Einfache Eintopf-Synthese von Polydopamin-Kohlenstoffpunkten für die photothermische Therapie

Hintergrund

Als Mitglied von niedrigdimensionalen Kohlenstoffmaterialien ist das riesige gemischte SP ² und SP ³ Atome sowie π-Elektronen in Kohlenstoffpunkten (CDs) erhöhen signifikant Defekte und Heteroatome der photoaktiven Systeme, wodurch die absorbierte Lichtenergie in Wärme umgewandelt oder stimulierte Photonen freigesetzt werden. Die CDs werden aufgrund ihrer abstimmbaren Fluoreszenz, ihrer photothermischen Umwandlungseigenschaft und ihrer ausgezeichneten Biokompatibilität in der Biobildgebung, photothermischen Therapie (PTT) und Biosensoren weit verbreitet eingesetzt. Die zuvor beschriebenen arzneimittelbeladenen magnetofluoreszierenden Kohlenstoffquantenpunkte (MCQDs), die durch hydrothermale Behandlung und Vernetzungsreaktion synthetisiert wurden, haben die Kombination von PTT und photodynamischer Therapie (PDT) durch die Herstellung einer effizienten Chemo-Photo-Krebstherapieplattform realisiert [1]. Bisher wurden umfangreiche Methoden erforscht, um die Fluoreszenzintensität von CDs zu erhöhen, seit ihrer ersten Entdeckung bei der Reinigung von lichtbogenentladenen einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (SWCNTs) im Jahr 2004 [2], trotz der synthetisierten Wege, um ein gewisses Maß an Oxidation zu erreichen allgemein kompliziert sein. Top-down- und Bottom-up-Behandlung sind zwei gängige Wege zur Synthese der CDs, einschließlich Laserablation [3, 4], oxidative Säurebehandlung [5, 6], hydrothermale Behandlung [7, 8], Mikrowellen-unterstützte Pyrolyse [9, 10,11], elektrochemische Oxidation [12, 13], Ultraschallbestrahlung [14] und Plasmabehandlung [15].

Untersuchungen zeigen, dass die Dotierung von N-Atomen für die Fluoreszenzverstärkung der CDs von großer Bedeutung ist [16,17,18]. Liuet al. verwendete Polyethylenimin (PEI), das die N-Atome lieferte, um PEI-funktionalisierte CDs durch einstufige mikrowellenunterstützte (700 W) Pyrolyse von Glycerin und verzweigtem PEI herzustellen; Die Quantenausbeute (QY) des Systems wurde bis zu 15,3% gemessen und wurde für die Zellbildgebung und den Gentransport verwendet [19]. Zhouet al. berichteten über die Entwicklung von mit Phosphor und Stickstoff kodotierten Kohlenstoffpunkten (N-P-dotierte CDs) für die Biobildgebung über die hydrothermale Behandlung von Nukleotid-Adenosin-5′-triphosphat (ATP) bei 180 °C für 10 h. Typischerweise war ATP die einzige Materialquelle für die Dotierung von N- und P-Atomen, um Defekte auf der Oberfläche des Systems zu verstärken, was zu einer Erhöhung der QY der N-P-dotierten CDs führte (berechnet mit 9,8 %) [20]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass phenolische Verbindungen als katalytische Keime für das Wachstum von Kohlenstoffpunkten dienen könnten. Leeet al. fanden heraus, dass die Kohlenstoffpunkte durch Zugabe einer Spur von Ferulasäure dramatisch erhöht wurden [21].

Polydopamin (PDA) ist eine Art melaninähnliches Polymer, das aus der Polymerisation von Dopamin (DA)-Monomer gewonnen wird und seit seiner ersten Untersuchung als adhäsives Oberflächenmodifizierungsmittel weit verbreitet zur Oberflächenmodifizierung verschiedener Materialien verwendet wurde [22]. Wie wir alle wissen, machen große Mengen an N-reichen und phenolischen Hydroxyl-funktionellen Gruppen wie Katecholamin in PDA es zu einem potenziell ausgezeichneten Passivierungsmittel und Katalysator für die CDs.

Davon inspiriert berichten wir über einen einfachen, effizienten Eintopf-Mikrowellen-unterstützten Pyrolyseweg für die Synthese von PDA-funktionalisierten CDs über 5 Minuten. Dynamische Lichtstreuung (DLS), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Ultraviolett- und sichtbare Spektroskopie (UV-Vis) und Fluoreszenzspektroskopie wurden verwendet, um die Komponenten von Polydopamin-Kohlenstoffpunkten (CD- PDA) und seine abstimmbare Photolumineszenz (PL). Die relativen Zelllebensfähigkeiten von HeLa-Zellen, die mit CD-PDA mit und ohne NIR-Bestrahlung behandelt wurden, wurden durch den Standard-3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay gemessen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von CD-PDA

In dieser Forschung synthetisierten wir die Polydopamin (PDA)-funktionalisierten Kohlenstoffpunkte (CD-PDA) über eine Eintopf-Mikrowellen-unterstützte Pyrolyse von Glycerin und PDA. Die Kohlenstoffpunkte (CDs), die über den gleichen mikrowellenunterstützten Pyrolyseansatz ohne Zugabe von PDA hergestellt wurden, wurden als Kontrollgruppe eingesetzt. Eine schematische Darstellung des Syntheseprozesses von CD-PDA wurde konzeptionell in Schema 1 beschrieben. Die Ausbeute von CD-PDA war fast 1,5-mal höher als die der CDs, aufgrund der Verbesserung der Keimbildungsstelle für die Kohlenstoffpunktbildung mit der phenolischen Gruppe, die von bereitgestellt wurde PDA [21].

Schematische Darstellung des Syntheseprozesses von CD-PDA

Profile der dynamischen Lichtstreuung (DLS) zeigten die Partikelgröße und das Zeta-Potenzial von CD-PDA. Die hydrodynamische Partikelgröße von CD-PDA betrug 51,5 ± 19,5 nm (Einschub in Abb. 1a) und das Zetapotential wurde mit − 27,5 ± 0,4 mV bestimmt, was auf negativ geladene Gruppen auf der Oberfläche der Nanopunkte hinweist, was die Oberfläche weiter demonstriert Modifikation durch PDA. Die hydrodynamische Partikelgröße von in DI-Wasser dispergierten CDs betrug 5,5 ± 2,5 nm (Einschub von Abb. 1b). Transmissionselektronenmikroskopie(TEM)-Bilder charakterisierten die monodispersen sphärischen und einheitlich größenverteilten Nanopartikel (Abb. 1a, b); der Durchmesser von CD-PDA betrug ~ 25 nm (Abb. 1c) und der von CDs (Abb. 1d) wurde bei ~ 5 nm gemessen. Nach der Oberflächenmodifizierung durch PDA betrug das Wachstum des Durchmessers von CD-PDA etwa 20 nm im Vergleich zu dem von CDs.

Morphologie, FT-IR-Spektren und UV-Vis-Spektren von CD-PDA und CDs. a TEM-Bild von CD-PDA (Maßstabsbalken 100 nm, Einschub:Größenverteilung bestimmt durch DLS). b TEM-Bild von CDs (Maßstab 100 nm, Einschub:Größenverteilung bestimmt durch DLS). c Vergrößertes Bild eines einzelnen CD-PDA (Maßstabsbalken 50 nm). d Vergrößertes Bild einer einzelnen CD (Maßstab 20 nm). e FT-IR-Spektren von CD-PDA, CDs und PDA. f UV-Vis-Spektren von CD-PDA, CDs und PDA (Einschub:die Absorption von 600 bis 900 nm)

Die Passivierung von PDA auf den Kohlenstoffpunkten wurde durch FT-IR-Spektren aufgezeichnet. Hier wurde PDA über die Polymerisation von 20 mg DA-Hydrochlorid in 10 ml Tris-Puffer (pH 8,5, 10 mM) bei Raumtemperatur für 12 h synthetisiert und anschließend bei 23.294 rcf zentrifugiert. Als Spektrumsinformation der charakteristischen Peaks von CD-PDA, CDs und PDA, die in Fig. 1e beobachtet wurden, ist der Peak von 3400 cm ⁻¹ und 1600 cm ⁻¹ schlugen die Catechol-OH-Gruppen und aromatische Ringe von PDA vor, die auch in CD-PDA vorkamen [23, 24]. Neue Peaks bei 1642 cm ⁻¹ , 1588 cm ⁻¹ , und 1640 cm ⁻¹ bezogen auf C=O, N–H und C–N, während der Peak bei 3400 cm ⁻¹ deuteten auf die Existenz von –OH und N–H im System hin, was die Oberflächenmodifikation von PDA auf den CDs weiter veranschaulichte. Die während der mikrowellenunterstützten Oxidation in den Kohlenstoffpunkten entstehenden N–H, C=O und C–N demonstrierten die Mechanismen der Oberflächenpassivierung für die Nanopunkte:Während der 5-minütigen mikrowellenunterstützten Oxidation wurden Dopamin und die Dehydratisierung des Systems, um den Kern der Nanopunkte zu bilden, woraufhin die Kohlenstoffpunkte wuchsen.

Die UV-Vis-Absorptionsspektren von CD-PDA, CDs und PDA mit derselben Konzentration sind in Abb. 1f dargestellt (Konzentration des Probeneinschubs Abb. 1f, 12,5 μg/ml). Als Oberflächenpassivierungsmittel des Systems zeigte PDA eine Breitbandabsorption von 200 bis 900 nm, insbesondere im nahen Infrarotbereich, was für die ausgezeichnete photothermische Umwandlungseigenschaft von CD-PDA wesentlich war. Die Absorption bei 220 nm und 280 nm repräsentierte den Elektronenübergang zwischen der starken π-Stapelung des Phenylrings als konjugiertes System, was die Modifikation von PDA bestätigt. Insbesondere die offensichtliche Verringerung der Absorption bei 280 nm deutete auf die räumliche Barriere zwischen den starken π-Stapelwechselwirkungen im konjugierten System nach der Passivierung von PDA hin [25], während die UV-Vis-Absorptionsspektren von CD-PDA die charakteristischen Peaks um . zeigen 274 nm und 370 nm, und die von CDs wurde bei 260 nm und 330 nm gemessen. Die bathochrome Verschiebung von 330 auf 370 nm wurde für die Einführung von Amidogen aus dem PDA erklärt, die auch für die Chelatisierung von Glycerin und PDA charakterisiert wurde [26, 27]. Der Einschub ist die Extinktion von CD-PDA, CDs und PDA von der Wellenlänge 600 bis 900 nm.

Photolumineszenz von CD-PDA

Wie bereits berichtet, kann die Oberflächenmodifikation der Kohlenstoffpunkte den Photonenumwandlungsprozess stark beeinflussen, was zu einer enormen Diversität in den Fluoreszenzspektren führt [28, 29]. In unserer Forschung wurde der Emissionspeak von CD-PDA von 450 auf 500 nm rotverschoben, wobei sich die Anregungswellenlänge von 350 auf 420 nm änderte (Abb. 2a). Dementsprechend haben wir rote, blaue und grüne Fluoreszenzmikroskopiebilder beobachtet, indem wir Tropfen auf einen Glasobjektträger getaucht haben, was die enorme Vielfalt der Fluoreszenz für CD-PDA weiter verdeutlicht (Einschub von Abb. 2a). Darüber hinaus haben wir die makroskopischen Bilder von CD-PDA, CDs und DI-Wasser unter UV-Licht (365 nm) nachgewiesen, was bestätigt, dass die Fluoreszenzintensität von CD-PDA viel stärker war als die von CDs (Abb. 2b). Figur 2c veranschaulicht weiter die Verbesserung der Fluoreszenzintensität nach der Oberflächenmodifizierung von PDA; die Quantenausbeute (QY) von CD-PDA war fast dreimal so hoch wie die der CDs (Chininsulfat wurde als Standardprobe gewählt [19]), was den Effekt der Dotierung von N-Atomen aus PDA bestätigt. Wir testeten die Stabilität der Fluoreszenzintensität von CD-PDA; es zeigte keine klare Änderung unter der Bestrahlung von 2100 s (365 nm) und zeigte daher eine stabile Photolumineszenzeigenschaft (Abb. 2d).

Optische Eigenschaften von CD-PDA und CDs. a Photolumineszenzspektren von CD-PDA (Anregungswellenlängen reichen von 350 bis 420 nm in 10 Schritten, Einschub:Fluoreszenzmikroskopiebilder von CD-PDA). b Von links nach rechts:CDs, CD-PDA und DI-Wasser unter UV-Bestrahlung (365 nm). c Photolumineszenzspektren von CD-PDA, CDs und DI-Wasser. d Stabilitätskurve der Fluoreszenzintensität von CD-PDA

Um den Einfluss von PDA auf die Erhöhung der Fluoreszenzintensität von CD-PDA weiter zu untersuchen, haben wir zunächst die Fluoreszenzintensität gegen die Dauer der Polymerisation von Dopamin in Tris-Puffer gemessen. Der Photolumineszenzgradient in Abb. 3a veranschaulichte, dass CD-PDA mit Dopamin in Tris-Puffer 2 h lang polymerisierte, die höchste Fluoreszenzintensität aufwies, was auf den Einfluss des Ausmaßes der Dopamin-Präpolymerisation hinweist. Wir haben die Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit verschiedenen ursprünglichen PDA-Konzentrationen in Tris-Puffer (3, 5, 7 und 9 mg/ml) weiter untersucht. Da die ursprünglichen DA-Konzentrationen zwischen 3 und 9 mg/ml schwanken, zeigte die Fluoreszenz von CD-PDA die Tendenz, zuerst zuzunehmen und dann zu sinken (Abb. 3b).

Photolumineszenzspektren von CD-PDA. a Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit unterschiedlicher Dauer der Dopamin-Polymerisation in Tris-Puffer. b Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit verschiedenen ursprünglichen Dopaminkonzentrationen. c Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit unterschiedlichem pH-Wert vor der mikrowellenunterstützten Pyrolyse. d Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit unterschiedlichem pH-Wert nach der mikrowellenunterstützten Pyrolyse

Darüber hinaus haben wir die Fluoreszenzintensität von CD-PDA mit verschiedenen anfänglichen pH-Werten untersucht; die Fluoreszenzintensität nahm mit steigendem pH-Wert des Tris-Puffers von 5 auf 11 ab (Abb. 3c). Abbildung 3d zeigt den Einfluss des pH-Werts nach der mikrowellenunterstützten Oxidation. Der pH-Wert des Systems nach Mikrowellen-unterstützter Oxidation wurde von 5 bis 11 vermittelt, und wir verglichen die Fluoreszenzintensität von CD-PDA; saures Medium (pH 5.0) führten zu einer stärkeren Fluoreszenz, was auch auf eine stärkere Fluoreszenz von CD-PDA in der sauren Tumormikroumgebung hindeutete.

Photothermische Leistung und Zytotoxizität von CD-PDA

Messung der photothermischen Wirksamkeit

Um die Analyse der photothermischen Umwandlungseffizienz von CD-PDA und CDs abzugrenzen, haben wir das Temperaturinkrement gegen die Zeit unter Bestrahlung quantitativ ausgewertet; Als zusätzliche Kontrollgruppe wurde PDA ausgewählt. Unter 10 Minuten Bestrahlung (808 nm, 2 W/cm ² ), betrug der Temperaturanstieg von CD-PDA 27 °C, während der von PDA etwa 30 °C bei 200 μg/ml betrug. Währenddessen betrug der Temperaturanstieg von CDs (200 μg/ml) unter Bestrahlung während der 10 Minuten etwa 7,5 °C und der von DI-Wasser nicht mehr als 5 °C (Abb. 4a). Darüber hinaus haben wir die Temperaturerhöhung des CD-PDA bei verschiedenen Konzentrationen als Funktion der Zeit bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm ² . gemessen NIR-Laserbestrahlung während 10 Minuten. Insgesamt nahm die Temperaturerhöhung mit der Konzentration von CD-PDA zu, und die Temperatur stieg schneller, wenn die Konzentration von CD-PDA von 25 auf 200 μg/ml anstieg (Abb. 4b). Daraufhin zeichnen wir die Kurve des Temperaturinkrements gegen verschiedene Konzentrationen von CD-PDA, unter denen das Temperaturinkrement von CD-PDA bei 200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml und 25 μg/ml ungefähr betrug 27 °C, 18 °C, 13 °C bzw. 10 °C (Abb. 4d). Um den Einfluss auf die photothermische Umwandlungseffizienz von CD-PDA gegenüber verschiedenen anfänglichen Konzentrationen von DA in Tris-Puffer zu untersuchen, haben wir typischerweise die Temperaturänderung von CD-PDA (200 μg/ml) mit verschiedenen ursprünglichen Konzentrationen von DA in Tris . gemessen Puffer (Abb. 4c). Die Temperatur stieg, wenn sich die DA-Konzentration von 3 auf 9 mg/ml verbesserte. Der Temperaturanstieg betrug 27 °C, wenn die ursprüngliche DA-Konzentration 9 mg/ml betrug, während der Temperaturanstieg nur 10 °C betrug, wenn die ursprüngliche DA-Konzentration 3 mg/ml betrug. Die natürliche Abkühlungskurve von CD-PDA ist in Abb. 4e dargestellt (200 μg/ml, 808 nm, 2 W/cm ² , 20 min) und die magereren Daten von − lnθ, die aus der Kühlperiode berechnet wurden, sind in Abb. 4f zu sehen. Die photothermische Umwandlungseffizienz von CD-PDA wurde mit 35% gemessen, höher als die der zuvor berichteten Au-Nanostäbchen (Literaturwert, 22% [30]).

Photothermische Umwandlungseigenschaften von CD-PDA und CDs. a Photothermische Heizkurven von CD-PDA, CDs, PDA und DI-Wasser bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm ² NIR-Laserbestrahlung für 10 Minuten. b Photothermische Erwärmungskurven von CD-PDA bei verschiedenen Konzentrationen während 10 Minuten. c Photothermische Heizkurven von CD-PDA (200 μg/ml) mit verschiedenen ursprünglichen DA-Konzentrationen in Tris-Puffer. d Temperaturerhöhung von CD-PDA bei verschiedenen Konzentrationen. e Abkühlkurve von CD-PDA (bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm ² NIR-Bestrahlung in den ersten 10 Minuten und natürliches Abkühlen auf Raumtemperatur). f Magerere Zeitdaten gegenüber − lnθ, berechnet gemäß der Abkühlkurve von CD-PDA

In-vitro-Zelllebensfähigkeit

Die Zytotoxizitäten von CD-PDA, CDs und PDA wurden durch einen Standard-MTT-Assay analysiert. Um die Unterschiede der Zelllebensfähigkeit zwischen CD-PDA, CDs und PDA zu bewerten, wurden HeLa-Zellen mit diesen Nanopartikeln in der gleichen Konzentration in jeder Gruppe inkubiert. Die MTT-Ergebnisse (Abb. 5a) zeigten, dass die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen eine dosisabhängige Beziehung zu CD-PDA, CDs und PDA aufwies. Es wurde berichtet, dass die chinonreiche PDA-modifizierte Oberfläche bei der Aktivität der Zellproliferation energisch war [31]. Bemerkenswert in unserer Studie ist, dass CD-PDA selbst bei einer Konzentration von 50 μg/ml aufgrund der Oberflächenmodifikation durch PDA offensichtlich die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen fördern konnte und die Zelllebensfähigkeit bei 100 μg/ml nicht dramatisch gehemmt wurde, die im Wesentlichen die gleiche Tendenz mit den Ergebnissen der PDA teilten, während die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen, die mit den CDs inkubiert wurden, auf 80 % bzw. 70 % bei 100 μg/ml bzw. 200 μg/ml reduziert wurde.

In-vitro-Zytotoxizität gegen HeLa-Zellen. a In-vitro-Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen, die 24 h lang mit CD-PDA, CDs und PDA in verschiedenen Konzentrationen inkubiert wurden. b In-vitro-Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen, inkubiert mit CD-PDA, CDs und PDA in verschiedenen Konzentrationen unter Bestrahlung (808 nm, 2 W/cm ² , 5 Minuten; Mittelwert ± SD, n = 6). *p < 0,05, **p < 0.01, ***p <0,001

Der Standard-MTT-Assay wurde weiter an HeLa-Zellen bewertet, um die photothermische Abtötungseffizienz von CD-PDA, CDs und PDA zu bestimmen, HeLa-Zellen wurden mit diesen Nanopartikeln bei der gleichen Konzentration in jeder Gruppe inkubiert. Unter Bestrahlung (808 nm, 2 W/cm ² , 5 min), zeigte der MTT-Assay (Abb. 5b), dass die photothermische Abtötungswirkung von CD-PDA, CDs und PDA in Abhängigkeit von ihrer Konzentration verstärkt wurde. Insgesamt reduzierte sich die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen, die mit CD-PDA inkubiert wurden, bei 200 μg/ml auf 30 %, was die photothermische Abtötungseffizienz des Systems manifestiert. In der Zwischenzeit ist bemerkenswert, dass der Unterschied in der Zelllebensfähigkeit zwischen CD-PDA und PDA mit zunehmender Konzentration von 25 auf 200 μg/ml dank des offensichtlichen Temperaturanstiegs von CD-PDA unter NIR-Bestrahlung und der Verbesserung seiner Konzentration progressiv abnahm (Abb. 4b, 4d). Darüber hinaus betrug die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen, die mit CDs unter NIR-Bestrahlung inkubiert wurden, 68 % bei 200 μg/ml, was aufgrund der schwachen Lichtabsorption im Nahinfrarotbereich keine signifikante Abweichung im Vergleich zu derjenigen bei der gleichen Konzentration ohne NIR-Laser darstellte (Abb. 1e).

Schlussfolgerungen

In dieser Arbeit berichten wir über die Synthese von fluoreszierenden Polydopamin (PDA)-passivierten Kohlenstoffpunkten (CD-PDA) durch mikrowellenunterstützte Eintopf-Pyrolyse innerhalb von 5 Minuten, was den Reaktionsprozess drastisch vereinfacht und seine Fluoreszenzintensität durch die Dotierung von . fördert N-Atome aus PDA und verbessert seine Ausbeute aufgrund der Verbesserung der Keimbildungsstelle für die Kohlenstoffpunktbildung mit der phenolischen Gruppe, die von PDA bereitgestellt wird. Nach der Passivierung von PDA betrug die Ausbeute an CD-PDA fast das 1,5-fache der CDs; Die Quantenausbeute von CD-PDA betrug ~~5%, das Dreifache der ursprünglichen CDs. Die photothermische Umwandlungseffizienz des Systems wurde mit 35% gemessen, höher als die von Au-Nanostäbchen, über die zuvor berichtet wurde (22%). Während des In-vitro-Tests zeigte der CD-PDA eine ausgezeichnete Biokompatibilität und die Leistung von PTT; es könnte sogar die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen mit einer Konzentration von 50 μg/ml fördern. Während der Bestrahlung verringerte sich die Zelllebensfähigkeit von HeLa-Zellen auf 30%. Noch wichtiger ist, dass die Passivierung von PDA das System für weitere Modifikationen durch Michael-Addition oder Schiff-Base-Reaktion kompatibel machte.

Methoden/Experimental

Materialien

Alle chemischen Reagenzien waren von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet, sofern nicht anders angegeben. Dopaminhydrochlorid (DA) wurde von Sigma-Aldrich (USA) bezogen; Chininsulfat (98%, fluoreszenztauglich) wurde von Fluka (USA) bezogen; und Glycerin (> 99%), Tris, Dimethylsulfoxid (DMSO,> 99,8%) und Dialysemembranen (MWCO 1000 Da) wurden von Sangon Biotech (Shanghai, China) geliefert. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Trypsin und Penicillin-Streptomycin-Lösung wurden von Beyotime Biotechnology (Shanghai, China) bezogen. Dulbeccos Modifikation Eagle Medium (DMEM) wurde von Hyclone (USA) bezogen. Fötales Rinderserum (FBS) wurde von Biological Industries (Israel) bezogen. HeLa-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) bereitgestellt.

Instrumentierung und Charakterisierung

Die elementare Zusammensetzung wurde durch Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie bestätigt, die auf dem Nicolet 380-Spektrometer (FT-IR, Thermo Nicollet, Instruments, Ltd., Amerika) durchgeführt wurde. UV-Vis-Spektren wurden durch Perkin Elmer Lambda 750 UV-Vis-Nah-Infrarot-Spektrophotometer (UV-Vis-NIR, Perkin-Elmer, Norwalk, CT) charakterisiert. Die Photolumineszenz-(PL)-Spektren wurden mit dem Infinite 200PRO Fluorometer (Tecan, Instruments, Ltd., Schweiz) gemessen. Die Durchmesserverteilung und das Zetapotential wurden von Mastersizer2000 (DLS, Nano-ZS, Malvern, Instruments, Ltd., UK) durchgeführt. Morphologie und Durchmesser wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Tecnai G, Spirit, FEI, Hong Kong) dargestellt. Als Mikrowellenquelle (500 W) und Reaktionsdestille diente ein Haushaltsmikrowellenherd (Galanz, Instruments, Ltd., China).

Vorbereitung von CD-PDA und CDs

Zuerst wurden 50 mg Dopaminhydrochlorid vollständig in 10 ml Tris-Puffer (10 mM, pH 8,5) gelöst und bei Raumtemperatur 2 h unter magnetischem Rühren selbstpolymerisiert. Dann wurde das CD-PDA durch direktes Mischen von 6 ml vorpolymerisierter PDA-Lösung oben und 20 ml Glycerin (> 99 %) vor einer 5 Minuten langen mikrowellenunterstützten (500 W) Oxidation und dem anschließenden Reinigungsschritt synthetisiert. Während die CDs durch 5 Minuten-Mikrowellen-unterstützte (500 W) Oxidation von 20 ml Glycerin hergestellt wurden, wurde sie als Kontrollgruppe festgelegt. Danach wurden sowohl CD-PDA als auch CDs durch Dialyse gegen DI-Wasser für 48 h (MWCO 1000 Da) gereinigt und schließlich durch Zentrifugation (23.294 rcf, 10 min) und Gefriertrocknung gesammelt.

Messung von Fluoreszenzquantenausbeuten

Die Quantenausbeute (QY) von CD-PDA wurde über die zuvor beschriebene kolorimetrische Methode [19] gemessen, Chininsulfat (in 0,1 M H₂ SO₄ ) wurde als Standardprobe ausgewählt (Literatur QY 54%) und die Photolumineszenz (PL)-Emission wurde mit dem Infinite 200PRO Fluorometer gemessen. Insgesamt repräsentierte der spezifische Wert für die Fluoreszenzintensität von CD-PDA und Chinin die QY von CD-PDA (Anregungswellenlänge 350 nm) unter der Bedingung, dass sie denselben optischen Dichtewert (OD) von weniger als 0,02 (Wellenlänge 350 nm) aufweisen. Die integrierte Fluoreszenzintensität war der Bereich unter der PL-Kurve mit einer Wellenlänge im Bereich von 380 bis 700 nm. Grundsätzlich ist Chininsulfat in 0,1 M H₂ . gelöst SO₄ diente als Standardprobe (OD-Wert 0,02, Wellenlänge 350 nm); CD-PDA wurde in DI-Wasser dispergiert, und wir vermittelten seinen OD-Wert auf 0,02, um den Einfluss der Lichtabsorption auszuschließen. Dann haben wir die Fluoreszenzintensität von CD-PDA und Chinin gemessen, um die Fläche der PL-Kurven zu berechnen. Die CDs wurden als Kontrollgruppe eingestellt. Der Absolutwert des QY wurde nach der Formel berechnet:

Darin ist F QY ist, Grad die Steigung der PL-Kurve ist, ST und X die Standard- bzw. Testgruppe darstellen und R ist der Brechungsindex des Lösungsmittels.

Messung der photothermischen Leistung

CD-PDA, CDs und PDA wurden alle in DI-Wasser dispergiert und ihre Konzentrationen wurden alle bei 200 μg/ml vermittelt. Dann gaben wir oben jeweils 1 ml Lösung in die Standardquarzzelle und stellten die Laserdiodenquelle (STL 808CFS-10W, China) etwa 1 cm über den Flüssigkeitsspiegel, um die Lösung vollständig zu bedecken. Wir haben die Temperaturänderungen von CD-PDA und CDs jede Minute bei einer Leistungsdichte von 2 W/cm ² . gemessen NIR-Laserbestrahlung; sowohl PDA als auch DI-Wasser wurden als Kontrollgruppen eingesetzt. Dann beendeten wir die Bestrahlung und zeichneten die Temperaturänderungen auf, während der CD-PDA auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abkühlte, um die Abkühlkurve zu zeichnen. Die photothermische Umwandlungseffizienz von CD-PDA wurde gemäß der zuvor berichteten Formel berechnet [30].

Zellkultur

HeLa-Zellen wurden in Dulbecco-Modifikation Eagle-Medium (DMEM, HyClone) mit hohem Glucosegehalt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) bei einer Temperatur von 37 °C kultiviert und 5 % CO₂ befeuchtete Atmosphäre. Wir haben das Kulturmedium einmal täglich gewechselt.

Zelllebensfähigkeitstest

Die Zytotoxizität von CD-PDA wurde über einen Standard-MTT-Assay gemessen. HeLa-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Vertiefung und kultiviert für 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂ befeuchtete Atmosphäre. Dann reinigten wir die HeLa-Zellen dreimal mit frischem PBS, wonach das in DMEM dispergierte CD-PDA mit verschiedenen Gewichtsverhältnissen (10, 25, 50 und 100 μg/ml) in jede Vertiefung gegeben wurde. Danach wurde es weitere 24 h bei 37 °C, 5 % CO₂ . inkubiert befeuchtete Atmosphäre. Das Kulturmedium wurde durch 200 μL DMEM mit 20 μL MTT (5 mg/ml in PBS) ersetzt und weitere 4 h bei 37 °C, 5 % CO₂ . inkubiert befeuchtete Atmosphäre. Schließlich haben wir das Medium gründlich entfernt und 200 μL DMSO in jede Vertiefung gegeben und weitere 15 Minuten geschüttelt. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 490 nm gemessen. Unbehandelte HeLa-Zellen (kultiviert in DMEM) wurden als Kontrollgruppe eingesetzt. Die relativen Zelllebensfähigkeiten von HeLa-Zellen wurden gemäß der Formel Abssample/Abscontrol ×   100% berechnet. Darin ist die Abssample die Absorption von mit CD-PDA behandelten HeLa-Zellen, während die Abscontrol die Absorption von nicht behandelten HeLa-Zellen repräsentiert.

Abkürzungen

CD-PDA:

Polydopamin-Kohlenstoffpunkte

CDs:

Karbonpunkte

DA:

Dopamin

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco’s Modifikation Eagle medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

FBS:

Fötales Rinderserum

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

NIR:

Nahinfrarotbereich

OD:

Optische Dichte

PDA:

Polydopamin

PEI:

Polyethylenimin

PL:

Photolumineszenz

PTT:

Photothermische Therapie

QY:

Quantenausbeute

SWCNTs:

Einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

UV-Vis:

Ultraviolett- und sichtbare Spektroskopie