative Reaktion bei HF-Zellen und beobachteten 40 % positive Raten bei MCF-7-Zellen und 95 % positive Raten bei HepG2-, SW480-, U2OS- und MKN45-Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Sonden spezifisch an HPA binden können, die in Tumorzellen exprimiert wird.

Spezifität und Bindungsaktivität der Sonde durch Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie nachgewiesen. a Immunfluoreszenz wurde unter Verwendung von Sonden wie angegeben durchgeführt. b Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Spezifität der HPA&GoldMag-Molekularsonde zu testen

MR-Bildgebung von HPA- und GoldMag-Sonden in vitro

Nach serieller Verdünnung mit 1% Agarose zeigte die MR-Bildgebung magnetischer Goldnanopartikel mit einer T2WI-Sequenz eine unterschiedliche Signalreduktion. Das T2WI-Signal einer 1:640-Verdünnung war viel niedriger als das der 1 % Agarosegel-Kontrolle (P < 0,05) (Abb. 4a, b). Die Ergebnisse zeigten, dass die magnetischen Goldnanopartikel das MR-Signal selbst in einer geringen Konzentration effektiv reduzieren konnten, was darauf hindeutet, dass magnetische Goldnanopartikel für die molekulare Bildgebung geeignet sein könnten. Dann wurden HPA- und GoldMag-Molekularsonden verwendet, um HepG2-, SGC7901-, MKN45-, SW480-, U2OS-, HF- und MCF-7-Zellen zu markieren, die dann mit 1% Agarose gemischt und unter 3,0 T Magnetresonanz (MR) platziert wurden (Abb. 4c). MR-Scans mit T1WI (Abb. 4c, d) oder T2WI (Abb. 4c, e) Sequenz für axiales plus koronales Scannen. Die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur T1WI-Sequenz das Signal bei Verwendung der T2WI-Sequenz des MR-Scans signifikant reduziert war (P < 0,05) während das Signal in den HF-Zellen nach der Markierung nicht signifikant verändert war (P> 0,05), und das Signal in den MCF-7-Zellen nach der Markierung war minimal reduziert (P < 0.05).

a MR-Bildgebung von magnetischen Goldnanopartikeln nach zwei Verdünnungsreihen. b Diagramm der statistischen Ergebnisse der MR-Bildgebungssignalstärken von zwei seriell verdünnten magnetischen Goldnanopartikeln. c MR-Bildgebung aller Zellen nach Markierung mit den Sonden. Spur 1, HF; Spur 2, MCF-7; Spur 3, HepG2; Spur 4, SGC-7901; Spur 5, MKN45; Spur 5, SW480; Spur 6, U2OS. d Statistische Ergebnisse zum Vergleich der Signalstärken aus der MR-Bildgebung unter Verwendung der T1WI-Sequenz auf Zellen, die mit HPA- und GoldMag-Sonden markiert wurden. e Statistische Ergebnisse für die Signalstärken, die mit MR-Bildgebung unter Verwendung der T2WI-Sequenz auf mit HPA- und GoldMag-Sonden markierten Zellen nachgewiesen wurden

MR-Bildgebung von HPA- und GoldMag-Sonden bei Nacktmäusen

Alle Nacktmäuse wurden mit Pentobarbital-Natrium in einer Dosis von 50 mg/kg anästhesiert. Die molekulare Sonde wurde in die Schwanzvene der Nacktmäuse injiziert und der MR-Scan wurde vor und 2 h nach der Verabreichung durchgeführt. Da die Sonde von Makrophagen in Lunge und Leber absorbiert und über die Niere ausgeschieden werden konnte, zeigten die Scanergebnisse, dass Tumor-, Leber-, Nieren- und Lungengewebe in den Nacktmäusen nach der Injektion im Vergleich zu den Signalen signifikant reduzierte Signale aufwiesen die vor der Injektion erkannt wurden (P  0,05) (Abb. 5).

a MR-Bildgebung von Nacktmäusen vor und 2 h nach der Injektion von Kontroll- oder HPA- und GoldMag-Sonden. Der Pfeil zeigt die Tumoren bei Mäusen an. b Vergleich der Signalstärken von MR-Bildern mittels T2WI vor und nach Injektion der Kontroll- oder HPA&GoldMag-Sonden in Nacktmäuse. ^* P < 0.01

Diskussion

Die Tumorinvasion und Metastasierung ist ein komplexer biologischer Prozess, der die schlechte Prognose von Tumoren verursacht. Daher ist die frühzeitige Diagnose von Tumormetastasen eine wichtige Strategie für die Auswahl klinischer Behandlungsstrategien. MRT ist eine nützliche nicht-invasive Methode zur Tumorerkennung; es ermöglicht mehrdimensionale kontrastreiche Gewebebildgebung. Die MRT konnte jedoch Tumore mit geringer Größe nicht erkennen und kontrastreiche Mittel wie Metallnanopartikel (Eisen, Gold usw.) sollten zur Verbesserung der Tumorvisualisierung verwendet werden [18,19,20]. Die Entwicklung neuer Kontrastmittel auf Basis neuer Nanomaterialien ist von Vorteil, um MRT-Techniken zur Früherkennung von Krebs zu verbessern. Unter den bildgebenden Mitteln wird das superparamagnetische Eisenoxidpartikel (SPIO) als übliches Kontrastmittel in der molekularen MR-Bildgebung verwendet, bei der magnetische Goldnanopartikel superparamagnetische Nanokompositmaterialien mit einem Fe₃ . sind O₄ (Kerne)/Au (Schale)-Struktur [21,22,23,24]. Die superparamagnetischen Eigenschaften anorganischer Nanopartikel sind für die Magnetresonanztomographie (MRT) nützlich [25]. Eine Kombination dieser Nanopartikel mit gewebespezifischen Wirkstoffen (Antikörper oder niedermolekulare Substanzen) ermöglicht eine präzise Detektion und Diagnose von Tumoren. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass HPA in vielen Tumoren exprimiert wird und sein Expressionsniveau eng mit dem metastatischen Potenzial von Tumoren verbunden ist [26]. HPA kann die Integrität der ECM und BM durch den Abbau von HSPG zerstören, wodurch aktive Moleküle wie bFGF, HGF und VEGF freigesetzt werden, die in der ECM verankert sind, und so die Tumorprogression fördern [27,28,29,30]. Da HPA hauptsächlich in Tumoren im mittleren bis späten Stadium exprimiert wird, haben unsere früheren Studien gezeigt, dass HPA als übliches TAA für die Tumortherapie verwendet werden könnte [13,14,15]. Daher könnte HPA ein potenziell nützliches Ziel für die molekulare Bildgebung und Therapie von Tumoren sein.

Magnetische Goldnanopartikel sind superparamagnetische Verbundnanomaterialien mit einem Fe₃ O₄ (Kern)/Au (Schale)-Struktur, die durch die Reduktion von Au ³⁺ . erzeugt wird durch Hydroxylaminhydrochlorid aus superparamagnetischem Fe₃ O₄ Partikel [31, 32]. Da das Markierungsverfahren recht einfach ist, können sie für biologische Anwendungen wie Zellselektion, Proteinreinigung, Nukleinsäuretrennung und Immunoassays verwendet werden. Daher konnten wir nach einem etablierten Verfahren erfolgreich goldbeschichtete Eisenoxid-Nanopartikel präparieren und charakterisieren, die mit Anti-HPA-Antikörpern verbunden sind. In dieser Untersuchung wurden 30-nm-Magnetgoldpartikel verwendet, da sie viel stabiler sind als 50-nm-Magnetgoldpartikel. Ein Milligramm 30-nm-magnetischer Goldpartikel könnte an ungefähr 200 μg HPA-mAbs binden. Unsere Daten zeigten, dass die Verwendung magnetischer Gold-Nanopartikel in einer Verdünnung von 1:640 (ca 0,05). Somit konnte der kritische Wert für die In-vivo-Bildgebung mit magnetischen Goldpartikeln berechnet werden.

Die Aktivität und Spezifität der magnetischen Goldnanopartikel-gekoppelten HPA-mAb-Sonden wurde anschließend mittels konfokaler Lasermikroskopie, Durchflusszytometrie und Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen. Kurz gesagt wurde die Sonde in vitro durch Inkubation der Zielsonde und der negativen Kontrollsonde sowohl mit HPA (+) als auch (–) Zellen getestet. Hier zeigten menschliche MCF-7-Brustkrebszellen eine schwache HPA-Expression, während MKN45-, SW480-, U2OS-, HepG2- und SGC-7901-Zellen eine höhere HPA-Expression aufwiesen. Darüber hinaus wurde normales Maus-IgG als Kontrolle für die HPA-mAbs verwendet, um die Spezifität des Nanopartikels weiter zu beweisen.

Nachdem die Spezifität der Sonde in vitro getestet wurde, die Ziel- und Kontrollsonden wurden Nacktmäusen injiziert, denen menschliche MKN45-Magenkrebszellen subkutan injiziert wurden. Sobald der Durchmesser des Tumorgewebes 1 cm erreichte, wurde eine MR-Untersuchung mit einer 3,0 T-MRT-Kammer durchgeführt, um Signaländerungen in Tumoren vor und nach der Injektion mit Sonden zu erkennen. Die Scanergebnisse zeigten, dass die Tumorsignale 2 h nach der Sondeninjektion im Vergleich zu den Signalen vor der Sondeninjektion signifikant reduziert waren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die HPA- und GoldMag-Sonden ausgezeichnete Immunaktivitäten und bessere Wirkungen bei MKN45-Zellen tragenden Nacktmäusen hatten.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die molekularen HPA&GoldMag-Sonden in Verbindung mit HPA-mAbs ausgezeichnete physikalische und chemische Eigenschaften aufweisen. Die Sonde könnte spezifisch auf viele Tumorzellen abzielen, die sowohl in vitro als auch in vivo hohe HPA exprimieren. Bei einer 3,0 T-MRT-Untersuchung wurde gezeigt, dass die Sonden das T2WI-Signal in Tumorgeweben signifikant reduzieren; dies könnte eine experimentelle Grundlage für die molekulare Bildgebung von Tumormetastasen bieten.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopische Aufnahme

BM:

Kellermembran

CT:

Computertomographie

ECM:

Extrazelluläre Matrix

HPA:

Heparanase

HSPG:

Heparansulfat-Proteoglykan

MRT:

Magnetresonanztomographie

PVDF:

Polyvinylidendifluorid

TAA:

Tumor-assoziiertes Antigen