Umweltfreundliche Mikroplasma-Synthese gelb-emittierender Kohlenstoff-Quantenpunkte für Krebszell-Imaging und photokatalytische Inaktivierung

Zusammenfassung

In den letzten Jahren zeigen multifunktionale Nanopartikel mit kombinierten diagnostischen und therapeutischen Funktionen großes Potenzial in der Nanomedizin. In dieser Studie berichten wir über die umweltfreundliche Synthese fluoreszierender Kohlenstoff-Nanopartikel, speziell Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs), mittels Mikroplasma unter Verwendung von o-Phenylendiamin. Die hergestellten CQDs zeigten breite Absorptionspeaks bei 380–500 nm und emittierten helle gelbe Fluoreszenz mit einem Peak bei 550 nm. Die CQDs wurden schnell von HeLa-Krebszellen aufgenommen. Unter Blaulichtanregung erzeugten sie effizient ein helles gelbes Fluoreszenzsignal und intensive reaktive Sauerstoffspezies (ROS), was simultanes fluoreszierendes Krebszell-Imaging und photodynamische Inaktivierung ermöglichte, mit einer 40%igen Abnahme der relativen Zelllebensfähigkeit. Zudem waren nach Inkubation mit 400 µg mL⁻¹ CQDs im Dunkeln etwa 98% der Zellen lebensfähig, was die exzellente Biokompatibilität der CQDs belegt. Daher sind die neu hergestellten CQDs als Materialien demonstriert, die effektiv und sicher für in-vivo-Bioimaging und bildgeführte Krebstherapie eingesetzt werden könnten.

Einleitung

Krebs bleibt weltweit eine der häufigsten Todesursachen. Multifunktionale Nanopartikel mit diagnostischen und therapeutischen Funktionen haben vielversprechende Anwendungen in der Nanomedizin. Simultane bildgeführte Therapie ist ein neues Konzept in der Krebstherapie und zeigt großes Potenzial zur Optimierung der therapeutischen Effizienz. Sie kann nützliche Informationen zu Tumorgröße und -lokalisation, optimalem Zeitfenster für Phototherapie und therapeutischer Wirksamkeit liefern. Photodynamische Therapie (PDT) wird zur Behandlung vieler Krebsarten und anderer Erkrankungen eingesetzt aufgrund ihrer räumlich-zeitlichen Selektivität und nicht-invasiven Natur. Ideale Photosensibilisatoren besitzen grundsätzlich: (1) hocheffiziente ROS-Generierung, (2) gute Biokompatibilität, (3) Wasserlöslichkeit. Aktuelle PDT-Anwendungen sind jedoch durch schlechte Wasserlöslichkeit, Instabilität und suboptimale Anregungswellenlängen von Photosensibilisatoren limitiert. Daher ist die Erzeugung von Photosensibilisator-Substituten mit guter Wasserlöslichkeit und Biokompatibilität durch umweltfreundliche, kostengünstige Methoden erforderlich.

Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs) haben aufgrund ihrer einzigartigen vorteilhaften Eigenschaften enorme Aufmerksamkeit erregt: einfache und umweltfreundliche Synthese, geringe Toxizität, bemerkenswerte Biokompatibilität, exzellente Wasserlöslichkeit und Lichtstabilität. CQDs haben Potenzial in zellulärem Imaging, Biosensing, gezielter Wirkstofffreisetzung und anderen biomedizinischen Anwendungen. Es gibt zwei Hauptansätze für die Synthese von Kohlenstoffpunkten: Bottom-up und Top-down. Top-down-Methoden umfassen elektrochemische Oxidation, Laserablation, chemische Oxidation und Ultraschallsynthese. Bottom-up-Methoden bestehen aus hydrothermaler Behandlung, Mikrowellensynthese und thermischer Zersetzung. Die erforderlichen hohen Temperaturen, Drücke und starken Säuren führen jedoch stets zu erheblichem Energieverbrauch, komplizierten Prozessen und unvermeidbaren Umweltschäden. Daher entstehen neuartige umweltfreundliche Synthesemethoden als Antwort auf die Zeit. Wie berichtet, können CQDs innerhalb weniger Minuten mittels Mikroplasma-Flüssigkeitsmethode ohne hohe Temperaturen, großen Energieeintrag und aufwendige Verfahren hergestellt werden. Mikroplasmen bieten eine einzigartige physikalisch-chemische Umgebung für Grundlagenstudien und Anwendungen mit fortschrittlichen Materialien. Die chemischen und elektronischen Umgebungen der Mikroplasmen sind stark aus dem Gleichgewicht und können Energie speichern. In dieser Umgebung können große Mengen an Elektronen, Ionen, freien Radikalen und anderen angeregten, ionisierten, aktiven Substanzen erzeugt werden. Obwohl o-Phenylendiamin ein Rohmaterial für die Synthese von Kohlenstoff-Nanopunkten ist, wurde es noch nicht in der Mikroplasma-Synthese verwendet.

In dieser Studie wurde o-Phenylendiamin als Rohmaterial zur Synthese von CQDs mittels Mikroplasma-Behandlung verwendet. Die so erzeugten CQDs waren einheitlich in der Größe (ca. 3,2 nm Durchmesser) und zeigten einen Emissionspeak bei ~550 nm. Wir demonstrierten, dass die neu synthetisierten CQDs unter Lichtbedingungen große Mengen an ROS produzieren können. In vitro konnten CQDs von HeLa-Tumorzellen aufgenommen werden und emittierten gelbes Licht unter Blaulichtanregung (420–500 nm) mit geringer Toxizität. Wir beobachteten auch die Inaktivierung von HeLa-Tumorzellen unter Bestrahlung bei 460 nm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die neu hergestellten CQDs vielversprechende Materialien für in-vivo-Bioimaging, bildgeführte oder gezielte Krebstherapie sein könnten.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der CQDs

Die gelb-emittierenden CQDs dieser Studie wurden in einer einfachen und umweltfreundlichen Weise durch eine Mikroplasma-Methode unter Verwendung von o-Phenylendiamin als Kohlenstoffvorläufer hergestellt. Obwohl die Mikroplasma-Verarbeitung für die Synthese von Kohlenstoff-Nanopunkten berichtet wurde, gibt es wenige entsprechende Forschungen. Abbildung 1A zeigt TEM-Bilder der CQD-Partikel. Die durch Mikroplasma erzeugten Partikel waren zyklisch oder oval mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 3,2 nm. Wie im hochauflösenden Bild (Abb. 1A, Inset) gezeigt, beträgt der Gitterabstand in den CQDs 0,21 nm, was der (1,1,0)-Ebene von Graphit entspricht. Das Raman-Spektrum zeigt den D-Modus (durch Unordnung induzierter Modus) bei ~1342 cm⁻¹ und den G-Modus bei ~1507 cm⁻¹, resultierend aus sp³- und sp²-Hybridisierung von Kohlenstoff (Abb. 1E). Bekanntlich hängt die Intensität des D-Modus im Vergleich zum G-Modus von der Größe der Graphit-Mikrokristalle in der Probe ab. Höhere Unordnung führt zu höherem ID/IG-Verhältnis und kleineren Graphit-Mikrokristallen. Zudem können D- und G-Modus von CQD-Pulvern als kleine Graphitflocken mit relativ hohem ID/IG-Verhältnis (0,77) betrachtet werden.

FTIR und RPS sind leistungsstarke Werkzeuge zur Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung und Struktur kohlenstoffbasierter Materialien. FTIR-Daten für CQDs wurden im Bereich 400–4000 cm⁻¹ aufgezeichnet (Abb. 1F). Das FTIR-Spektrum zeigte, dass die CQDs hauptsächlich Amin (3052 und 3324 cm⁻¹), OH (3200 cm⁻¹), C=O (1595 cm⁻¹), C–N/C–O (1200 cm⁻¹), C=C (1500 cm⁻¹) und CH (748 cm⁻¹) funktionelle Gruppen oder chemische Bindungen enthalten. Die Oberflächenbestandteile der CQDs, bestimmt durch RPS, stimmten mit den FTIR-Ergebnissen überein. Das Vollspektrum (Abb. 2A) zeigte drei typische Peaks: C 1s (285 eV), N 1s (400 eV), O 1s (531 eV).

Wie in Abb. 2B–D gezeigt, ergab die C 1s-Analyse sp²/sp³-Kohlenstoffe (C–C/C=C, 284,8 eV), stickstoffhaltige Kohlenstoffe (C–O/C–N, 285,9 eV) und Carbonyl-Kohlenstoffe (C=O, 287,7 eV). Das N 1s-Band wurde in drei Peaks bei 399,3, 400,3 und 401,7 eV dekonvolutiert, korrespondierend zu pyrrolischem N, graphitischem N und aminischem N. Das O 1s-Band enthielt Peaks bei 531,6 und 533,1 eV für C–O und C=O. Wichtig: Das Vorhandensein dieser funktionellen Gruppen verleiht den CQDs günstige Löslichkeit. Weiterhin wurden die optischen Eigenschaften mittels Fluoreszenz- und UV-Vis-Spektroskopie untersucht. Die Fluoreszenzemissionsspektren (Abb. 1C) zeigen anregungsabhängiges Emissionsverhalten. Bei Anregung von 400 bis 500 nm verschiebt sich der maximale Fluoreszenzemissionspeak von 473 auf 519 nm, die Intensität nimmt stark ab. Abb. 1D zeigt die UV-Vis-Spektren mit starkem Absorptionspeak im Bereich 400–490 nm. Die CQDs wiesen zwei charakteristische Absorptionspeaks bei 280 und 420 nm auf, zugeordnet zu π–π* (aromatisches C=C) und n–π* (Carboxyl und/oder C–N) Übergängen. Diese optischen Eigenschaften ermöglichen simultanes biologisches Imaging und photodynamische Inaktivierung.

Bioimaging und Zytotoxizität der CQDs

Zur Bewertung der Bioimaging- und Zellmarkierungsfähigkeit wurde in vitro zelluläres Imaging mit CQDs an HeLa-Zellen mittels Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) durchgeführt. HeLa-Zellen wurden mit 200 µg mL⁻¹ CQDs 6 h inkubiert und für CLSM-Detektion präpariert. Ergebnis: HeLa-Zellen zeigten helle gelbe Fluoreszenz, gleichmäßig im gesamten Zellinneren verteilt (Abb. 3A). Wichtig: Bereits die niedrige CQD-Konzentration von 200 µg mL⁻¹ reichte zur Markierung mit gelber Fluoreszenz, was das Potenzial für Zellimaging unterstreicht. Wie berichtet, zeigen Kohlenstoffnanopartikel oft starke Emission nur im Blaulichtbereich, während langwellige Emissionen meist schwach sind. Unter UV-Anregung zeigen biologische Gewebe häufig blaue Autofluoreszenz und sind anfällig für Photodamage, was biologische Imaging-Anwendungen von Kohlenstoffnanopartikeln mit kurzwelliger Emission stark behindert. Daher war die Entwicklung von Kohlenstoffnanopartikeln mit langwelliger Emission weit verbreitet. In dieser Studie zeigten die hergestellten CQDs helle gelbe Fluoreszenz unter Anregung mit 400–450 nm Licht. Die angeregte gelbe Fluoreszenz könnte CQDs für die Detektion tiefsitzender Tumoren befähigen. Allerdings ist der Weg zu praktischen Anwendungen im menschlichen Krebs-Imaging noch weit.

Neben Lumineszenzeigenschaften sind hohe Biokompatibilität und geringe Toxizität erforderlich, wenn CQDs als potenzielles Bio-Markierungsreagenz entwickelt werden sollen. Für biomedizinische Anwendungen müssen Materialien bei empfohlenen Dosierungen hoch biokompatibel sein. Zur Zytotoxizitätsprüfung wurden HeLa-Zellen mit CQDs bei Endkonzentrationen von 0 bis 400 µg mL⁻¹ für 24 h behandelt. Wie in Abb. 3B gezeigt, überlebten mehr als 95% der Zellen (MTT-Assay), was zeigt, dass CQDs praktisch ungiftig sind.

Diese Daten deuten darauf hin, dass die neu erzeugten CQDs mit angeregter gelber Fluoreszenz geringe Zytotoxizität und hohe Biokompatibilität aufweisen, was ihre vielversprechenden Aussichten für biologisches Imaging erleichtert.

Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie

Krebszell-Inaktivierung

Wie in Abb. 3C gezeigt, unterschied sich die Lebensfähigkeit nicht zwischen HeLa-Zellen, die nur mit CQDs oder nur mit Blaulicht behandelt wurden. Die gleichzeitige Behandlung mit CQDs und Blaulicht reduzierte die Zelllebensfähigkeit markant, abhängig von der Bestrahlungsdauer. Nach Bestrahlung bei 460 nm für 15 min zeigten die CQDs bemerkenswerte Antitumor-Aktivität; die Lebensfähigkeit von HeLa-Zellen sank um ca. 40% bei 200 µg mL⁻¹. Zur weiteren Detektion der Effekte angeregter CQDs wurden MTT-Assays zur Bestimmung der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) durchgeführt. Ergebnis: IC50 der angeregten CQDs auf HeLa-Zellen betrug ~427,5 µg mL⁻¹ (95% KI 366,7–498,7 µg mL⁻¹) nach 10 min Bestrahlung und ~255,1 µg mL⁻¹ (95% KI 220,9–249,8 µg mL⁻¹) nach 15 min Bestrahlung.

Diese Ergebnisse zeigen, dass angeregte CQDs Tumorzellen ähnlich effektiv abtöten können wie einige klinische Antikrebsmedikamente (z. B. Photofrin), was das vielversprechende Potenzial von CQDs in bildgeführter Antitumortherapie unterstreicht.

ROS-Generierung der CQDs

Während PDT können Krebszellen durch zytotoxische ROS abgetötet werden, die vom endozytierten Photosensibilisator unter geeigneten Bestrahlungsbedingungen erzeugt werden. ROS können Zielzellen durch Apoptose oder Nekrose mit geringen Nebenwirkungen via PDT in verschiedenen Erkrankungen inaktivieren. Abb. 4A zeigt, dass das ROS-Reagenz rote Fluoreszenz emittiert, was ROS-Generierung anzeigt. Das rote ROS-Signal überlagerte sich gut mit der Fluoreszenz der CQDs, was bedeutet, dass die ROS-Generierung eng mit der Aufnahme der CQDs durch Tumorzellen verknüpft ist. Abb. 4B: Im Vergleich zu Kontroll- und Nicht-Bestrahlungsgruppen zeigten die Versuchsgruppen unter 460 nm Laserbestrahlung für 15 min offensichtliche ROS-Generierung. Unsere Ergebnisse belegen, dass CQDs die intrazelluläre ROS-Produktion unter 460 nm Bestrahlung signifikant fördern und großes Potenzial für PDT-Anwendungen haben. Prinzipiell können CQDs vom Grundzustand (S0 in Abb. 4C) in einen angeregten Zustand (Sn) überführt werden; die Effizienz hängt von Lichtintensität und Extinktionskoeffizient ab. Nach lösungsmittelvermittelter Relaxation verbleiben CQDs im niedrigsten Schwingungsniveau des ersten angeregten Singulettzustands. Durch schnelle Schwingungsrelaxation nach Anregung ist die Energie des emittierten Photons aus dem ersten angeregten Singulettzustand (S1) niedriger als die Anregungsphotonenenergie, was zu einer Wellenlängenzunahme führt. Fluoreszenz-Imaging nutzt den CQD-Übergang S0 → Sn → S1. Die CQDs wurden von HeLa-Zellen aufgenommen und emittierten Fluoreszenz bei Bestrahlung mit geeigneter Wellenlänge, wodurch die Zellen markiert wurden. S1 kann in den S0-Zustand durch Fluoreszenz oder durch Intersystem-Crossing in einen nicht-fluoreszierenden Triplett-Zustand (T1) zurückkehren. Die fluoreszierende Gruppe von T1 ist besonders aktiv in Elektronentransferreaktionen, erzeugt Superoxid-Freie Radikale und führt anschließend zum Abbau der fluoreszierenden Gruppe. Die Energie von T1, übertragen auf molekularen Sauerstoff, erzeugt ein angeregtes Singulett-Sauerstoff-Oxidationsmittel, das stärker ist als Sauerstoff im Grundzustand. Superoxid-Radikale, Singulett-Sauerstoff und andere ROS (OH, H₂O₂) reagieren mit benachbarten biologischen Molekülen, üben Phototoxizität aus und führen zum Zelltod. Nach Aufnahme der CQDs durch HeLa-Zellen bewirkte Bestrahlung den Übergang vom Singulett- zum Triplettzustand über Intersystem-Crossing, der Energietransferprozess erzeugte ROS und führte letztlich zum Zelltod. Unter geeigneter Wellenlänge durchlaufen CQDs zwei Energieübertragungsarten: Fluoreszenzemission zur Markierung von HeLa-Tumorzellen und Abtötung von HeLa-Zellen durch ROS. Unsere experimentellen Daten zeigten die gute Biokompatibilität der neu hergestellten CQDs im Dunkeln und die Tumoreffizienz unter Lichtbedingungen. Daher können CQDs als Photosensibilisator für Tumorzellen und -gewebe eingesetzt werden.

Zusätzlich bleibt ungelöst, wie CQDs Tumoren präzise gezielt ansprechen und Tumorzellen effektiver abtöten können. Die vorhandenen oberflächenfunktionalen hydrophilen Gruppen (Carboxyl, Carbonyl, Epoxy, Hydroxyl etc.) ermöglichen Konjugation mit spezifischen Antikörpern, die Tumoren präzise targetieren könnten, sofern Tumore spezifische Biomarker aufweisen. Gleichzeitig könnten Kohlenstoffpunkte als Werkzeug für Wirkstoff- und Gentransfer dienen aufgrund ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses. Angesichts exzellenter Biokompatibilität, kleiner Größe für Internalisierung, reichhaltiger oberflächenfunktionaler Gruppen und Bioimaging-Potenzial gelten Kohlenstoffpunkte (inkl. CQDs) als vielversprechende theranostische Kandidaten für Tumortherapie. Dennoch bestehen Herausforderungen und ungelöste Probleme für Anwendungen in Nanomedizin und Bioimaging. Weitere Anstrengungen sind nötig, um die Translation von Kohlenstoffpunkt-basierter Nanomedizin vom Labor zum Patienten in Zukunft zu fördern.

Fazit

Zusammenfassend synthetisierten wir photolumineszente CQDs mittels Plasmaprozess aus o-Phenylendiamin. Angeregt durch einen Blaulaser emittierten CQDs mit ~3,2 nm Durchmesser gelbe Fluoreszenz. Raman, UV-Vis, FTIR und RPS zeigten, dass mehr Kohlenstoffatome in sp²-Hybridisierung involviert waren und eine neue organische Gruppe bildeten. Die per Plasmaprozess synthetisierten CQDs erwiesen sich als effektive Sonde in Zellimaging-Experimenten; die gelbe Fluoreszenz markiert HeLa-Zellen deutlich. Zudem zeigten die synthetisierten CQDs günstige Löslichkeit, Ungiftigkeit und hohe Biokompatibilität, was ihre Bioimaging-Fähigkeit beschleunigt. Darüber hinaus konnten angeregte CQDs HeLa-Zellen durch ROS-Generierung effektiv abtöten, was die zufriedenstellende photodynamische Zytotoxizität in vitro belegt und ihre Anwendung in PDT unterstützt.

Experimentelle Methoden

Synthese von Kohlenstoff-Quantenpunkten

Das Mikroplasma-Verarbeitungssystem ist in Zusatzdatei 1: Abbildung S1 zusammengefasst. Ein hohler Edelstahlrohr mit 180 µm Innendurchmesser wurde an eine Hochspannungs-Gleichstromquelle (Tianjin Dongwen High-Voltage Supply Co., Ltd., Tianjin, China) angeschlossen und 2 mm über der Lösungssoberfläche positioniert. Eine Pt-Elektrode (DJS-1; Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) wurde an den Kathodenpol der Stromquelle angeschlossen und in die Lösung getaucht. 400 mg o-Phenylendiamin (Shanghai, China) wurden in 40 ml deionisiertem Wasser gelöst, 20 ml der Lösung in eine Petrischale gegeben und mit einem Magnetrührer gerührt. Während der Mikroplasma-Behandlung floss Argon (Ar) mit 60 sccm durch das Rohr, der Gleichstrom wurde auf 17 mA gehalten. Nach 10 min Plasmasbehandlung wurde das bräunlich-schwarze Produkt mittels Dialysemembran (MWCO 500 Da) gegen 2 l deionisiertes Wasser 12 h dialysiert und anschließend durch eine 0,22 µm Ultrafiltrationsmembran filtriert. Schließlich wurden reine CQDs durch Gefriertrocknung erhalten.

Charakterisierung von Struktur, Zusammensetzung und optischen Eigenschaften der CQDs

Größe und Morphologie der CQDs wurden mittels TEM (JEM-2100F, JEOL, Tokyo, Japan) charakterisiert. Fluoreszenzspektroskopie erfolgte mit Perkin Elmer LS 55 Lumineszenzspektrometer (Waltham, MA, USA). UV/Vis-Absorptionsspektren wurden mit Varian Cary 50 UV-Vis-Spektrophotometer (Palo Alto, CA, USA) gemessen. FTIR-Spektren wurden mit Nicolet 6700 Spektroskop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) aufgenommen, Raman-Spektroskopie mit 800 UV Mikro-Raman-Spektrometer (Invia-reflex, UK). RPS-Experimente wurden mit Axis Ultra DLD System (Shimadzu/Kratos Analytical Ltd., Kyoto, Japan) durchgeführt.

Zellkultur und Zytotoxizitätsassay

HeLa-Zellen (ATCC, Manassas, VA, USA) wurden in DMEM mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in feuchter 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert. Für Zytotoxizitätsstudien wurden Zellen in 96-Well-Platten mit 200 µl Volldmedium bei 6000 Zellen pro Well geimpft. Nach 24 h Inkubation wurden Zellen mit CQDs bei 0, 25, 50, 100, 200, 400 µg mL⁻¹ für weitere 24 h inkubiert, dann Zelllebensfähigkeit mittels MTT-Assay bestimmt. Kurz: Lösungen wurden durch 100 µl MTT-Testlösung (0,5 mg mL⁻¹) ersetzt, 4 h im Dunkeln inkubiert. Überstand entfernt, Kristalle in DMSO gelöst. Absorption jedes Wells bei 490 nm gemessen. Optische Dichte wurde auf Zelllebensfähigkeit bezogen, wobei Kontrollprobe ohne CQDs 100% Lebensfähigkeit entsprach.

MTT-Assay wurde auch zur Bestimmung des IC50 angeregter CQDs auf HeLa-Zellen verwendet. HeLa-Zellen in 96-Well-Platten wurden mit CQDs bei 0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1600, 3200, 6400 µg mL⁻¹ für 24 h inkubiert, mit Licht bei 460 nm für 10 min bzw. 15 min bestrahlt, dann weitere 24 h kultiviert. Zelllebensfähigkeit jedes Wells mittels MTT-Assay bestimmt und für IC50-Auswertung verwendet.

Zellimaging

Zellen bei 2×10⁴ mL⁻¹ wurden in Konfokal-Schale (Durchmesser 15 mm) geimpft, 24 h kultiviert, zweimal mit PBS gewaschen (keine toten Zellen). CQD-Lösung (200 µg mL⁻¹, pH 7) zugegeben, 6 h inkubiert. Zellen dreimal mit PBS gewaschen (entfernung ungebundener CQDs), mit 4% Paraformaldehyd fixiert. Proben mit CLSM (LSM510, Zeiss, Deutschland) bei Anregungswellenlängen 400–450 nm beobachtet.

Photodynamische Therapie und ROS-Messung

Zur Untersuchung antitumoraler Effekte wurden HeLa-Zellen mit 200 µg mL⁻¹ CQDs 24 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert und mit Licht bei 460 nm (30 mW cm⁻²) für 5, 10, 15 min bestrahlt. Nach 24 h Inkubation wurde standardisierter MTT-Assay zur Bestimmung relativer Zelllebensfähigkeit durchgeführt. Intrazelluläre ROS-Generierung wurde chemisch mittels spektrophotometrischer Methode mit Fluorometrischem Intrazellulärem ROS-Assay-Kit (Sigma, USA) detektiert. Zellen wurden in Konfokal-Schale (15 mm) über Nacht für Anheftung kultiviert. Dann 200 µg mL⁻¹ CQDs 4 h inkubiert. Anschließend 100 µl/Well Master Reaction Mix zugegeben. Nach 1 h Inkubation Zellen mit 4% Paraformaldehyd 10 min fixiert, Fluoreszenzbilder per CLSM aufgenommen. Zur ROS-Produktionsdetektion: Zellen in 96-Well-Platten mit 200 µl Kultivierungsmedium. Nach 24 h Medium durch 100 µl CQD-Lösung bei 0, 100, 200 µg mL⁻¹ ersetzt, 4 h inkubiert. Proben dreimal mit PBS gewaschen, 15 min bestrahlt oder nicht, 100 µl/Well Master Reaction Mix 1 h inkubiert. Fluoreszenzintensität mit Fluoreszenzreader (520 nm Anregung, 605 nm Emission) detektiert.

Statistische Analysen

Experimente wurden dreimal wiederholt, statistische Analysen mit SPSS 19.0 durchgeführt. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden mit Mann-Whitney-U-Test verglichen. IC50 angeregter CQDs auf HeLa-Zellen wurde durch nichtlineare Regression evaluiert. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten und Materialien der aktuellen Studie sind auf Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

PDT:

Photodynamische Therapie

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

CQDs:

Kohlenstoff-Quantenpunkte

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

CLSM:

Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskop

DMEM:

Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

DMSO:

Dimethylsulfoxid

IC50:

Halbmaximale inhibitorische Konzentration