Gezielte Doxorubicin-Abgabe mittels Anti-EpCAM-Aptamer-funktionalisierter Liposomen: Wirksamkeit in C26-Kolonkarzinom-Modellen

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde PEGyliertes nanoliposomales Doxorubicin (DOX) (Caelyx®) über die Post-Insertion von Anti-EpCAM-Aptamer-konjugiertem DSPE-mPEG₂₀₀₀ oberflächenfunktionalisiert (ED-Lip). Größe, Ladung, Freisetzungsprofil, Zytotoxizität und zelluläre Aufnahme der Formulierung wurden charakterisiert. Die ED-Lip-Charakterisierung zeigte einen leichten Anstieg der Größe und des Polydispersitätsindex (PDI) sowie eine Abnahme des Zeta-Potenzials, was auf eine effiziente Post-Insertion hindeutete. Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie belegten, dass ED-Lip die zelluläre Aufnahmerate in der C26-Zelllinie im Vergleich zu Caelyx® signifikant erhöhte. ED-Lip wies zudem eine stärkere zytotoxische Wirkung auf, was die Effizienz des Anti-EpCAM-Aptamers als Targeting-Ligand bestätigt. Pharmakokinetik und Gewebebiodistribution in Mäusen mit C26-Tumoren zeigten, dass ED-Lip das Verteilungsprofil von DOX im Vergleich zu Caelyx® nicht veränderte. Allerdings verbesserte ED-Lip die Tumorakkumulation von DOX signifikant und verlängerte das Überleben der Tiere. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Funktionalisierung von Caelyx® mit Anti-EpCAM-Aptamer vielversprechend für die Krebstherapie ist und weitere Untersuchungen verdient.

Einleitung

Nano-Drug-Delivery-Systeme (NDDS) mit einer Größe von 100–200 nm reichern sich passiv im Tumormikromilieu über den Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt an. Dies geschieht durch die undichte Endothelauskleidung und den schwachen lymphatischen Abfluss. Neuere Daten zeigen jedoch, dass weniger als 1 % des verabreichten Wirkstoffs den Tumorort erreicht [1]. Die Unfähigkeit, die dichte extrazelluläre Matrix (ECM) des Tumors zu durchdringen, die Rückdiffusion des freigesetzten Wirkstoffs in die Zirkulation und die Heterogenität der Tumoren sind dafür verantwortlich [2]. Verschiedene Strategien wurden genutzt, um die Tumorakkumulation von NDDS durch endogene und exogene Stimuli zu verbessern [3]. Diese Systeme können auf exogene Reize wie Licht reagieren und für Tumorimaging eingesetzt werden [4]. Anorganische Nanomaterialien zeigen ebenfalls antikarzinogene Eigenschaften [5, 6], doch ihre Toxizität und Umweltsicherheit erfordern besondere Aufmerksamkeit [7–11].

Aktives Targeting ist ein wichtiger Ansatz, um NDDS effizienter in Tumoren zu leiten und die Exposition nicht-zielgeweber zu minimieren [12, 13]. Ein ideales Targeting-Molekül bindet an Zelloberflächenproteine oder Rezeptoren, die in bestimmten Zellen oder Gewebekomponenten überexprimiert sind [14].

Das Epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein transmembranes Glykoprotein und gilt als Kandidat für aktives Targeting. EpCAM wird in gesunden Epithelzellen gering, in Krebszellen jedoch bis zu 1000-fach erhöht exprimiert [15–17]. Während der Karzinogenese verschiebt sich das Expressionsmuster von der basalen und basolateralen Membran normaler Epithelien zur apikalen Oberfläche tumoröser Epithelzellen [18]. Diese differentielle Expression macht EpCAM zu einem attraktiven Liganden für die Wirkstoffabgabe, der den therapeutischen Index verbessern kann [19].

EpCAM dient als Marker für Krebsstammzellen (CSC) oder tumorinitiierende Zellen (TIC), deren Expression mit schlechter Prognose korreliert [20]. CSCs/TICs besitzen Selbstverjüngungsfähigkeit und spielen Schlüsselrollen bei Tumorentwicklung und Metastasierung [21]. Die Überexpression von EpCAM wurde in CSCs verschiedener solider Tumoren nachgewiesen [22]. In jüngerer Zeit haben Aptamer als potenziell leistungsstarke Targeting-Liganden in NDDS an Bedeutung gewonnen [23, 24]. Aptamer sind DNA- oder RNA-basierte Oligonukleotidsequenzen mit sekundären und tertiären Strukturen, die Affinität zu Zelloberflächenrezeptoren aufweisen [23, 24]. Sie bieten Vorteile gegenüber Antikörpern: Sie sind nicht-immunogen, haben ein geringes Molekulargewicht (8–25 kDa), chemische und thermische Stabilität, und ihre Synthese sowie chemische Modifikation sind kostengünstig und skalierbar [25]. Die selektive Targeting von NDDS über Anti-EpCAM-spezifische Aptamer stellt eine effektive Option dar, Chemotherapeutika in das Tumormikromilieu zu liefern [19, 26]. Verschiedene Studien belegten, dass Anti-EpCAM-Aptamer-funktionalisierte Nanocarrier die Abgabe von Antikrebsmedikamenten an Tumorzellen effektiv verbessern [15, 27, 28].

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Anti-EpCAM-DNA-Aptamers (SYL3C)-PEGylierten Nanoliposoms, beladen mit Doxorubicin (DOX) (ED-Lip), als NDDS-Modell. Die Funktionalisierung erfolgte durch EDC/NHS-Kupplungschemie zwischen der Aminogruppe des Aptamers und der Carboxylgruppe von DSPE-mPEG₂₀₀₀, welches anschließend in das Liposom post-insertiert wurde (Abb. 1). ED-Lip wurde auf Größe, Zeta-Potenzial, DOX-Einkapselungseffizienz, Freisetzungsprofil und Zytotoxizität charakterisiert. Anschließend wurde geprüft, ob ED-Lip die zelluläre Aufnahme in vitro verbessert und DOX über Targeting in Mäusen mit C26-Kolonkarzinom in den Tumor transportiert.

Abbildung 1. Herstellung von Anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-Lip). a Kopplung des Anti-EpCAM-Aptamers an DSPE-mPEG₂₀₀₀ durch kovalente Bindung der primären Aminogruppen (-NH₂) des Aptamers an die Carboxylgruppe (-COOH) von DSPE-mPEG₂₀₀₀. b Post-Insertions-Methode zur Herstellung von Anti-EpCAM-funktionalisiertem Caelyx® (ED-Lip).

Ergebnisse und Diskussion

Caelyx®, ein PEGyliertes liposomales Doxorubicin, ist eines der am häufigsten verwendeten Chemotherapeutika und das erste von der FDA zugelassene Nanopartikelpräparat für Ovarialkarzinom, AIDS-assoziiertes Kaposi-Sarkom und Multiples Myelom. Caelyx® gelangt passiv über den EPR-Effekt in den Tumor [29]. Obwohl Caelyx® die Pharmakokinetik und Halbwertszeit von DOX signifikant verbessert, bestehen Hauptlimitierungen in unzureichender zellulärer Aufnahme und geringer Freisetzungsrate am Tumorort [29]. Hier wurde der SYL3C-Aptamer als Targeting-Ligand verwendet, um liposomales Doxorubicin (ED-Lip) zu funktionalisieren und das EpCAM-Molekül an der Oberfläche von Krebszellen anzusteuern, was die aktive zielgerichtete Abgabe von DOX ermöglicht.

Konjugation von DSPE-mPEG₂₀₀₀ an den Aptamer

In dieser Studie wurde EDC/NHS-Kupplungschemie für die Konjugation aminofunktionalisierter Anti-EpCAM-Aptamere an die aktivierte Carboxylgruppe von DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH eingesetzt. Der Vorteil dieser Reaktion liegt in der Stabilität der entstehenden Amidbindung und der Reduktion unspezifischer Interaktionen zwischen Aptameren [30]. Aptamere können mit primären Amin- oder Thiolgruppen modifiziert und kovalent an aktivierte Carboxyl- oder Maleimidgruppen gekoppelt werden [31]. Thiolfunktionalisierte Aptamere wurden an Maleimid-funktionalisiertes DSPE-PEG₂₀₀₀ konjugiert und anschließend in die Liposomstruktur post-insertiert, um die äußere Oberfläche zu dekorieren [32]. Eine wesentliche Einschränkung der Maleimid-Thiol-Chemie ist die Oxidation der Thiolgruppen während der Lagerung, was zur Disulfidbrückenbildung und damit zur Inaktivierung der Aptamere führt [30]. Die EDC/NHS-Reaktion erhöht daher die Ausbeute und verbessert die Post-Insertions-Methode.

Aptamere bieten gegenüber Antikörpern Vorteile wie einfache Synthese und Skalierbarkeit, geringe systemische Toxizität und fehlende Immunogenität [33]. Nach der Aptamer-Lipid-Konjugation wurde die Post-Insertions-Methode angewendet, um Anti-EpCAM-Aptamer-dekoriertes Caelyx® (ED-Lip) herzustellen. Die Post-Insertion ist eine einfache und effektive Methode zur Anbindung von Aptamern an Liposomen und ermöglicht eine höhere Inkorporationsrate [34].

Ein Gel-Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungsassay diente der Evaluation der Post-Insertion. Wie in Abb. 2 gezeigt, migrierten die negativ geladenen freien Aptamere im Gel und zeigten Bandsignale, während für ED-Lip kein entsprechendes Band sichtbar war, da die Liposomen im Well hingen blieben. Dies bestätigt die erfolgreiche Post-Insertion der Aptamer-konjugierten Mizellen in die Liposomenoberfläche.

Abbildung 2. Agarose-Gelelektrophorese der ED-Lip-Formulierung. Proben wurden auf Agarosegel aufgetragen und unter UV-Licht visualisiert. Die Wells für Leiter, freien Aptamer und PL-konjugierte Aptamere sind gekennzeichnet. Das Fehlen eines Bands beim Liposom-Aptamer-Komplex bestätigt die Post-Insertion.

Physikochemische Charakterisierung von ED-Lip

Die physikochemischen Eigenschaften von Caelyx® und ED-Lip sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Modifikation mit Anti-EpCAM-Aptamer hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße (p > 0,05). Die Größe von Caelyx® betrug ca. 96 nm (PDI 0,11), nach Post-Insertion (ED-Lip) stieg sie leicht auf 117 nm (PDI 0,14) an – eine für die Tumorabgabe wünschenswerte Größe. Frühere Studien zeigten ebenfalls, dass die Einbindung von Targeting-Liganden zu Größen- und PDI-Zunahmen führt [35, 36]. Das Zeta-Potenzial von ED-Lip (−19,25 mV) war negativer als das von Caelyx® (−12 mV). Die RNA-Aptamer-Konjugation führt bekanntermaßen zu einer Abnahme des Zeta-Potenzials [37]. Der Größenanstieg und das negativere Zeta-Potenzial belegen die erfolgreiche Post-Insertion [38]. Dies stimmt mit unserer Vorarbeit überein, die einen leichten Größenanstieg und negativeres Zeta-Potenzial bei aptamer-funktionalisiertem Caelyx® zeigte [38, 39]. Die Inkubationszeit und -temperatur sollten jedoch optimiert werden, um effizientere post-insertierte Liposomen mit besserer Größe und PDI zu erhalten. Die Einkapselungseffizienz betrug für beide Formulierungen 100 % (Tabelle 1).

Die Anzahl der post-insertierten Aptamere pro Liposom wurde wie beschrieben bestimmt [6]. Der Gesamtphospholipidgehalt lag bei 14 mM. Bei einer durchschnittlichen Lipidmolekülzahl von 8×10⁴ pro Liposom (Durchmesser ~100 nm) ergibt sich eine Liposomenkonzentration von ~10¹⁴ pro ml. Basierend auf Phosphatassay-Daten entsprechen die Molchenzahlen der Phosphatmoleküle denen der konjugierten Moleküle. Daraus resultieren ~10¹⁵ Aptamermoleküle pro ml Aliquot.

DOX-Freisetzungsprofil

Die Insertion aptamer-konjugierter Mizellen in die äußere Oberfläche von Caelyx® könnte das DOX-Freisetzungsprofil beeinflussen. Daher wurde die Freisetzung aus ED-Lip im Vergleich zu Caelyx® in 5 % Dextrose mit 50 % FBS über 24 h bei 37 °C untersucht. Dieses Medium ahmt das Plasmaprofil nach [40]. Abb. 3 zeigt keine signifikanten Unterschiede in der DOX-Freisetzung zwischen beiden Formulierungen; nur vernachlässigbare Mengen wurden freigesetzt. Dies entspricht unseren Vorarbeiten, die zeigten, dass die Aptamer-Insertion die Membranstabilität und das Freisetzungsprofil nicht beeinflusst [38, 39]. Hauptgrund ist die Stabilität der Caelyx®-Formulierung, die durch einen pH-Gradienten-getriebenen Remote-Loading-Prozess hergestellt wird [41].

Abbildung 3. Freisetzungsstudie. DOX-Leckageprofil aus Caelyx® und ED-Lip bei 37 °C in Gegenwart von 50 % FBS in Dextrose über 24 h. Daten als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) (n = 3).

Zellinteraktion und zelluläre Aufnahme per Fluoreszenzmikroskopie

Die Zellinteraktion und -aufnahme liposomaler Formulierungen wurde bei 4 °C und 37 °C untersucht (Abb. 4). Die Targeting-Effizienz von ED-Lip zeigte keine Unterschiede in den mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) von CHO-K1-Zellen (EpCAM-negativ) bei Caelyx®- und ED-Lip-Behandlung, weder bei 4 °C noch bei 37 °C (Abb. 4a, c). Im Gegensatz dazu wies ED-Lip eine signifikant höhere Aufnahme in C26-Zellen (EpCAM-positiv) auf, sowohl bei 4 °C als auch bei 37 °C (Abb. 4b, d), wobei der Unterschied bei 37 °C hochsignifikant war (p < 0,0001). ED-Lip zeigte im Vergleich zu Caelyx® eine signifikant erhöhte Aufnahme (p < 0,001). Dies belegt die gesteigerte Targeting-Spezifität von ED-Lip durch die höhere Affinität des Anti-EpCAM-Aptamers zu C26-Zellen. Freies DOX diffundiert frei durch die Lipiddoppelschicht und zeigt die höchste zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität. Die PEGylierung von Caelyx® limitiert die Endozytoserate und verringert die Zytotoxizität. Die Anwesenheit des Anti-EpCAM-Aptamers auf der Liposomenoberfläche (ED-Lip) erhöht die Internalisierungsrate und Zytotoxizität im Vergleich zu Caelyx® [38]. Fluoreszenzmikroskopiedaten zeigten, dass der Unterschied in der zellulären Aufnahme zwischen ED-Lip und freiem DOX in C26-Zellen bei 37 °C nicht signifikant war (Abb. 5). Eine Skalierung basierend auf der Intensität internalisierten DOX (Tabelle 2) ergab jedoch, dass sowohl ED-Lip als auch freies DOX statistisch signifikante Unterschiede zu Caelyx® in der C26-Aufnahme aufwiesen (p < 0,001). Obwohl C26-Zellen niedrige EpCAM-Level exprimieren [42], legt diese Studie nahe, dass Anti-EpCAM-Aptamer die Internalisierungsrate von Liposomen erhöhen können [43].

Abbildung 4. Zellinteraktion und -aufnahme liposomaler Formulierungen bei 4 °C und 37 °C. a CHO-K1-Zellinteraktion der Formulierungen bei 4 °C und 37 °C. b Interaktion der Formulierungen mit C26-Zellen bei 4 °C und 37 °C. c Mittlere MFI der Formulierungen auf CHO-K1- und C26-Zellen. Daten als Mittelwert ± SEM (n = 3). ****p < 0,0001.

Abbildung 5. Fluoreszenzmikroskopie. Zelluläre Internalisierung von DOX in C26-Zelllinien, visualisiert per Fluoreszenzmikroskopie. Zellen mit DAPI gefärbt. Sowohl freies DOX als auch ED-Lip zeigen höhere DOX-Internalisierung als Caelyx®. Vergrößerung ×200.

Zytotoxizitätsstudie

Die zytotoxischen Effekte von freiem DOX, Caelyx® und ED-Lip sind in Abb. 6 dargestellt. Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen für 1, 3 und 6 h inkubiert und anschließend 72 h weiterkultiviert. Alle Formulierungen zeigten zeit- und dosisabhängige Effekte. Die Vitalität von C26-Zellen unter ED-Lip-Behandlung nahm im Vergleich zu Caelyx®-behandelten Zellen ab. Da CHO-K1-Zellen (EpCAM-negativ) schwächer auf ED-Lip reagierten als C26-Zellen, deutet dies auf eine spezifische Abgabe von Caelyx® an Zielzellen durch den Anti-EpCAM-Aptamer hin. Dies bestätigt die spezifische zelluläre Aufnahme von ED-Lip durch C26-Zellen. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung gezielter Wirkstoffabgabe mit spezifischen Targeting-Agenten, um Nebenwirkungen durch Off-Target-Effekte zu reduzieren [44]. Wie zuvor berichtet, führt aktives Targeting von Caelyx® mit spezifischen Liganden (Aptamer, Antikörper) zu verbesserter Tumor-Targeting und spezifischer Wirkstoffabgabe, was die therapeutische Effizienz von DOX steigert [35, 39].

Abbildung 6. In vitro Zytotoxizität (IC₅₀) von ED-Lip, Caelyx® und freiem Doxorubicin gegen CHO- und C26-Zellen nach verschiedenen Expositionszeiten. Daten in µg/ml ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Biodistribution und Pharmakokinetik

Um den Einfluss des Anti-EpCAM-Aptamers auf die DOX-Biodistribution zu bewerten, wurden Mäusen mit subkutanen C26-Tumoren 10 mg/kg ED-Lip und Caelyx® intravenös injiziert. Die DOX-Plasmakonzentrationen zu 3, 12, 24, 48 und 72 h post-Injektion sind in Abb. 7 dargestellt. Beide Gruppen zeigten ähnliches Verhalten ohne signifikante Unterschiede. Wie in Tabelle 3 gezeigt, verringerte die Aptamer-Konjugation die Zirkulationshalbwertszeit leicht von 39,3 h auf 34,2 h und die mittlere Verweilzeit (MRT) von 47,6 h auf 42,9 h. Die pharmakokinetischen Parameter deuten darauf hin, dass die Aptamer-Konjugation t_½ und MRT leicht verkürzt, was mit Berichten übereinstimmt, die eine beschleunigte Clearance von ligand-konjugierten Nanopartikeln zeigen [38]. Proteinadsorption und nachfolgende Elimination durch das mononukleäre Phagozyten-System (MPS) könnten der Grund sein [45].

Abbildung 7. Plasmakonzentration von DOX. Konzentrations-Zeit-Verlauf von DOX im Blut zu 3, 12, 24, 48 und 72 h post-Injektion. Daten als Mittelwert ± SEM (n = 3).

Abb. 8 vergleicht die DOX-Konzentrationen in wichtigen Organen nach Caelyx®- und ED-Lip-Gabe. Die Hauptnebenwirkung von freiem DOX ist die Kardiotoxizität, die durch Caelyx® signifikant reduziert wird [46]. Die Biodistribution von ED-Lip in Leber, Lunge und Milz war zum 3-h-Zeitpunkt signifikant höher als bei Caelyx®. Die presence von undichten Blutgefäßen sowie der Größen- und PDI-Anstieg nach Post-Insertion könnten für die frühere Akkumulation in diesen Geweben verantwortlich sein. Es ist bekannt, dass eine Nanopartikelgrößenvergrößerung auf 150 nm die Akkumulation in Leber, Lunge und Milz erhöht [47]. Die Biodistributionsdaten zeigen eindeutig den EPR-Mechanismus bei der Nanopartikelakkumulation im Tumor. Beide Formulierungen reichern sich allmählich im Tumor an, erreichen ein Maximum bei ~12 h, bleiben bis 24 h auf Plateau und nehmen dann bis 48 und 72 h ab. Bemerkenswert ist, dass die ED-Lip-Akkumulation im Tumor zu allen Zeitpunkten (3, 12, 24, 48, 72 h) signifikant höher war als bei Caelyx®, was auf die Wirksamkeit des aktiven Targetings mit Anti-EpCAM-Aptamer hindeutet. Die Aptamer-Bindung beeinträchtigte die DOX-Verteilung in der Niere nicht. Anti-EpCAM-Aptamer fördern offenbar die tumorspezifische Penetration von Liposomen, was auch auf die Überexpression von EpCAM in tumorösen Gefäßendothelzellen zurückzuführen sein könnte [48]. Frühere Arbeiten zeigten, dass Anti-EpCAM-Aptamer die Tumorpenetration in Xenograft-Modellen verbessern [49]. CSCs/TICs sind ebenfalls Ziele der Anti-EpCAM-Therapie. Die Verabreichung von Anti-EpCAM-Aptamern als Targeting-Ligand zur EpCAM-Adressierung zeigte vielversprechende Effekte bei der CSC-Targeting [22, 50]. Ein Teil der effizienten Antitumorwirkung von ED-Lip könnte daher auf erfolgreiches CSC-Targeting zurückzuführen sein.

Abbildung 8. Gewebebiodistribution. DOX-Konzentrationen (µg/g) in Herz, Tumor, Leber, Lunge, Milz und Niere zu 3, 12, 24, 48 und 72 h post-Injektion. Daten als Mittelwert ± SEM (n = 3). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

In vivo Antitumor-Aktivität

Die therapeutische Wirksamkeit von ED-Lip wurde im C26-Kolonkarzinom-Modell evaluiert. Tumorgröße, Körpergewicht und Überleben wurden über ~2 Monate überwacht (Abb. 9, Tabelle 4). ED-Lip zeigte keinen offensichtlichen Einfluss auf das Körpergewicht der Mäuse (Abb. 9a). Nach i.v. Injektion von Caelyx® und ED-Lip wurde das Tumorwachstum bis Tag 30 post-Injektion effizient inhibiert, ohne signifikanten Unterschied zwischen den Liposomengruppen (Abb. 9b). Nach Tag 30 beschleunigte sich das Wachstum, blieb aber in den Behandlungsgruppen langsamer als in der PBS-Kontrolle. Der Unterschied zwischen Caelyx®- und ED-Lip-Gruppe war während der ersten 30 Tage nicht signifikant. Die Überlebensdaten (Kaplan-Meier-Plot, Abb. 9c) zeigen, dass ED-Lip die Überlebenskurve im Vergleich zu PBS oder Caelyx® verbessert. Die Hauptindikatoren sind in Tabelle 4 zusammengefasst. In der ED-Lip-Gruppe heilten die Tumoren bei drei Mäusen vollständig ab, weshalb die mittlere Überlebenszeit (MST) für diese Gruppe undefiniert ist. Die Behandlung mit ED-Lip erhöhte die Zeit bis zum Endpunkt (TTE) von 41,1 auf 49,7 Tage und zeigte eine effektive Antitumoraktivität mit 90,27 % Tumorwachstumsverzögerung (TGD) und undefinierter MST durch komplette Tumorremission bei drei Mäusen (Tabelle 4).

Abbildung 9. In vivo therapeutische Wirksamkeit in weiblichen BALB/c-Mäusen mit C26-Kolonkarzinom. Einmalige i.v. Injektion von 10 mg/kg. a Körpergewichtsverlauf. b Tumorgrößenverlauf. c Überlebenskurve (Kaplan-Meier). Daten als Mittelwert ± SD (n = 5).

Die Tumordaten zeigen, dass ED-Lip das Tumorwachstum dramatisch inhibiert. Die Überlebensanalyse belegt, dass ED-Lip MST und TTE erhöht. Die ED-Lip-Gruppe wies höhere TGD% auf und war effektiver als Caelyx®. Diese Ergebnisse korrelieren mit der hohen DOX-Konzentration im Tumorgewebe der ED-Lip-behandelten Gruppe. Daher verbessern aptamer-konjugierte liposomale DOX-Formulierungen die Penetration und Akkumulation im Tumor, was die Effizienz von Caelyx® steigert und zu höheren TGD% in den Überlebensdaten führt. Zusammenfassend zeigen diese Befunde, dass Anti-EpCAM-Aptamer als wichtige Targeting-Agenten für die Wirkstoffabgabe dienen können.

Schlussfolgerung

Hier wurde Caelyx® mit Anti-EpCAM (SYL3C) Aptamer über Post-Insertion oberflächenfunktionalisiert (ED-Lip). Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie zeigten hohe DOX-Aufnahme in C26-Zellen, was belegt, dass der Aptamer die Internalisierungsrate von ED-Lip erhöht. Pharmakokinetische Daten wiesen darauf hin, dass die Post-Insertion von DSPE-mPEG-EpCAM die Pharmakokinetik von DOX im Vergleich zu Caelyx® nicht veränderte. Die Gewebebiodistribution zeigte jedoch eine signifikant höhere Tumorakkumulation von ED-Lip sogar noch nach 72 h post-Injektion. ED-Lip verbesserte die therapeutischen Effekte in Mäusen mit C26-Tumoren. Die verbesserten Überlebensparameter bei ED-Lip-behandelten Mäusen deuten darauf hin, dass das EpCAM-targetierte DOX-Liposom ein vielversprechender Drug-Delivery-Carrier für die Krebstherapie ist und weitere Untersuchungen verdient.

Materialien und Methoden

Materialien

Der 5'-Amin-Anti-EpCAM-DNA-Aptamer (Sequenz: 5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3') (SYL3C) wurde von BIONEER (Daejeon, Südkorea) bezogen. DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOH stammte von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Dowex®, EDC, NHS, Penicillin/Streptomycin und Fluoroshield™ mit DAPI wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Kommerzielles Caelyx® wurde von Behestan Darou Company (Teheran, Iran) erworben.

Konjugation von DSPE-mPEG₂₀₀₀ an den Aptamer

Der Anti-EpCAM-Aptamer wurde über kovalente Bindung der primären Aminogruppen (-NH₂) an die Carboxylgruppe (–COOH) von DSPE-mPEG₂₀₀₀ gekoppelt (Abb. 1). Die Konjugation erfolgte via EDC/NHS-Chemie [51]. Kurz: DSPE-mPEG₂₀₀₀ wurde in MES-Puffer (pH 6,5) dispersiert, 400 mM EDC und 100 mM NHS wurden zugegeben und 15 min gerührt zur Aktivierung der Carboxylgruppen. Anschließend wurde der Anti-EpCAM-Aptamer zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Das molare Verhältnis Lipid:Aptamer betrug 1:1, EDC/NHS zu Lipid 10-fach.

Modifikation von Caelyx® mit DSPE-mPEG-Anti-EpCAM-Aptamer

ED-Lip wurde durch Post-Insertion synthetisiert. DSPE-mPEG-Anti-EpCAM-Aptamer-Mizellen wurden zu 1 ml Caelyx® für 30 min bei 60 °C gegeben. Die Mengen wurden gemäß Bartlett-Phosphatassay [52] bestimmt. Basierend auf ~10¹⁴ Liposomen pro ml Caelyx® wurde das Volumen so angepasst, dass ~10 Aptamere pro Liposom vorlagen [36]. Agarose-Gelelektrophorese bestätigte die Post-Insertion [39].

Physikochemische Charakterisierung

Partikelgröße, PDI und Oberflächenladung wurden per Dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK) bestimmt. Zur Entfernung von freiem DOX wurden Liposomen mit Dowex®-Harz 60 min rotiert und über Poly-Prep-Säulen (Bio-Rad) von Dowex® befreit [53]. Die DOX-Menge in den liposomalen Formulierungen wurde per Fluoreszenzspektrophotometrie (LS-45, Perkin-Elmer, UK) bei Ex/Em 485:590 nm gemessen.

Freisetzungsstudie

Zur Evaluation der DOX-Freisetzung wurde 1 ml Formulierung zu 9 ml Dextrose (50 % FBS) gegeben. Zu definierten Zeitpunkten (0, 1, 2, 4, 6, 12, 24 h) wurden Proben entnommen. Nach Entfernung von freiem DOX mit Dowex®-Harz wurde der verbleibende DOX-Gehalt per Fluoreszenzspektrophotometrie bestimmt und der Freisetzungsprozentsatz berechnet [39].

Zellkultur

C26-Kolonkarzinom- und CHO-K1-Zelllinien (Pasteur-Institut Iran) wurden in RPMI1640 mit 10 % FBS (Gibco), 100 IE/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C, 5 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert.

Zellinteraktion und zelluläre Aufnahme-Assay

Zellinteraktion und -aufnahme wurden bei 4 °C und 37 °C evaluiert. CHO-K1- und C26-Zellen wurden in 12-Well-Platten (2,5×10⁵ Zellen/Well) ausgesät. Nach Übernachtinkubation wurden Behandlungen zugegeben und Platten für 3 h bei 4 °C bzw. 37 °C inkubiert. Zellen wurden mit PBS gewaschen, trypsinisiert und die DOX-Fluoreszenz per Durchflusszytometrie (BD FACSCalibur) gemessen. Datenanalyse erfolgte mit FlowJo v7.0.

Fluoreszenzmikroskopische Evaluation

1×10⁶ C26-Zellen/Well wurden in 6-Well-Platten mit Deckgläsern ausgesät. Nach Übernachtinkubation (37 °C, 5 % CO₂) wurden Zellen mit freiem DOX, Caelyx® und ED-Lip für 24 h behandelt. Nach PBS-Waschung und Fixierung (4 % Formaldehyd) wurden Deckgläser mit Fluoroshield™/DAPI gefärbt und auf Objektträger montiert. Behandlungen erfolgten in Triplikaten. Pro Objektträger wurden sechs Zonen bei ×200 Vergrößerung analysiert. Die intrinsische DOX-Fluoreszenz diente zur Evaluierung der zellulären Aufnahme. Skalierung basierte auf dem Prozentsatz der Zellen mit DOX-Aufnahme pro mikroskopischem Feld: 1: 0–20 %, 2: 20–40 %, 3: 40–60 %, 4: 60–80 %, 5: 80–100 %.

Zytotoxizitätsbewertung

IC₅₀-Werte von freiem DOX, Caelyx® und ED-Lip wurden per MTT-Assay bestimmt. CHO-K1- und C26-Zellen (5×10³ Zellen/Well, 96-Well-Platten) wurden über Nacht inkubiert. Liposomale Formulierungen und freies DOX wurden seriell in FBS-freiem Medium verdünnt, zugegeben und 1, 3, 6 h bei 37 °C inkubiert. Nach Waschung weitere 72 h Inkubation. Optische Dichten (OD) wurden bei 570 nm (Referenz 630 nm) auf Stat-Fax 2100 Microplate Reader (Awareness Technology Inc., USA) gemessen. IC₅₀-Werte wurden berechnet.

Tierstudie

Weibliche BALB/c-Mäuse (4–6 Wochen, 18–20 g) wurden bei 22 ± 2 °C, Standardfutter und Wasser ad libitum gehalten. Narkose: i.p. Ketamin/Xylazin (100/10 mg/kg) [55]. 3×10⁵ C26-Zellen in 60 µl PBS wurden subkutan in die rechte Flanke injiziert. Zwei Wochen post-Inokulation (Tumorgröße ~5 mm³) wurden Mäuse randomisiert in 3 Gruppen (n = 3 für Biodistribution, n = 5 für Antitumorstudie). Alle Protokolle wurden vom Ethikkomitee der Mashhad University of Medical Sciences genehmigt und gemäß internationalen Tierschutzrichtlinien durchgeführt.

Biodistributions- und Pharmakokinetikstudien

14 Tage post-Inokulation erhielten Mäuse 10 mg/kg Caelyx® und ED-Lip i.v. über den Schwanzvene. Kontrollgruppe erhielt 200 µl PBS. Zu den Zeitpunkten 3, 12, 24, 48, 72 h wurden Tiere euthanasiert, Blut- und Gewebeproben (Leber, Milz, Niere, Lunge, Herz, Tumor) entnommen. DOX-Konzentrationen wurden per Fluoreszenzspektrophotometrie (LS-45, Perkin-Elmer) bestimmt. Nicht-kompartimentale Analyse der pharmakokinetischen Parameter (AUC, AUMC, t_1/2, V_d, C_max, T_max, MRT, Cl) aus Blutkonzentrations-Zeit-Profilen.

In vivo Antitumor-Aktivität

10 Tage post-Inokulation erhielten Mäuse mit tastbaren Tumoren einmalig 10 mg/kg Caelyx® und ED-Lip i.v. PBS als Negativkontrolle. Parameter: Time to Endpoint (TTE), Tumor Growth Delay (TGD%), Median Survival Time (MST), Überleben. Während der Studie wurden Gesundheit, Körpergewicht und Tumorvolumen (digitaler Messschieber, Volumen = Höhe × Länge × Breite × 0,52) überwacht. Ethische Endpunkte: Tumor > 1000 mm³, > 20 % Gewichtsverlust oder Schwächezeichen.

Statistische Analyse

Datenanalyse mit GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Daten als Mittelwert ± SEM von mindestens drei unabhängigen Experimenten. t-Test für Freisetzungsstudie, Durchflusszytometrie, Biodistribution. ANOVA für Fluoreszenzmikroskopie und Tumorvolumen. Kaplan-Meier-Methode für Überlebensparameter (TTE, MST, TGD%). P < 0,05 als signifikant angesehen.