Synthese von reabsorptionsunterdrückten Typ-II/Typ-I-ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale-Quantenpunkten und ihre Anwendung für Immunsorbent-Assays

Hintergrund

Fluoreszierende Kern/Schale-Halbleiter-Quantenpunkte (QDs) zeichnen sich durch hervorragende optische Eigenschaften wie einen breiteren Emissionsbereich, höhere Photolumineszenz (PL)-Quantenausbeuten (QYs) und eine höhere optische und chemische Stabilität als herkömmliche organische Farbstoffe aus. Diese Vorteile eröffnen Möglichkeiten für revolutionäre Fortschritte bei Fluoreszenzmarkierungen für die biomedizinische Diagnostik, molekulare Bildgebung und photoelektrische Felder [1,2,3,4,5,6,7]. Entsprechend der Bandausrichtung zwischen Kern- und Schalenmaterialien können die Kern/Schale-QDs als Typ-I-, umgekehrte Typ-I- und Typ-II-Strukturen klassifiziert werden. Typ-I-QDs, gekennzeichnet durch die „verschachtelte“ Bandausrichtungsstruktur, die sowohl Elektronen als auch Löcher auf die Kernregion beschränken kann, um die strahlende Rekombination zu verbessern und die Oberfläche des optisch aktiven Kerns physisch von seinem umgebenden Medium zu trennen und somit die PL-Intensität zu verbessern und optische Stabilität [6,7,8,9]. Trotz dieser günstigen Eigenschaften erzeugt eine kleine Stokes-Verschiebung (nur ein Dutzend Nanometer), die als Differenz zwischen den Absorptions- und PL-Spektren bezeichnet wird, eine ernsthafte Reabsorption, die zu einem Gesamtemissionsverlust führt und ihre Anwendung bei der quantitativen Bestimmung einschränkt [10, 11]. Im Gegensatz dazu fördern Typ-II-QDs mit gestaffelter Bandgap-Ausrichtung die räumliche Trennung von Elektron und Loch in verschiedene Regionen der Kern/Schale-Struktur. Die nachfolgende e-h-Rekombinationsübergangsenergie der Bandkante ist kleiner als die Bandlücke einer der konstituierenden Materialkomponenten, was zu einer signifikanten rotverschobenen Emission führt, die bei keinem der Einkomponentenmaterialien verfügbar ist. Die Oszillatorstärke des ersten Exzitonen-Absorptionsmerkmals von Typ-II-QDs nimmt im Vergleich zu der von Kern-QDs dramatisch ab [12, 13]. Die stark rotverschobene Emission und der abgeflachte erste Exzitonen-Absorptionspeak verringern beide die Überlappung der Absorptions- und Emissionsspektren, was die Reabsorption unterdrückt und der biologischen quantitativen Detektion zugute kommt. Die typischen Typ-II-ZnSe/CdS-QDs haben eine abstimmbare Emission vom blauvioletten bis zum roten Bereich und eine unterdrückte Reabsorption [13]. Die in der CdS-Schale delokalisierten Elektronen sind jedoch anfällig für Einfang durch Oberflächendefekte oder das umgebende Medium, was zu einer geringen Fluoreszenzquantenausbeute führt. Eine praktikable Lösung ist die Beschichtung von ZnSe/CdS-QDs mit der äußersten ZnS-Schale, um nicht nur die Oberfläche zu passivieren, um die Quantenausbeute und optische Stabilität zu erhöhen, sondern auch um das Austreten von toxischen Cd-Elementen zu begrenzen und die Biotoxizität zu reduzieren. Bisher konzentrierte sich die Mehrzahl der Forschungen auf Typ-I-QDs, und nur wenige wurden auf ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-QDs durchgeführt [12,13,14,15]. Darüber hinaus verwendeten alle Studien zum Syntheseprozess von ZnSe/CdS/ZnS-QDs eine zweistufige Herstellung durch Vorreinigung von rohen ZnSe-Kern-QDs und verwendeten giftige und teure Phosphine. Darüber hinaus beinhaltete keiner von ihnen die Anwendung von ZnSe/CdS/ZnS-QDs beim biologischen Nachweis.

Hier berichten wir über eine phosphinfreie Eintopfmethode zur Synthese hochwertiger ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-Kern/Schale-QDs mit roter Emission mit dem Merkmal der Reabsorptions-Unterdrückung und der ersten Verwendung der QDs zur Fluoreszenz-linked Immunosorbent Assay (FLISA) herstellen. Wir verwendeten hochreaktive und wenig toxische Se-Vorläufer (ODE-Se) und Zinkoleat, um hochwertige ZnSe-Kern-QDs zu synthetisieren, und erreichten dann ein Mehrschalenwachstum ohne Reinigung der Kern-Quantenpunkte. Dies ist vielversprechend für die großmaßstäbliche Synthese von Kern/Schale-Quantenpunkten. Die Quantenausbeute von rot emittierenden ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-QDs wie hergestellt kann bis zu 82% erreichen bei einem niedrigeren Gehalt an toxischem Cadmium, was besonders wichtig ist, um die Biotoxizität im biomedizinischen Bereich zu reduzieren. Darüber hinaus haben die QDs eine große Stokes-Verschiebung sowie einen abgeflachten ersten Absorptionspeak, was zu einer geringen Überlappung von PL und Absorptionsspektren und einem unterdrückten Reabsorptionseffekt führt.

C-reaktives Protein (CRP) gilt als Akute-Phase-Protein aus Leberzellen als Frühindikator für Infektionen und Autoimmunerkrankungen. Solche Krankheiten beginnen oft bei sehr niedrigen CRP-Spiegeln. Daher ist die sensitive quantitative Immunoassay-Analyse von CRP-Spiegeln in biologischen Proben von entscheidender Bedeutung für die Diagnose und Überwachung der Krankheitsentwicklung [16]. Im Vergleich zum traditionellen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist FLISA zeitsparend ohne enzymatische Reaktion und weniger empfindlich gegenüber Umgebungsbedingungen, die sich aus der optischen Qualität fluoreszierender QDs ergeben [17]. Daher ist FLISA zu einem neuen Forschungs-Hotspot für quantitative Immunoassays geworden [2, 18, 19, 20, 21]. Hier demonstrierten wir zunächst einen quantitativen FLISA-Immunoassay mit wasserlöslichen ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-Kern/Schale-QDs als Fluoreszenzsonde. Die Nachweisgrenze (LOD) für den quantitativen Nachweis von CRP-Protein erreichte 0,85 ng/ml, was 15 % empfindlicher war als die des CdSe/ZnS-Typ-I-QD-basierten FLISA in Kontrollexperimenten. Die hohen QYs, die ausgezeichnete optische Stabilität und der geringe Reabsorptionseffekt können die Anwendung von ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs in der Biomedizin und im photoelektrischen Feld fördern.

Methoden

Chemikalien

Cadmiumoxid (CdO, 99,99%), Zinkoxid (ZnO, 99,9%, Pulver), Selen (Se, 99,9%, Pulver), 1-Octadecen (ODE, 90%), 1-Octanthiol (OT, 98%), Ölsäure (OA, 90%) Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-octadecen) (PMAO) und 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) wurden von Aldrich bezogen. Paraffinöl (analytische Qualität), Aceton (analytische Qualität), Hexane (analytische Qualität) und Methanol (analytische Qualität) wurden von Beijing Chemical Reagent Co., Ltd, China bezogen. NaOH, HCl, Na₂ CO₃ , NaHCO₃ , KH₂ PO₄ , Na₂ HPO₄ , H₃ BO₃ , Na₂ B₄ O₇ · 10H₂ O und Tween-20 wurden von Shanghai Sangon Co., Ltd., China, bezogen. Rinderserumalbumin (BSA) und Kälberserum wurden von Sigma bezogen. 1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimid (EDC), N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS) und die Mikrotiterplatten wurden von Thermo Fisher Scientific (USA) bezogen. Monoklonaler Maus-Anti-C-Reaktionsprotein-Antikörper und CRP-Antigen wurden von Abcam (USA) erhalten. Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet.

Stammlösung für den Se-Vorläufer (0,1 M)

Se (6 mmol) und ODE (60 ml) wurden in einen 100 ml-Dreihalskolben geladen und dann 180 Minuten unter Stickstoff auf 220 °C erhitzt, um eine gelbe klare Lösung zu erhalten.

Stammlösung für Zn-Vorläufer (0,4 M) und Cd-Vorläufer (0,2 M)

ZnO (30 mmol), Ölsäure (30 ml) und 45 ml ODE wurden in einen 100 ml-Dreihalskolben gefüllt und unter Stickstoff auf 310 °C erhitzt, um eine klare Lösung zu erhalten. Die resultierende Lösung wurde zur Injektion auf 140 °C abkühlen gelassen. Der Herstellungsprozess für den Cd-Vorläufer war der gleiche wie für den Zn-Vorläufer, außer dass die Konzentration auf 0,2 M eingestellt und die Reaktionstemperatur auf 240 °C eingestellt wurde.

Typische Synthese von ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs

Als typisches Syntheseverfahren wurden 4 ml Se-Vorstufe und ODE (15 ml) in einen 100-ml-Rundkolben gegeben. Die Mischung wurde auf 310 °C erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 2 ml Zn-Vorläufer schnell in den Reaktionskolben injiziert. Aliquots wurden in verschiedenen Zeitintervallen extrahiert, um die Entwicklung der PL-Position zu überwachen, die mit der Partikelgröße der QDs koordiniert. Als die Kern-Nanokristalle die gewünschte Dimension erreichten, wurde die Reaktionstemperatur für das Wachstum der CdS-Schale auf 230 °C gesenkt. Ohne irgendwelche Reinigungsschritte, als die Mischung aus Cd-Vorstufe und 1-Octanthiol (das molare Radio von OT und Kation beträgt 1:1,2) tropfenweise mit einer Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/h zugegeben wurde, während die Temperatur auf 310 °C erhöht. Das gleiche Verfahren wurde auf das Schalenwachstum von ZnS angewendet. Aliquots von QDs wurden während der Reaktion entnommen, um die Entwicklung von ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale-QDs zu analysieren. Die so hergestellten Kern/Schale-QDs wurden durch Zugabe von Aceton gereinigt und dann in Chloroform redispergiert.

Typische Synthese von CdSe/ZnS-Typ-I-QDs

CdSe/ZnS-QDs wurden wie in unseren früheren Berichten beschrieben synthetisiert [7]. Anschließend waren der Prozess des Phasentransfers, der QDs-Antikörper-Nachweissonden und die Herstellung von FLISA dieselben wie bei ZnSe/CdS/ZnS-QDs, die unten beschrieben werden würden.

Phasentransfer von ZnSe/CdS/ZnS-QDs für die Bioanwendung

Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-octadecen) (PMAO) – ein amphiphiles Oligomer, dessen hydrophobe Enden sich mit der organischen Beschichtung auf QDs verzahnen und hydrophile Endgruppen frei mit dem umgebenden Puffer interagieren können – wurde verwendet, um hydrophobe QDs in reine Wasser. Die ZnSe/CdS/ZnS-QDs und PMAO wurden gemischt und in Chloroform unter Beschallung gelöst (Molverhältnis von QD/PMAO war 1:7). Danach wurde Chloroform durch Rotationsverdampfung bei 45 °C entfernt. Dann ein gleiches Volumen von 0,1 M NaHCO₃ wßrige Lösung (pH&sub2;= 8,5) wurde zugegeben, um das QDs-PMAO aufzulösen. PMAO-verkapselte ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-QDs zeigen keinen Fluoreszenzverlust und haben eine hohe Stabilität in wässriger Lösung unter einem breiten pH-Bereich.

Vorbereitung von QDs-Antikörper-Nachweissonden

Über das Verfahren wurde in früheren Literaturstellen ausführlich berichtet [1, 2, 3]. Die QDs-PMAO wurden zunächst mit monoklonalen CRP-Antikörpern durch Aktivierung dieser -COOH-Gruppen durch EDC und Sulfo-NHS konjugiert. Als nächstes wurde eine bestimmte Menge monoklonaler CRP-Antikörper in die QDs gegeben und in BS-Puffer gelöst und dann durch BSA blockiert. Schließlich wurde das Produkt mit 5 mM BS-Puffer (pH  =8,0) unter Zentrifugation gewaschen. Der QDs-mAb wurde in 50 μL BS-Puffer (5 mM, pH = 8,0) aufbewahrt.

Vorbereitung einer Antikörper-beschichteten Fluoreszenz-Mikrotiterplatte

Der primäre Antikörper (die Konzentration des monoklonalen CRP-Antikörpers betrug 1,8 mg/ml) wurde mit einem Carbonat-Bicarbonat-Puffer (50 mM pH   =  9,6, CB-Puffer) in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte verdünnt. Anschließend wurde die Mikrotiterplatte mit Versiegelungsfolie abgedeckt und 24 h bei 4 °C inkubiert. Um zusätzliche Beschichtungsantikörper zu entfernen, wurde die Mikrotiterplatte dreimal mit einem Waschpuffer (0,05% Tween-20 in 10 mM PBS, pH =  7,4) gewaschen. Dann wurden überschüssige Bindungsstellen mit 0,5 % (w/v) BSA in 10 mM PBS (pH = 7,4) zur Inkubation über Nacht bei 4 °C blockiert. Dieser Prozess stellte sicher, dass alle verfügbaren und verbleibenden Bindungsseiten der Mikrotiterplatten-Wells bedeckt waren. Die Mikrotiterplatte wurde 24 Stunden lang in einer Kammer mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit getrocknet und dann für die spätere Verwendung bei 4 °C gelagert.

Quantitativer Nachweis von CRP durch Fluoreszenz-Linked Immunoassay

In jede Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte wurde der enthaltene Beschichtungsantikörper mit 100 μl des Standardantigens versetzt und mit dem Probenpuffer auf eine Reihe von Konzentrationen verdünnt. Die Platten wurden 30 min bei 37 °C inkubiert und dann fünfmal mit einem Waschpuffer gewaschen. Als nächstes wurden 100 μl der QDs-mAb-Sonden mit dem Sondenpuffer (10% Kalbsserum (v/v) in 0,1 M PBS) in jede Vertiefung verdünnt, inkubiert und wie im oben genannten Verfahren gewaschen.

Charakterisierung

Die UV-Vis-Absorption bei Raumtemperatur und die PL-Spektren wurden mit einem Spektrophotometer von Ocean Optics (Modus PC2000-ISA) gemessen. PL-Quantenausbeuten (QYs) wurden durch Vergleich der integrierten Fluoreszenzintensität der QD-Proben in Lösung mit der des Standards bekannter QYs (Rhodamine 101 (R101) Ethanollösung (0,01% HCl, QY = 100%) als Standard) bestimmt. . Untersuchungen mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden mit einem JEOL JEM-2010-Elektronenmikroskop bei 200 kV durchgeführt. Die Phasenbestimmung der Produkte erfolgte an einem Röntgendiffraktometer (D8-ADVANCE) mit Cu-Ka-Strahlung (Wellenlänge = 1,54 Å). Die Größen der QDs und der QD-Antikörpersonden wurden mit dynamischer Lichtstreuung (Nano-ZS 90, Malvern Instruments, UK) aufgezeichnet.

Ergebnisse und Diskussion

Die UV-Vis-Absorptions- und PL-Spektren des Schalenwachstumsprozesses sind in Abb. 1 dargestellt. Die Stokes-Verschiebung des ZnSe-Kerns beträgt nur 8 nm, wobei der erste Absorptionspeak bei 420 nm und der Emissionspeak bei 428 nm und die volle Emissionsbreite bei halb liegt maximal (FWHM) von 17 nm. Wenn jedoch nur eine Monoschicht (ML) der CdS-Schale auf dem ZnSe-Kern wuchs, stieg die Stokes-Verschiebung signifikant auf 54 nm an, wobei der erste Absorptionspeak bei 497 nm und der Emissionspeak bei 551 nm mit einer halben Emissionsbreite (FWHM) lag. von 38 nm. Aufgrund der Delokalisierung der Elektronenwellenfunktion ist die PL-Emission von ZnSe/CdS-QDs (629 nm) in Bezug auf ZnSe-Kern-QDs (428 nm) rotverschoben und die FWHM verbreitert sich mit der Abscheidung der CdS-Schale auf 52 nm. Die verbreiterte PL FWHM entstand aus einer verstärkten Frölich-ähnlichen Exziton-Phonon-Wechselwirkung [22, 23]. Darüber hinaus schwächte sich die Oszillatorstärke des ersten Absorptionspeaks aufgrund des räumlich indirekten Typ-II-Übergangs vom Valenzband des ZnSe zum Leitungsband des CdS schnell ab. Das Phänomen tritt häufig bei Typ-II-QDs auf [24,25,26]. Während der dramatische Anstieg der Absorption im blauen Spektralbereich (<500 nm) der Bandlücke von CdS-Volumenmaterial (2,42 eV) zugeschrieben wurde. Infolgedessen führten die rote Emission, der abgeflachte erste Exzitonen-Absorptionspeak und die robuste Absorption im kurzwelligen Bereich (<500 nm) von ZnSe/CdS-Typ-II-QDs zu einer großen Stokes-Verschiebung und unterdrückten Reabsorption. Mit dem sequentiellen Wachstum der ZnS-Schale wurde die PL zu einer kurzen Wellenlänge verschoben und die FWHM von 52 nm auf 43 nm verengt. Dieses Phänomen wurde der Tatsache zugeschrieben, dass die Zn-Atome in die Cd-reichen Regionen diffundieren, um bei hoher Temperatur eine Gradientenschale zu bilden, wodurch der Band-Offset der Schale erhöht wird. Die QYs könnten während des Schalenwachstumsprozesses von CdS und ZnS auf ZnSe-Kernen von 20 auf 82% steigen.

Entwicklung der UV-vis-Absorptions- und PL-Spektren bei konsekutivem Wachstum von ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale-QDs

Es war bemerkenswert, dass ein Überschuss an Zn-OA-Vorstufe relativ zur Se-Vorstufe in der Kernlösung notwendig war, um qualitativ hochwertige und monodisperse ZnSe-Kern-QDs zu erhalten. Infolgedessen würde sich während der Zugabe des Cd-OT-Schalenvorläufers im Anfangsstadium unweigerlich eine ZnCdSeS-Legierungsschale bilden, da die hohe Temperatur (>200 °C) den Kationenaustausch und die Diffusion zwischen Zn ²⁺ und Cd ²⁺ , und das reiche Octanthiol in der Cd-OT-Vorstufe könnte auch mit dem überschüssigen Zn-OA reagieren [7, 12, 27, 28]. Die Legierungshülle kann nicht nur die Grenzflächenspannung und den Defekt reduzieren, um die QYs zu erhöhen, sondern auch eine Energiebarriere für Löcher erzeugen. Die Leitungsbandkante des ZnCdSeS-Legierungsschalenmaterials befand sich zwischen der von ZnSe und CdS, während die Valenzbandkante tiefer war als die von CdS. Dies bildete ein größeres Potentialtal in der Valenzbandkante als zusätzliche Sperrschicht für die Löcher (Schema 1) [12]. Diese Energiebandstruktur kann die Überlappung von Elektronen und Löchern weiter reduzieren, um die Stärke des ersten Exzitonen-Absorptionspeaks zu verringern und die Reabsorption zu unterdrücken.

Der schematische Aufbau (up ) und die Bandausrichtung (unten ) für ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs basierend auf den entsprechenden abrupten bzw. legierten Grenzflächen

Die Informationen über die Kern/Schale-Bandstruktur und die Entwicklung von PL und Extinktion während des Schalenwachstums können durch den Vergleich von XRD, TEM und HRTEM von Kern- und Kern/Schale-Nanokristallen weiter verifiziert werden. Die Pulver-XRD-Muster des ZnSe-Kerns, ZnSe/CdS und ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale (das linke Bild von Abb. 2) zeigen, dass die Beugungspeaks scharf werden und sich zu Positionen verschieben, die dem Wurtzit (WZ) CdS . entsprechen oder ZnS-Kristallstrukturen. Dieses Ergebnis stimmt mit den vorhergesagten Werten für das größere Volumen der CdS- oder ZnS-Schale im Vergleich zum ZnSe-Kern in den endgültigen Kern/Schale-QDs überein und bezeugt das Wachstum von Mehrschalen. Darüber hinaus hat eine Umwandlung von ZnSe-Kernen vom Typ Zinkblende (ZB) zu Kern/Mantel vom WZ-Typ mit CdS- und ZnS-Beschichtung stattgefunden. Dieses Phänomen wurde in CdSe/CdS-Kern/Schale-QD-Systemen berichtet [29, 30]. TEM-Bilder der Kern-QDs und mehrerer Kern/Schale-QDs sind in Abb. 2a − 2 F gezeigt. Alle TEM-Bilder zeigen nahezu monodisperse sphärische QDs mit allmählich ansteigenden durchschnittlichen Durchmessern vom ursprünglichen ZnSe-Kern (3,90 nm) zu ZnSe/6CdS-Typ- II QDs (7,98 nm) und ZnSe/6CdS/6ZnS Typ-II/Typ-I-QDs (11,92 nm). Wie im HRTEM-Bild von ZnSe-Kern-QDs (Einschub in Abb. 2a) gezeigt, beträgt der Gitterabstand der (111)-Ebenen 0,32 nm, und die QDs besitzen eine gute Kristallinität und Monodispersität. Mit dem Wachstum der Schalen zeigte der Gitterparameter eine entsprechende Änderung (0,35 nm für CdS und 0,31 nm für ZnS) gemäß den XRD-Daten. Die Ergebnisse haben eindeutig das kontrollierbare Wachstum von CdS- und nachfolgenden ZnS-Schalenmaterialien nahegelegt.

Links :XRD-Muster von ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs mit unterschiedlichen Schalenwachstumsstadien. Die Beugungslinien für Zinkblende (ZB) ZnSe (unten), WZ CdS (Mitte ) und WZ ZnS (oben ) sind indiziert. Richtig :das entsprechende TEM und HRTEM (Einschub , Balken von 5 nm) Bilder des ZnSe-Kerns (a ), ZnSe/CdS Typ-II QDs mit 2 ML (b ), 4 ml (c ) und 6 ml (d ) CdS-Schale bzw. ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs mit 3 ML (E) bzw. 6 ML (F)

Um die Entwicklung der Zusammensetzung während des Wachstums von Mehrschalen zu bestätigen, wurde die energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDS)-Analyse für verschiedene Stadien des Kern/Schale-Wachstums durchgeführt, wie in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 gezeigt. Die EDS-Daten zeigen, dass die entsprechenden Gehaltsänderungen von Cd, Se, Zn und S mit dem Schalenwachstumsstadium übereinstimmen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass das Cd/(Zn + Cd)-Molverhältnis in den resultierenden ZnSe/CdS-QDs aufgrund des Kationenaustauschs zwischen Zn ²⁺ und Cd ²⁺ während des Beschichtungsprozesses der CdS-Schale auf den ZnSe-Kern bei über 200 °C. Im Vergleich mit der veröffentlichten Literatur zu typischen Typ-I-CdSe/CdS/ZnS-QDs (Cd-Molverhältnis ~ 40%) [31] enthielten die Typ-II/Typ-I-ZnSe/CdS/ZnS-QDs weit weniger Cd-Elemente (~ 13%).

Ein visueller Vergleich von hydrophoben QDs in Chloroform und PMAO-verkappten QDs in Wasser unter Sonnenlicht und UV-Licht ist in Zusatzdatei 1:Abbildung S1 (A) gezeigt. Es scheint, dass beide QD-Lösungen ungestört sind und keine Aggregation von Nanopartikeln vorliegt. Beide QDs strahlten dasselbe rote Licht aus, wenn sie mit einer tragbaren UV-Lampe (365 nm) beleuchtet wurden. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 (B) zeigt die UV−Vis−Absorptions‐ und PL‐Spektren von QDs vor und nach dem Phasentransfer. Verglichen mit den hydrophoben QDs in Chloroform weist das PL-Spektrum von PMAO-verkappten QDs eine vernachlässigbare Veränderung auf, was auf keine offensichtliche Veränderung der Partikelgröße und der PL-Eigenschaften hinweist. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 (C) und (D) präsentieren die TEM-Bilder der QDs vor und nach dem Phasentransfer, die die Morphologie und den Zustand von PMAO-verkappten QDs weiter bestimmen. Es scheint, dass QDs mit PMAO-Kappe gut isoliert sind und selten als Aggregate beobachtet werden.

Um die Bildung von PMAO-verkapselten QDs während des Phasentransferprozesses zu bestätigen, wurde FTIR-Spektroskopie verwendet, um die funktionellen Gruppen auf der Oberfläche von QDs zu charakterisieren (gezeigt in Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Die Abnahme des Peaks bei 1777 cm ⁻¹ (im Vergleich von PMAO mit QDs-PMAO) und der Anstieg des Peaks bei 1715 cm ⁻¹ (Vergleich der drei Proben) wurden der Zersetzung von Anhydrid und der Bildung von -COOH zugeschrieben. Die FTIR-Ergebnisse zeigten, dass amphiphiles PMAO-Polymer erfolgreich auf die Oberfläche der ZnSe/CdS/ZnS-QDs aufgetragen wurde.

Die Stabilität der vorbereiteten QDs ist für die nachfolgende Behandlung sehr wichtig. Abbildung 3a zeigt die Entwicklung der relativen PL-Stabilität von hydrophoben ZnSe/CdS/ZnS-QDs nach Reinigungsschritten. Die PL-Intensität von ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale-QDs konnte nach vielen Reinigungszyklen in Hexanen 85% aufrechterhalten. Wie in Abb. 3b gezeigt, wurde die kolloidale Stabilität des QDs-PMAO in BS-Puffer (pH = 7,2) als Funktion der Zeit bei 25 °C geschätzt. Die PL-Intensität blieb nahezu konstant und die Lösung war auch nach 400 h klar. Dies zeigt an, dass das QDs-PMAO in BS-Lösung ohne Schaden stabil ist. Abbildung 3c zeigt die Variation der PL-Intensität von QDs-PMAO, die 30 Minuten lang in eine Lösung mit saurem bis basischem pH (pH = 1-14, eingestellt durch HCl oder NaOH) eingetaucht wurden. Die PL-Intensität hydrophiler QDs könnte über 85 % beibehalten, außer wenn der PH = 14 ist. Abbildung 3d zeigt den Einfluss des Temperaturparameters auf die relative Fluoreszenzintensität von QDs-PMAO. Die Fluoreszenzintensität nahm mit steigender Temperatur allmählich ab, blieb jedoch bei 90 °C bei 76 %, während sich die PL-Peaks aufgrund der thermischen Ausdehnung und des Elektron-Phonon-Kopplungseffekts allmählich zu längeren Wellenlängen verschoben. Alle Stabilitätsbewertungen zeigen, dass die ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs und QDs-PMAO sehr stabil und somit für biologische Anwendungen geeignet waren.

Stabilitätstest hydrophober QDs nach (a ) wiederholte Reinigungsverfahrensschritte; Stabilitätstest von QDs-PMAO nach (b ) BS-Puffer, (c ) PH und (d ) Temperatur

CRP ist ein Akute-Phase-Protein aus Leberzellen, dessen Spiegel als Frühindikator für Infektionen und Autoimmunerkrankungen gilt. Hier werden die wie synthetisierten PMAO-verkappten ZnSe/CdS/ZnS-QDs mit CRP gekoppelt, um die Möglichkeit der Anwendung in quantitativen Immunoassays zu demonstrieren. Ein Vergleichsdiagramm der Fluoreszenzspektren von wässrigen ZnSe/CdS/ZnS-QDs und dem QDs-mAb sind in Abb. 4a gezeigt. Offensichtlich ist die PL-Peakform beider Proben ungefähr identisch, außer dass die Fluoreszenzintensität nach der Kopplungsreaktion aufgrund des unvermeidlichen Probenverlusts während des Zentrifugentrennverfahrens auf 60 % abfällt. Es beweist die ausgezeichnete optische Stabilität von ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs auch nach dem Antikörper-Protein-Kopplungsprozess.

Fluoreszenzspektren (a ) und dynamische Lichtstreuung (b ) des QDs-PMAO und QDs-mAb in Puffer

Um den Effekt der Konjugation auf die Größe von QDs weiter zu untersuchen, werden die wässrigen QDs und QDs-mAb durch dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Die DLS-Ergebnisse (Abb. 4b) zeigen deutlich, dass beide Proben eine enge Größenverteilung mit guter Monodispersität aufweisen und eine diskrete Form ohne Aggregation beibehalten, während die hydrodynamische Größe nach dem Kupplungsprozess von 46 auf 120 nm ansteigt. Dies zeigt den Erfolg bei der Konjugation mit CRP-Antikörpern.

Darüber hinaus verwendeten wir die zusammengesetzten Quantenpunkte ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I anstelle von CdSe/ZnS-Typ-I-QDs als Fluoreszenzsonde, um einen FLISA zum quantitativen Nachweis von CRP zu etablieren. Der Assemblierungsvorgang ist in Zusätzliche Datei 1 gezeigt:Schema S1. Abbildung 5a zeigt die relative Fluoreszenzintensität der QDs-Fluoreszenzmarkierung für Immunoassays beim Nachweis verschiedener Konzentrationen von CRP-Antigenen (das Standard-CRP-Antigen wird auf 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200, 400 ng/ml verdünnt). Offensichtlich nimmt die PL-Intensität mit der Zunahme der CRP-Konzentration allmählich zu. Abbildung 5b zeigt, dass die Korrelation zwischen der Fluoreszenzintensität und den Ziel-CRP-Konzentrationen einer quadratischen Regressionskurvengleichung von y . folgt = 44230 + 8121,1x-10,3x ² mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,9991, je näher an 1 desto besser. Die Arbeitskonzentrationen reichen von 0 bis 400 ng/ml. Die LOD ist einer der Schlüsselparameter für Immunoassays für FLISA. Durch die Verwendung der zusammengesetzten ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-QDs als Fluoreszenzsonde beträgt die Sensitivität des quantitativen Nachweises von CRP 0,85 ng/ml, was 15 % empfindlicher ist als die von FLISA basierend auf CdSe/ZnS-Typ -I QDs (1,00 ng/ml) (in Zusatzdatei 1:Abbildung S3).

Photolumineszenzspektren von FLISA zur Bestimmung unterschiedlicher Konzentrationen von CRP-Antigen (a ) und die Standardkurven (b )

Darüber hinaus wurden Wiederfindungsexperimente verwendet, um den Matrixeffekt des FLISA mit einer Reihe bekannter Standard-CRP-Antigene zur Analyse zu bewerten, und die Endkonzentrationen deckten die niedrigen, mittleren und hohen Risikoniveaus ab. Wie in Tabelle 1 dargestellt, liegen alle Wiederfindungsraten im Bereich von 83,61 bis 105,9 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass der FLISA basierend auf ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs mit Reabsorptionsunterdrückungseigenschaft eine hohe Genauigkeit aufweist und große Vorteile beim quantitativen Immunoassay-Nachweis bietet.

Schlussfolgerungen

Wir berichten über eine phosphinfreie Eintopfmethode zur Synthese reabsorptionsunterdrückter ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-Kern/Schale-QDs mit großer Stokes-Verschiebung und flachem ersten Absorptionspeak. Diese Eigenschaften reduzieren die Reabsorption und verbessern die Fluoreszenzleistung. Die wie synthetisierten QDs haben ein hohes QY (82%) und eine hohe Stabilität gegenüber verschiedenen Testbedingungen. Dann verwenden wir zunächst ZnSe/CdS/ZnS-QDs als Fluoreszenzsonde im FLISA zum quantitativen Nachweis von CRP-Protein mit hoher Sensitivität (LOD von 0,85 ng/ml). Dies weist darauf hin, dass die reabsorptionsunterdrückten ZnSe/CdS/ZnS-Typ-II/Typ-I-Kern/Schale-QDs vielversprechendes Potenzial für Anwendungen in der Biomedizin und auf photoelektrischen Gebieten haben.

Abkürzungen

BSA:

Rinderserumalbumin

CRP:

C-reaktives Protein

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EDC:

1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimid

EDS:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FLISA:

Fluoreszenz-linked Immunosorbent Assay

FWHM:

Volle Breite auf halbem Maximum

LOD:

Nachweisgrenze

MES:

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

OT:

1-Octanthiol

PMAO:

Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-octadecen)

QDs:

Quantenpunkte

QYs:

Quantenausbeute

Sulfo-NHS:

N-Hydroxysulfosuccinimid