Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines auf Nanoliposomen basierenden Systems für die duale Wirkstoffabgabe

Hintergrund

Bei hartnäckigen Krebsarten wie dreifach negativem Brustkrebs sind der Behandlung mit Standardtherapien Grenzen gesetzt, da die Reaktion auf DNA-Schäden stark mit verschiedenen Signalnetzwerken verbunden ist [1,2,3]. Therapeutische Strategien, die die anfängliche Chemosensitivität solcher widerspenstigen Tumoren erhöhen, wurden untersucht, um die Grenzen in Frage zu stellen [4, 5]. Eine aktuelle Studie zur Unterdrückung onkogener Signalwege unter Verwendung eines DNA-Schadenswirkstoffs ist eine der kombinatorischen therapeutischen Strategien [6,7,8]. Die Studie deutete darauf hin, dass die Vorbehandlung eines Wachstumsfaktor-Inhibitors gegen resistente Krebszellen ihre apoptotische Reaktion auf ein genotoxisches Medikament synergisiert [9, 10]. Es besteht ein sehr wichtiger klinischer Bedarf an therapeutischen Strategien, die auf mehrere Krebszell-spezifische Überlebenswege abzielen, um das Ausmaß der Tumorzellabtötung und eine potenzielle Reduzierung der Gesamtarzneimittelexposition während der Behandlung zu erhöhen [11, 12]. Um in-vitro-synergistische Wirkungen von zwei Arten von Medikamenten in die Klinik zu übertragen, ist ein Verabreichungssystem, das beide Medikamente verabreichen und zeitdifferenziert freisetzen kann, aufgrund des Unterschieds zwischen den pharmakokinetischen (PK) Eigenschaften der Medikamente und die Schwierigkeit, auf dieselben Krebszellen in der richtigen zeitlichen Reihenfolge abzuzielen [13,14,15,16].

Ein nanoliposomales Abgabesystem ist eines der dualen Arzneimittelabgabesysteme, die auf eine Kombinationstherapie angewendet werden können. Die Hauptbestandteile von Liposomen sind im Allgemeinen Phospholipide ähnlich denen von Zellmembranen. Die Phospholipide bilden eine zweischichtige konzentrische Kugel mit einem inneren Kompartiment und zweischichtigen Membranen [17]. Die Nanoliposomen können es ermöglichen, dass die Medikamente mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften in das innere Kompartiment und die Doppelschichtmembran der Liposomen geladen und dann an die Läsion abgegeben werden. Somit kann eine synergistische In-vivo-Wirkung der beiden Medikamente, die unter Verwendung des nanoliposomalen Systems verabreicht werden, durch eine verbesserte Co-Lokalisierung der Medikamente in Krebszellen erreicht werden, nicht nur durch den Abgleich der PK-Eigenschaften jedes Medikaments, sondern auch durch die sogenannte verbesserte Permeabilität und Retention ( EPR) Wirkung von Tumorgewebe. Neben der Einkapselung von Wirkstoffen in das innere Kompartiment kann das Nanoliposom hydrophobe Wirkstoffe solubilisieren, ihre Stabilität erhöhen, ihre Blutzirkulationseigenschaften modulieren und somit ihre Anreicherung im Tumorgewebe induzieren [18].

Trotz der jüngsten Studien zu Nanoliposomen-basierten kombinierten Chemotherapie-Verabreichungssystemen müssen die Herstellungsprozesse der Systeme für eine zuverlässige und reproduzierbare Herstellung optimiert und physikalisch-chemische Eigenschaften von ihnen für die Entwicklung fortschrittlicherer Systeme aufgeklärt werden [13, 19]. In unserer Studie wurde ein nanoliposomales Abgabesystem, das mit Elrotinib (ERL; ERL freie Base, log_P = 3.3) und Doxorubicin (DOX; DOX HCl, log_P = 1.27) in einem einzelnen Liposomenvesikel wurde gemäß einem früheren Bericht als Modell-Nanoliposomensystem hergestellt, mit Ausnahme einer sogenannten nicht-PEGylierten Liposomenformulierung [13], und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Systems wurden untersucht. In-vitro-Studien zur Wirkstofffreisetzung wurden durchgeführt, um eine zeitlich unterschiedliche Freisetzung der Wirkstoffe zu untersuchen. Unter mehreren Methoden wie Extrusion, Beschallung und Hochdruckhomogenisierung [20,21,22] wurde die Ultraschallbehandlung mit einem Sondenbeschallungsgerät verwendet, um den Liposomendurchmesser aufgrund seiner effizienteren Verarbeitbarkeit zu reduzieren. Zur Optimierung der Wirkstoffverkapselung wurde eine vergleichende Studie über die Auswirkungen von Wirkstoffbeladungstechnologien wie der pH- oder Ammoniumsulfat-Gradientenmethode auf die Verkapselungseffizienz (EE) des Wirkstoffs durchgeführt. Darüber hinaus wurde das effektivste Verfahren zur Arzneimittelverkapselung durch Untersuchung der Auswirkungen der Verfahrensbedingungen auf die EE des Arzneimittels bestimmt. Die Herstellungsbedingungen für das nanoliposomale duale Wirkstoffabgabesystem, das sowohl mit ERL als auch DOX verkapselt ist und die Wirkstoffe in der richtigen Reihenfolge freisetzt, wurden optimiert. Die optimierten Zubereitungsmethoden und die Eigenschaften des dualen Wirkstoffabgabesystems legen eine Plattform für zuverlässige und reproduzierbare Zubereitungsprozesse und ein fortschrittlicheres Abgabesystem für translationale Studien nahe.

Methoden

Materialien

1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-phosphocholin (DSPC) und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -Glycerin) (Natriumsalz) (POPG) wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AI, USA) geliefert. Cholesterin stammte von Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, USA). Doxorubicin (DOX)-Hydrochlorid und freie Base von Erlotinib (ERL) wurden von Boryung Co., Ltd. (Seoul, Korea) bzw. Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Ammoniumsulfat (AS) und Zitronensäure (CA) wasserfrei wurden von Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd. (Siheung-si, Korea) geliefert. Alle anderen Reagenzien waren von Reagenzqualität und wurden von Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, USA) geliefert.

Herstellung von dualen Wirkstoff-verkapselten Nanoliposomen

Allgemeine Verfahren zur Herstellung der mit ERL und DOX verkapselten Nanoliposomen sind in Abb. 1 dargestellt. Kurz gesagt wurden ERL-verkapselte Liposomen unter Verwendung der sogenannten Thin Lipid Film-Hydratation-Methode hergestellt [23]. ERL wurde der Lipidmischung zugesetzt, die den dünnen Lipidfilm bildete, um das Arzneimittel in die Lipiddoppelschichtmembran der Liposomen einzukapseln. Der Liposomendurchmesser wurde durch Ultraschall mit einem Sondenbeschallungsgerät (Vibra Cell; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) verringert. DOX wurde unter Verwendung eines Transmembran-Ionenkonzentrationsgradienten der Nanoliposomen in das innere wässrige Kompartiment von ERL-verkapselten Nanoliposomen eingekapselt. Die detaillierten experimentellen und analytischen Methoden des Verfahrens werden in den folgenden Abschnitten vorgeschlagen.

Verfahren zur Herstellung und Charakterisierung von dualen Wirkstoff-verkapselten Nanoliposomen

ERL-verkapselte Liposomen

Eine Lipidmischung bestehend aus DSPC, Cholesterin und POPG im Verhältnis 27:20:3 (w /w /w ) wurde mit der freien ERL-Base in einem Gewichtsverhältnis des Arzneimittels zum Gesamtlipid von 3:50 gemischt. Diese Mischungen wurden in 9 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Chloroform:Methanol = 2:1 (v /v ). Die Lipidlösung wurde in einen Rundkolben gegeben und zur Bildung einer Lipidmembran wurde das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (Rotavapor R-210; BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Schweiz) unter Vakuum bei 40 °C entfernt. Die Membran wurde über Nacht im Vakuum getrocknet, um das gesamte restliche Lösungsmittel zu entfernen. Bei diesen Prozessen werden ERL-Moleküle über hydrophobe Anziehungskräfte in die Lipidmembran eingefügt und dann spontan in die Lipiddoppelschichtmembran der Liposomen eingekapselt, die durch den folgenden Hydratationsprozess gebildet werden.

Um die ERL-haltige Lipidmembran zu hydratisieren, wurden 8 ml 250–400 mM AS oder 300 mM Zitronensäurepuffer (pH 3,9) zu der an der Innenfläche des Rundkolbens gebildeten Membran gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation der Membran bei 65 °C durch Rotation des Kolbens wurde die Liposomensuspension mit einem Badbeschallungsgerät (Branson 3510E-DTH; Branson, Danbury, CT, USA) beschallt. Um den Liposomendurchmesser zu reduzieren, wurde die Liposomensuspension mit dem Sondenbeschallungsgerät bei Bedingungen wie einem Puls von 5 s an und 2 s aus, einer Amplitude von 20 % und einer Energie von 36 J pro Puls in einem Eiswasserbad beschallt , oder ein Wasserbad unter magnetischem Rühren. Um AS zu entfernen, das in die Nanoliposomen entladen wurde, wurde die Dialyse der Nanoliposomen über Nacht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) mit einer Dialyseschlauch-Zellulosemembran (14.000 Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO); Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA). Im Fall einer Nanoliposomensuspension, die unter Verwendung des Zitronensäurepuffers hergestellt wurde, wurde der pH-Wert der Lösung mit 300 mM Natriumbicarbonatpuffer auf etwa 6,5 ​​eingestellt, um einen Gradienten zwischen der Innenseite und der Außenseite der Nanoliposomen herzustellen.

DOX-Laden in ERL-verkapselte Nanoliposomen

Um DOX in ERL-verkapselte Nanoliposomen einzukapseln, wurde DOX-Hydrochlorid zuerst in 0,9%iger wässriger NaCl-Lösung bei 65 °C gelöst. Im Allgemeinen wurden 2 ml einer 1,5 mg/ml DOX-Lösung zu 8 ml der AS- und ERL-verkapselten oder Zitronensäure- und ERL-verkapselten Nanoliposomensuspension gegeben. Wirkstoffbeladungsprozesse der DOX-zugesetzten Nanoliposomensuspension bestanden aus Inkubation, Beschallung mit dem Bad-Sonicator, Äquilibrierung bei Raumtemperatur (RT) und Dialyse gegen PBS (pH 7,4) unter Verwendung der Dialyseschlauch-Zellulosemembran, um nicht eingekapseltes DOX aus dem Nanoliposomensuspension. Die Auswirkungen der DOX-Beladungsbedingungen auf die EE von DOX wurden mit vier experimentellen Gruppen untersucht. Gruppe 1 war die Mischung aus DOX-Lösung und den Liposomen, die in der Reihenfolge einer Inkubation bei 65 °C für 30 Minuten, einer Beschallung bei 65 °C für 5 Minuten und einer Dialyse über Nacht behandelt wurde. Gruppe 2 wurde 30 min bei 65 °C inkubiert, 5 min bei 65 °C beschallt, 30 min bei RT äquilibriert und dann über Nacht dialysiert. Gruppe 3 wurde 30 min bei 65 °C inkubiert, 15 min bei 65 °C beschallt und dann über Nacht dialysiert. Gruppe 4 wurde 30 Minuten lang bei 65 °C inkubiert, 15 Minuten lang bei 65 °C beschallt, 30 Minuten lang bei RT äquilibriert und dann über Nacht dialysiert.

Durchmesser, Morphologie und physikalische Stabilität dualer Wirkstoff-verkapselter Nanoliposomen

Der Durchmesser der arzneimittelverkapselten Nanoliposomen wurde bei 25 °C unter Verwendung eines Partikelgrößenanalysators (ELS-Z; Otsuka Electonics Co., Ltd., Osaka, Japan) gemessen. Morphologie und mittlerer Durchmesser der einzelnen oder dualen Wirkstoff-verkapselten Nanoliposomen wurden mit einem Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskop (FE-TEM) (JEM 2100F; JEOL Ltd., Tokio, Japan, installiert am Korea Basic Science Institute) bei 200 kV beobachtet. Zur Herstellung der Probe wurde die Nanoliposomensuspension auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter aufgetropft und das Gitter vor der Betrachtung unter dem Mikroskop bei RT luftgetrocknet. Die physikalische Stabilität der dualen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen, die in PBS (pH 7.4) bei verschiedenen Temperaturen von 4, 25 und 37 °C inkubiert wurden, wurde untersucht, indem eine Änderung des Liposomendurchmessers als Funktion der Zeit beobachtet wurde. Der Liposomendurchmesser wurde unter Verwendung eines Partikelgrößenanalysators (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Worcestershire, UK) gemessen.

EE of Drugs

Die Verkapselungseffizienz (EE) von DOX oder ERL in den dualen Wirkstoff-verkapselten Nanoliposomen wurde durch die folgende Gl. (1).

wobei C _f ist die verkapselte Menge an ERL oder DOX in den Nanoliposomen, gemessen nach Zerstörung der Nanoliposomen mit 10 % Triton-X 100 für eine vollständige Freisetzung von ERL oder DOX aus ihnen. Die Extinktion von ERL wurde mit einem UV-Vis-Spektrometer (DU-800 Spektrophotometer; Backman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) bei 345 nm gemessen und die Fluoreszenzintensität von DOX wurde mit einem Spektrofluorometer (SFM-25; Tegimenta AG, Rotkreuz) gemessen , Schweiz) bei 495 nm und 590 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge. Die Menge an ERL oder DOX wurde unter Verwendung einer im Voraus erstellten Kalibrierungskurve von ERL oder DOX berechnet. C _ich ist die ERL- oder DOX-Menge, die der Lipidmischung oder den ERL-verkapselten Nanoliposomen zugesetzt wird. Die Mengen wurden bestimmt, indem die Extinktion oder Fluoreszenzintensität jedes Arzneimittels bei entsprechenden Wellenlängen gemessen wurde.

Arzneimittelfreigabe

Eine Dialysekassette (10.000 MWCO, Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2; Thermo Scientific Corp., Rockford, IL, USA) wurde mit der sowohl mit DOX als auch mit ERL verkapselten Nanoliposomensuspension gefüllt. Die Kassette wurde in PBS (pH 7,4) gelegt und die Freisetzungstestmedien wurden kontinuierlich bei 37 °C gerührt. Zu vorbestimmten Zeitpunkten wurden Aliquots der Probe aus der Kassette entnommen, um die Konzentration jedes Arzneimittels zu bestimmen, und dann wurde die Arzneimittelfreisetzung durch die folgende Gl. (2).

wo D _t ist die Konzentration von DOX oder ERL, die zu einem bestimmten Zeitpunkt während des Freisetzungstestzeitraums in den Nanoliposomen verbleibt und D _ich ist die Konzentration von DOX oder ERL, die in den Nanoliposomen vor dem Wirkstofffreisetzungsexperiment eingekapselt ist. Die DOX-Konzentration wurde durch Messung der Fluoreszenzintensität der Probe mit dem Fluoreszenzspektrometer bei 495 und 590 nm Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge bestimmt. Die ERL-Konzentration wurde durch Messung der Absorption der Probe bei 345 nm mit dem UV-Vis-Spektrometer bestimmt.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, sofern nicht anders angegeben.

Ergebnisse und Diskussion

Auswirkung von Herstellungsprozessen auf die Eigenschaften von Nanoliposomen

Es wurden duale arzneimittelverkapselte Nanoliposomen hergestellt, die ERL in eine Lipiddoppelschichtmembran und DOX in das innere Kompartiment der Nanoliposomen einkapselten. Nur mit ERL verkapselte Liposomen wurden hergestellt, um die in ERL eingebaute Lipidmembran mit einer wässrigen AS-Lösung zu hydratisieren. Während dieser Prozesse werden ERL-Moleküle über hydrophobe Anziehungskräfte in die Lipidmembran eingebaut und dann spontan in die Lipiddoppelschichtmembran der Liposomen eingekapselt. Nach der Hydratation wurde die Liposomensuspension unter Verwendung des Sondenbeschallers vom Horntyp mit Ultraschall behandelt, um den Liposomendurchmesser zu verringern. Um die Auswirkungen der Ultraschallbehandlung und der Kühlmethoden auf den Liposomendurchmesser zu untersuchen, wurden die Liposomen mit einer Verlängerung der Beschallungszeit unter verschiedenen Kühlbedingungen behandelt und die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Abbildung 2a zeigt die Auswirkung der Ultraschallbehandlungszeit auf die Durchmesser und Polydispersitätsindex (PDI) der Liposomen, die unter den Kühlbedingungen eines Eiswasserbades behandelt wurden. Der Durchmesser der ERL-verkapselten Liposomen, die nicht mit Ultraschall behandelt wurden, betrug 759 ± 44 nm. Bis 10 Minuten der Ultraschallbehandlung nahm der Liposomendurchmesser jedoch bemerkenswert auf 222 ± 40 nm ab, und nach 10 Minuten gab es keine signifikante Änderung des Durchmessers mit zunehmender Ultraschallzeit. Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei ERL-verkapselten Liposomen, die durch die Hydratation gebildet werden, hauptsächlich um multilamellare Vesikel (MLVs) handelt. Die hohe Energie, die den Liposomen vom MLV-Typ über die Ultraschallbehandlung zugeführt wird, schält die Mehrschicht von MLVs ab und zerlegt die großen Liposomen. In wässriger Lösung werden die von den MLVs abgetrennten Lipide durch hydrophobe Anziehung selbstorganisiert und so in große unilamellare Vesikel (LUV)–– oder kleine UV(SUV)-artige Nanoliposomen umgewandelt. Wenn sich diese Phänomene wiederholen, nimmt der mittlere Nanoliposomendurchmesser allmählich ab [24,25,26]. Wie in Abb. 2a gezeigt, wurde der Durchmesser der Liposomen in einer kurzen Ultraschallperiode merklich reduziert. Es wird angenommen, dass während dieser Zeit die meisten Liposomen vom MLV-Typ in Liposomen vom LUV- oder SUV-Typ umgewandelt wurden [27]. Die Ultraschallbehandlung von mehr als 10 Minuten führte zu einer leichten Abnahme des Liposomendurchmessers, was auf eine geringere Umwandlung des Vesikeltyps mit der Ultraschallzeit hinweist. Der PDI des Liposomendurchmessers nahm mit zunehmender Ultraschalldauer ab, was darauf hindeutet, dass der Liposomendurchmesser mit der Zeit trotz eines leichten Anstiegs des PDI nach 20 min gleichförmig wurde. Abbildung 2b stellt die Wirkung der Ultraschalldauer auf den Durchmesser und den PDI der Liposomen dar, die unter Kühlbedingungen eines Wasserbads behandelt wurden. Der Durchmesser der Liposomen ohne Ultraschallbehandlung betrug 1433 ± 143 nm. Der Liposomendurchmesser verringerte sich signifikant auf 337 ± 67 nm bis 5 Minuten Ultraschall, und nach 5 Minuten nahm der Durchmesser bis 15 Minuten allmählich ab, gefolgt von einer geringen Änderung des Durchmessers. Der PDI des Liposomendurchmessers variierte mit der Ultraschalldauer bis 15 min und erreichte danach ein Plateau. Unter Wasserbadbedingungen war die Zeit, die zum Reduzieren des Liposomendurchmessers auf unter 30% des Durchmessers unbehandelter Liposomen aufgewendet wurde, kürzer als die Zeit, die unter Eiswasserbadbedingungen verbracht wurde. Es wird angenommen, dass die Verringerung des Liposomendurchmessers durch Übertragung der durch die Ultraschallbehandlung erzeugten Wärmeenergie auf Liposomen vom MLV-Typ erfolgte. Verglichen mit der Eiswasserbadbedingung war die Temperatur der unter Wasserbadbedingungen beschallten Liposomensuspension zu hoch angehoben, was bedeutet, dass die Wärme der Liposomensuspension, die aufgrund einer Massenerhitzung durch Ultraschallkavitation stattfand, weniger effizient abgegeben wurde. Um die Liposomensuspension vor Nebenwirkungen wie einer Mediumverdunstung und einer möglichen Zerstörung der Lipidmoleküle durch Überhitzung zu bewahren, wurde das Eiswasserbad als Kühlbedingung für die Ultraschallbehandlung gewählt. Andererseits wurden die ultraschallbehandelten Liposomen dialysiert, um nicht eingekapseltes AS zu entfernen. Die mit Ultraschall und Dialyse hergestellten ERL- und AS-verkapselten Nanoliposomen hatten einen mittleren Nanoliposomendurchmesser von etwa 140 nm, was auf eine leichte Abnahme des Nanoliposomendurchmessers durch die Dialyse hindeutet. Die ERL- und AS-verkapselten Nanoliposomen wurden für die DOX-Verkapselung in das innere Kompartiment der Nanoliposomen unter Verwendung der AS-Gradientenmethode verwendet.

Auswirkungen der Sondenbeschallungszeit auf den Durchmesser und den Polydispersitätsindex von ERL-verkapselten Nanoliposomen:ein Eiswasserbad (a ) oder ein Wasserbad (b ) Abkühlen der Liposomensuspension in einem Behälter während der Ultraschallbehandlung (n = 3, die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM)

Abbildung 3 zeigt den Durchmesser von DOX- und ERL-verkapselten Nanoliposomen gemäß der Ultraschallbehandlungszeit mit einem Ultraschallbad während eines DOX-Beladungsprozesses. Geringe Variationen des Durchmessers waren denen nach 10 Minuten Ultraschallbehandlung von ERL-verkapselten Nanoliposomen ähnlich, wie in Abb. 2a gezeigt. Trotz der Verlängerung der Ultraschalldauer änderte sich der Nanoliposom-Durchmesser bis 45 min Ultraschall nicht signifikant. Diese Ergebnisse können darauf zurückgeführt werden, dass es sich bei DOX- und ERL-verkapselten Nanoliposomen um LUVs oder SUVs handelt [27]. Wenn die Ultraschalldauer länger als 45 Minuten war, trat eine Zunahme des SEM des mittleren Nanoliposomendurchmessers auf, was auf eine Zunahme der Unterschiede zwischen den Liposomenproben hinweist. Der PDI des Durchmessers nahm mit zunehmender Ultraschalldauer ab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gleichmäßigkeit des Liposomendurchmessers mit der Ultraschalldauer trotz eines leichten Anstiegs des PDI nach 60 Minuten Ultraschall zugenommen hat. Kurz gesagt, die Änderung des Nanoliposomendurchmessers durch Ultraschall war in der Transformationsphase am höchsten, in der die Liposomen von MLVs in LUVs oder SUVs umgewandelt wurden. Daher war die Ultraschallbehandlung zur Verringerung des Liposomendurchmessers am effektivsten, wenn die Behandlung zwischen der Hydratation der Lipidmembran und der DOX-Einkapselung in das innere Kompartiment von ERL-eingekapselten Nanoliposomen für eine relativ kurze Dauer durchgeführt wurde.

Auswirkungen der Badbeschallungszeit auf den Durchmesser und den Polydispersitätsindex von DOX- und ERL-verkapselten Nanoliposomen (n = 3, die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM)

Auswirkung der Drug-Loading-Methode auf EE

Die dualen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen wurden unter Verwendung von DOX-Beladung in ERL-verkapselte Nanoliposomen mit ungefähr 30 % EE von ERL und 140 nm des Nanoliposomendurchmessers hergestellt. Die Menge an eingekapseltem DOX oder ERL in den Liposomen wurde nach Zerstörung der Liposomen mit einem Tensid zur vollständigen Freisetzung der Arzneimittel aus den Liposomen gemessen. Die Fluoreszenzintensität von DOX und die Extinktion von ERL wurden durch Spektrofluormetrie bzw. UV-Vis-Spektrometrie gemessen. Um die Auswirkungen von DOX-Beladungsmethoden auf die EE von DOX in ERL- und DOX-verkapselten Nanoliposomen zu untersuchen, wurde eine aktive Beladungsmethode wie die pH-Gradient- oder AS-Gradientenmethode für die DOX-Einkapselung in die Liposomen verwendet. Der EE-Unterschied zwischen den beiden Wirkstoffbeladungsmethoden wurde untersucht, und die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt. Die EEs von DOX bei Verwendung der AS-Gradientenmethode betrugen 90 % oder mehr, und die EE bei Verwendung des pH-Gradienten betrug etwa 17%, was darauf hinweist, dass die AS-Gradientenmethode bei der DOX-Einkapselung weitaus effektiver war als die pH-Gradientenmethode [28].

Verkapselungseffizienz von DOX in dualen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen gemäß DOX-Beladungsmethoden und Ammoniumsulfat (AS)-Konzentrationen:CA Citronensäure (n = 3, die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM)

Beim Vergleich der Veränderungen der EEs von DOX gemäß den AS-Konzentrationen war die EE mit 350 mM AS am höchsten und SEM der EE am niedrigsten. Die AS-Gradienten- oder pH-Gradienten-Methode verwendet einen Wirkstoff-Translokationsmechanismus, der die Wirkstoffe außerhalb der Nanoliposomen aufgrund einer treibenden Kraft, die von einem transmembranen Ionenkonzentrationsgradienten der Nanoliposomen erzeugt wird, dazu veranlasst, in das innere Kompartiment der Nanoliposomen zu wandern [29, 30]. Der EE von DOX nach der AS-Gradientenmethode war jedoch deutlich höher als der der pH-Gradientenmethode. Diese Ergebnisse können der Tatsache zugeschrieben werden, dass die AS-Gradientenmethode bei der Entwicklung kristalliner Komplexe effektiver ist als die pH-Gradientenmethode aufgrund der höheren Kristallisierbarkeit zwischen dem ionisierten DOX und den Gegenionen innerhalb der Nanoliposomen [31, 32].

Auswirkungen von Medikamentenbelastung auf die EE

Um die Wirkung der Behandlungsbedingungen für eine Mischung aus DOX-Lösung und ERL-verkapselten Nanoliposomen auf die EE von DOX während des DOX-Beladungsprozesses zu untersuchen, wurden vier experimentelle Gruppen, die in Abb. 5a gezeigt sind, entsprechend den unterschiedlichen Behandlungsbedingungen entworfen und experimentiert. Gruppe 1 war die Mischung, die in der Abfolge einer Inkubation, einer Beschallung und einer Dialyse über Nacht behandelt wurde. In Gruppe 2 wurde die Mischung inkubiert, beschallt, 30 Minuten bei RT äquilibriert und dann über Nacht dialysiert, um die Wirkung einer Äquilibrierung der beschallten Mischung auf den EE zu untersuchen. Als Gruppe zur Untersuchung der Wirkung einer Langzeitbeschallung auf den EE wurde die Mischung in Gruppe 3 inkubiert, bei 65 °C für 15 Minuten beschallt und dann über Nacht dialysiert. Darüber hinaus wurde als Gruppe zur Untersuchung der Auswirkungen einer Langzeitbeschallung und einer Äquilibrierung auf den EE die Mischung in Gruppe 4 inkubiert, 15 min bei 65 °C beschallt, 30 min bei RT äquilibriert und dann über Nacht dialysiert. In allen Gruppen wurde die DOX-Beladung nach der AS-Gradientenmethode durchgeführt. Wie in Abb. 5b gezeigt, lagen die EEs von DOX der Gruppen 1, 2, 3 und 4 bei 93 ± 7,8, 98 ± 2,5, 83 ±   4,9 bzw. 59 ± 4,2 %. Im Vergleich zum EE von Gruppe 3 war der EE von Gruppe 1 höher, was darauf hindeutet, dass eine kürzere Dauer der Badbeschallung eine wirksamere Behandlung ist, um den EE in den Nanoliposomen zu erhöhen. Im Vergleich mit der EE von Gruppe 1 hatte Gruppe 2 eine höhere EE von DOX. Die EE von Gruppe 4 war die niedrigste unter allen getesteten Gruppen. Im Gegensatz zur EE-Anreicherung durch die Äquilibrierung nach einer Kurzzeitbeschallung bei Gruppe 2 war die Äquilibrierung nach einer Langzeitbeschallung bei Gruppe 4 für die EE-Anreicherung nicht wirksam. Diese Ergebnisse können auf die übermäßige Energiemenge zurückzuführen sein, die der Suspension zugeführt wird und die die Nanoliposomen während der oben beschriebenen Badbeschallung zerstören könnte. Es wird auch angenommen, dass durch eine Langzeitbadbeschallung in den Gruppen 3 und 4 die EE aufgrund einer Abnahme des AS-Gehalts in den Nanoliposomen gesenkt wurde. Da die Temperatur der Nanoliposomensuspension weit über die Phasenübergangstemperatur (T _c ) durch die Langzeitbadbeschallung erhöhte sich die Fluidität der Lipiddoppelschicht und induzierte somit die AS-Freisetzung aus den Liposomen. Die Nanoliposomenproben der Gruppe 3 wurden unmittelbar nach der Badbeschallung dialysiert, was auf eine schnelle Abkühlung der Proben schließen lässt. Im Gegensatz dazu wurden die Nanoliposomenproben der Gruppe 4 durch die Langzeitbadbeschallung gefolgt von der Äquilibrierung behandelt, was die AS-Freisetzung aufrechterhalten, die Bildung von DOX-Sulfat-Komplex außerhalb der Liposomen erhöhen und daher den EE senken könnte. Obwohl die Äquilibrierung nach der Langzeitbeschallung nicht effektiv war, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der DOX-Beladungsprozess wie eine sequentielle Behandlung einer Mischung der DOX-Lösung und der ERL-verkapselten Nanoliposomen – eine Inkubation über T _c von Phospholipid, eine Badbeschallung, ein Gleichgewicht unterhalb des T _c B. bei RT und eine Dialyse über Nacht – ist eine effektivere Methode zur Erhöhung der EE als andere Verfahren ohne die Äquilibrierungsbehandlung [33,34,35].

Einkapselungseffizienz von DOX in dual arzneimittelverkapselten Nanoliposomen gemäß verschiedenen Arzneistoffbeladungsbedingungen:Arzneistoffbeladungsbedingungen für jede experimentelle Gruppe (a ) und die Wirksamkeit der Wirkstoffverkapselung der Versuchsgruppen (b ) (n = 3, die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± SEM)

Morphologie und physikalische Stabilität dualer Wirkstoff-verkapselter Nanoliposomen

Abbildung 6 zeigt die mit TEM beobachtete Morphologie der Nanoliposomen. Die Proben für die TEM-Beobachtung wurden durch Tropfengießen der ERL- und DOX-co-verkapselten Nanoliposomen auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter und Trocknen an der Luft bei RT hergestellt. Um die Eigenschaften der dualen arzneimittelverkapselten Liposomen mit den einzelnen arzneimittelverkapselten Liposomen zu vergleichen, wurde die Morphologie der ERL-verkapselten oder der DOX-verkapselten Nanoliposomen durch TEM beobachtet. Wie in Abb. 6a gezeigt, betrug der Durchmesser der dualen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen weniger als 200 nm und die Form war nahezu kugelförmig. Der durch TEM-Analyse beobachtete Liposomendurchmesser stimmte mit dem Wert überein, der unter Verwendung eines Teilchengrößenanalysators unter Verwendung dynamischer Lichtstreuung gemessen wurde. Abbildung 6b zeigt das Bild eines einzelnen Nanoliposoms, das DOX-Sulfat-Komplexe im Inneren des Liposoms enthält. Es wurde angenommen, dass die Komplexe Kristalle sind, die durch Anziehung zwischen protonierten DOX-Kationen und zweiwertigen Sulfatanionen gebildet werden [36]. Abbildung 6c zeigt ein hochauflösendes (HR-) TEM-Bild, das die Wirkstoffkristalle in der äußersten Region des Nanoliposoms in Abbildung 6b zeigte. Das Bild zeigte, dass ein hochkristallines Gitter im inneren Kompartiment des Nanoliposoms und eine weniger kristalline Domäne eine amorphe Domäne in der Nähe des Kohlenstoffs auf dem Gitter aufweisen [37]. Die amorphe Domäne in der äußersten Region des Nanoliposoms kann auf die Instabilität der Lipiddoppelschicht bei Einwirkung des Elektronenstrahls mit hoher Energie zurückzuführen sein. Das in Abb. 6d dargestellte Selected Area Electron Diffraction (SAED)-Muster zeigte eine Regelmäßigkeit heller Beugungsflecken, was darauf hinweist, dass die in Abb. 6c gezeigten Kristalle ein hochgeordnetes Kristallgitter aufweisen [38]. Um die Ergebnisse der TEM-Analyse der dualen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen mit denen der einzelnen arzneimittelverkapselten Nanoliposomen zu vergleichen, wurde das ERL-verkapselte Nanoliposom durch TEM beobachtet und das Bild ist in Abb. 6e gezeigt. The outermost region of the nanoliposome present in Fig. 6e was observed by HR-TEM, and the result is shown in Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

Schlussfolgerungen

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

Abkürzungen

DOX:

Doxorubicin

DSPC:

1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine

EE:

Encapsulation efficiency

EPR:

Enhanced permeability and retention

ERL:

Erlotinib

PK:

Pharmacokinetic

POPG:

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)

SAED:

Ausgewählte Bereichselektronenbeugung

SEM:

Standard error of mean

T _c :

Phase-transition temperature

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie