Anti-Epcam-Aptamer (Syl3c)-funktionalisiertes Liposom zur gezielten Abgabe von Doxorubicin:In-vitro- und In-vivo-Antitumorstudien bei Mäusen mit C26-Kolonkarzinom

Einführung

Nano-Drug-Delivery-Systeme (NDDS) mit einer Größe von 100–200 nm werden durch einen verbesserten Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR) passiv in der Tumormikroumgebung akkumuliert. Dies geschieht durch die lockere Endothelauskleidung und eine schwache Lymphdrainage. Neuere Daten zeigten jedoch, dass nur weniger als 1% des verabreichten Arzneimittels die Tumorstelle erreichen konnte [1]. Mangelnde Fähigkeit, in die dichte extrazelluläre Matrix (ECM) des Tumors einzudringen, die Rückkehr des freigesetzten Arzneimittels in den Kreislauf und die Heterogenität der Tumoren sind die Gründe für dieses Versagen [2]. Es wurden verschiedene Strategien verwendet, um die Tumorakkumulation von NDDSs unter Verwendung endogener und exogener Stimuli zu verbessern [3]. Diese NDDSs könnten auf exogene Stimuli wie Licht reagieren und können in der Tumorbildgebung verwendet werden [4]. Es gibt viele verschiedene anorganische Nanomaterialien, die als Antikrebsmittel eingesetzt werden können [5, 6]. Bei anorganischen Nanomaterialien muss jedoch auf deren Toxizität und Umweltsicherheit geachtet werden [7,8,9,10,11].

Die aktive zielgerichtete Abgabe ist ein wichtiger Ansatz, der NDDSs hilft, Therapeutika effizienter an die Tumore zu verabreichen und die Exposition gegenüber Nicht-Zielgeweben zu minimieren [12, 13]. Ein ideales Targeting-Agens für eine gezielte Abgabe ist ein Molekül, das eine Affinität zu den Zelloberflächenproteinen oder Rezeptoren aufweist, die von bestimmten Zellen oder Gewebekomponenten hochreguliert werden [14].

Das Epithelzelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein Transmembran-Glykoprotein, das als Ligandkandidat für aktives Targeting gilt. Jüngste Ergebnisse zeigten, dass die EpCAM normale gesunde Epithelzellen mit niedriger Expression aufweist, während ihre Expression in Krebszellen in höherem Maße (bis zu 1000-fach) ansteigt [15,16,17]. Während der Krebsentwicklung ändert sich das Expressionsmuster von EpCAM von der basalen und basolateralen Membran im normalen Epithel zur apikalen Oberfläche in Tumorepithelzellen [18]. Diese unterschiedliche Expression macht EpCAM zu einem sehr interessanten Liganden für die Wirkstoffabgabe, der den therapeutischen Index des Wirkstoffs verbessern könnte [19].

EpCAM wird als Marker für Krebsstammzellen (CSC) oder Tumor initiierende Zellen (TIC) nachgewiesen, dessen Expression bei Krebs mit der schlechten Prognose zusammenhängt [20]. CSC oder TIC sind Zellen mit Selbsterneuerung, der Fähigkeit, mehr Zellen des gleichen Typs zu produzieren, die eine Schlüsselrolle bei der Tumorentwicklung und Metastasierung spielen [21]. Die Überexpression von EpCAM wurde bei CSC verschiedener solider Tumoren berichtet [22]. In jüngster Zeit haben Aptamere in weiten Bereichen viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen und haben sich als potenziell leistungsfähige Moleküle erwiesen, die in NDDSs als Targeting-Ligand verwendet werden können [23, 24]. Aptamere sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotidsequenzen, die Sekundär- und Tertiärstrukturen besitzen, die eine Affinität zu ihren Zielen wie Zelloberflächenrezeptoren aufweisen [23, 24]. Aptamere haben auch mehrere Vorteile gegenüber dem, sie sind zum Beispiel nicht immunogen und haben ein niedriges Molekulargewicht (8–25 kDa) mit chemischer und thermischer Stabilität. Darüber hinaus ist ihre Synthese und chemische Modifikation kostengünstig und skalierbar [25]. Das selektive Targeting der NDDS durch Anti-EpCAM-spezifisches Aptamer könnte als wirksame Targeting-Option angesehen werden, um Chemotherapeutika in die Tumormikroumgebung zu transportieren [19, 26]. In dieser Hinsicht zeigten verschiedene Studien, dass Anti-EpCAM-Aptamer-funktionalisierte Nanoträger die Abgabe von Krebsmedikamenten an Tumorzellen effektiv verbessern könnten [15, 27, 28].

Das Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines Anti-EpCAM-DNA-Aptamers (SYL3C)-PEGylierten-Nanoliposomen, beladen mit Doxorubicin (DOX) (ED-lip) als Modell für NDDS. Eine solche Funktionalisierung wurde durch EDC/NHS-Kopplungschemie zwischen der Amingruppe des Aptamers und der Carboxylgruppe von DSPE-mPEG₂₀₀₀ . durchgeführt , das wie in Fig. 1 gezeigt in das Liposom nachinseriert wird. Die ED-Lippe charakterisiert hinsichtlich Größe, Zeta-Potential und Prozentsatz der Doxorubicin-Einkapselung, Freisetzungsprofil und Zytotoxizität. Dann untersuchten wir, ob diese ED-Lippe die Zellaufnahme in vitro verbessern und DOX über das Targeting in den Tumor an Mäuse mit C26-Kolonkarzinom-Tumoren abgeben könnte.

Herstellung von anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-Lippe). a Verknüpfung von Anti-EpCAM-Aptamer mit DSPE-mPEG₂₀₀₀ durch kovalente Bindung der primären Amine (-NH2) des Anti-EpCAM-Aptamers an die Carboxylgruppe (-COOH) von DSPE-mPEG₂₀₀₀ . b Postinsertionsverfahren zur Herstellung von anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-lip)

Ergebnis und Diskussion

Caelyx®, PEGyliertes liposomales Doxorubicin, ist eines der am häufigsten verwendeten Chemotherapeutika und der erste von der FDA zugelassene Nanopartikel, der zur Behandlung von Eierstockkrebs, AIDS-bedingtem Kaposi-Sarkom und multiplem Myelom indiziert ist. Caelyx® drang über den EPR-Effekt passiv in die Tumorstelle ein [29]. Caelyx® hat jedoch eine signifikant verbesserte Pharmakokinetik und Halbwertszeit von DOX; Die Haupteinschränkungen von Caelyx® sind jedoch eine unzureichende zelluläre Aufnahme und eine geringe Freisetzungsrate des Arzneimittels an der Tumorstelle [29]. Hier haben wir SYL3C-Aptamer als Targeting-Ligand verwendet, um liposomales Doxorubicin (ED-lip) so zu funktionalisieren, dass es auf das EpCAM-Molekül in der Oberfläche von Krebszellen abzielt, was die Abgabe von DOX an eine bestimmte Zielstelle durch den Prozess des aktiven Targetings ermöglicht.

Konjugation von DSPE-mPEG₂₀₀₀ zu Aptamer

In der vorliegenden Studie verwendeten wir EDC/NHS-Kopplungschemie zur Konjugation von Amin-funktionalisierten Anti-EpCAM-Aptameren an die aktive Carboxylgruppe von DSPE-mPEG₂₀₀₀ -COOH. Der Vorteil dieser Kupplungsreaktion unter Verwendung der EDC/NHS-Kupplungschemie und der Bildung der Amidbindung ist ihre Stabilität und die Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen zwischen Aptameren [30]. Aptamere könnten mit einer primären Amin- oder Thiolgruppe modifiziert und kovalent konjugiert werden, um die Carboxyl- bzw. Pyrrolgruppe von Maleimid zu aktivieren [31]. Mit Thiolgruppen modifizierte Aptamere wurden an die funktionelle Maleimidgruppe von DSPE-PEG₂₀₀₀ . konjugiert . Dann DSPE-PEG₂₀₀₀ -Aptamer postinseriert in eine Liposomenstruktur, um die äußere Oberfläche von Liposomen zu dekorieren [32]. Eine wichtige Einschränkung bei der Maleinimid-Thiol-Chemie besteht darin, dass während der Lagerung die Thiolgruppe von Aptameren durch Oxidation beeinflusst werden kann und zur Bildung einer Disulfidbindung (S-S) zwischen zwei thiolmodifizierten Aptameren führt. Diese dimeren Aptamere sind nicht in der Lage, an der Konjugationsreaktion mit der funktionellen Maleimidgruppe von DSPE-PEG₂₀₀₀ . teilzunehmen [30]. Daher erhöht die Verwendung von EDC/NHS-Reaktionen die Produktausbeuten und verbessert das Verfahren nach der Einfügung.

Aptamer hat einige Vorteile gegenüber den Antikörpern, einschließlich der einfachen Synthese und des Scale-up, der geringen systemischen Toxizität und der fehlenden Immunogenität [33]. Hier wurde nach Aptamer-Konjugation an das Lipid die Post-Insertion-Methode rekrutiert, um Anti-EpCAM-Aptamer-dekoriertes Caelyx® (ED-lip) herzustellen. Im Allgemeinen ist die Post-Insertion-Technik eine einfache und effektive Methode zur Anlagerung von Aptameren an die Oberfläche von Liposomen und bietet eine höhere Rate des Aptamereinbaus in die Liposomen [34].

Wir verwendeten einen Gelelektrophorese-Mobilitäts-Shift-Assay zur Bewertung der Postinsertion von Anti-EpCAM-Aptamer auf Liposomen. Wie in Fig. 2 gezeigt, wanderten die negativ geladenen Aptamere in das Gel und ihre Bande wurde beobachtet, während es keine Gegenbande für die ED-Lippenformulierung gab, da die ED-Lippe in der Vertiefungslinie eingeschlossen war und sich nicht durch das Gel bewegen konnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass Aptamere-konjugierte Micellen erfolgreich in die Oberfläche von Liposomen nachträglich eingefügt wurden.

Agarosegel-Elektrophorese der ED-Lippenformulierung. Proben werden auf das Agarosegel geladen. UV-Licht visualisierte das Gel. Die Wells, die der Leiter, dem freien Aptamer und den PL-konjugierten Aptameren entsprechen, sind angegeben. Das Fehlen einer entsprechenden Bande im Liposom-Aptamer zeigte die Bestätigung nach der Insertion an

Physikochemische Charakterisierung der ED-Lippe

Die physikalisch-chemische Charakterisierung von Caelyx® und ED-lip wurde in Tabelle 1 gezeigt. Die Größe und Ladung der hergestellten Formulierungen zeigten, dass die Modifikation von Caelyx® mit Anti-EpCAM-Aptamer keinen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße hatte (p> 0,05). Die Liposomengröße vor der Insertion von Aptamer (Caelyx®) betrug etwa 96 nm mit einem PDI von 0,11, nach der Postinsertion (ED-Lippe) erhöhte sich die Größe der Liposomen teilweise auf 117 nm mit einem PDI von 0,14, die eine wünschenswerte Größe für die Abgabe an . haben Tumor. Die Ergebnisse früherer Studien zeigten auch, dass der Einbau von Targeting-Liganden zu einer Zunahme der Größe und des PDI von Liposomen führt [35, 36]. Darüber hinaus wurde das Zetapotential der ED-Lippe (− 19.25) negativer als bei Caelyx® (− 12). Es wurde gezeigt, dass die RNA-Aptamer-Konjugation in das Liposom zu einer Abnahme des Zetapotentials des Liposoms führte [37]. Die Größenzunahme und das negative Zetapotential der ED-Lippe könnten ein Hinweis auf eine erfolgreiche Postinsertion konjugierter Aptamere auf der Liposomenoberfläche sein [38]. Diese Ergebnisse stimmen mit unserer vorherigen Studie überein, die darauf hinwies, dass die Anlagerung von Aptamer an die Oberfläche von Caelyx® zu einer leichten Zunahme der Partikelgröße und dem negativeren Zeta-Potential im Aptamer-funktionalisierten Caelyx® führte [38, 39]. Die Wirksamkeit der Postinsertion sollte jedoch in Bezug auf Inkubationszeit und Temperatur getestet werden, um ein wirksameres Liposom nach der Insertion mit besserer Größe und PDI zu erreichen. Die Einkapselungseffizienz von Caelyx® und ED-lip betrug 100 % (siehe Tabelle 1).

Die Zahl der Aptamere, die nach der Insertion in die Oberfläche des Liposoms inseriert wurden, wurde wie beschrieben bestimmt [6]. Der Gesamtgehalt an Phospholipiden der liposomalen Formulierung, bestimmt durch Phosphatassay, betrug 14 mM. Da beträgt die durchschnittliche Anzahl von Lipidmolekülen in Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 100 nm 8 × 10 ⁴ die Anzahl der Liposomen pro Milliliter beträgt fast 10 ¹⁴ [38]. Das Molekulargewicht des Aptamers betrug g/mol. Die Anzahl der DSPE-mPEG₂₀₀₀ -Aptamer wurde basierend auf Phosphat-Assay-Verfahren bestimmt, bei denen Mole von Phosphatmolekülen Molen von konjugierten Molekülen entsprechen. Basierend auf diesen Daten beträgt die Anzahl der Aptamermoleküle pro ml aliquoter Lösung 10 ¹⁵ .

DOX-Release-Profil

Die Insertion von Aptamer-konjugierten Micellen in die äußere Oberfläche von Caelyx® kann das Freisetzungsprofil von DOX beeinflussen. Daher haben wir die Freisetzung von DOX-Form ED-lip im Vergleich zu Caelyx® in 5% Dextrose mit 50% FBS untersucht. Dieses Medium könnte das Freisetzungsverhalten der Formulierungen im Plasma nachahmen [40]. Abbildung 3 zeigte, dass es während der 24-stündigen Studie keinen signifikanten Unterschied in der DOX-Freisetzung von Caelyx® und ED-Lippenformulierungen gab und nur die vernachlässigbaren Mengen an DOX freigesetzt wurden. Dies steht im Einklang mit unseren früheren Studien, die darauf hindeuteten, dass die Insertion von Aptamer an die Oberfläche von Liposomen die Membranstabilität und das Freisetzungsprofil von DOX nicht beeinflusste [38, 39]. Dies ist hauptsächlich auf die Stabilität der Caelyx®-Formulierung zurückzuführen, die mit einer pH-Gradienten-gesteuerten Remote-Loading-Methode formuliert wurde [41].

Studie freigeben. Leckageprofil des DOX-Gehalts von Caelyx® und ED-lip bei 37 °C in Gegenwart von 50 % FBS in Dextrose während 24 Stunden der Studie. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3)

Zellinteraktion und Zellaufnahme durch Fluoreszenzmikroskopie

Die Zellinteraktion und Zellaufnahme von liposomalen Formulierungen wurde bei 4 °C und 37 °C bewertet und ist in Abb. 4 gezeigt. Die Bewertung der zielgerichteten Wirksamkeit von ED-lip zeigte, dass es keine Unterschiede zwischen den mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFIs) gab. von CHO-K1-Zellen, die mit Caelyx® und ED-lip bei 4 °C und 37 °C behandelt wurden (Abb. 4a, c). Die Daten zeigten jedoch, dass die gezielte ED-Lippe im Vergleich zu Caelyx® bei 4 °C und 37 °C eine deutlich höhere Aufnahme durch C26-Zellen aufwies (Abb. 4b, d), die bei 37 °C statistisch signifikant war (p <0,0001). Die ED-Lippe hatte die signifikante Aufnahme im Vergleich zu Caelyx® (p <0,001). Diese Ergebnisse zeigten, dass die ED-lip-verstärkte Zielspezifität aufgrund von Anti-EpCAM-Aptamer im Vergleich zu CHO-K1-Zellen eine höhere Affinität zur C26-Zelllinie aufweist. Freies DOX wird ungehindert durch die Lipiddoppelschicht geleitet und dringt in die Zelle ein, hat also die höchste Zellaufnahme unter den Formulierungen und hat daher die höchste Zytotoxizität. Im Fall von Caelyx® begrenzt die PEGylierung die Endozytoserate und führte zu einer verringerten Zytotoxizität. Das Vorhandensein von Anti-EpCAM-Aptamer auf der Oberfläche von Liposomen (ED-lip) erhöht jedoch die Internalisierungsrate der Formulierung in die Zellen und erhöht ihre Zytotoxizität im Vergleich zu Caelyx® [38]. Die Daten der Fluoreszenzmikroskopie zeigten, dass der Unterschied zwischen der zellulären Aufnahme von ED-Lippe und freiem DOX in der C26-Zelllinie bei 37 °C nicht signifikant war (Fig. 5). Die Skalierung basierend auf der Intensität von internalisiertem DOX ist in Tabelle 2 dargestellt, wobei sowohl ED-lip als auch DOX statistisch signifikante Unterschiede mit Caelyx® in der zellulären Aufnahme von C26 gezeigt haben (p <0,001). Obwohl C26-Zellen ein geringes Maß an EpCAM auf ihrer Oberfläche exprimieren [42], deuten die Daten dieser Studie darauf hin, dass die Anwesenheit von Anti-EpCAM-Aptamer die Internalisierungsrate von Liposomen erhöhen könnte [43].

Zellinteraktion und Zellaufnahme von liposomalen Formulierungen bei 4 °C und 37 °C bewertet. a Die CHO-K1-Zellinteraktion der Formulierungen bei 4 °C und 37 °C. b Die Wechselwirkung von Formulierungen mit C26-Zellen bei 4 °C und 37 °C. c Der Graph zeigte den mittleren MFI der Formulierungen auf CHO-K1- und C26-Zellen. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3). ****p <0,0001

Fluoreszenzmikroskopie. Die Ergebnisse der Zellinternalisierung von DOX auf C26-Zelllinien, visualisiert durch Fluoreszenzmikroskopie. Mit DAPI gefärbte Zellen. Sowohl freies DOX als auch ED-lip haben im Vergleich zu Caelyx® eine höhere DOX-Internalisierung. Zellen inspiziert unter × 200-Vergrößerung

Zytotoxizitätsstudie

Die Zytotoxizitätswirkungen von freiem DOX, Caelyx® und ED-Lippenformulierungen sind in Fig. 6 angegeben. Verschiedene Konzentrationen von Formulierungen, die zur Behandlung von Zellen für 1, 3 und 6 h verwendet und für die nächsten 72 h inkubiert werden gelassen. Die Daten zeigten, dass alle Formulierungen zeit- und dosisabhängig Wirkungen auf Zellen haben. Die Lebensfähigkeit von C26-Zellen, die mit ED-Lippenformulierung behandelt wurden, nahm im Vergleich zu mit Caelyx® behandelten Zellen ab. Da CHO-K1-Zellen als EpCAM-negative Zellen im Vergleich zu C26-Zellen eine geringere Reaktion auf ED-lip zeigen, scheint es, dass Anti-EpCAM-Aptamer die spezifische Abgabe von Caelyx® an Zielzellen erhöht. Diese Ergebnisse könnten die spezifische zelluläre Aufnahme von ED-lip durch C26-Zellen bestätigen. Diese Ergebnisse unterstrichen die Bedeutung der gezielten Wirkstoffabgabe mit spezifischen Targeting-Agenzien für die selektive Abgabe von Wirkstoffen an die Zielzellen, wobei die Nebenwirkungen des Wirkstoffs durch Vermeidung von Off-Targets reduziert werden [44]. Wie bereits berichtet, führt das aktive Targeting von Caelyx® mit spezifischen Targeting-Liganden wie Aptamer und Antikörper zu einem verstärkten aktiven Tumor-Targeting und einer spezifischen Wirkstoffabgabe an die Zielzellen, was wiederum die therapeutische Wirksamkeit von DOX steigert [35, 39].

In-vitro-Zytotoxizitätswirkung (IC50) von ED-lip, Caelyx® und freiem Doxorubicin gegen CHO-Zellen und C26-Zellen nach unterschiedlichen Expositionszeiten. Daten dargestellt als μg/ml ± Standardabweichung (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001

Bioverteilung und Pharmakokinetik

Um zu bewerten, wie Anti-EpCAM-Aptamer die Bioverteilung von DOX beeinflusst, injizierten wir Mäusen mit subkutanen C26-Darmkrebstumoren eine Dosis von 10 mg/kg ED-lip und Caelyx®. Die DOX-Konzentration im Plasma 3, 12, 24, 48 und 72 h nach der Injektion mit Caelyx® und ED-lip ist in Abb. 7 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Verhalten der Plasma-DOX-Konzentrationen in beiden Gruppen ähnlich war Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen beiden Formulierungen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, verringerte die Konjugation von Anti-EpCAM-Aptamer an die liposomale Oberfläche leicht die Halbwertszeit der Zirkulation von 39,3 Stunden auf 34,2 Stunden und die MRT von 47,6 auf 42,9 Stunden (siehe Tabelle 3). Die pharmakokinetischen Parameter zeigten, dass die Konjugation von Anti-EpCAM-Aptamer auf dem Liposom t_½ . leicht verringerte und MRT, die mit früheren Berichten übereinstimmten, zeigten, dass die Konjugation von Aptamer auf der liposomalen Oberfläche die Clearance von Liposomen beschleunigt [38]. Proteinadsorption und nachfolgende Entfernung durch das mononukleare Phagozytosesystem (MPS) könnten der Grund für die Beschleunigung der Blutclearance von ligandenkonjugierten Nanopartikeln sein [45].

Plasmaspiegel von DOX. Die Ergebnisse der Konzentration gegen die Zeit der DOX-Menge im Blut 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3)

Wie in 8 gezeigt, wurden die Konzentrationen von DOX in den wichtigsten entnommenen Organen in Gruppen verglichen, die Caelyx® und ED-lip erhielten. Die wichtigste Nebenwirkung von freiem DOX ist die Kardiotoxizität, wodurch Caelyx® das Risiko dieser Nebenwirkung deutlich senkt [46]. Die Bioverteilung von ED-lip in Leber, Lunge und Milz ist zum Zeitpunkt 3 h signifikant höher als bei Caelyx®. Das Vorhandensein undichter Blutgefäße und die Zunahme der Größe und des PDI der ED-Lippe nach dem Einsetzen können die Gründe für eine frühere Ansammlung von ED-Lippe in diesen Geweben sein. Es wurde gezeigt, dass die Vergrößerung der Nanopartikel auf 150 nm die Ansammlung von Nanopartikeln in Leber, Lunge und Milz verstärkt [47]. Inzwischen zeigen die Ergebnisse der Biodistributionsstudie deutlich den EPR-Mechanismus bei der Ansammlung von Nanopartikeln im Tumor. Abbildung 8 zeigt deutlich, dass sich sowohl ED-lip als auch Caelyx® allmählich an der Tumorstelle anreichern und nach etwa 12 h ein Maximum erreichen, bis zu 24 h auf einem Plateau bleiben und dann nach 48 und 72 h allmählich abfallen. Es ist in allen Zeitpunkten von 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden interessant; die Akkumulation von ED-lip im Tumor ist signifikant höher als bei Caelyx®, was auf die Wirksamkeit des aktiven Targetings mit Anti-EpCAM-Aptamer zurückzuführen sein könnte. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Anlagerung von Aptamer an der Liposomenoberflächendosis die DOX-Verteilung in der Niere nicht beeinflusste. Daher scheint es, dass Anti-EpCAM-Aptamere die tumorspezifische Penetration von Liposomen effektiv fördern, was auch auf die Überexpression von EpCAM-Molekülen in vaskulären Endothelzellen von Tumoren zurückzuführen sein könnte [48]. Zuvor wurde darauf hingewiesen, dass Anti-EpCAM-Aptamere die Tumorpenetration in Xenotransplantat-Tumoren verbessern können [49]. Die CSCs oder TICs sind auch Ziel der Anti-EpCAM-Therapie. Die Gabe von Anti-EpCAM-Aptameren als Targeting-Ligand zum Targeting von EpCAM zeigte vielversprechende Effekte beim Targeting von CSCs [22, 50]. Hier könnte vorgeschlagen werden, dass ein Teil der effizienten Antitumorwirkung von ED-lip auf das erfolgreiche Targeting von CSCs zurückzuführen ist.

Bioverteilung im Gewebe. Die Ergebnisse der DOX-Bioverteilung in Herz, Tumor, Leber, Lungenmilz und Niere. Die Konzentrationen (μg/g), die 3, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion für jedes Organ angegeben wurden. Daten dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001

In Vivo Anti-Tumor-Aktivität

Die therapeutische Wirksamkeit von ED-lip wurde im C26-Kolonkarzinom-Tumormodell untersucht. Tumorgröße, Körpergewicht und Überleben wurden während fast 2 Monaten überwacht und die Ergebnisse sind in Abb. 9 und Tabelle 4 zusammengefasst. Die Daten zeigen, dass ED-lip keinen offensichtlichen Einfluss auf das Körpergewicht von Mäusen sowie Caelyx® hat (siehe Abb. 9a .). ). Wie in Abb. 9b gezeigt, wird nach intravenöser Injektion von Caelyx® und ED-lip die Tumorwachstumsrate bis zum 30. Tag nach der Injektion wirksam gehemmt, und es gibt keinen signifikanten Unterschied in den liposomalen Gruppen. 30 Tage nach der Injektion beschleunigte sich die Tumorwachstumsrate, jedoch war die Wachstumsrate in den Gruppen, die Medikamente erhielten, immer noch langsamer als in der Gruppe, die PBS erhielten. Der Unterschied zwischen der Caelyx®-Gruppe und der ED-Lippe war während der 30 Tage nach der Injektion nicht signifikant. Die Überlebensergebnisse werden in einem Kaplan-Meier-Plot dargestellt. Abbildung 9c zeigt, dass ED-lip die Überlebenskurve im Vergleich zu PBS oder Caelyx® verbessert. Die Hauptindikatoren der Überlebensstudie sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Tumoren bei drei Mäusen der ED-Lippengruppe waren vollständig geheilt, so dass der MST für diese Gruppe nicht definiert ist. Die Behandlung mit ED-lip erhöhte die TTE von 41,1 auf 49,7 Tage und führte zu einer wirksamen Antitumoraktivität mit 90,27 % TGD mit undefiniertem MST aufgrund der vollständigen Entfernung des Tumors bei drei Mäusen (siehe Tabelle 4).

Therapeutische In-vivo-Wirksamkeit von Formulierungen bei weiblichen BALB/c-Mäusen, die C26-Kolonkarzinom tragen. Mäuse erhielten eine IV-Injektion einer Einzeldosis der Formulierungen (10 mg/kg). a Stellt das jeweilige Gewichtsprozentprofil des BALB/c in jeder experimentellen Gruppe dar. b Zeigt die Tumorgrößen-Follow-ups bei BALB/c-Mäusen. c Zeigt das Überlebensdiagramm für BALB/c. Daten dargestellt als Mittelwert ± SD (n =5)

Daten zur Tumorgröße zeigten, dass ED-lip das Tumorwachstum dramatisch hemmen könnte. Die Ergebnisse der Überlebensanalyse zeigten, dass die Behandlung mit ED-Lippe MST und TTE erhöhte. Die Gruppe, die ED-lip erhielt, hatte einen höheren TGD% und war im Vergleich zu Caelyx® wirksamer. Unsere Ergebnisse stimmen mit der hohen DOX-Konzentration im Tumorgewebe der mit ED-Lippe behandelten Gruppe überein. Daher verbessert Aptamer-konjugiertes liposomales DOX ihre Penetration und erhöht folglich die Wirkstoffakkumulation an der Tumorstelle, was wiederum zu einer Steigerung der Wirksamkeit von Caelyx® und höheren TGD% in den Überlebensdaten führt. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Anti-EpCAM-Aptamere als wichtiges Targeting-Agens für die Wirkstoffabgabe dienen könnten.