Phosphinfreie Synthese von Reabsorptions-unterdrückten ZnSe/CdS/ZnS-Kern-Schale-Quantenpunkten und ihre Anwendung in sensitiver CRP-Detektion

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein phosphinfreies, eintöpfiges Protokoll zur Herstellung von ZnSe/CdS/ZnS-Kern-Schale-Quantenpunkten (QDs), die Typ-II- und Typ-I-Bandausrichtungen kombinieren, um Reabsorption zu unterdrücken. Die resultierenden rot-emittierenden QDs erreichen eine beeindruckende Photolumineszenz-Quantenausbeute (QY) von 82 % und außergewöhnliche optische Stabilität. Im Vergleich zu konventionellen Typ-I-QDs weisen die Komposit-QDs einen deutlich größeren Stokes-Shift und reduzierte Reabsorption auf, was in höherer Fluoreszenzausbeute resultiert. Nutzen wir diese Eigenschaften, setzten wir die QDs als fluoreszente Markierungen in einem fluoreszenz-gekoppelten Immunosorbent-Assay (FLISA) für C-reaktives Protein (CRP) ein. Der Assay erreichte eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,85 ng ml⁻¹ – 15 % empfindlicher als ein CdSe/ZnS-basierter FLISA (1,00 ng ml⁻¹). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I-QDs starke Kandidaten für biomedizinische Diagnostik und photonische Anwendungen sind.

Hintergrund

Halbleiter-Kern/Schale-QDs besitzen überlegene optische Eigenschaften – breite Emissionsbereiche, hohe Quantenausbeuten (QYs) und robuste chemische Stabilität – was sie zu idealen fluoreszierenden Markierungen für Diagnostik, Bildgebung und Optoelektronik macht. Ihre elektronische Struktur fällt in drei Kategorien basierend auf Bandausrichtung: Typ-I, umgekehrter Typ-I und Typ-II. Typ-I-QDs schließen sowohl Elektronen als auch Löcher im Kern ein, was radiative Rekombination fördert und den aktiven Kern von Oberflächenfehlern isoliert. Der jedoch kleine Stokes-Shift (≈10 nm), der Typ-I-QDs eigen ist, verursacht signifikante Reabsorption, was Emissionsintensität mindert und quantitative Assays limitiert. Typ-II-QDs trennen Elektronen und Löcher über Kern und Schale, was rotverschobene Emission und abgeflachten ersten Exzitonen-Absorptionspeak erzeugt. Dies reduziert spektrale Überlappung, unterdrückt Reabsorption und verbessert quantitative Detektion. ZnSe/CdS Typ-II-QDs decken von bläulich-violett bis rot emittierend mit unterdrückter Reabsorption ab, aber ihre Cd-reichen Schalen können unter oberflächenfalleninduziertem Quenching und Bio-Toxizität leiden. Beschichtung mit einer äußeren ZnS-Schale passiviert die Oberfläche, erhöht QY und begrenzt Cd-Auslaugung. Frühere Synthesen von ZnSe/CdS/ZnS-QDs erforderten toxische Phosphine und mehrstufige Reinigung, ohne berichtete biologische Anwendungen.

Hier führen wir einen phosphinfreien, eintöpfigen Weg zur Herstellung hochwertiger rot-emittierender ZnSe/CdS/ZnS-QDs ein, die Reabsorption unterdrücken. Die Methode nutzt einen niedrigtoxischen Se-Vorläufer (ODE-Se) und Zinkoleat zur Bildung von ZnSe-Kernen, gefolgt von in-situ-Wachstum von CdS- und ZnS-Schalen ohne Zwischenschritt-Reinigung – was skalierbare Produktion erleichtert. Die QDs erreichen 82 % QY bei reduziertem Cd-Gehalt, und ihr großer Stokes-Shift plus abgeflachtes Absorptionsprofil ergeben geringe Reabsorption. Schließlich demonstrieren wir ihre erste Verwendung als fluoreszierende Sonden in einem FLISA für CRP, mit einer LOD von 0,85 ng ml⁻¹ – überlegen gegenüber einem CdSe/ZnS-Referenzassay.

Methoden

Chemikalien

Alle Reagenzien wurden unverändert verwendet: CdO (99,99 %), ZnO (99,9 %), Se (99,9 %), 1-Octadecen (ODE, 90 %), 1-Octanthiol (OT, 98 %), Oleinsäure (OA, 90 %), PMAO, MES und Standard-Laborsolventien (Paraffinöl, Aceton, Hexan, Methanol). Pufferbestandteile (NaOH, HCl, Na₂CO₃, NaHCO₃, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, H₃BO₃, Na₂B₄O₇·10H₂O, Tween-20) stammten von Shanghai Sangon Co., Ltd. BSA und Kälberserum von Sigma. EDC, Sulfo-NHS und Mikrotiterplatten von Thermo Fisher Scientific. Maus anti-CRP monoklonale Antikörper und CRP-Antigen von Abcam. Alle Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Se-Vorläufer (0,1 M)

Se (6 mmol) wurde in 60 ml ODE gelöst und 180 min bei 220 °C unter Stickstoff erhitzt, was eine klare gelbe Lösung ergab.

Zn- und Cd-Vorläufer

ZnO (30 mmol) wurde mit 30 ml OA und 45 ml ODE kombiniert, dann auf 310 °C unter Stickstoff erhitzt, um eine klare Lösung zu bilden; das Gemisch kühlte auf 140 °C für Injektion ab. Der Cd-Vorläufer wurde identisch hergestellt, aber bei 240 °C und 0,2 M Konzentration.

Synthese von ZnSe/CdS/ZnS Typ-II/Typ-I QDs

Ein typischer Lauf begann mit Erhitzen von 4 ml Se-Vorläufer und 15 ml ODE auf 310 °C. Bei dieser Temperatur wurde 2 ml Zn-Vorläufer schnell injiziert. Aliquote wurden in Intervallen entnommen, um PL-Verschiebungen, die mit Partikelwachstum verknüpft sind, zu überwachen. Sobald der Kern die gewünschte Größe erreichte, wurde die Temperatur auf 230 °C für CdS-Schalenwachstum gesenkt. Cd-Vorläufer und OT (OT : Kation = 1 : 1,2) wurden dann tropfenweise zugegeben bei 3 ml h⁻¹, während die Temperatur auf 310 °C angehoben wurde. Die ZnS-Schale wurde mit derselben Methode gewachsen. QDs wurden durch Aceton-Fällung gereinigt und in Chloroform redispergiert.

CdSe/ZnS Typ-I QDs

Diese QDs wurden nach etablierten Protokollen synthetisiert und anschließend für Phasentransfer und FLISA-Vorbereitung identisch zum ZnSe/CdS/ZnS-Verfahren verwendet.

Phasentransfer in Wasser

Polymaleinsäureanhydrid-Octadecen (PMAO) amphiphiles Oligomer wurde verwendet, um die hydrophoben QDs wasserlöslich zu machen. QDs und PMAO wurden in Chloroform gelöst (QD/PMAO = 1 : 7) mit Sonikation, dann Chloroform bei 45 °C verdampft. Ein gleiches Volumen 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,5) wurde hinzugefügt, um den Komplex zu lösen. Die resultierenden QDs-PMAO behielten volle Fluoreszenz und zeigten exzellente wässrige Stabilität über einen weiten pH-Bereich.

QDs-Antikörper-Konjugation

QDs-PMAO wurden mit EDC/Sulfo-NHS aktiviert, um Carboxylgruppen an monoklonale CRP-Antikörper zu binden. Nach Inkubation in PBS und BSA-Blockierung wurden die Konjugate durch Zentrifugation gewaschen und in 50 µl BS-Puffer (5 mM, pH 8,0) gelagert.

Antikörper-beschichtete Mikrotiterplatten-Präparation

Mikrotiterplatten-Wellen wurden mit 1,8 mg ml⁻¹ CRP monoklonalem Antikörper in 50 mM Carbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) beschichtet, 24 h bei 4 °C inkubiert, dreimal mit 0,05 % Tween-20 in 10 mM PBS gewaschen und mit 0,5 % BSA in PBS (pH 7,4) über Nacht blockiert. Platten wurden getrocknet und bei 4 °C gelagert.

CRP-Quantifizierung durch FLISA

In jede Welle wurden 100 µl Standard-CRP oder Probe (in Puffer verdünnt) gegeben, 30 min bei 37 °C inkubiert und fünfmal gewaschen. Anschließend wurden 100 µl QDs-mAb-Sonde (in 10 % Kälberserum/PBS verdünnt) hinzugefügt, inkubiert und wie zuvor gewaschen.

Charakterisierung

UV-Vis-Absorption und PL-Spektren wurden mit einem Ocean Optics PC2000-ISA Spektrophotometer aufgezeichnet. QYs wurden relativ zu Rhodamin 101 (QY = 100 %) in Ethanol gemessen. TEM-Bildgebung nutzte ein JEOL JEM-2010 bei 200 kV. Phasenanalyse verwendete ein D8-ADVANCE XRD mit Cu-Kα-Strahlung (λ = 1,54 Å). Hydrodynamische Durchmesser wurden durch dynamische Lichtstreuung (Nano-ZS 90, Malvern) bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Die Entwicklung von UV-Vis- und PL-Spektren während des Schalenwachstums ist in Abbildung 1 illustriert. Der nackte ZnSe-Kern zeigt 420 nm Absorption und 428 nm Emission (FWHM = 17 nm). Hinzufügen einer einzelnen CdS-Monolage erweitert den Stokes-Shift auf 54 nm, mit Absorption bei 497 nm und Emission bei 551 nm (FWHM = 38 nm). Weiteres CdS-Schalenwachstum rotverschiebt die PL weiter auf 629 nm und verbreitert FWHM auf 52 nm, was verstärkte Exziton-Phonon-Kopplung reflektiert. Der abgeflachte erste Exzitonen-Absorptionspeak und starke Kurzwelligenabsorption (<500 nm) reduzieren gemeinsam spektrale Überlappung und unterdrücken effektiv Reabsorption. Die ZnS-Schale verschiebt die Emission anschließend blau und verengt FWHM auf 43 nm, während die QY von 20 % auf 82 % über die CdS/ZnS-Wachstumssequenz ansteigt.

Abbildung 2 bestätigt die strukturelle Entwicklung: XRD-Peaks schärfen und verschieben zu Wurtzit-CdS- und ZnS-Positionen, was erfolgreiches Mehrschalenwachstum und einen Zinkblende-zu-Wurtzit-Übergang anzeigt. TEM-Bilder (Abb. 2a-f) zeigen monodisperse kugelförmige QDs, die sich von 3,90 nm (Kern) auf 11,92 nm (vollständiger Kern/Schale) ausdehnen. HRTEM-Gitterabstände (0,32 nm für ZnSe, 0,35 nm für CdS, 0,31 nm für ZnS) stimmen mit XRD-Daten überein und bestätigen kompositionelle Treue.

EDS-Analyse (Tabelle S1) zeigt, dass Cd/(Zn+Cd)-Verhältnisse während des CdS-Schalenwachstums durch Kationenaustausch bei >200 °C zunehmen, doch der Gesamt-Cd-Gehalt bleibt niedrig (~13 %) im Vergleich zu typischen Typ-I CdSe/CdS/ZnS-QDs (~40 %). Diese reduzierte Cd-Last mindert Bio-Toxizität.

Phasentransfer in wässrige Medien via PMAO (Abb. S1) erhält PL-Intensität und Morphologie, bestätigt durch UV-Vis, PL, TEM und FTIR-Spektren. Die FTIR-Spektren demonstrieren erfolgreiche Anhydrid-Ringöffnung und COOH-Bildung auf der QD-Oberfläche.

Stabilitätstests (Abb. 3) zeigen, dass hydrophobe QDs 85 % der PL nach wiederholter Reinigung behalten, und PMAO-eingekapselte QDs >85 % PL nach 400 h in PBS, über pH 1–13 und bis 90 °C (verbleibende 76 % PL) beibehalten. Diese Ergebnisse bestätigen Eignung für biologische Assays.

Konjugation mit CRP-Antikörpern (Abb. 4a) reduziert PL-Intensität um ~40 % durch Trennverluste, bewahrt aber Spektralform. DLS zeigt hydrodynamischen Durchmesseranstieg von 46 nm (QDs-PMAO) auf 120 nm (QDs-mAb), was erfolgreiche Konjugation ohne Aggregation bestätigt.

Verwendung der QDs-mAb in FLISA (Abb. 5a) ergibt eine klare, quadratische Dosis-Wirkungs-Beziehung (R² = 0,9991) über 0–400 ng ml⁻¹. Die LOD von 0,85 ng ml⁻¹ übertrifft die CdSe/ZnS-Referenz um 15 %. Rückgewinnungsexperimente (Tabelle 1) zeigen 83,6–105,9 % Genauigkeit über niedrige, mittlere und hohe CRP-Konzentrationen, was Assay-Zuverlässigkeit unterstreicht.

Schlussfolgerungen

Wir haben eine phosphinfreie, skalierbare Synthese von reabsorptionsunterdrückten ZnSe/CdS/ZnS-Kern/Schale-QDs entwickelt, die Typ-II- und Typ-I-Bandstrukturen kombinieren. Die QDs liefern hohe QY (82 %), großen Stokes-Shift und exzellente Stabilität, was einen hochsensitiven FLISA für CRP-Detektion ermöglicht (LOD = 0,85 ng ml⁻¹). Diese Eigenschaften positionieren ZnSe/CdS/ZnS-QDs als vielversprechende Werkzeuge für biomedizinische Diagnostik und optoelektronische Geräte.

Abkürzungen

BSA

Bovines Serumalbumin

CRP

C-reaktives Protein

DLS

Dynamische Lichtstreuung

EDC

1-Ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimid

EDS

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

ELISA

Enzym-gekoppelter Immunosorbent-Assay

FLISA

Fluoreszenz-gekoppelter Immunosorbent-Assay

FWHM

Volle Breite bei halber Maximität

LOD

Nachweisgrenze

MES

2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

OT

1-Octanthiol

PMAO

Poly(maleinsäureanhydrid-alt-1-octadecen)

QDs

Quantenpunkte

QYs

Quantenausbeuten

Sulfo-NHS

N-Hydroxysulfosuccinimid