Modifizierte magnetische Fe3O4-Nanopartikel-Abgabe von CpG hemmt das Tumorwachstum und spontane Lungenmetastasen zur Verbesserung der Immuntherapie

Hintergrund

Bösartige Tumoren sind eine der wichtigsten Krankheiten, die die Gesundheit und das Leben des Menschen bedrohen, und die Tumorinzidenz nimmt kontinuierlich zu [1, 2]. Leider waren die Ergebnisse traditioneller Behandlungen wie Strahlentherapie, Chemotherapie und Operation bei bösartigen Tumoren nicht bemerkenswert wirksam. Im Gegensatz zu Chemotherapie und Strahlentherapie, die auf sich schnell vermehrende Zellen zum Absterben abzielen, sind Immuntherapien darauf ausgerichtet, das eigene Immunabwehrsystem des Wirts zu stärken, um Tumorzellen anzugreifen und zu eliminieren.

Es ist bemerkenswert, dass immuntherapeutische CpG umfassend auf ihre Wirksamkeit bei der Tumorprävention und -regression untersucht wurden [3]. Trotz ermutigender klinischer Daten hat die Verwendung von freiem CpG immer noch mehrere Nachteile. Erstens sind CpG unter biologischen Bedingungen anfällig für einen Nuklease-vermittelten Abbau. Zweitens fehlt ihnen die Spezifität für Zielzellen nach systemischer Verabreichung und sie weisen eine schlechte zelluläre Aufnahme auf. Daher sind wahrscheinlich Verbesserungen erforderlich. Da sich TLR9s auf Endosomen befinden, stellten wir die Hypothese auf, dass die schlechte CpG-Aufnahme durch tumorassoziierte Entzündungszellen eine schwache klinische Reaktion verursacht. Somit könnten Verfahren, die die CpG-Internalisierung verstärken, seine immunstimulatorische Reaktion verstärken.

Abgesehen von den Nachteilen von freiem CpG beeinflusst der Verabreichungsweg von CpG die Antitumorfähigkeit und Toxizität. Freies CpG und andere stabile Phosphorothioat-Oligonukleotide, die durch intravenöse Injektion verabreicht werden, werden schnell eliminiert und weisen eine breite Gewebeverteilung auf [4, 5]. Darüber hinaus kann systemisch verabreichtes freies CpG eine unspezifische Immunaktivierung induzieren, die zu schweren Nebenwirkungen wie Erschöpfung der Immunzellen, Zerstörung von Lymphfollikeln, Leberschäden und Exazerbation von Autoimmunerkrankungen führt [6,7,8]. Diese Eigenschaften können für das Versagen von systemisch verabreichtem freiem CpG bei menschlichen Patienten verantwortlich sein [9]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die intratumorale Injektion von CpG eine große Antitumorwirkung hat, indem sie die Immunstimulation auf Tumorstellen „fokussiert“ [10]. Die Kontrolle der Retentionszeit von CpG, das in den Tumor injiziert wird, ist ein Problem.

Durch die Verwendung des Toll-like-Rezeptor-9 können dendritische Zellen, Makrophagen und NK-Zellen CpG erkennen, das in bakterieller DNA häufig vorkommt [11]. CpG induziert Immunzellen zur Produktion von Chemokinen und Zytokinen und die hochregulierten kostimulatorischen Zelloberflächenmoleküle von T-Zellen [12,13,14,15]. Somit haben sich CpG als potente Typ-1-polarisierende Adjuvantien herausgestellt [16, 17]. Darüber hinaus ist die direkte Injektion von CpG in Tumore eine Form der Immunisierung, die den in situ-Tumor als Antigenquelle verwendet und CpG als Adjuvans einführt, um eine Immunantwort innerhalb des Tumors zu aktivieren. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die intratumorale Injektion von CpG das Immunprivileg von Tumoren aufheben würde, indem lokale dendritische Zellen rekrutiert und aktiviert werden, abhängig vom Typ-1-Antitumor-T-Zell-Reaktionsweg.

Um die oben genannten Probleme zu überwinden, haben wir eine modifizierte Magnetpartikelplattform basierend auf Fe₃ . entwickelt O₄ Partikel, um die Freisetzung von CpG durch intratumorale Injektion an Tumorstellen zu steuern und zu kontrollieren. Aufgrund einiger einzigartiger Eigenschaften von Fe₃ O₄ magnetische Partikel, insbesondere ihre gute Histokompatibilität [18], Superparamagnetismus [19, 20], geringe Toxizität [21] und einfache Zubereitung und gezielte Wirkstoffabgabe mit einem externen Magnetfeld [22, 23], können ihre Bewegung und Konzentration kontrolliert werden den Körper mit einem externen Magnetfeld, wodurch das Fe₃ O₄ Partikel als Träger der Genmedizin mit erhöhter Gentransfektionseffizienz [24]. Darüber hinaus Beschichtung von APTES auf Fe₃ O₄ Partikel durch kovalente Bindung verhindert die Bildung von Aggregaten und bietet mehr Modifikationsstellen (Aminogruppen) [25, 26] für weitere Hilfe bei der Bindung von CpG. In dieser Studie wurde Fe₃ O₄ magnetische Partikel wurden durch eine Copräzipitationsmethode hergestellt [27] und mit APTES modifiziert. CpG wurden fest mit der Oberfläche des modifizierten Fe₃ . verbunden O₄ Partikel durch elektrostatische Wechselwirkung, um FeNP/CpG-Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 50 nm zu bilden. Weitere Studien zeigten, dass FeNP-Partikelabgabesysteme eine verbesserte Aufnahmeeffizienz von CpG im Vergleich zu der von freiem CpG in dendritische Zellen aufweisen, und die intratumorale Injektion von FeNP/CpG-Partikeln stimuliert eine wirksame Antitumor-Immunantwort vom Th1-Typ, die nicht nur den Tumor in situ-Wachstum, sondern auch zur Hemmung der Tumormetastasierung bei C26-Dickdarmkrebs- und 4T1-Brustkrebsmodellen in vivo. Daher kann die Nanopräparationstherapie eine potenzielle Strategie für die Tumorimmuntherapie sein.

Materialien und Methoden

Materialien und Tiere

3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) wurde von Aladdin Company, Inc. bezogen. Eisenchlorid-Hexahydrat (FeCl₃ ∙6H₂ O) und Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat (FeCl₂ .) ∙4H₂ O) wurden vom Tianjin Guangfu Fine Chemical Industry Research Institute bezogen. Das folgende CpG wurde von Invitrogen Co. synthetisiert:5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wurde von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.

Eine humane embryonale Nierenzelllinie (293T), eine Maus-Brusttumorzelllinie (4T1) und eine Dickdarmkrebszelllinie (C26) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten, und vom Knochenmark abgeleitete dendritische Zellen (BMDCs) wurden erhalten von BALB/c-Mäusen. Weibliche 6–8 Wochen alte BALB/c-Mäuse wurden von Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltd. bezogen. Die Mäuse wurden gezüchtet und unter pathogenfreien Bedingungen gehalten. Alle Tierprotokolle wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt.

Vorbereitung von FeNP

Die Copräzipitationsmethode wurde für die Synthese von Fe₃ . verwendet O₄ Partikel [29]. Im experimentellen Verfahren 11,68 g FeCl₃ ∙6H₂ O und 4,30 g FeCl₂ ∙4H₂ O wurden in einen Dreihalskolben mit 200 ml entionisiertem Wasser bei 80 °C gegeben, gefolgt von der Zugabe von 15 ml 25 % NH₃ . ·H₂ O. Während des 1-stündigen Reaktionsprozesses wurde die Mischung mit N₂ . gespült und gerührt. Dreißig Milligramm des vorbereiteten Fe₃ O₄ wurde in einer Mischung aus 60 ml entionisiertem Wasser und absolutem Ethanol durch Ultraschallvibration für 30 Minuten dispergiert. 0,3 g zubereitetes Fe₃ O₄ wurde in einer Mischung aus 4 ml entionisiertem Wasser und 600 ml absolutem Ethanol durch Ultraschallvibration für 30 Minuten dispergiert. Dann wurden 1,2 ml APTES unter konstantem mechanischem Rühren für 7 h in die Mischung gegeben. Das resultierende funktionalisierte APTES-modifizierte Fe₃ O₄ (FeNP)-Nanopartikel wurden magnetisch vom Überstand durch einen Magneten getrennt, dann mit Ethanol gewaschen und bei 40 °C unter Vakuum 24 h getrocknet. Schließlich wurde der Niederschlag des FeNP für die weitere Verwendung aufbereitet.

Charakterisierung von FeNP/CpG-Partikeln

Die Partikelgrößenverteilungsspektren von Fe₃ O₄ , FeNP- und FeNP/CpG-Partikel wurden mit einem Zetasizer Nano ZS90 Laser-Partikelgrößenanalysator (Malvern Instruments, Malvern, UK) bei 25 °C bestimmt. Jeder Test wurde dreimal durchgeführt und der Mittelwert wurde genommen. Ein Transmissionselektronenmikroskop (H-6009IV; Hitachi Ltd., Tokio, Japan) und ein Rasterelektronenmikroskop (REM) wurden verwendet, um die Morphologie der hergestellten Partikel zu beobachten.

Ein Agarose-Verzögerungsassay wurde durchgeführt, um die CpG-Bindungsfähigkeit von FeNP-Partikeln zu bewerten. Kurz gesagt, das funktionalisierte APTES-modifizierte Fe₃ O₄ Partikel (FeNP) wurde mit 1 μg CpG in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt (FeNP:CpG, w /w ) in destilliertem Wasser. Nach einer Co-Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur werden die Mischungen einer Elektrophorese auf einem 1% (w /v ) Agarosegel bei 120 V für 30 min. Das Gel wurde dann mit Golden View™ (0,5 mg/ml) gefärbt und mit einem UV-Illuminator (Bio-Rad ChemiDox XRS, USA) fotografiert.

MTT-Assay

Die Zytotoxizität von FeNP-Partikeln gegenüber C26-, 4T1- und 293T-Zelllinien wurde mit einem MTT-Assay bewertet. C26-, 4T1- und 293T-Zellen wurden mit einer Dichte von 5 × 10 ³ . ausplattiert Zellen pro Well in 100 μl RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS in 96-Well-Platten und für 24 h oder 72 h gezüchtet. Die präparierten Zellen wurden einer Reihe von FeNP-Partikeln mit unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt:1,25, 0,625, 0,3, 0,15, 0,07, 0,03, 0,01 und 0 mg/ml in sechsfacher Ausführung. Nach gezielter Kultivierung wurden 100 μl Komplettmedium und 10 μl MTT in jede Vertiefung pipettiert und 4 h bei 37 °C inkubiert. DMSO wurde 30 Minuten lang dem gelösten Stoff zugesetzt, und Formazan wurde gebildet. Dann wurde die Extinktion bei 570 nm mit einem Spectramax M5 Mikrotiterplatten-Luminometer (Molecular Devices, USA) gemessen. Die Zelllebensfähigkeit der unbehandelten Zellen wurde als 100 % angesehen.

In-vitro-Transfektion

BMDCs wurden aus BALB/c-Mäusen hergestellt. Kurz gesagt, Knochenmarkzellen aus dem Femur und der Tibia wurden mit einer Spritze mit freies FBS-enthaltendem 1640-Kulturmedium ausgespült. Die Zellen wurden 3 min bei 1500 U/min zentrifugiert, mit ACK-Lysepuffer (Lonza Inc.) behandelt, um rote Blutkörperchen zu entfernen, und in RPMI-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS, Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin ( 100 U/ml) bei 37 °C in 5 % CO2 mit 20 ng/ml Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF). Die Zellen wurden dann in einer Dichte von 10 ⁶ . in Sechs-Well-Platten ausgesät Zellen pro Vertiefung und das Wachstumsmedium wurde alle 2 Tage gewechselt. Die dendritischen Zellen wurden am Tag 7 geerntet.

An Tag 7 wurde ein Partikeläquivalent von 0,2 μg freiem FITC-konjugiertem CpG (CpG-FITC) oder FeNP, das CpG-FITC mit einem Massenverhältnis von 10:1 liefert, in die vorgefertigten Wells gegeben. Eine oder 3 h nach der Transfektion wurden die Wachstumsmedien entfernt, die Zellen wurden 10 min mit DAPI gefärbt und die Zellen wurden dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Bilder von jeder Vertiefung wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (LSCM) aufgenommen und die Transfektionseffizienz wurde durch Durchflusszytometrie (NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences, USA) gemessen.

In-vivo-Test zur Tumorinhibition

Einhunderttausend C26- oder 4T1-Zellen wurden subkutan in den Rücken jeder BALB/c-Maus (6–8 Wochen alt) injiziert. Die Tumorvolumina wurden anschließend mit einem digitalen Messschieber gemessen und nach folgender Formel berechnet:Tumorvolumen =0.5 × Länge (mm) × [Breite (mm)] ² . Sobald die Tumore etwa 50 mm ³ . erreicht haben in der Größe wurden die Behandlungen angewendet. Die Mäuse (n = 10) erhielten entweder intratumorale Injektionen von CpG/FeNP (in einem Verhältnis von 10:1) Partikel entsprechend 20 μg CpG oder CpG allein alle 3 Tage für vier Behandlungen. Mäuse, die ein Äquivalent an normaler Kochsalzlösung (NS) oder FeNP-Partikeln erhielten, wurden als Kontrollgruppen angesehen. Die Tumorgröße und das Körpergewicht der Tiere wurden alle 3 Tage überwacht. Am 31. Tag wurden alle Mäuse durch Halswirbelluxation getötet. Das Tumorgewebe und andere wichtige Organe wurden mit 4% neutralem Formalin fixiert, gefolgt von Paraffinschnitten zur HE-Färbung zur Bewertung des morphologischen Unterschieds und zur Immunfluoreszenz zum Testen von Tumormikroumgebungen. Im 4T1-Modell haben wir das Tumorgewicht gemessen und die Anzahl der pulmonalen Metastasenknoten gezählt.

Das Tumor-Re-Challenge-Experiment wurde im C26-Modell verarbeitet. Kurz gesagt, mit der FeNP/CpG-Behandlung geheilte Mäuse wurden erneut mit 5 × 10 ⁵ . belastet C26- oder 4T1-Zellen s.c. in zwei getrennte Stellen auf der gegenüberliegenden Seite der Flanke ohne weitere Behandlung. Mäuse wurden getötet, als das Volumen des 4T1-Tumors auf 200–300 mm ³ . anwuchs oder 20 Tage.

Zytotoxischer T-Lymphozyten-Assay

Der CTL-Assay wurde gemäß veröffentlichten Verfahren durchgeführt. Im Detail wurden Lymphozyten der Milz als Effektorzellen geerntet und mit Ammoniumchlorid von roten Blutkörperchen befreit und am Ende der Behandlungsexperimente durch Nylonwolle geleitet. 4T1 oder C26 als Zielzellen wurden mit 300 mci Na₂ . markiert ⁵¹ CrO₄ für 2 h und dann mit PBS gewaschen und auf 96-Well-Platten verteilt. Die präparierten Effektorzellen wurden mit den Zielzellen bei unterschiedlichen E:T-Verhältnissen co-inkubiert. Die Radioaktivität enthaltenden Überstände der Zielzellen wurden mit einem Szintillationszähler gemessen. Die spezifische Lyse wurde wie folgt bestimmt:% spezifische Lyse =100 [(Freisetzung in Gegenwart von CTL-Spontanfreisetzung)/(maximale Freisetzungs-Spontanfreisetzung)]. In allen Experimenten betrug die spontane Freisetzung weniger als 30 % der maximalen Freisetzung.

ELISpot-Assay

Milzzellen wurden am Ende des Experiments von Kontroll- oder CpG-behandelten Mäusen geerntet und ELISpot-Assays wurden unter Verwendung des Maus-IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die geernteten Splenozyten wurden mit ihren jeweiligen Behandlungen für 96 h co-inkubiert, die Suspension wurde zugetropft und die Zellen wurden dreimal mit Waschpuffer gewaschen, bevor der gemischte Antikörper von IFN-γ und IL-4 zugegeben wurde. Nach der Verarbeitung durch chromogene Mittel wurde die Anzahl der fleckenbildenden Zellen (SFCs) unter einem Mikroskop gezählt.

ELISA-Assay

Ein ELISA wurde durchgeführt, um die Konzentrationen der Ct-spezifischen Serum-Antikörper-Titer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Kurz gesagt, mit gereinigtem vollständigem Ct-Protein (BestBio Biotechnology Co. Shanghai, China) beschichtete Mikrotiterplatten wurden mit PBS-Lösung, die 0,05 % Tween 20 (PBST) enthielt, gespült und dann mit 100 μl Blockierungspuffer (5 % Magermilch in PBST) blockiert. bei 37 °C für 1 h. Nach fünfmaligem Spülen mit PBST wurden die Platten mit Immunseren (verdünnt 1:1000 in Blockierungspuffer, 100 μl/Vertiefung) oder Vaginalspülungen (verdünnt 1:10 in Blockierungspuffer, 100 μl/Vertiefung) bei 37 . inkubiert °C für 2 h. Nach fünfmaligem Spülen mit PBST wurden die Platten mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (verdünnt 1:1000 in Blockierungspuffer, 100 μl/Vertiefung) oder HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgA-Antikörper (verdünnt auf 1:2000 in Blockierungspuffer, 100 μl/Well) bei 37 °C für 1 h.

Histologische Analyse

Das Tumorgewebe und die wichtigsten Organe, die aus In-vivo-Inhibitionsstudien gewonnen wurden, wurden fixiert und in Paraffin eingebettet. Nach dem Entwachsen und Rehydratisieren wurden in Wachs eingebettete Gewebeschnitte mit Mayers HE angefärbt. Um infiltrierende Lymphozyten (TILs) im Tumorgewebe jeder Gruppe zu analysieren, wurden Schnitte einer Hochdruck-Antigenreparatur unterzogen, gefärbt mit Anti-Maus-FITC-CD4, PE-CD8 und PE-CD49b (als NK-Hersteller) (BD, USA) für 1 h bei 4 °C und dann mit DAPI für 10 Minuten gefärbt, bevor PBS für die Bildgebung gewaschen wird. Ein Bild von jeder Gruppe wurde durch ein positives Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) aufgenommen.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der Software Prism 5.0c (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) SPSS 17-Software durchgeführt. Ein Intergruppenvergleich wurde mit dem Tukey-Test für die Einfaktor-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. P Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Herstellung und Charakterisierung von FeNP/CpG-Partikeln

Um ein magnetisches Partikel für die CpG-Abgabe mit geringer Zytotoxizität zu entwickeln, wurde Fe₃ O₄ Partikel wurden unter Verwendung des Co-Präzipitationsverfahrens synthetisiert, wie in Abb. 1a gezeigt. Aufpfropfen der Aminopropylsilangruppen (–O)3Si–CH2–CH2–CH2–NH2 von APTES auf die Oberfläche von Fe₃ O₄ um FeNP-Partikel zu bilden (Abb. 1b). Negativ geladenes CpG (CpG) bindet an wirksame funktionelle Gruppen, die von den APTES bereitgestellt werden, um FeNP/CpG-Partikel durch elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden, wie in Abb. 1c schematisch dargestellt. Basierend auf der dynamischen Lichtstreuungsmessung wird die Größe des präparierten Fe₃ O₄ Partikel betrug 10,7 ± 4,1 nm (Abb. 2a). Wie durch TEM (Abb. 2b) und SEM (Abb. 2c) beobachtet, Fe₃ O₄ Die in dieser Arbeit entwickelte, zeigte eine einheitliche und nahezu kugelförmige Form. Der dynamische Durchmesser von APTES-modifiziertem Fe₃ O₄ Partikel war 34,5 ± 5,0 nm (Abb. 2d), was in guter Übereinstimmung mit den TEM-Ergebnissen (Abb. 2e) war.

Herstellung von FeNP/CpG-Partikeln. a Synthesegleichung von Fe₃ O₄ magnetische Partikel nach dem Co-Präzipitationsverfahren. b Hydrolyse- und Kondensationsreaktionen mit Produktion von Silanpolymer und Silanisierungsreaktion von APTES auf der Magnetitoberfläche zur Bildung von FeNP-Partikeln. c Schematische Darstellung der FeNP/CpG-Partikel. CpG wird durch elektrostatische Wechselwirkungen an die Oberfläche der FeNPs gebunden, um FeNP/CpG-Partikel zu bilden

Charakterisierung von FeNP/CpG-Partikeln. a Größenverteilungsspektrum von Fe₃ O₄ Partikel. b Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme (TEM) von Fe₃ O₄ . c Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Fe₃ O₄ Partikel. d Größenverteilung von APTES-beschichtetem Fe₃ O₄ (FeNP) Partikel. e Das TEM-Bild von FeNP-Partikeln. f Die CpG-Bindungsfähigkeit von FeNPs wird durch Gel-Retardations-Assay bestimmt. Alle Daten repräsentieren drei unabhängige Experimente

Um die Bindungsfähigkeit von FeNP-Partikeln an CpG zu veranschaulichen, wurde ein Gel-Retarding-Assay durchgeführt (Abb. 2f). Wenn das Molverhältnis von FeNP zu CpG 10:1 betrug, wurde keine helle CpG-Bande beobachtet, was zeigt, dass das negativ geladene CpG durch elektrostatische Wechselwirkungen nach der Elektrophorese vollständig von FeNP-Partikeln adsorbiert werden kann. Daher haben wir dieses Verordnungsverhältnis für die weitere Anwendung in unserer Studie gewählt. Zusammen zeigten diese Ergebnisse, dass sich CpG erfolgreich auf der Oberfläche von FeNPs durch elektrostatische Wechselwirkungen verbinden kann, was Stabilität und eine kleine Dimension zeigt.

Zelllebensfähigkeit und Transfektion von FeNP/CpG-Partikeln in vitro

Um die biophysikalische Charakterisierung in vitro weiter zu beschreiben, haben wir die Zytotoxizität von FeNPs in 293T-, 4T1- und C26-Zellen nach 24 h oder 72 h nachgewiesen (Abb. 3a). Es gab keine offensichtliche dosisabhängige Beziehung zwischen der Zelllebensfähigkeit und den FeNP-Partikeln in den 293T-, C26- und 4T1-Zellen. Die Zellüberlebensrate betrug mehr als 80 % nach 24 h und 60 % nach 72 h bei drei Zellarten, selbst bei einer FeNP-Konzentration von 1,25 mg/ml. Diese Ergebnisse bewiesen die Biokompatibilität von FeNP-Partikeln sowohl für normale Zellen (293T) als auch für Tumorzellen (C26, 4T1).

Zytotoxizität und Aufnahmeaktivität von FeNP/CpG-Partikeln in vitro. a MTT-Assay. Wir haben die Lebensfähigkeit von 293T-, 4T1- und C26-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von FeNP-Partikeln für 24 Stunden oder 72 Stunden nachgewiesen. Es gab bei keiner Dosis von FeNPs einen signifikanten Unterschied in der Zelllebensfähigkeit. b , c Der Nachweis der FeNP/CpG-Aufnahme in BMDCs. BMDCs vorbereitet nach GM -CSF Behandlung für 7 Tage wurden mit CpG-FITC oder FeNP-geliefertem CpG-FITC für 1 oder 3 h transfiziert, bevor sie intensiv gewaschen, fixiert und mit DAPI markiert wurden. Die Bilder wurden durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (LSCM) aufgenommen. Im Vergleich zu freiem FITC-markiertem CpG weist das FeNP/CpG eine erhöhte Fluoreszenzintensität (b ) und die Transfektionseffizienz waren statistisch signifikant (c ). Diese Daten waren repräsentativ für drei unabhängige Experimente, der mittlere ± Standardfehler; *P  0,05, *P  0,01 und ***P  0,001 gegenüber der unbehandelten Gruppe

Dendritische Zellen als Hauptrezeptorzellen für CpG spielen eine wichtige Rolle bei einer durch TLR9 vermittelten Antitumor-Immunantwort. CpG als potentes Typ-1-polarisierendes Adjuvans induziert DCs, um eine Immunantwort innerhalb des Tumors durch Sekretion von Chemokinen und Zytokinen zu aktivieren. Daher ist die effiziente Abgabe von CPG in DC-Zellen entscheidend, um eine Antitumorantwort zu erreichen. In unserer Studie wurde FITC-konjugiertes CpG verwendet, um die Abgabefähigkeit von FeNP-Partikeln an DCs in vitro zu untersuchen. Nach 1 oder 3 Stunden nach der Transfektion mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (LSCM) war die zelluläre Fluoreszenzintensität in den mit FITC-konjugierten CpG-beschichteten FeNP-Partikeln (FeNP/CpG-FITC) behandelten Gruppen höher als bei den äquivalente Menge an freien CpG-Gruppen (Abb. 3b). Die FeNP/CpG-FITC-Partikel konnten nach 1 h bis zu 18,3% der DCs transfizieren. Dann, 3 h nach der Transfektion, stieg der Anteil der positiven Zellen auf 39,2 % (Abb. 3c). Bei den mit freien FITC-konjugierten CpG-behandelten Zellen konnte mit weniger als 10 % Transfektion sogar 3 Stunden nach der Transfektion eine minimale Fluoreszenz beobachtet werden. Daher wird vorgeschlagen, dass die Abgabe von CpG durch FeNP-Partikel die zelluläre Aufnahme von CpG erhöht.

FeNPs liefern CpG an Xenotransplantate und hemmen das Tumorwachstum und spontane Lungenmetastasen in vivo

Die Antikrebsaktivität von CpG/FeNP-Partikeln wurde zuerst in vivo in C26-Kolonkarzinom- und 4T1-Brustkrebs-Tumormodellen zur subkutanen Transplantation untersucht. Wenn das Tumorvolumen ungefähr 50 mm ³ betrug , wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt, um mit der Behandlung zu beginnen (n = 10). Mäuse wurden während des gesamten Experiments dreimal mit einer intratumoralen Injektion von CpG/FeNP-Partikeln behandelt (Abb. 4a). In unserer Studie führte die intratumorale Injektion von FeNP/CpG-Partikeln zu einer signifikanten Hemmung des Xenotransplantat-Tumorwachstums im Vergleich zu der der Kontrollgruppen, und die Hemmungsrate betrug bis zu 69 % (P < 0,05 vs. NS) (Abb. 4b). Verglichen mit der mit Kochsalzlösung (NS) behandelten Gruppe (0,90 ± 0,08 g) und der FeNP-Gruppe (0,81 ±   0,03 g) kam es bei den mit FeNP/CpG-Partikeln behandelten Gruppen zu einer statistisch signifikanten Verringerung des Tumorgewichts (0,38 ±   0,03 g, P < 0,001). Im Vergleich dazu zeigte die Gruppe mit freiem CpG eine minimale Antikrebsfähigkeit (0,68 ±   0,03 g) (Abb. 4c). Darüber hinaus entwickelten Mäuse in der PBS-Kontrollgruppe ausgedehnte Lungenmetastasen, im Vergleich dazu zeigten die mit den FeNP/CpG-Partikeln behandelten Mäuse eine 64,1%ige Abnahme der Anzahl der Tumorknötchen in der Lunge (Abb. 4d, e), was die Stärke demonstriert der FeNP/CpG-Partikel bei der Behandlung von metastatischen Tumoren. Wie in Abb. 4f gezeigt, zeigte die H&E-Färbung der Lunge eine geringere Lungenbelastung mit deutlichen Lungenmetastasen nach FeNP/CpG-Behandlung als andere Gruppen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die FeNP-Lieferung von CpG in 4T1-Zellen nicht nur das Wachstum des 4T1-Tumors signifikant hemmte (P < 0,001 gegenüber NS), sondern unterdrückte auch die Metastasierung von Brustkrebs in die Lunge.

Antitumorfähigkeit von FeNP/CpG-Partikeln in vivo. a Behandlungsschema von Antitumor durch FeNP/CpG-Partikel sowohl in C26-Kolonkarzinom- als auch in 4T1-Brustkrebs-Xenotransplantatmodellen durch intratumorale Injektion in vivo. b –d Die Behandlung mit FeNP/CpG-Partikeln hemmte das Wachstum von 4T1-Tumoren. b Repräsentative Tumorwachstumskurven des 4T1-Tumormodells. c Durchschnittliches Tumorgewicht. d Durchschnittlicher Lungentumorknoten in jeder Gruppe zeigt deutlich Lungenmetastasen nach intratumoraler FeNP/CpG-Injektion. e , f Hellfeld-Bildgebung und H&E-Färbung der Lunge:e Die Anzahl der sichtbaren Lungenmetastasen, Pfeile zeigen Lungenmetastasen an. f H&E-Färbung der Lungenmetastase. Maßstabsbalken, 100 μm für H&E-Färbung. g , h FeNP/CpG-Partikel hemmten das Wachstum von C26-Xenotransplantat-Tumoren signifikant:e Tumorwachstumskurven jeder Gruppe während des Experiments und f durchschnittliches Tumorgewicht. Es gab 10 Mäuse in jeder Gruppe. g Tumor-Re-Challenge-Experiment. ich Im C26-Modell wurden Mäuse, die mit FeNP/CpG-Behandlung geheilt wurden, erneut mit 5 × 10 ⁵ . belastet C26 (rechte Flanke) oder 4T1-Zellen (linke Flanke) s.c. in zwei getrennte Stellen auf der gegenüberliegenden Seite der Flanke ohne weitere Behandlung. Die gezeigten Bilder sind repräsentative Mäuse 20 Tage nach der erneuten Herausforderung des Tumors. Alle Daten waren repräsentativ für drei unabhängige Experimente, der Mittelwert  ± SEM; *P  0,05, *P  0,01 und ***P  0,001

In ähnlicher Weise wurde eine signifikant verstärkte Antitumorwirkung mit FeNP/CpG-Behandlungsgruppen im subkutanen Modell von mit C26 inkubierten Mäusen beobachtet. Wie in Abb. 4g gezeigt, wuchs der Tumor bei den Kontrollmäusen, der Vehikelgruppe und der CpG-Gruppe schnell mit einem mittleren Tumorvolumen von ungefähr 2300 ± 239,4 mm ³ . , 2116,7 ± 360,9 mm ³ , und 1353,3 ± 158,9 mm ³ , jeweils bis zum 31. Tag. Im Gegensatz dazu war in der FeNP/CpG-Gruppe das Tumorwachstum mit einem mittleren Tumorvolumen von ungefähr 153,7 ± 62,7 mm ³ . extrem gehemmt (P <  0,01 gegenüber NS) und eine Hemmungsrate von 94,4%. Die Tumoren schienen nach der ersten Behandlung langsam zu wachsen, und ein Teil der Tumoren begann nach dem Ende der drei Behandlungen allmählich zu verschwinden. Noch wichtiger war, dass in den Behandlungsgruppen mit FeNP/CpG-Partikeln die Tumoren bei fast der Hälfte der Mäuse am Ende des Experiments vollständig verschwunden waren. Wie in Abb. 4h gezeigt, hatte die FeNP/CpG-Behandlungsgruppe ein viel niedrigeres durchschnittliches Tumorgewicht als die anderen Gruppen (P < 0,001):FeNP/CpG-Behandlungsgruppe (0,14 ± 0,08 g), NS-Gruppe (2,41 ± 0,26 g), FeNP-Gruppe (2,50 ± 0,4 g) und CpG-Gruppe (1,44 ± 0,32 g). Um zu bestimmen, ob FeNP/CpG-Partikel ausreichend waren, um die spezifische Antitumorantwort zu vermitteln, wurde ein Tumor-Re-Challenge-Experiment im C26-Modell durchgeführt ( 4i ). Die Mäuse, deren Tumoren nach der FeNP/CpG-Partikelbehandlung im C26-Kolonkrebsmodell vollständig regressiv waren, wurden mit 4T1- und C26-Tumoren in verschiedenen Positionen auf den BALB/c-Mäusen subkutan inokuliert und es wurde keine weitere Behandlung durchgeführt. Alle 4T1-Tumoren wuchsen schnell und ihre Volumina überstiegen am Tag 20 nach der Exposition 1000 mm3. Im Gegensatz dazu gab es im C26-Modell solide Tumoren, die für das bloße Auge unsichtbar waren, was darauf hindeutet, dass die FeNP/CpG-Partikelgruppen eine spezifische Antitumorreaktion stimulierten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die intratumorale Injektion von FeNP/CpG-Partikeln das Wachstum von a . effizient hemmte subkutanes Xenotransplantat.

FeNP/CpG-Partikel stimulieren eine verstärkte systematische Antitumor-Immunantwort

Die in-vivo-Antitumormechanismen von FeNP/CpG-Partikeln in den obigen beiden Modellen wurden weiter untersucht. Um die Art der Immunantwort zu untersuchen, wendeten wir den ELISpot-Test an, um die IFN-γ/IL-4-Spiegel der Mausmilz zu analysieren. Wenn der IFN-γ-Spiegel in Milz-Lymphozyten (mit Erythem auf der ELISpot-Tafel) signifikant höher ist als der IL-4-Spiegel (mit blauen Flecken auf der ELISpot-Tafel), war die Art der stimulierten Immunantwort Th1, nämlich die Aktivierung von CD8 ⁺ T-Lymphozyten und hauptsächlich die CTL-Antwort des Körpers. Ansonsten war die Art der Immunantwort Th2, nämlich hauptsächlich CD4 ⁺ . zu aktivieren T-Lymphozyten, wodurch B-Lymphozyten stimuliert und antigenspezifische Antikörper produziert werden. Ein zweifarbiger ELISpot-Assay wurde durchgeführt, um die Expression von IFN-γ und IL-4 in verschiedenen Behandlungen zu messen (Fig. 5a). Im Vergleich zu den anderen drei Gruppen zeigte die Zahl der fleckbildenden Zellen (SFCs) von IL-4 und IFN-γ, die aus Milzlymphozyten von Mäusen sezerniert wurden, in der Gruppe mit FeNP/CpG-Partikelbehandlung einen steigenden Trend, und die Zahl der SFCs die Sekretion von IFN-γ war 1,5-fach höher als die von IL-4 (P <  0,05), was auf eine verstärkte zelluläre Antitumor-Immunantwort nach intratumoraler Injektion von FeNP/CpG-Partikeln hindeutet. Darüber hinaus wurde das Serum der mit NS, FeNP, CpG und FeNP/CpG behandelten Mäuse unter Verwendung eines ELISA-Tests auf das Vorhandensein von gesamtem tumorspezifischem IgG nach drei Immunisierungen analysiert. Obwohl FeNP/CpG-immunisierte Mäuse im C26-Tumormodell signifikant höhere Titer an tumorspezifischem IgG entwickelten als die in anderen Gruppen (Abb. 5b), gab es keinen statistischen Unterschied zwischen FeNP/CpG-immunisierten Mäusen und CpG-immunisierten Mäusen .

The mechanism of antitumor immune response. a ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U testet. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. (a ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

Diskussion

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ O₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ O₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ O₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ O₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ O₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

Schlussfolgerung

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ O₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

Abkürzungen

APTES:

3-Aminopropyltriethoxysilane

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ O₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF :

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor