Evaluierung der antimikrobiellen, apoptotischen und Krebszellen-Genabgabeeigenschaften von proteinbedeckten Goldnanopartikeln, die aus dem essbaren Mykorrhiza-Pilz Tricholoma crassum synthetisiert wurden

Hintergrund

Mit der unvermeidlichen und weit verbreiteten Anwendung von Nanopartikeln in Landwirtschaft, Medizin und Haushaltsprodukten steigt der Druck, die schädlichen Auswirkungen und Möglichkeiten zu ihrer Reduzierung zu verstehen [1]. Die grüne Synthese von Nanomaterialien aus lebenden Organismen oder deren Enzymen hat den Vorteil, dass sie umweltfreundlich, kostengünstig und sicher für therapeutische Anwendungen ist [2]. Unter den Mikroben haben Fadenpilze aufgrund ihrer Fähigkeit, größere Mengen an Enzymen zu sezernieren, eine größere Fähigkeit, Nanopartikel zu synthetisieren [3, 4]. Extrazelluläre Goldnanopartikel (AuNPs) wurden unter Verwendung verschiedener Pilze hergestellt [5,6,7], aber in diesen Berichten werden nur wenige natürliche Proteinhüllen über diesen Partikeln erwähnt [8, 9].

In der Medizin sind mit dem Aufkommen multiresistenter Bakterien Nanopartikel die Alternative, da diese keine Resistenzen auslösen [10]. AuNPs sind insbesondere vielversprechend in der Therapie und Diagnostik von Tumorzellen und der Nanocarrier-basierten Genübertragung [11,12,13]. Unter physiologischen Bedingungen zeigen AuNPs eine geringe Permeabilität durch die Zellmembran, aber in Tumorzellen wird die Aufnahme aufgrund des verstärkten Permeations- und Retentionseffekts (EPR) erhöht [14]. Diese Aufnahme wird noch verstärkt, wenn die AuNPs mit Proteinen bedeckt sind. Die Proteinkappe hilft dabei, die Nanopartikel im kolloidalen Zustand zu stabilisieren und bietet Andockstellen für Medikamente oder Gene zur Abgabe [14]. Der Vorgang des Verschließens umfasst jedoch zusätzliche Schritte. Die Bereitstellung einer natürlichen Proteinkappe eliminiert die Anwendung chemischer Wege, die meist gefährlich sind [5]. Trotz ihrer Bedeutung gibt es nur wenige Berichte über die grüne Synthese von Edelmetall-Nanopartikeln mit natürlichen Proteinhüllen [15, 16].

Vor dem Einsatz von AuNPs in der Therapie ist ein wichtiger Aspekt, der untersucht werden muss, die Biokompatibilität eines Nanomaterials mit den Zellmembranen [6]. Ein weiterer Aspekt ist die Zytotoxizität und AuNPs können rote Blutkörperchen aggregieren [13]. Daher muss der Schwerpunkt auf die gefährlichen Aspekte gelegt und innerhalb sicherer Grenzen verwendet werden [7, 17].

Unser Labor hat bisher den einzigen essbaren Mykorrhiza-Pilz gemeldet, der extrazelluläre Silber-Nanopartikel produziert, der Pilz ist Tricholoma crassum (Berk.) Sacc [2]. Hier beschreiben wir die grüne Synthese von AuNPs aus T. Krassum im Größenbereich 5–25 nm und in verschiedenen Formen. Diese wurden charakterisiert und auf antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Pilze sowie multiresistente (MDR) pathogene Bakterien untersucht. Diese hatten eine hemmende Wirkung auf die Wachstumskinetik von Bakterien und die Wirksamkeit von Pilzsporen. Am wichtigsten ist, dass die Partikel von Natur aus proteinbeschichtet sind. Wir haben diese Partikel auf ihre Wirksamkeit als Vehikel für den Gentransport in Krebszellen getestet. Ein Hämolyse-Assay wurde durchgeführt, um die Biokompatibilität und Toxizität dieser Partikel zu überprüfen. Die apoptotischen Eigenschaften der AuNPs wurden mit Comet-Assays an eukaryontischen Zellen getestet, um eine brauchbare Konzentration für den therapeutischen Einsatz mit minimalen Nebenwirkungen abzuschätzen. Die vorliegende Arbeit versucht daher, die Synthese und Anwendung der AuNPs an der medizinischen und nanotechnologischen Grenzfläche innerhalb sicherer Grenzen zu optimieren, um so minimale Umwelt- und biologische Schäden zu verursachen.

Methoden

Pilze, Bakterien und Pflanzenwachstumsbedingungen

Tricholoma crassum (Berk.) Sacc. wurde zur Herstellung von Nanopartikeln verwendet. Für antimikrobielle Assays E. coli (DH5α), Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), multiresistente (MDR) Stämme von E. coli (DH5α) und A. tumefaciens (LBA4404) verwendet. Die pflanzenpathogenen Pilze Magnaporthe oryzae und Alternaria solani wurden verwendet. Tomaten- (Sorte Pusa Ruby) und Tabak (Sorte SR1) wurden auf Erde in Wachstumskammern mit 16:8 h Licht/Dunkel-Photoperioden, 28 ± 1 °C und einer Lichtintensität von 50 μmol m ^− 2 s ^− 1 .

Synthese von AuNPs

T. Krassum Myzel wurde in Kartoffel-Dextrose-Brühe (PDB) für 7 Tage bei 28 °C kultiviert. 1 g Myzelmatte wurde mit 10 ml entionisiertem Wasser auf einem Schüttler bei 50 U/min 24, 48 und 72 h lang bei 28 °C geschüttelt. Die Überstände wurden durch Whatman-Filterpapier Nr. 1. Das Zellfiltrat (pH 5,2) wurde mit 1 mM wässriger Chlorauratlösung (HAuCl₄ .) inkubiert ) und geschüttelt bei 28 °C im Dunkeln gemäß unserem Bericht [2] für 1 h für jeden Zellfiltrattyp, der nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation mit Myzel hergestellt wurde.

Für die Biosynthese von AuNPs bei unterschiedlichen pH-Werten wurde 1 M HCl oder 1 M NaOH verwendet, um den pH-Wert des zellfreien Filtrats vor der Inkubation auf den sauren Bereich (3,5) und den alkalischen Bereich (7, 8 und 9) einzustellen. AuNPs wurden auch mit unterschiedlichen Reaktionstemperaturen (0, 15, 28, 75 und 100 °C), unterschiedlichen Konzentrationen von zellfreiem Filtrat (× 0.5, × 1, × 2) und Chloraurationen (0.5, 1, 2 mM .) synthetisiert ).

UV-sichtbare Spektroskopie

Die Absorption der Überstände von jedem Zellfiltrat, das 1 h mit Chlorauratlösung inkubiert wurde, wurde mit einem UV-Vis-Spektrophotometer zwischen 450 und 750 nm analysiert, um die Absorptionsspektren aufzuzeichnen.

Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Röntgenbeugung (XRD)

Diese Analysen wurden nach Chowdhury et al. [15] mit wenigen Modifikationen. Goldnanopartikel, hergestellt mit 24 Stunden-Zellfiltraten, gefolgt von 1 Stunden Inkubation mit 1 mM HAuCl₄ Lösung bei 28 °C (pH 5,5) wurde mit Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Röntgenbeugung (XRD) charakterisiert. Ein dünner Film der AuNPs auf einem Glasstumpf wurde vakuumgetrocknet und einem SEM unter Verwendung von FEI Quanta 200 (FEI, USA) unterzogen.

Die Formen und Größen der AuNP wurden durch TEM bestimmt. Ein Tropfen (10 μl) der AuNP-Suspension wurde auf kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter gegeben und vor dem Laden auf einen Probenhalter einer Vakuumtrocknung unterzogen. TEM-Aufnahmen dieser Nanopartikel wurden mit TECNAI G TEM mit einer Niederspannungskonstruktion (100 kV) erstellt.

Für die AFM-Bildgebung wurden AuNPs auf einer frisch gespaltenen Muskovit-Ruby-Glimmerschicht (Ruby Mica Co. Ltd., Indien) abgeschieden und unter Verwendung eines Vakuumtrockners getrocknet. AFM im akustischen Wechselstrommodus (AAC) wurde mit einem Pico plus 5500 ILM AFM (Agilent Technologies, USA) durchgeführt.

Für die XRD-Studie wurde ein dünner Film der AuNP-Suspension gleichmäßig auf einem Glasobjektträger verteilt und unter Verwendung eines Vakuumtrockners getrocknet. XRD-Muster wurden in einem D8 Advance DAVINCI XRD-System (Bruker AXS Pvt. Ltd.) aufgenommen, das bei einer Spannung von 40 kV und einem Strom von 40 mA mit CuKα-Strahlung (λ = 1.54060/1.54443 Å) betrieben wurde, und die gebeugten Intensitäten wurden aufgezeichnet von 35° bis 80° 2θ Winkel.

Computersoftwareanalyse

Die Messungen der AuNPs und die Erstellung eines Histogramms wurden mit dem OLYMPUS-Software MEASURE IT-Tool durchgeführt. Die Konzentration der Nanopartikel wurde nach Sriram et al. [18] und unsere frühere Veröffentlichung Chowdhury et al. [15].

Transformation von Bakterien zur Entwicklung einer Multi-Drug-Resistenz

A. tumefaciens Stamm LBA4404 und E. coli Stamm DH5α wurden durch Transformation unter Verwendung der Plasmide pCAMBIA2301 und pUC19 mit pZPY112 unter Verwendung unseres veröffentlichten Protokolls [2, 15] multiresistent gemacht

Antibakterielle Assays und Bakterienwachstumsassays

Diese Assays wurden gemäß unserem veröffentlichten Protokoll durchgeführt [15]. Goldnanopartikel, die mit 24-Stunden-Zellfiltraten und 1 Stunden Inkubation mit 1 mM HAuCl₄ . synthetisiert wurden Lösung bei 28 °C (pH 5,5) wurden für alle biologischen Assays verwendet. Für Papierscheiben-Assays wurden zunehmende Mengen polydisperser AuNPs (0,249, 0,498, 0,747, 0,996, 1,245 μg) verwendet. Aus frischen Übernachtkulturen jedes Bakterienstamms wurde ein 25 μl-Aliquot auf LB-Agarplatten ausgestrichen. Verdünnungsreihen der Nanopartikellösung wurden unter Verwendung einer AuNP-Lösung mit einer Konzentration von 31,121 mg/l und sterilem entionisiertem Wasser hergestellt. Sterile Papierscheiben von 5 mm Durchmesser mit zunehmender Menge an Goldnanopartikeln in jeder Scheibe wie 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 und 1,245 μg (in einem Gesamtvolumen von 40 μl) wurden auf die Bakterienplatten gelegt und inkubiert. A. tumefaciens Platten wurden bei 28 °C für 48 h inkubiert und E. coli bei 37 °C für 12 h. Für Wachstumsassays von DH5α und LBA4404 wurden 7,5 ml Bakterienkultur mit 2,5 ml AuNPs ergänzt.

Antimykotischer Test

Wässrige Suspension von M. oryzae Sporen wurden bei 6.1 × 10 ⁵ . hergestellt Sporen/ml mit einem Hämozytometer. 150 μl dieser Suspension wurden auf einer MEA-Platte verteilt. Sterile Papierscheiben von 5 mm Durchmesser mit steigenden Mengen an polydispersen AuNPs (0,249, 0,498, 0,747, 0,996 und 1,245 μg) wurden auf die Platten gelegt und bei 28 °C inkubiert. Hemmzonen wurden nach 2 Tagen gemessen.

Antimikrobieller Assay für mit AuNPs behandelte Bakterienzellen

Über Nacht wurde die flüssige LBA4404-Kultur mit dem gleichen Volumen AuNP-Suspension (15,56 mg/l) für 12 h bei 28 °C behandelt. 50 μl der Suspension wurden mit dem gleichen Volumen einer 0,4%igen Trypanblaulösung (0,5 g Trypanblau, 500 ml Glycerin, 450 ml destilliertes H₂ .) gemischt O, 50 ml HCL) wurde unter einem zusammengesetzten Mikroskop (Leica DMLS, Deutschland) beobachtet.

Test zur Keimung von Pilzsporen in Gegenwart von AuNPs

Eine Verdünnungsreihe von Nanopartikeln wurde mit 20, 40, 60, 80 und 100 % v . hergestellt /v Verwendung einer Stammlösung von Nanopartikeln mit einer Konzentration von 15,56 mg/l, wobei das Endvolumen mit Wasser auf 100 μl eingestellt wird. Gleiche Volumina dieser Suspensionen wurden zu 50 μl Alternaria solani . hinzugefügt Sporensuspension (4,2 × 10 ⁵ Sporen/ml) und bei 28 °C inkubiert. Die Sporen wurden nach 0, 2, 4 und 6 h unter einem Verbundmikroskop (Leica DMLS, Deutschland) beobachtet.

Comet-Assays

Die apoptogenen Eigenschaften der AuNPs wurden mit wenigen Modifikationen durch Standard-Komet-Assay [19] gemessen. Die Tabak- oder Tomatenblätter wurden steigenden Konzentrationen ausgesetzt (0, 15, 20 und 30 % v /v für Tabak; 5, 10, 15 und 20 % v/v für Tomaten) von AuNPs (15,56 mg/l Vorrat) für 24 h. Die Elektrophorese isolierter Kerne wurde bei 0,74 V/cm (25 V, 300 mA) für 30 Minuten bei 4 °C durchgeführt. Die Objektträger wurden mit 0,4 M Tris-Puffer neutralisiert, in Methanol dehydratisiert, mit Ethidiumbromid (20 μg/ml) gefärbt und unter einem Fluoreszenzmikroskop mit Anregungsfilter von 515–560 nm und Sperrfilter von 590 nm beobachtet. Die Daten wurden mit der Tritek CometScore-Software analysiert.

SDS-PAGE

Proteine ​​wurden gemäß unserer Veröffentlichung [15] isoliert. Zur Analyse der an die Nanopartikel gebundenen Proteine ​​wurden die AuNPs mit sterilem Wasser gewaschen und 10 Minuten in Laemmli-Puffer gekocht und 10 Minuten bei 8000 U/min zentrifugiert. Die SDS-behandelten und unbehandelten Proben wurden auf 12% SDS-PAGE laufen gelassen.

Krebszelllinienkultur

Die Sarcoma 180-Zelllinie wurde in RPMI 1640-Medium [20] mit 10 % fötalem Rinderserum, 200 E/ml Penicillin und 200 μg/ml Streptomycin bei 37 °C, 5 % CO₂ . kultiviert im befeuchteten Inkubator.

Lieferung des Plasmid-DNA-AuNP-Komplexes in Krebszellen

Plasmid wurde aus DH5α isoliert, das pCAMBIA1302 enthielt, unter Verwendung des veröffentlichten Protokolls [15]. Das Plasmid, das das Konstrukt von gfp . enthält Die unter dem pCaMV35s-Promotor klonierte Sequenz wurde unter Verwendung des Standardprotokolls [21] in Sarcoma 180-Zellen eingebracht. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem für GFP spezifischen Filter (Anregungsmaximum = 395 nm) (Axioskop-40, Carl Zeiss) betrachtet. Mit nackter Plasmid-DNA behandelte Zellen wurden als Kontrolle aufbewahrt.

Hämolytischer Test

Der hämolytische Assay wurde nach dem Standardprotokoll durchgeführt [22]. Gleiche Erythrozytenvolumina (1,6 × 10 ⁹ Erythrozyten/ml) wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von AuNPs (0,1, 0,5, 1, 5, 10 und 20 μl/ml aus einem Vorrat von 15,56 mg/l) für 1 h behandelt und die hämolytischen Aktivitäten der Nanopartikel bei unterschiedlichen Konzentrationen berechnet.

Ergebnisse und Diskussion

Biosynthese von AuNPs bei pH 5,5

Während der Synthese wird die Bildung des AuNP durch den Farbumschlag des Zellfiltrats von hellgelb nach violett angezeigt [23] aufgrund der Änderung der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). 1 mM HAuCl₄ Lösung ohne Pilzfiltrat war grünlich-gelb (Abb. 1a, „A“) und das Zellfiltrat von T. Krassum die blassgelb war (Abb. 1a, „B“). Nach der Inkubation änderte sich die Farbe der Mischung innerhalb von 1 h in Violett (Abb. 1a, "C"), was auf die Bildung von AuNPs hinweist.

Biosynthese von AuNPs mit Tricholoma crassum und spektroskopische Analyse. a Farbänderung während der Reaktion. A 20 mM Lösung von HAuCl₄ . B Myzelfreies Zellfiltrat von Tricholoma crassum . C 1 mM HAuCl₄ mit 24 h Zellfiltrat für 1 h, das eine violette Farbe zeigt, die die Synthese von AuNPs anzeigt. b UV-Vis-Spektren der mit unterschiedlichen Inkubationszeiten (24, 48, 72 h) synthetisierten AuNPs. Der durchgezogene Pfeil zeigt den Absorptionspeak bei 552 nm für eine Inkubationszeit von 24 Stunden. Der gestrichelte Pfeil zeigt eine leichte Rotverschiebung der Absorptionsmaxima mit zunehmender Inkubationszeit. c AuNPs, synthetisiert unter verschiedenen pH-Werten, zeigen unterschiedliche Farben. d UV-Vis-Spektren derselben. Der durchgezogene Pfeil zeigt den Absorptionspeak bei 552 nm für pH 5,5 und der gestrichelte Pfeil zeigt die Blauverschiebung der Absorptionsmaxima mit steigendem pH-Wert an

Ein Nachteil anderer Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln aus Mikroorganismen besteht darin, dass diese zeitaufwendig sind und die Organismen Toxine produzieren. Zuvor Phanerochate chrysosporium zellfreier Extrakt wurde verwendet, um AuNPs in 90 Minuten zu produzieren [3]. Vor kurzem wurden Silber- und Gold-Nanopartikel mit Sporosarcina koreensis . biosynthetisiert mit einer verlängerten Reaktionszeit von 1–2 Tagen [24]. In unserem Bericht wurde die Produktionszeit von AuNP auf nur 1 h verkürzt.

Ultraviolett bis sichtbare Spektroskopie

Die optischen Absorptionsspektren von Metallnanopartikeln werden durch Form, Aggregation und SPR bestimmt, die sich entsprechend der Partikelgröße und -form verschieben [25, 26]. Abbildung 1b zeigt die UV-Vis-Spektren von AuNPs, die mit Zellfiltraten synthetisiert wurden, die über 24, 48 und 72 Stunden produziert wurden, gefolgt von einer 1 stündigen Inkubation mit 1 mM HAuCl₄ Lösung (pH 5,5). Hier liegt der Extinktionspeak bei 552 nm für das 24-h-Zellfiltrat. Die transversale Plasmonenresonanzbande, die zuerst bei 552 nm erscheint, verschiebt sich von 24 auf 48 und 72 h leicht nach Rot (dargestellt als durchgezogene vs. gestrichelte Linie in Abb. 1b), was eine Rotverschiebung mit zunehmend verstärkter Absorptionsintensität bestätigt. Die Verbreiterung der Peaks zeigt an, dass die Partikel polydispergiert sind. Die starke SPR zentriert bei ca. 550–560 nm sind typisch für kolloidales Gold (Abb. 1b). Da die Konzentration des Zellfiltrats mit zunehmender Inkubationszeit (d. h. 24, 48, 72 h) zunahm, nahm auch die Extinktion proportional zu. Als die Reaktion bei 28 °C durchgeführt wurde, erreichte sie nach 1 h ein Gleichgewicht und war über 30 Tage stabil, ohne Anzeichen einer Aggregation, wahrscheinlich aufgrund der stabilisierenden Proteinhülle. In früheren Studien zeigten BSA-beschichtete AuNPs keine Aggregation [27]. Weitere Studien wurden mit AuNPs durchgeführt, die mit 24-Stunden-Zellfiltrat hergestellt wurden.

Biosynthese von AuNPs bei verschiedenen pH- und UV-Vis-Spektroskopie

Die AuNPs wurden bei unterschiedlichen pH-Werten von 3,5, 5,5, 7, 8 und 9 synthetisiert, was zu einer rosa bis tiefvioletten Färbung führte (Abb. 1c). Die UV-Vis-Spektroskopie zeigte die Absorptionsmaxima und die SPR-Wellenlänge stieg von pH 3,5 auf pH 5,5 an, was zu einer Rotverschiebung führte. Mit weiterem pH-Anstieg von 7 auf pH 9 nahmen jedoch die Absorptionsmaxima und die SPR-Wellenlänge ab, was eine Blauverschiebung zeigt (Abb. 1d). Der Peak bei pH 9 hatte eine kleinere Amplitude und eine unveränderte Farbe, was darauf hindeutet, dass nur geringe Mengen an AuNPs gebildet wurden. Da es sich um eine enzymatische Biosynthese handelt, hemmte pH 9 wahrscheinlich die Enzymreaktion, die für die Bildung von AuNPs erforderlich ist (Abb. 1d). Die bei unterschiedlichen pH-Werten produzierten Nanopartikel aggregierten nach 1 Monat bei Raumtemperatur nicht.

Herstellung von AuNPs mit unterschiedlichen Temperaturen, Substratkonzentrationen und Vorläuferkonzentrationen

Die Optimierung der physikalisch-chemischen Bedingungen während der Biosynthese ist entscheidend für die Erzeugung funktionell effizienter Nanopartikel [28]. Die Synthese mit höheren Filtratkonzentrationen zeigte eine erhöhte Produktion von AuNPs mit mehr Farbintensität und Absorptionsmaxima (Abb. 2a, b). Eine leichte Blauverschiebung der maximalen lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) wurde für die Synthese mit × 2-Filtrat beobachtet, was auf einen erhöhten Inter-Partikel-Abstand und eine verringerte Clustergröße hinweist [29, 30].

Biosynthese und UV-vis-Spektroskopie von AuNPs aus Tricholoma crassum mit unterschiedlichen Syntheseparametern. a , b Zellfiltrat in unterschiedlichen Konzentrationen. c , d Verschiedene Konzentrationen von HAuCl₄ . e , f Unterschiedliche Reaktionstemperaturen. g , h Im Dunkeln und unter Licht. Der durchgezogene Pfeil zeigt den typischen Absorptionspeak bei 552 nm für × 1 Zellfiltrat und 1 mM HAuCl₄ bei 28 °C pH 5,5 und ein gestrichelter Pfeil zeigt eine Blauverschiebung der Absorptionsmaxima an, ein gepunkteter Pfeil zeigt eine Rotverschiebung der SPR-Bande

Von den drei getesteten Konzentrationen von Goldchlorid (0,5, 1 und 2 mM) war die Synthese bei 1 mM maximal, mit Absorptionsmaxima bei 552 nm. (Abb. 2c, d). Als optimal für die Synthese erwiesen sich 28 °C. Höhere Temperaturen (75 und 100 °C) vermittelten zwar eine schnellere Synthese von AuNPs, die dunkle Farbe und die Rotverschiebung des Absorptionsmaximums (Abb. 2e, f) deuteten jedoch auf größere Partikel als bei 28 °C hin. Bei 0 und 15 °C gab es keinen Farbentwicklungs- oder Absorptionspeak innerhalb von 550–600 nm. Die Synthese im Licht führte zu einer tiefvioletten Färbung (Abb. 2g) und einer Rotverschiebung des Absorptionsmaximums mit einem breiten Peak (Abb. 2h), der größere Partikel anzeigt. Die Partikelgröße und -anzahl wurde mit DLS bestimmt (Abb. 3a–j). Diese Variation der Größe und Aggregation von Nanopartikeln hängt von der Art und Menge der assoziierten organischen Stoffe ab [30] die wiederum mit den Synthesebedingungen variieren.

DLS mit Größenverteilungen der synthetisierten AuNPs a mit × 1 zellfreiem Filtrat, 1 mM HAuCl4 bei 28 °C im Dunkeln, b unter Licht, c mit × 0,5 zellfreiem Filtrat, d mit × 2 zellfreiem Filtrat, e bei 0 °C, f bei 15 °C, g bei 75 °C, h bei 100 °C, i mit 0,5 mM HAuCl₄ und j mit 2 mM HAuCl₄

Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

SEM zeigte AuNPs kleiner Größe und unterschiedlicher geometrischer Formen bei einer Vergrößerung von × 80000 (Abb. 4a). Die TEM-Analyse zeigte deutlich polydisperse AuNPs mit einem Größenbereich von 2–22 nm Durchmesser (Abb. 4b). Das Diagramm der Größenverteilung zeigt, dass AuNPs im Größenbereich 5–10 nm die höchste Häufigkeit aufwiesen, gefolgt von 2–5 nm, 10–15 nm, 15–20 nm und 20–22 nm (Abb. 4c). Diese hatten unterschiedliche geometrische Formen wie kleine Kreise oder Rhomboide mit einem Durchmesser von 5 nm oder weniger, Sechsecke, Quader, gleichschenklige Dreiecke und nahezu gleichseitige Dreiecke mit Seiten zwischen 4,36 und 22,94 nm (Abb. 4d, e).

Elektronenmikroskopie der AuNPs. a SEM bei Vergrößerung von × 80.000. b TEM, das dispergierte Partikel unterschiedlicher Größe in einem mikroskopischen Feld zeigt. c Ein Histogramm, das die Partikelgrößenverteilung der AuNPs zeigt. Vergrößerte Ansicht einzelner AuNPs mit unterschiedlichen geometrischen Formen und deren schematische Darstellungen mit Abmessungen. d Sphärisch (links) und rhombisch (rechts) im kleinen Größenbereich. e Von links:sechseckig, gleichseitig dreieckig, rautenförmig, polyedrisch und gleichschenklig dreieckig

Rasterkraftmikroskopie (AFM)

Abbildung 5a zeigt ein AFM-Bild der dispergierten AuNPs. Die zweidimensionale Ansicht (Abb. 5a) zeigt, dass die Partikel eine nahezu ähnliche Oberflächendicke hatten. Die Höhen dieser Partikel wurden mit einem einflächigen 3D-AFM visualisiert (Abb. 5b). Die AFM-2D-Grafik der AuNPs, die auf einer zufälligen linearen Zone liegen (gestrichelt markiert, Abb. 5c), zeigt Höhen im Bereich von 1 bis 4 nm. Die Plasmonenbande der ebenen Oberfläche zeigte an, dass die Dicke der Partikel kleiner war als die Kantenlänge.

AFM und Röntgenbeugung der AuNPs. a AFM-Bild:Draufsicht. b AFM-Bild:dreidimensionale Ansicht. c Ein AFM-Bild von AuNPs und ein grafisches Profil für die Höhen der Nanopartikel, die auf der gestrichelten Linie im Feld liegen. d Röntgenbeugungsmuster der Nanopartikel mit goldtypischen Peaks

Röntgenbeugungsstudien (XRD)

Das XRD-Muster des dünnen Films der Partikel zeigte, dass nur AuNPs vorhanden waren. Ein starker Beugungspeak bei etwa 38° wird im Allgemeinen der {111}-Facette der kubisch-flächenzentrierten (FCC)-Struktur zugeschrieben [3]. Das XRD-Muster zeigte hier einen dominanten Beugungspeak bei 38,23, der der FCC-Struktur zugeschrieben wird. Die Beugungspeaks der anderen vier Facetten waren schwächer. Die vier unterschiedlichen Bragg-Beugungspeaks bei 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 und 81,63 stimmten eng mit denen von AuNPs überein (Abb. 5d, Zusätzliche Datei 1:Tabelle S1).

Berechnung der Konzentration von AuNPs

Die Konzentration der Nanopartikel [15] betrug 15,56 mg/l für Partikel, die mit 24-h-Zellfiltrat inkubiert mit 1 mM HAuCl₄ . hergestellt wurden .

Antimikrobieller Test der AuNPs mit pathogenen Bakterien und Pilzen

Die AuNPs zeigten starke antimikrobielle Aktivitäten gegen menschliche Bakterien sowie pflanzenpathogene Bakterien und Pilze. Die antimikrobielle Aktivität der Nanopartikel wurde mit Papierscheiben mit steigenden Mengen an AuNP getestet, d. h. 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 und 1,245 μg. Menschliche Bakterien E. coli (DH5α), die pflanzenpathogenen Bakterien A. tumefaciens (LBA4404) und der pflanzenpathogene Pilz M. oryzae wurden verwendet. Die AuNPs waren für alle diese Mikroorganismen selbst bei den niedrigsten Konzentrationen inhibitorisch, und die Hemmzonen nahmen proportional zur Zunahme der Partikelkonzentration zu (Abb. 6). Abbildung 6a–c zeigt, dass die Hemmzonen für E. coli (DH5α), A. tumefaciens (LBA4404) und M. oryzae , bzw. Abbildung 6f–h zeigt das Diagramm der Hemmzonen dieser drei Mikroben als Funktion der Menge der verwendeten AuNPs. Der Pilzextrakt allein hatte keine hemmende Wirkung. Der vergleichende Hemmtrend für die drei Mikroben weist auf eine stärkere Hemmwirkung auf DH5α im Vergleich zu LBA4404 und M hin. oryzae (Zusätzliche Datei 2:Abb. S1a).

Untersuchung der antimikrobiellen Eigenschaften von AuNPs auf pathogene Bakterien, Pilze und multiresistente (MDR) Bakterien. a , f Platten und entsprechende Grafiken zeigen den Disk-Diffusions-Assay der Nanopartikel mit zunehmenden Hemmzonen für E. coli . In ähnlichen Tests mit b . erhaltene Hemmzonen , g Agrobacterium tumefaciens . c , h Magnaporthe oryzae . d , ich MDR E. coli . e , j MDR A. tumefaciens . Alle Experimente wurden mit steigenden Mengen an AuNPs auf Papierscheiben durchgeführt; im Uhrzeigersinn von oben:0,249 μg (20%), 0,498 μg (40%), 0,747 μg (60%), 0,996 μg (80%) und 1,245 μg (100%) AuNPs. Daten sind Mittelwerte ± SE von drei Replikaten. Unterschiedliche Buchstaben weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Stichproben hin (P < 0,05, Tukeys HSD-Test). Einfluss von AuNPs auf die Wachstumskurve von k E. coli , l A. tumefaciens , m MDR E. coli , und n MDR A. tumefaciens . Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede hin, die zu kontrollieren sind (Schüler t testen, P < 0,05). o Mikroskopie der Kontrolle A. tumefaciens Zellen. p A. tumefaciens zeigt den Verlust der zellulären Integrität nach der Behandlung mit den AuNPs

Assay der antimikrobiellen Aktivität von AuNPs mit multiresistenten human- und pflanzenpathogenen Bakterien

Es wurden multiresistente (MDR) DH5α und LBA4404 hergestellt, die Plasmide mit Resistenzgenen trugen. Die pUC19 tragende MDR DH5α war resistent gegen 100 µg/ml Ampicillin und 35 µg/ml Chloramphenicol. Mit pCAMBIA2301 transformiertes LBA4404 war resistent gegen 25 µg/ml Rifampicin und 50 µg/ml Kanamycin. Die AuNPs zeigten eine starke inhibitorische Aktivität gegen MDR DH5α und MDR LBA4404 (Abb. 6d, e). Abbildung 6i, j sind die Diagramme, die die Zunahme der Hemmung mit Zunahme der Konzentration der Nanopartikel zeigen. Der vergleichende Hemmtrend für die beiden MDR-Bakterien weist auf größere Hemmzonen für A hin. tumefaciens im Vergleich zu E.coli (Zusätzliche Datei 2:Abb. S1b).

Bakterienwachstumsassay im Zeitverlauf in Gegenwart von AuNPs

Die Wachstumskurve von DH5α, die mit AuNPs behandelt wurde, unterschied sich signifikant von der Kontrollgruppe (Abb. 6k, m). In den Kontrollsätzen von DH5α und MDRDH5α begann die logarithmische Phase der Wachstumskurve innerhalb von 2 h nach der Inokulation, während bei AuNP-behandeltem DH5α und MDRDH5α bis zu 6 h nach der Inokulation kein Wachstum beobachtet wurde. Die Wachstumskurven erreichten sowohl bei Kontroll- als auch bei behandelten Zellen nach 12 h die stationäre Phase, das Wachstum war jedoch bei den behandelten Bakterien signifikant reduziert. Die LBA4404-Wachstumskurve zeigte den Beginn der logarithmischen Phase 4 h nach der Inokulation im Kontrollsatz gegenüber 6 h im mit AuNP behandelten Satz. Ein ähnlicher Effekt auf die Wachstumskurve von MDR LBA4404 wurde beobachtet, obwohl in der Kontroll-MDR LBA4404 die Log-Phase innerhalb von 2 h begann (Abb. 6l, n).

Auswirkung von AuNPs auf die Morphologie und Lebensfähigkeit von Bakterienzellen

Im Allgemeinen können die meisten Nanopartikel effizient an Zellmembranen haften, adsorbiert werden und danach die Zellintegrität beeinträchtigen [31]. Normal A. tumefaciens Bakterien sind stäbchenförmig mit klaren Umrissen (Abb. 6o). Die Bakterien zeigten bei Inkubation mit den AuNPs eine verzerrte Morphologie, eine Auflösung der äußeren Membran, die zu unregelmäßigen Konturen führte, und einen Verlust der Integrität der Zellform und -größe (Abb. 6p). Dies stimmt mit dem überein, das zuvor in E beobachtet wurde. coli mit Silica-Nanopartikeln behandelte Zellen [32]. Wir fanden heraus, dass die Inkubation von Bakterienzellen mit den Nanopartikeln über einen längeren Zeitraum einen vollständigen Zellzerfall zeigte.

Test zur Keimung von Pilzsporen

Die AuNPs waren ein starker Suppressor der Virulenz des pflanzenpathogenen Pilzes Alternaria solani . Die Behandlung von Pilzkonidien mit zunehmenden Dosen von AuNPs für verschiedene Inkubationszeiten zeigte eine allmähliche Abnahme der Keimungsfrequenzen und der Länge der Keimschläuche (Abb. 7a). The representative pictures of conidia (Fig. 7a) and graphs show that the percentage of germination (Fig. 7b) and average lengths of the germ tubes (Fig. 7c) emerging from the fungal conidia decreased with increasing doses of the particles and increasing incubation periods. Thus, these AuNPs had significant antifungal property which is mediated through the suppression of germination of spores and retardation in the growth of hyphae.

Effect of the AuNPs on the spore germination of plant pathogenic fungus Alternaria solani; a Spores after treatment with AuNPs (bar = 30 μm). Rows top to bottom:control spores followed by spores treated with different dilutions of AuNPs (15.56 mg/L stock). Columns left to right:increasing time of incubation with AuNPs showing least germination at 6 h incubation with 100% AuNPs. b Spore germination frequency (%) at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Asterisks indicate significant differences to control (Student’s t test, P < 0.05). c Average germ tube length at different concentrations of AuNPs as a function of time of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Duncan’s multiple range test). Spore germination frequency and the average germ tube length decreased with increasing doses of the AuNPs and increasing incubation period

Thus, these AuNPs have antimicrobial functions on bacteria as well as fungi, which is rarely reported for AuNPs. These AuNPs being toxic to multi-drug-resistant human bacteria can be utilized in treatment of MDR or extensively drug-resistant (XDR) bacteria-related human diseases which are difficult to treat. Furthermore, the antimicrobial effect against typical phytopathogens like Agrobacterium and fungi, it makes the particles suitable for as bacteriocides and fungicides in the form of nano-agrochemicals. These would enable sustainable management of crop loss through elimination of excessive and indiscriminate use of agrochemicals causing deterioration of soil health, degradation of agro-ecosystem, environmental pollution, and resistance in pathogens [33].

The AuNPs have potent apoptogenic properties

The single cell gel electrophoretic assay or comet assay is a sensitive method to compare apoptoic effects of materials [34, 35]. Treatment of tobacco leaf cells with 7.78 mg/L of AuNPs for a period of 15, 20, and 30 min resulted in gradual increase in apoptosis indicated by increase in percentage of DNA in tail (Fig. 8a, ‘A’, ‘B’, ‘C’, ‘D’). The maximum migration of DNA occurred after 30 min of treatment showing a tail DNA value 28.44 ± 0.74% which was significantly higher than that of untreated control cells (1.7 ± 0.59%). The incubation periods of 15 and 20 min caused less DNA migration with tail DNA values of 7.25 ± 2.56 and 19.19 ± 1.54%, respectively (Fig. 8b). Therefore, these AuNPs have the capacity to induce apoptosis in eukaryotic cells in higher doses. Recently, nanoparticles are being used in novel strategies to target and kill cancer cells. As illustrated by dynamic and quantitative imaging, successful application of nanoparticles as an alternative therapy for cancer depends on the apoptotic properties of the particles [36]. Hence, the present finding shows potent apoptogenic properties of these AuNPs which holds promise in future cancer therapy.

Assay of apoptotic properties of the AuNPs. a Comet assay and fluorescent microscopic images of nuclei of tobacco leaves treated with AuNPs for A 0 min. B 15 min, C 20 min, and D 30 min (bar = 5 μm). In the control sets (0 min incubation), most of the DNA is located in the head of the comet while cells subjected to longer treatment show increasing DNA damage and longer comet tails. b Mean of % tail DNA ± SE after different periods of incubation. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P < 0.05, Tukey’s HSD test). c Assay of threshold dosage of AuNPs for apoptosis showing images of nuclei of tomato leaf cells treated with A 0% (control), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% of AuNP suspension for 24 h (bar = 10 μm). d Mean % tail DNA ± SE after 24 h treatment with different concentration of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test). Dosage below 10% show negligible DNA damage while higher than 20% show start of DNA damage

These AuNPs are non-apoptogenic at lower doses

Safe application of metal nanoparticles as therapeutic agent needs a pre-determination of biological effect of the particles at the borderline toxicity [37]. A threshold level of nanoparticles required for apoptosis was obtained through treatment of tomato leaf cells with different concentration of AuNP for 24 h (Fig. 8c). Low concentration, e.g., 5% v /v of AuNP stock suspension (15.56 mg/L) did not show significant apoptogenic effect on tomato cells even after 24 h of exposure. The nuclei after 10% AuNP treatment showed 6.52 ± 0.63 percentage of DNA in tail which was higher than untreated control nuclei (0.95 ± 0.66 percentage of DNA in tail) and those treated with 5% AuNP suspension (1.04 ± 0.89 percentage of DNA in tail). Treatment of tomato leaf cells with 15 and 20% AuNP resulted in a slight rise in DNA damage showing 7.15 ± 1.70 and 13.47 ± 2.16 percentage of DNA in tail, showing significant apoptogenic effect (Fig. 8d). Thus, in lower doses apoptogenic effect is negligible holding the possibility for these nanoparticles to be used as antimicrobial agent or drug/gene delivery vehicle in eukaryotic cells.

The AuNPs are protein-coated

A few previous studies have mentioned nanoparticles coated with protein of natural origin [15]. Lower magnification TEM showed that the AuNPs are surrounded by protein-like material (Fig. 9a, b). In order to confirm the nature of the material, the AuNPs were washed and run on SDS-PAGE along with cell-free extracts in other lanes (Fig. 9c). Boiling in SDS served to detach the surface bound proteins from the nanoparticles. The boiled nanoparticles (lane 4) showed the presence of a single intense band of 40 kDa which was similar to a protein band present in lane 2 (cell filtrate). However, in the sample that was not boiled (lane 3), a faint protein band bound to AuNP was seen at the 116 kDa level. Although another faint band did appear at the 40 kDa level due to dissociation of the capping proteins from the particles. Protein coats are known to promote stability of nanoparticles in solution and their catalytic activity [28, 38]. The naturally formed protein coat around the nanoparticles makes them functionally efficient for biomedical uses including easy adsorption and delivery of DNA or hydrophobic drugs [39]. Peptides and protein-aided delivery of AuNPs have been successfully used to overcome blood-brain barrier in treatment of central nervous system disorders [14]. Hence, these biocompatible AuNPs can be potentially suitable for several biomedical applications due to the small size, unique physico-chemical properties, and other advantages.

Protein cap analysis. a , b TEM images showing capping protein layer (arrows) around AuNPs. c SDS-PAGE of extracellular protein secreted from T. crassum and protein associated with nanoparticles. Lane 1, molecular size marker. Lane 2, total extracellular protein. Lane 3, nanoparticles loaded without boiling show faint protein band bound to the AuNPs at 116 kDa mark. There is also a band of detached protein at 40 kDa mark. Lane 4, nanoparticles after boiling with 1% SDS loading buffer showing disappearance of the 116 kDa band and a distinct 40 kDa band. Arrow indicates 40 kDa

The AuNPs could deliver green fluorescence protein (GFP) gene into Sarcoma 180 cancer cell lines

Plasmid DNA pCAMBIA1302 harboring gfp marker gene, complexed with AuNPs, was used to treat Sarcoma 180 cells. The cells produced green fluorescence indicating uptake of plasmid DNA/AuNPs complex and subsequent expression of the gene in the cancer cell, while the cells treated only with naked plasmid DNA did not show the fluorescence (Fig. 10a, b). This confirms the high potential of these particles to not only deliver genes into cancer cells, the genes were stably expressed and remained functional once delivered into the cells.

Gene delivery using AuNPs into Sarcoma 180 cancer cells and hemolysis assay with human erythrocytes; fluorescence microscopic image of a cancer cells expressing green fluorescence protein after uptake of DNA-AuNP complex and b control cells treated with free plasmid DNA (bars = 20 μm). c Percentage hemolysis with different dilutions of AuNPs. Data represents means ± SE of three replicates. Different letters indicate statistically significant differences among the samples (P  < 0.05, Tukey’s HSD test)

Earlier metallic nanoparticles have been shown to exhibit immense therapeutic potential in treating variety of diseases like retinal neovascularization, HIV, Dalton’s lymphoma, and exhibited activity against hepatitis virus, respiratory syncytial virus, and herpes simplex virus [18]. Congruent to these reports, gold nanocarrier-based drug delivery in present study using AuNPs can be considered as a prospective mediator in numerous medical applications including diagnostics, drug delivery, and cancer therapeutics.

Compatibility of the AuNPs with human erythrocytes and toxicity assay

Erythrocytes are simple and convenient model of the cell membrane system and used for studying nanoparticle-membrane interactions [40]. The hemolytic assay elucidates membrane-lytic activity of the AuNPs at different concentrations. Figure 10c shows that membrane-lytic activity of the nanoparticles was negligible at low concentrations. The highest hemolytic activity found at higher concentrations of nanoparticle suspension (up to 20 μl/mL) was less than 8% which indicates very low blood toxicity. The gradually increasing hemolytic activity with increasing concentration of AuNPs is likely due to increased affinity and adhesion of larger number of particles with the erythrocytes. This affinity of the particles to cell membranes is expected to facilitate their cellular transport. Low hemolytic activity along with effective cellular uptake render nanoparticles highly suitable for the development of safe and efficient theranostic agents [41].

Conclusions

Use of edible mycorrhizal fungus to synthesize AuNPs of different geometric shapes in short reaction time with natural protein coat make this method simple and unique. The protein coat coming from the edible fungus did not have appreciable toxic effects and favor easy attachment of DNA onto the surface of the particles. Overall, these AuNPs show promise as antimicrobial, apoptotic agents for gene delivery into cancer cells.

Since filamentous fungi can withstand flow pressure or agitation [15], T. crassum can be cultured in fermentors to produce AuNPs on a large-scale using non-toxic agricultural wastes, allowing for easy withdrawal of product and system replenishing options [2]. Since the AuNPs are of different geometric shapes, there is the scope shape-based assortment with mechanical means such as centrifugation [42] and can be utilized according to their specific shape-based properties.