Synthese und In-vitro-Studie einer Dual-Mode-Sonde, die auf Integrin αvβ3 abzielt

Hintergrund

Maligne Tumorinfiltration und Fernmetastasierung sind die Hauptursachen für ein Therapieversagen. Der Prozess der malignen Tumormetastasierung erfordert die Zerstörung der extrazellulären Matrix (ECM) und der Neovaskulatur des Tumors [1]. Daher ist die nichtinvasive In-vitro-Überwachung von molekularen Markern im Zusammenhang mit der Neovaskularisation von Tumoren besonders wichtig für die Vorhersage von Tumormetastasen und die Früherkennung. Integrin α_v β₃ , ein umfassend untersuchter molekularer Marker der Tumorneuvaskulatur, hat große Aufmerksamkeit erregt. Dieses Integrin ist eng mit der Adhäsion, Proliferation und Differenzierung von vaskulären Endothelzellen während der Neovaskularisation von Tumoren verbunden [2].

Der Fortschritt in der molekularen Bildgebung hat die nichtinvasive Überwachung des Tumorwachstums auf molekularer Ebene ermöglicht. Molekulare Bildgebungsstudien der interessierenden Zielmoleküle müssen zwei grundlegende Elemente aufweisen:(1) geeignete Zielkomponenten und (2) Signalkomponenten, die durch bildgebende Verfahren nachgewiesen werden können. Integrin α_v β₃ , das spezifisch die Arginin-Glycin-Aspartat-Sequenz (Arg-Gly-Asp, RGD) in ECM-Proteinen erkennt und bindet, wird durch Konformationsänderungen aktiviert. Daher wurde die RGD-Sequenz bei der Synthese von Tumor-Targeting-Tracern als wichtige Targeting-Komponente häufig verwendet [3]. Die Magnetresonanz(MR)-Bildgebung hat sich aufgrund ihrer nichtionisierenden Strahlung, der hohen Weichteilauflösung und der unbegrenzten Eindringtiefe zu einem der leistungsfähigsten molekularen Bildgebungsdiagnostikinstrumente zur Überwachung von Tumoren entwickelt [4, 5]. Statistische Auswertungen ergaben, dass etwa 50 % der MR-Untersuchungen den Einsatz von Kontrastmitteln erfordern, um die Bildqualität zu verbessern [6, 7]. Die Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung ist eine Art optischer Bildgebung, und die Wellenlänge von Nahinfrarotlicht, dem am frühesten entdeckten nicht sichtbaren Licht, reicht von 700 bis 900 nm. Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren ermöglichen es Chirurgen, Tumore während der Operation zu visualisieren, abzugrenzen und zu resezieren [8, 9]. Mit Veränderungen im Krankheitsspektrum des Menschen kann die molekulare Bildgebung im Single-Mode jedoch aufgrund ihrer hohen falsch-positiven und falsch-negativen Raten den Anforderungen einer Präzisionsdiagnostik nicht gerecht werden. Daher werden molekulare Bildgebungsverfahren, die auf der Integration mehrerer Modi basieren, ein neuer Trend in der Entwicklung der molekularen Bildgebung sein [10].

In dieser Studie haben wir eine molekulare Dual-Mode-Sonde cRGD-Gd-Cy5.5 hergestellt, die in der histologischen und funktionellen Bildgebung von Tumoren verwendet werden kann (Schema 1). Im Vergleich zu den molekularen Sonden mit Fe₃ O₄ als Signaleinheit [11, 12] war cRGD-Gd-Cy5.5 herausragend mit (a) hohem Paramagnetismus (sieben ungepaarte Elektronen um Gd ^{3 +} ); (b) Fähigkeit, mit dem Träger zu binden, um einen stabilen Chelatbildner zu bilden, wie beispielsweise Magnevist, das in der Klinik weit verbreitet verwendet wird; (c) hohe räumliche Auflösung und höhere Bildschärfe als bei negativen Kontrastmitteln [13, 14]. Wir wählten Liposomen als Trägermolekül, das das MR-Kontrastmittel mit dem Fluoreszenz-Kontrastmittel verbindet. Herkömmliche Phospholipide haben zwei lange hydrophobe Kohlenwasserstoffketten und eine hydrophile Gruppe in ihren Molekülstrukturen. Bei Zugabe zu Wasser oder Pufferlösung nehmen geeignete Mengen an Phospholipidmolekülen Anordnungen in bestimmten Richtungen ein, wobei ihre hydrophilen Gruppen auf beiden Seiten der Wasserphase zugewandt sind und die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten einander zugewandt sind, um die Doppelschicht in Liposomen zu bilden. Auf RGD gerichtete zyklische Peptide und Cy5.5-fluoreszierende Moleküle wurden über ein eingeführtes Polyethylenglycol (PEG)-Phospholipid mit Aminogruppen an die Liposomenoberfläche konjugiert, und schließlich wurden Gd-Ionen in die Liposomen eingekapselt, um den Aufbau der zielgerichteten multimodalen molekularen Sonde zu erreichen mit wünschenswerten Eigenschaften in Bezug auf Struktur, Zusammensetzung, Größe, Form, Stabilität und MR-Relaxivität. Seine Zytokompatibilität wurde durch einen Zytotoxizitätstest und eine Beobachtung der Zellmorphologie bestimmt. Schließlich wurde das Potenzial von cRGD-Gd-Cy5.5 für die T1-gewichtete MR-Bildgebung und Fluoreszenzbildgebung von In-vitro-Krebszellen bewertet.

Der Syntheseweg der Gd-dotierten Liposomen, gefolgt von RGD-Konjugation und Cy5.5 für Bioanwendungen, zum hochempfindlichen Nachweis von Integrin α_v β₃

Ergebnisse

Charakterisierung der cRGD-Gd-Cy5.5-Nanoprobe

Die cRGD-Gd-Cy5.5-Lösung war eine blassrosa klare Flüssigkeit ohne offensichtliche Ausfällung nach längerem Stehen, was auf eine gute Dispersion hinweist. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte das Erscheinungsbild des cRGD-Gd-Cy5.5-Liposomenkomplexes als kugelförmige Form von einheitlicher Größe ohne Körnchenaggregation oder -schädigung nach negativer Färbung mit 2% Natriumphosphowolframat, wie in Abb. 1a gezeigt. Die Partikelgrößenverteilung war konsistent und reichte von 50 bis 80 nm mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 60,08 ± 0,45 nm. Die hydratisierte Partikelgröße des cRGD-Gd-Cy5.5-Liposomenkomplexes, gemessen mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), betrug 124,2 ± 0,215 nm (Abb. 1b). Wie in der Abbildung gezeigt, zeigten die Nanopartikel eine enge Größenverteilung in Wasser und eine gute Dispergierung. Das Oberflächen-Zetapotential betrug 39,5 ± 1,65 mV, was eine positive Oberflächenladung zeigt, die mit dem Vorhandensein von Aminogruppen auf der Oberfläche übereinstimmt (Abb. 1c).

Charakterisierungsdaten der CRGD-GD-CY5.5-Nanosonde. a TEM-Bilder mit geringer Vergrößerung von cRGD-Gd-Cy5.5. b Die Partikelgröße wurde durch Größenanalyse nachgewiesen und die durchschnittliche Größe der Sonde betrug 124,2 nm. c Das Zeta-Potential beträgt etwa 39,5 mV, die scheinbare Oberfläche ist elektropositiv

Der multifunktionale Mikroplattenassay zeigte, dass die leeren Liposomen keinen UV-Absorptionsbereich aufweisen und Liposomen, die mit fluoreszierendem Cy5.5 in 600 nm Anregungslicht gekoppelt sind, einen offensichtlichen Absorptionspeak bei 685 nm aufweisen (Abb. 1a), was mit der Emissionswellenlänge von fluoreszierendem Cy5.5 . übereinstimmt . Fluoreszierende Moleküle zeigten, dass Cy5.5 erfolgreich gekoppelt wurde. Die Ergebnisse des Kleintier-Fluoreszenz-Bildgebungssystems zeigten, dass das mit Liposomen konjugierte Fluoreszenz-Cy5.5 unter dem 600-nm-Anregungslicht eine deutliche rote Fluoreszenz aufwies, während das leere Liposom kein Fluoreszenzsignal aufwies (Abb. 2b).

Fluoreszenzeigenschaften der cRGD-Gd-Cy5.5-Nanosonde. a Das mit Fluoreszenz-Cy5.5 markierte Liposom wurde mit einem multifunktionalen Enzymanalysator nachgewiesen, und es gab einen sichtbaren Emissionspeak bei 670 nm bei 600-nm-Anregungslicht. b Unter 600-nm-Anregungslicht weist das Liposom-gekoppelte fluoreszierende Cy5.5 (links) eine deutliche Lumineszenz auf, während das leere Liposom (rechts) keine Fluoreszenzbildgebung aufweist

MR-Relaxometrie der cRGD-Gd-Cy5.5-Nanoprobe

Die r1-Relaxationsrate ist ein wichtiger Parameter zur Beurteilung der Abbildungsleistung von T1-MR-Kontrastmitteln. Daher haben wir die T1-Relaxationszeit der Sonde cRGD-Gd-Cy5.5 mit verschiedenen Gd-Konzentrationen gemessen. Wie in Abb. 3b gezeigt, betrug die r1-Relaxationsrate von cRGD-Gd-Cy5.5 10,515 mM ⁻¹ s ⁻¹ nach linearer Anpassung viel höher als beim klinischen Produkt Magnevist (4,56 mM ⁻¹ .) s ⁻¹ ). Die hohe r1-Relaxationsrate von cRGD-Gd-Cy5.5 kann auf die besondere räumliche Struktur der Trägerliposomen und den biologischen Signalverstärkungseffekt der Liposomen zurückzuführen sein. Mit steigender Gd-Konzentration verstärkte cRGD-Gd-Cy5.5 die MR-Signalintensität (Abb. 3a). Diese Ergebnisse zeigten, dass das synthetische cRGD-Gd-Cy5.5 die Anforderungen an einen hohen Bildkontrast in der MR-Bildgebung erfüllt.

Die Relaxationseigenschaften von cRGD-Gd-Cy5.5-Nanosonden. a T1- gewichtete Bilder (Siemens, Verio,3.0T, MOLLI, Sequenz:TR = 5.8 ms, TE = 3.66 ms, TI = 16–3200 ms) dieser Partikel bei unterschiedlichen Konzentrationen (Gd). b Die Anpassungskurven von Gd-Konzentration und Relaxationszeit; der r1-Wert von cRGD-Gd-Cy5.5 betrug 10.515 mM ⁻¹ s ⁻¹

Zytotoxizitätsstudie der cRGD-Gd-Cy5.5-Nanoprobe

Die In-vitro-Zytotoxizität von cRGD-Gd-Cy5.5 wurde durch den CCK-8-Assay im Vergleich zur Lebensfähigkeit der Zellen in der unbehandelten Gruppe (100%) bewertet. Alle Zellen zeigten eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 70 % im Bereich der getesteten Gd-Konzentrationen (50–400 μM) (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass diese molekulare Sonde eine gute Zellkompatibilität aufweist. Bemerkenswert ist, dass die Zelllebensfähigkeit selbst nach 24 Stunden Inkubation mit 400 μM Gd immer noch über 70 % lag, einer Konzentration, die wesentlich höher war als die in vitro und in vivo verwendeten Dosierungen.

Zytotoxizitätstest. Zelllebensfähigkeit des menschlichen Lungenadenokarzinoms (A549), der Nasopharynxkarzinom-Zelllinie (SUNE-1-5-8F), der menschlichen Nabelvenen-Endothelzelle (HUVEC) und der normalen Brustzelllinie (MCF10A), inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von cRGD-Gd- Cy5.5 für 24 Stunden

Immunfluoreszenz-Färbung und Durchflusszytometrie-Assay von Integrin αvβ3

Die Ergebnisse der Immunfluoreszenz zeigten, dass die Integrin-αvβ3-Expression in A549- und 5-8F-Zellen in der Zellmembran und im Zytoplasma lokalisiert war. Das Integrin von A549-Zellen war hauptsächlich in der Zellmembran lokalisiert, und die Fluoreszenzintensität auf der Oberfläche von A549-Zellen war höher als die von SUNE-1-5-8F-Zellen. Die Fluoreszenzintensität von MCF-10A-Zellen war extrem schwach, was zeigt, dass auf der Oberfläche von Brustepithelzellen fast kein Integrin αvβ3 exprimiert wurde (Abb. 5a). Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie sind in Abb. 5c dargestellt. Die Integrin-αvβ3-Expressionsniveaus rangieren wie folgt:A549 (89,07 %)> SUNE-1-5-8F (63,84 %)> MCF-10A (1,56%), was darauf hindeutet, dass die αvβ3-Werte in Krebszellen signifikant höher waren als in normaler Brust Drüsenzellen.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bilder von A549-, SUNE-1-5-8F- und MCF-10A-Zellen. a Zelluläre Immunfluoreszenzbilder von Integrin αvβ3. A549- und SUNE-1-5-8F-Zelllinie exprimiert in der Zellmembran, MCF-10A-Zellen fast keine Expression von Integrin α_v β₃ . b A549-, SUNE-1-5-8F- und MCF10A-Zellen, inkubiert mit cRGD-Gd-Cy5.5 bei 200 μg ml ^-1 Konzentration bei 37 °C für 1 h. Die Menge der an Zellen gebundenen Sonden stimmt mit den Ergebnissen der zellulären Immunfluoreszenz überein. c Durchflusszytometrie-Assay zum Nachweis der Integrin-αvβ3-Expression in den A549-, SUNE-1-5-8F- und MCF-10A-Zellen

Zelluläre Aufnahme von cRGD-Gd-Cy5.5

Basierend auf den Ergebnissen der Immunfluoreszenzfärbung wurden mit cRGD-Gd-Cy5.5 inkubierte A549- und 5-8F-Zellen als Versuchsgruppen verwendet, während die mit cRGD-Gd-Cy5.5 inkubierten MCF-10A-Zellen als Kontrollgruppe. Nach Inkubation mit cRGD-Gd-Cy5.5 wurden in der Membran sowohl von A549- als auch von 5-8F-Zellen rote Fluoreszenzsignale beobachtet, wobei die Signalintensität in A549-Zellen höher war als in SUNE-1-5-8F-Zellen (Abb. 5b). Dieses Ergebnis stimmt mit der Expression von Integrin αvβ3 überein, die durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen wurde. In der Membran der MCF-10A-Zellen der Kontrollgruppe wurde fast kein rotes Fluoreszenzsignal gefunden.

In-vitro-MR-Bildgebung und Fluoreszenz-Bildgebung

Aufgrund seiner hohen r1-Relaxationsrate und guten Zellkompatibilität wurde cRGD-Gd-Cy5.5 als positives Kontrastmittel für die MR-Bildgebung von Krebszellen in vitro verwendet. Wie in Abb. 6a, b gezeigt, wurde die Farbe der T1-gewichteten MR-Bilder allmählich heller, was darauf hindeutet, dass die MR-Signalintensität von mit cRGD-Gd-Cy5.5 behandelten A549-Zellen mit höheren Gd-Konzentrationen zunahm. Der Unterschied in der T1-Relaxationszeit zwischen den beiden Gruppen war statistisch signifikant, wie durch das t . angezeigt Test auf zwei unabhängige Stichproben (p < 0,05). Diese Daten legen nahe, dass synthetisches cRGD-Gd-Cy5.5 das Potenzial hat, als positives Kontrastmittel in der in-vitro-MR-Bildgebung von Krebszellen verwendet zu werden. In ähnlicher Weise zeigte ein Kleintier-Fluoreszenzsystem eine entsprechende Zunahme der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Sondenkonzentration (Abb. 6c). Aus dem Bildsignal und den spezifischen Daten war die bildgebende Wirkung der Zielgruppe (cRGD-Gd-Cy5.5) besser als die der Nicht-Targeting-Gruppe (Gd-Cy5.5).

Zell-Magnetresonanz- und Fluoreszenz-Bildgebung. a Die Zellen wurden mit A549-Zellen für 2 h gemäß den Gd-Konzentrationen inkubiert:0, 0,005, 0,01, 0,02, 0,04 und 0,08 (mM). Als Kontrollgruppe wurde Gd-Cy5.5 verwendet. b T1-Relaxationszeit des entsprechenden Magnetresonanzbildes. c Bilder von Kleintier-Live-Imaging-Systemen

In-vivo-MR- und Fluoreszenz-Bildgebung

Die vor Kontrastmittelinjektion aufgenommenen MRT-Bilder zeigten keine signifikanten Signalunterschiede zwischen Tumoren und anderen peripheren Organen/Geweben. 5 Minuten nach der Injektion mit CRGD-Gd-Cy5.5 begann die Signalintensität an den Tumorstellen verstärkt zu werden, aber die stabile Hyperintensität wurde 6 h nach der Injektion aufrechterhalten. In der Testgruppe wurde seit 30 min ein verstärktes Tumorparenchym beobachtet, und die Verstärkung war nach 2 h verstärkt (Abb. 7a). In der rezeptorblockierten Gruppe wurde jedoch nur eine leichte Verstärkung an den Rändern von Tumoren gefunden, und der Verstärkungsgrad war nach 2 h abgeschwächt und bereits verschwunden (Abb. 7a). Auf den Fluoreszenzbildern nahm die Fluoreszenzintensität in der Zielgruppe seit der 30. Minute allmählich zu, war jedoch zur sechsten Stunde immer noch hoch (Abb. 7b), was darauf hindeutet, dass die Blutzirkulation verlängert und CRGD-Gd-Cy5.5 effizient in . konzentriert wurde Tumoren. In der rezeptorblockierten Gruppe wurde zu keinem der getesteten Zeitpunkte eine spezifische Sondenkonzentration beobachtet. In der sechsten Stunde wurde eine hochintensive Fluoreszenz an der beidseitigen Niere beobachtet (Abb. 7b). Wir folgern, dass der Stoffwechselweg von CRGD-Gd-Cy5.5 die Clearance durch das Nierensystem sein könnte.

MR- und Fluoreszenz-Bildgebung von subkutanen Xenotransplantat-Tumormodellen von Nacktmäusen mit Nasopharynxkarzinom. a Nackte Mäuse wurden anästhesiert und mit einem 3,0-T-MRT-Scanner vor der Injektion und 0,5, 2 und 6 h nach der Injektion dargestellt. b Nackte Mäuse wurden 0,5, 2 und 6 h nach der Injektion anästhesiert und mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem abgebildet.

Diskussion

Integrin αvβ3 wird nicht nur in den Endothelzellen der Tumor-Neovaskulatur, sondern auch auf der Oberfläche einer Vielzahl von Tumorzellen, wie malignes Melanom, malignes Gliom, Prostatakrebs, Lungenkrebs und Brustkrebszellen, stark exprimiert [15], während αvβ3 wird in regulären Epithelzellen und reifen vaskulären Endothelzellen nicht oder in geringen Mengen exprimiert. Basierend auf den oben genannten Eigenschaften ist Integrin αvβ3 zu einem idealen Ziel für die In-vivo-Überwachung von Tumormetastasen geworden [16]. Die aktuellen Methoden zur Messung der Integrin-αvβ3-Expressionsniveaus haben jedoch immer noch Probleme in Bezug auf Nicht-Invasivität, Wiederholbarkeit und Aktualität der Bildgebung, die noch gelöst werden müssen. Angesichts der obigen objektiven Probleme wurde in dieser Studie eine molekulare Dual-Mode-Sonde für die dynamische Echtzeitüberwachung der Integrin-αvβ3-Expression synthetisiert, die indirekt das Ziel der Vorhersage und Überwachung von Tumormetastasen erreichte.

Kontrastmittel lassen sich nach dem Mechanismus der MR-Bildgebung in zwei Typen einteilen:Gd-Verbindungen (T1-positives Kontrastmittel) und paramagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (T2-negatives Kontrastmittel). Gegenüber anderen Kontrastmitteln haben Gd-Verbindungen in der klinischen Praxis beispiellose Vorteile [17]. Das Gd-Ion, ein superparamagnetisches Material, liefert in T1-gewichteten Bildern ein Signal hoher Intensität. Gd kann auch an eine Vielzahl von Substanzen binden, um stabile Komplexe mit hoher räumlicher Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis zu bilden. Jeder Kontrastmitteltyp hat jedoch seine eigenen Grenzen (nämlich die kurze Blutzirkulationszeit von T1-Kontrastmitteln und die magnetischen Suszeptibilitätsartefakte von T2-Kontrastmitteln) [18,19,20,21]. Herkömmliche Gd-Verbindungen haben die folgenden Einschränkungen. (1) Herkömmliche Gd-Chelate haben keine zielgerichtete Wirkung. (2) Die Signalintensität von Gd-Chelat-Kontrastmitteln ist bei gleicher Konzentration geringer als die von ultrakleinen superparamagnetischen Eisenoxidpartikeln (USPIOs). Um die oben genannten Probleme zu lösen, werden Gd-Ionen an makromolekulare Strukturen (wie Liposomen, dendritische Moleküle und Dextran) gebunden, um den T1-Relaxationseffekt zu verstärken [22], und der Komplex wird dann an den Liganden von Tumorzielen gebunden, um molekulare Sonden herzustellen und eine tumorgerichtete Bildgebung zu erreichen [23]. In dieser Studie wurden Liposomen als Trägermolekül ausgewählt, das MR-Kontrastmittel mit fluoreszierenden Kontrastmitteln verbindet. Die spezielle räumliche Struktur der Liposomen hat einen biologischen Signalverstärkungseffekt und verbessert effektiv die Konzentration von Gd-Ionen in lokalen Geweben, wodurch die MR-Signalintensität erhöht wird. Zhouet al. [24] verwendeten β-Cyclodextrin-verknüpfte polyedrische oligomere Silsesquioxan(POSS)-Nanopartikel als Träger, um RGD an Gd-Verbindungen zu koppeln, um erfolgreich die molekulare Sonde cRGD-POSS-βCD-(DOTA-Gd) mit einer T1-Relaxationsrate von . zu erhalten 9,50 mM ⁻¹ S ⁻¹ . Für den in dieser Studie erhaltenen Liposom-cRGD-Gd-Cy5-Komplex wurde eine T1-Relaxationsrate von 10,515 mM ⁻¹ . gefunden S ⁻¹ , das mehr als das Doppelte der T1-Relaxationsrate des derzeit klinisch eingesetzten Gd-Wirkstoffs (Magnevist) ist, und dieser Komplex zeigte auch hervorragende MR-Bildgebungseigenschaften.

Die von unserer Gruppe hergestellte Nanosonde hat eine einheitliche Größe, ein regelmäßiges Aussehen und eine gute Dispergierbarkeit. Das Zetapotential spiegelt die Stabilität der molekularen Sonde wider, und ein höherer positiver oder negativer Wert des Zetapotentials ist mit einem stabileren System und einer geringeren Möglichkeit der Aggregation verbunden. Im Allgemeinen gilt, dass Moleküle mit Zetapotentialen von mehr als + 30 mV oder weniger als – 30 mV eine gute Stabilität aufweisen. Das in dieser Studie erhaltene Zetapotential auf der Oberfläche des Sondenpartikels betrug + 39,5 ± 1,65 mV, was etwas niedriger als + 30 mV ist. Trotzdem wurde unter TEM keine Aggregation beobachtet.

Gd-Mittel sind die am häufigsten verwendeten MR-Kontrastmittel in der aktuellen klinischen Praxis, und ihre Biosicherheit kann nicht ignoriert werden. Guo et al. [25] fanden heraus, dass ein an dendritische Hyaluronsäure gekoppelter Gd-Komplex ein sehr sicheres und wirksames Mikropartikel als MR-Kontrastmittel mit hoher Sensitivität und geringer Restpräsenz im menschlichen Körper ist. Durch die Untersuchung der In-vitro-Zytotoxizität der konstruierten molekularen Sonde wurde gezeigt, dass diese molekulare Sonde eine geringe Zytotoxizität und eine hohe Biosicherheit für Tumorzellen sowie Nicht-Tumorzellen (Epithelzellen und vaskuläre Endothelzellen) aufweist. Wir glauben, dass Liposomen eine gute Biokompatibilität aufweisen, und die geringe Biotoxizität könnte ein Vorteil des Liposoms sein, das die Gd-Ionen einkapselt.

Basierend auf früheren Studien [26,27,28] wählte unsere Gruppe die Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549 mit hoher Expression von Integrin αvβ3 zur Verwendung in der experimentellen Gruppe aus, mit der innovativen Ergänzung der Nasopharynx-Karzinomzelle SUNE-1-5-8F Linie in den In-vitro-Zell-Targeting-Experimenten; Brustepithelzellen mit nahezu keiner Expression von Integrin αvβ3 wurden als negative Kontrollgruppe eingeschlossen. Die molekulare Sonde band gut an die Zellmembran der A549-Lungen-Adenokarzinom-Zellen und der SUNE-1-5-8F-Nasen-Rachen-Karzinom-Zellen, aber nicht an MCF-10A-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Sonde eine ausgezeichnete molekulare Targeting-Fähigkeit besitzt, die wurde durch die Ergebnisse des Immunfluoreszenztests bestätigt. Die Ergebnisse der MR-Bildgebung bestätigten ferner die Targeting-Eigenschaft der liposomalen cRGD-Gd-Cy5.5-Molekülsonde bei MR, mit Signalen von höherer Intensität als die von nicht zielgerichtetem Kontrastmittel (Gd-Cy5.5) in Tumorzellen. In-vivo-Experimente bestätigen, dass Sonden im Serum stabil bleiben und mindestens 6 h lang anhaltend auf die Tumorstellen abzielen können. Die Ergebnisse der in-vitro-Studien gewährleisten nachfolgende in-vivo-Studien der molekularen Sonde in einem metastasierten Modell des Nasopharynxkarzinoms bei Nacktmäusen.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Herstellungsverfahren für die Dual-Mode-Sonde cRGD-Gd-Cy5.5, die auf Integrin &agr;v&bgr;3 abzielt, machbar ist und diese Sonde die wünschenswerte Stabilität und Biosicherheit sowie eine hohe T1-Relaxationsrate aufweist. Die Sonde zeigte eine starke Targeting-Wirkung auf Zellen mit hoher Integrin-αvβ3-Expression, was eine solide Grundlage für eine nichtinvasive, effiziente und dynamische Echtzeitüberwachung von Tumormetastasen auf anatomischer und molekularer metabolischer Ebene mittels molekularer MR/Fluoreszenz-Bildgebung bildete in vivo.

Methoden

Synthese von cRGD-Gd-Cy5.5

Zu 20 ml Chloroform wurden 70 mg Lecithin, 20 mg Cholesterin und 210 mg DSPE-PEG2000-NH zugegeben und die Mischung in einen Ultraschallreiniger gegeben, um die Substanzen vollständig aufzulösen (wie durch eine klare Lösung ohne körnige Stoffe). Die Lösung wurde dann in einen birnenförmigen Kolben zur Rotationsverdampfung in einem 60 °C warmen Wasserbad gegeben, bis sich ein wabenartiger Film (kein flüssiger Rückstand) gebildet hatte. Gd-Trichlorid-Hexahydrat (10 mg) wurde genau abgewogen und in Carbonatpuffer bei pH 8,5 gelöst, um eine klare Lösung zu erhalten, die dann mit dem obigen wabenartigen Film zur Hydratation bei 50 °C für 1 h vermischt wurde; diesem Schritt folgte die Dispergierung und Verfeinerung durch eine Ultraschallsonde in einem Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor (VCX 750, Sonics, USA). Schließlich wurde die Mischung gesammelt und durch einen 0,22-μm-Filter geleitet und einer Ultrafiltration mit einem 10-kD-Ultrafiltrationsröhrchen unterzogen, um freies Gd-Trichlorid zu entfernen und Gd-Trichlorid tragende Liposomen zu erhalten, die dann bei 4 °C gelagert wurden.

Das zyklische RGD-Peptid wurde dann an das fluoreszierende Cy5.5-Molekül gekoppelt. Das zyklische RGD-Peptid (5 mg) wurde in 1 ml verdünntem Salzsäurepuffer bei pH 5,0 und 1 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und 0,5 mg N<. gelöst /i> -Hydroxysuccinimid (NHS) wurden zugegeben und dann bei Raumtemperatur 30 min in einem Oszillator bei konstanter Temperatur aktiviert. Das aktivierte cyclische RGD-Peptidmolekül wurde dann mit 100 μg des fluoreszierenden Cy5.5-Moleküls und dem Liposom gemischt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von Präzisions-pH-Testpapier mit 8,4 gemessen. Die Mischung wurde dann 4 h bei Raumtemperatur in einem Schüttler inkubiert; diesem Schritt folgte die Entfernung des nicht umgesetzten zyklischen RGD-Peptids und des fluoreszierenden Cy5.5-Moleküls durch die Verwendung eines 10-kD-Ultrafiltrationsröhrchens.