Carbon Dots @ Platin-Porphyrin-Composite als theranostischer Nanowirkstoff für eine effiziente photodynamische Krebstherapie

Hintergrund

Die photodynamische Therapie (PDT) wurde weithin als vielversprechende nicht-invasive therapeutische Methode zur Behandlung vieler menschlicher Krankheiten praktiziert, darunter verschiedene Hauterkrankungen, altersbedingter Makulaabbau und Krebs [1]. Die PDT kann allein oder in Kombination mit Operation, Chemotherapie oder ionisierender Strahlung angewendet werden [2]. Bei der photodynamischen Therapie werden Photosensibilisatoren (PSs) mit einer bestimmten Lichtwellenlänge bestrahlt, was die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies aus intrazellulärem Sauerstoff auslöst, die folglich Zelltod und Nekrose des proximalen Gewebes induzieren [3,4,5,6]. Da Photosensibilisatoren ohne Licht in der Regel harmlos sind, kann die Tumorbehandlung durch selektive Beleuchtung gezielt erfolgen und so die Schädigung des umgebenden gesunden Gewebes begrenzt werden [7,8,9]. Aktivierbare Photosensibilisatoren, wie Porphyrin- und Phthalocyanin-Derivate, besitzen nachweislich simultane Bildgebungs- und Therapiefähigkeiten für Krebs, und einige dieser Photosensibilisatoren wurden für die klinische Anwendung zugelassen [10, 11]. Viele von ihnen sind jedoch aufgrund der schlechten Wasserlöslichkeit, der verlängerten Lichtempfindlichkeit der Haut, der unzureichenden Selektivität und ihrer Unfähigkeit, in dem Bereich (>   700 nm) absorbiert zu werden, in dem die Haut am transparentesten ist, eingeschränkt, was bei klinischen Anwendungen zahlreicher herkömmlicher Chemikalien. Daher wurden zahlreiche Ansätze vorgeschlagen, PSs in Träger wie Liposomen [12], Polymernanopartikel [13, 14], Goldnanopartikel [15,16,17], Kohlenstoffnanoröhren [18], Graphene [19] und Kohlenstoff . einzubauen Nanopunkte [20,21,22].

In letzter Zeit haben Kohlenstoffquantenpunkte (CQDs) als neue Art von Kohlenstoffnanomaterialien aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften, wie überlegene optische Eigenschaften, ausgezeichnete Wasserlöslichkeit, geringe Toxizität, ausgezeichnete Biokompatibilität, gute Zellpermeabilität und einfache Herstellung, erhebliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. und Modifikation. Daher wurden für CQDs viele vielversprechende Anwendungen in den Bereichen Optoelektronik, Sensorik [23, 24], Theranostik [25,26,27] und Bioimaging gezeigt. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Methoden entwickelt, um eine Vielzahl von CQDs zu synthetisieren, wie das hydrothermale Verfahren, das Mikrowellenverfahren, das thermische Behandlungsverfahren und das elektrochemische Verfahren [28]. Unter ihnen wurden hydrothermale Methoden unter Verwendung natürlicher Vorstufen zur Herstellung von CQDs aufgrund ihrer grünen Chemie weit verbreitet [29, 30].

Darüber hinaus haben CQDs aufgrund ihrer zahlreichen Oberflächengruppen und ihrer angemessenen Biokompatibilität das Potenzial, eine Ladeplattform für verschiedene Moleküle zu sein [31, 32]. Insbesondere wenn sie mit verschiedenen chemischen Gruppen funktionalisiert sind, können CQDs mit verschiedenen funktionellen Elementen wie Wirkstoffmolekülen, Proteinen und Aptameren durch kovalente oder nichtkovalente Interaktion für vielseitige biomedizinische Anwendungen konstruiert werden [33]. Im Jahr 2012 haben Huang et al. entwarfen eine neuartige theranostische Plattform basierend auf Photosensibilisator-konjugierten Kohlenstoffpunkten. Bei Bestrahlung zeigte das hergestellte CQDs-Ce6 die stärkere Fluoreszenzemission und höhere photodynamische Wirksamkeit im Vergleich zu Ce6 allein [34]. 2014 haben Choi et al. entwickelten eine ähnliche theranostische Plattform basierend auf FA-konjugierten CQDs, beladen mit ZnPc [3]. Im selben Jahr haben Wang et al. entwickelten Konjugate, indem sie TMPyP elektrostatisch mit nicht-toxischen CQDs verbanden [35]. 2015 haben Beack et al. synthetisierten ein CQDs-Ce6-HA-Konjugat, das einen viel höheren photodynamischen Effekt zeigte als der von freiem Ce6 und CQDs-Ce6 [36].

Vor kurzem wurde von Naik et al. über einen neuen tetraplatinierten Porphyrinkomplex berichtet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Platinporphyrin im Dunkeln eine geringe Zytotoxizität aufwies, aber IC₅₀ Werte bis zu 19 nM bei 420-nm-Laserbestrahlung, was darauf hindeutet, dass der tetraplatinierte Porphyrinkomplex ein vielversprechendes Antikrebsmittel für die Krebstherapie ist [37]. Die synthetisierten tetraplatinierten Porphyrine wiesen jedoch eine geringe Biokompatibilität und Wasserlöslichkeit auf, was ihre klinische Anwendung einschränkte. Zu diesem Zweck entwickeln wir hier einen neuen theranostischen Nanoagens (CQDs@PtPor) durch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem tetraplatinierten Porphyrinkomplex (PtPor) und den negativ geladenen CQDs (Schema 1). Das CQDs@PtPor-Komposit integriert die optischen Eigenschaften von CQDs und die Antikrebsfunktion von Porphyrin in einer einzigen Einheit. Die spektralen Ergebnisse deuteten auf einen effektiven Resonanzenergietransfer von CQDs zu PtPor im CQDs@PtPor-Komposit hin. Beeindruckenderweise zeigte CQDs@PtPor den stärkeren PDT-Effekt als der von PtPor allein, was auf die höhere Effizienz von ¹ . zurückgeführt werden könnte O₂ Generierung von PtPor durch CQDs. Darüber hinaus könnte die geringe Größe von CQDs@PtPor eine selektive Akkumulation an der Tumorstelle durch den EPR-Effekt ermöglichen. Somit zeigte der as-prepared Nanomagnet (CQDs@PtPor) großes Anwendungspotential in der Krebstherapie.

Schematische Darstellung der Vorbereitung von CQDs@PtPor

Methoden

Trans-Platindiammindichlorid (Transplatin) wurde von Aladdin® bezogen. 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) wurde von Sigma-Aldrich bezogen. Alle Lösungsmittel wurden von Tianjin Fu Chen Chemical Reagents bezogen. Die anderen Chemikalien wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. gekauft und wie erhalten verwendet.

Synthese von [Trans-PtCl(NH₃ .) )₂ ]₄ -5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)-Porphyrinnitrat

Transplatin (0,193 mmol, 58 mg) und Silbernitrat (0,193 mmol, 33 mg) wurden in 5 ml DMF gelöst. Nach 24 Stunden langem Faden wurde das gebildete weiße Silberchlorid aus der resultierenden trüben Lösung durch Zentrifugation entfernt, um die klare Lösung zu erhalten, die dann zu der Suspension von 5,10,15,20-Tetra(4-pyridyl)porphyrin . gegeben wurde (0,487 mmol, 30 mg) in 3 ml DMF. Nach 48 h Rühren bei 50 °C wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt. Dann wurden 10 ml Diethylether zugegeben, um den roten Niederschlag zu erhalten, der dann mit Methanol, Dichlormethan und Diethylether gewaschen wurde. Schließlich wurde die Probe unter Vakuum getrocknet, um 81 mg Produkt zu erhalten. Ausbeute 86%. ¹ H-NMR (400 MHz; DMSO-d₆ ):δ 9,45 (d, 8H), 9,14 (s, 8H), 8,52 (m-Pyridyl, d, 8H), 4,70 (NH₃ , s, 24H), – 3.04 (s, 2H); MS (ESI):m /z =1209 [M-3(NO₃ .) )-2{PtCl(NH₃ .) )₂ }] ⁺ , 1074 [M-4(NO₃ .) )-2{PtCl(NH₃ .) )₂ }-2NH₃ -Cl-2H] ⁺ , 883 [M-4(NO₃ .) )-3{PtCl(NH₃ .) )₂ }] ⁺ , 866 [M-4(NO₃ .) )-3{PtCl(NH₃ .) )₂ }-NH₃ ] ⁺ , 812 [M-4(NO₃ .) )-3{PtCl(NH₃ .) )₂ }-Cl-2(NH₃ )] ⁺ , 574 [M-4(NO₃ .) )-2{PtCl(NH₃ .) )₂ }] ²⁺ .

Vorbereitung der CQDs

Im Allgemeinen wurden Zitronensäure (0,45 g) und Ethylendiamin (500 μl) in DI-Wasser (10 ml) gelöst. Dann wurde die Lösung in einen mit Poly(tetrafluorethylen) (Teflon) ausgekleideten Autoklaven (30 ml) überführt und 5 h auf 200°C erhitzt. Nach der Reaktion wurden die Reaktoren mit Wasser oder natürlich auf Raumtemperatur gekühlt. Das braun-schwarze Rohprodukt wurde in einer Zentrifuge 30 Minuten lang gereinigt, um agglomerierte Partikel zu entfernen, und dann gegen DI-Wasser dialysiert, um die CDs zu erhalten.

Vorbereitung des CQDs@PtPor-Composites

Das PtPor-Molekül, das vier positive Ladungen im Pyridinring trägt, kann durch eine elektrostatische Wechselwirkung an die Oberflächen der negativ geladenen CQDs binden, um das CQDs@PtPor-Komposit zu erhalten. Im Allgemeinen wurden 20 mg PtPor, gelöst in 3 ml DMSO, in 12 ml Wasser dispergiert. Die Lösung wurde langsam in die CQDs-Suspension (5 mg CQDs gelöst in 15 ml H₂ .) gegeben O) unter Beschallung. Nach 24 h Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung 30 min in einer Zentrifuge gereinigt, um agglomerierte Partikel zu entfernen, und dann 2 Tage gegen DI-Wasser dialysiert. Die wässrige Lösung von CQDs@PtPor wurde bei 4 °C lyophilisiert, um das gewünschte Produkt zu erhalten.

Die Berechnung der Quantenausbeute von CQDs

Die Quantenausbeute von CQDs wurde mit Chininsulfat als Referenz gemessen (0,1 M H₂ SO₄ wässrige Lösung, Fluoreszenzquantenausbeute ∼ 54%) nach folgender Gleichung:

Wobei Φ die Fluoreszenzquantenausbeute ist, I die Steigung der Kurven ist und η der Brechungsindex des Lösungsmittels ist. Der Index „st“ bezieht sich auf die Referenz der bekannten Quantenausbeute (Chininsulfat in 0,1 M H₂ SO₄ ). Die Absorption wurde bei der Anregungswellenlänge von 360 nm unter 0,1 gehalten, um die Reabsorption zu minimieren.

Singulett-Sauerstofferzeugung

Eine Lösung der Probe und 3-Diphenylisobenzofuran wurden in einer Glasküvette (3 ml) bei Raumtemperatur bestrahlt. Der Absorptionsabfall von DPBF bei 415 nm wurde in Bestrahlungsintervallen von 3 min bis 30 min gemessen. Die Produktion von Singulett-Sauerstoff wurde qualitativ durch den DPBF, einen Singulett-Sauerstoff-Quencher, bewertet. Der Prozentsatz des DPBF-Absorptionsabfalls, proportional zur Produktion von ¹ O₂ , wurde anhand der Differenz zwischen der anfänglichen Extinktion und der Extinktion nach einer gegebenen Bestrahlungsdauer bewertet. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.

Zytotoxizitäts-Assay von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor

Humane Zervixkarzinomzellen (HeLa) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum (FCS), 100 E/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin bei 37 °C und 6 % CO₂ . Der Methylthiazolyltetrazolium (MTT)-Lebensfähigkeitstest wurde gemäß einem Standardverfahren durchgeführt. Kurz gesagt, HeLa-Zellen (3 × 10 ³ /Well) wurden für 24 Stunden in 96-Well-Platten ausgesät, bevor sie den Medikamenten ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden über Nacht im Dunkeln mit Proben behandelt. Die Zytotoxizität wurde durch den MTT-Reduktionsassay bestimmt. Die Zellmonolayer wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann mit 50 &mgr;l MTT-Lösung (0,5 mg/ml) bei 37 °C für 3 h inkubiert. Nachdem die Medien entfernt wurden, wurden 100 ul DMSO zugegeben. Die Lösung wurde 30 min geschüttelt, um die gebildeten Formazankristalle in lebenden Zellen aufzulösen. Die Extinktion wurde bei zwei Wellenlängen, 540 nm und 690 nm, auf einem Labsystem Multiskan-Mikroplattenlesegerät (Merck Eurolab, Schweiz) gemessen. Jede dosierte Konzentration wurde in dreifachen Wells durchgeführt und für den MTT-Assay zweimal wiederholt.

Die Photozytotoxizität der Proben wurde nach einem ähnlichen Protokoll bewertet. Im Allgemeinen sind HeLa-Zellen (3 × 10 ³ pro Well) wurden in 96-Well-Platten für 24 h inkubiert, bevor sie den Arzneimitteln ausgesetzt wurden. Die Zellen wurden mit den Proben im Dunkeln über Nacht behandelt. Anschließend wurden die Zellen für 10 min einer 50 W Xenonlampe mit einem Wärmeisolierfilter und einem 500 nm Langpassfilter ausgesetzt. Die Fluenzrate betrug 6 mW/cm ² . Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT-Reduktionsassay bestimmt.

Bioimaging-Anwendungen von CQDs@PtPor

Die zelluläre Bildgebung wurde unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops bewertet. HeLa-Zellen (5 × 10 ⁴ Zellen pro Well) wurden in 6-Well-Kulturplatten ausgesät und 12 h anhaften gelassen. Anschließend wurden die Zellen 1 h bei 37 °C mit CQDs@PtPor (0,25 mg/ml) behandelt. Danach wurde der Überstand vorsichtig entfernt und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Objektträger montiert und mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss Laser Scanning Confocal Microscope; LSM7 DUO) unter Verwendung der ZEN 2009-Software (Carl Zeiss) beobachtet.

Ergebnisse

Vorbereitung von CQDs@PtPor

CQDs wurden durch eine hydrothermale Eintopfreaktion gemäß der in der Literatur beschriebenen Methode hergestellt [38], wie in Schema 1 gezeigt. Das PtPor wurde durch Komplexierung von substituiertem Transplatin mit 5, 10, 15, 20-Tetra(4-pyridyl .) synthetisiert )Porphyrin nach der beschriebenen Methode [37]. Da das PtPor-Molekül vier positive Ladungen im Pyridinring aufweist, können diese durch eine elektrostatische Wechselwirkung an die Oberflächen der negativ geladenen CQDs binden, was das gewünschte CQDs@PtPor-Komposit ergibt.

Charakterisierung von CQDs@PtPor

Die Transmissionselektronenmikroskop-(TEM-)Aufnahmen (Abb. 1 links) zeigen, dass die CQDs und CQDs@PtPor wie vorbereitet mit einheitlicher Größe homogen verteilt sind. Die in Abb. 1 rechts gezeigte Partikelgröße ist schmal (1–9 nm) und die durchschnittliche Größe, bestimmt durch das Histogramm, beträgt 2.5 bzw. 7.6 nm für CQDs bzw. CQDs@PtPor. Die mittlere Größe von CQDs@PtPor ist größer als die von CQDs, wahrscheinlich aufgrund der Adsorption des PtPor-Moleküls an der Oberfläche von CQDs durch eine elektrostatische Wechselwirkung.

TEM-Bilder (links) und entsprechende Größenverteilungshistogramme (rechts) von a CQDs und b CQDs@PtPor

Abbildung 2a zeigt das Röntgenbeugungsmuster (XRD) der wie synthetisierten CQDs. Der breite XRD-Peak von CQDs erscheint bei etwa 23°, was auf die ungeordnete Struktur von CQDs hinweist [39]. Die funktionellen Gruppen von CQDs wurden durch FTIR-Spektroskopie charakterisiert. Wie in Abb. 2b gezeigt, sind die breiten Peaks von 3000 bis 3500 cm ⁻¹ werden auf O-H- und N-H-Streckschwingungen zurückgeführt, was auf das Vorhandensein von Hydroxyl- und Aminogruppen hinweist. Die Peaks bei 1150 und 1230 cm ⁻¹ werden den C-O- bzw. C-N-Streckschwingungen zugeschrieben. Die Amidbindung wird durch die typischen Peaks bei 1678 und 1392 cm ⁻¹ . bestätigt , was auf die Schwingungen von C=O bzw. C-N des Amids zurückzuführen ist. Schließlich der Peak bei 1600 cm ⁻¹ wird als C=C/C=N-Bindung identifiziert. Im Vergleich zu den FTIR-Ergebnissen von Zitronensäure zeigten die CQDs keine signifikante charakteristische Absorption von Zitronensäure (CA), was darauf hindeutet, dass CA während des Hydrolyseprozesses hauptsächlich karbonisiert werden sollte. Außerdem ein neuer scharfer Peak bei 1700 cm ⁻¹ , wurde der Amidbindung zugeschrieben, was darauf hindeutet, dass Ethylendiamin auf der Oberfläche von CQDs über die -CONH-Bindung funktionalisiert werden sollte. Der mittlere Durchmesser und die Partikelgrößenverteilung von CQDs und CQDs@PtPor wurden durch DLS-Messung bestimmt (Zusatzdatei 1:Abbildung S1 und Abbildung 2c). Wie in Abb. 2c gezeigt, beträgt die mittlere Größe von CQDs@PtPor etwa 9,2 nm, was mit dem Ergebnis des TEM-Tests übereinstimmt. Die Messung des Zetapotentials wurde weiterhin durchgeführt, um die Konjugation zwischen CQDs und PtPor zu bestätigen. Wie in Abb. 3d gezeigt, beträgt das Zetapotential freier CQDs aufgrund der negativen Ladungen auf der Oberfläche − 15.6 mV. Nach der Konjugation mit PtPor wurde das Zeta-Potential des CQDs@PtPor-Verbundstoffs auf 4,5 mV geändert, was die erfolgreiche Bedeckung der CQDs durch die PtPor-Moleküle anzeigt.

XRD-Muster von CQDs (a ). Das FTIR-Spektrum von CQDs (b ). Partikelgrößenverteilung von CQDs@PtPor gemessen durch dynamische Lichtstreuung (c ). Zetapotential von CQDs und CQDs@PtPor (d )

XPS-Umfragespektrum (a ) und C 1s (b ), N 1s (c ) und O 1s (d ) hochauflösende XPS-Spektren von CQDs

Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde durchgeführt, um die chemische Zusammensetzung von CQDs (Abb. 3) und CQDs@PtPor (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2) weiter zu untersuchen. Das Übersichtsspektrum der CQDs in Abb. 3a zeigt, dass die Existenzelemente auf der Oberfläche C, N und O sind, mit den entsprechenden Signalen bei 535, 402 bzw. 283 eV [40]. Das in Abb. 3b gezeigte C 1s-Signal weist drei unterschiedliche Peaks bei 284.4 eV, 286,3 eV und 288.2 eV auf, die der C-C-Bindung, der C-O-Bindung bzw. der C=O-Bindung zugeordnet werden. Das in Abb. 3c gezeigte hochauflösende XPS N 1s ist mit drei Peaks mit Bindungsenergien bei 395,3, 399,1 und 402,2 eV ausgestattet, die dem Pyridin-ähnlichen N, Pyrrol-N bzw. quaternären N entsprechen [41]. Die Entfaltung von O 1s zeigte die C-O- und O-H-Peaks (Abb. 3d), was auf die Existenz großer Carboxylgruppen auf der Oberfläche von CQDs hinweist.

Photophysikalische Eigenschaften von CQDs@PtPor

Die UV-Vis-Absorptions- und Fluoreszenzspektren wurden durchgeführt, um die photophysikalischen Eigenschaften des Komposits zu untersuchen. Wie in Abb. 4a gezeigt, zeigte das CQDs@PtPor-Komposit die charakteristischen Peaks von CQDs und Porphyrin. Beispielsweise wurde ein signifikanter Absorptionspeak bei 360 nm wahrscheinlich dem n → π*-Übergang von CQDs zugeschrieben [42], während die Peaks bei 425 nm, 520 nm und 580 nm den Soret- und Q-Banden von Porphyrin . zugeschrieben wurden , bzw. Die wässrige Lösung von CQDs zeigt blaue Emission unter der Bestrahlung einer 365-nm-Ultraviolett-(UV)-Lampe. Außerdem zeigten die CQDs das anregungsabhängige PL-Verhalten, bei dem sich der Emissionspeak von 460 auf 552 nm verschiebt, wenn sich die Anregungswellenlänge von 280 auf 500 nm ändert, wie in 4b gezeigt. Die Fluoreszenzquantenausbeute der so hergestellten CQDs betrug 36% mit Chininsulfat als Referenz.

UV-Vis-Absorption (a ) und Fluoreszenz (b ) Spektren von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor. Fluoreszenzspektren (c ) von CQDs mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen. Fluoreszenzzerfälle (d ) von CQDs und CQDs@PtPor. Die Konzentration der Proben:CQDs (5 μg/ml), CQDs@PtPor (5 μg/ml, 3 μg/ml) und PtPor (3 μg/ml)

Diskussion

Der Effekt des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) in CQDs@PtPor-Kompositen konnte durch den Vergleich der Fluoreszenzintensität von CQDs@PtPor mit CQDs und PtPor untersucht werden. Die Fluoreszenzspektren und -intensitäten von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor mit gleicher Konzentration wurden unter Anregung mit 360 nm gemessen (Abb. 4c). Da die CQDs eine sehr starke Absorption bei 360 nm (Abb. 4a) mit einer PL-Quantenausbeute von 36% zeigten, emittiert sie eine sehr starke Fluoreszenz. Im Gegenteil, da die Absorption von PtPor bei 360 nm sehr gering ist und seine PL-Quantenausbeute weniger als 1% beträgt, zeigt das PtPor eine sehr schwache Emission. Bemerkenswert ist, dass die Intensität der blauen Emission (500 nm) in CQDs@PtPor im Vergleich zu freien CQDs offensichtlich abgenommen hat, während die rote Emission (660 nm) im Vergleich zu der von PtPor allein deutlich erhöht ist, was auf den effizienten Energietransfer in CQDs@PtPor-Komposit hinweist . Die Fluoreszenzlebensdauer von CQDs in CQDs@PtPor-Komposit verringerte sich im Vergleich zu der von freien CQDs, wie in Abb. 4d gezeigt. Eine solch offensichtliche Abnahme der Donorlebensdauer weist ferner auf den effektiven Resonanzenergietransfer von CQDs auf PtPor im CQDs@PtPor-Komposit hin.

Da die Singulett-Sauerstoffproduktion ein Schlüsselfaktor bei der PDT ist, ist die ¹ O₂ Generation wurde durch eine chemische Methode mit 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) als ¹ . bestimmt O₂ Assgeier. Im Allgemeinen nimmt die Absorptionsintensität von DPBF in Gegenwart von Singulett-Sauerstoff allmählich ab. Daher kann die Abnahmerate der Absorptionsintensität von DPBF verwendet werden, um die relative Ausbeute an Singulett-Sauerstoff zu bewerten. In diesem Experiment wurden CQDs (5 mg/mL), PtPor (5 mg/mL) bzw. CQDs@PtPor (5 mg/mL) mit DPBF (10 mM) gemischt, gefolgt von der Bestrahlung mit einer Xenonlampe. Wie in Fig. 5a gezeigt, zeigte nach der Zugabe von CQDs die Absorption von DPBF keine Änderung mit der Verlängerung der Bestrahlungszeit, was darauf hinweist, dass CQDs keine signifikante Singulett-Sauerstoffproduktion aufwiesen. Außerdem zeigte der CQDs@PtPor-Verbund einen sehr deutlichen Abbau zu DPBF, der viel höher ist als der von PtPor, was darauf hindeutet, dass die ¹ O₂ Die Ausbeute an Porphyrin könnte unter der Rolle von CQDs erhöht werden. Inzwischen ist die Produktion von ¹ O₂ wurde mit dem Dichlorfluorescein (DCFH)-Reagenz weiter quantifiziert. Die grüne Fluoreszenz (λ_em = 525 nm) von DCFH ist bekannt, dass es quantitativ zunimmt, wenn es mit ¹ . reagiert O₂ aus den Photosensibilisatoren erzeugt. Wie in Abb. 5b gezeigt, zeigte der CQDs@PtPor-Verbund eine höhere Effizienz von ¹ O₂ Produktion als die von reinem PtPor. Dieses Ergebnis stimmt in hohem Maße mit dem Ergebnis der DPBF-Methode überein.

Singulett-Sauerstofferzeugung von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor aus der DPBF-Methode (a ) und DCFH-Methode (b )

Die Zytotoxizität von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor auf HeLa-Zellen wurde durch den Methylthiazolyltetrazolium (MTT)-Assay getestet. Wie in Fig. 6a gezeigt, zeigten alle drei Proben nach 24 h Behandlung im Dunkeln eine vernachlässigbare Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen. Über 90% der Krebszellen waren noch am Leben, wobei ihre Konzentration auf 50 μg/ml erhöht war, was darauf hindeutet, dass alle drei Proben im Dunkeln keine nachteiligen Auswirkungen auf Krebszellen hatten. Darüber hinaus wurde die Photozytotoxizität von drei Proben mit einem ähnlichen Verfahren weiter bewertet. Wie in Fig. 6b gezeigt, nahm die Lebensfähigkeit der Zellen nach Behandlung von Krebszellen mit CQDs@PtPor für 24 h gefolgt von Lichtbestrahlung allmählich mit steigender Probenkonzentration ab. Bei einer Konzentration von CQDs@PtPor von 50 µg/ml betrug die Überlebensrate der Krebszellen nur 8 %, was offensichtlich niedriger war als die von PtPor allein (18 %) und CQDs (90 %). Das heißt, das CQDs@PtPor-Komposit zeigte eine stärkere therapeutische Wirksamkeit als das von PtPor allein, was darauf hindeutet, dass CQDs@PtPor gegenüber der herkömmlichen Formulierung vorteilhaft ist, was wahrscheinlich auf die verbesserte Effizienz der Singulett-Sauerstofferzeugung von PtPor durch CQDs zurückgeführt wird.

Dunkle Zytotoxizität (a ) und Photozytotoxizität (b ) von CQDs, PtPor und CQDs@PtPor in unterschiedlichen Konzentrationen

Die zelluläre Aufnahme von reinem CQDs, PtPor und CQDs@PtPor wurde mit einem konfokalen Laserscanningmikroskop unter Anregung eines 405-nm-Lasers untersucht. Wie in Abb. 7 gezeigt, verteilt sich der CQDs@PtPor-Verbund hauptsächlich im Zytoplasma von HeLa-Zellen. Außerdem überlappt die blaue Fluoreszenzbildgebung von CQDs fast mit der roten Emission von PtPor im CQDs@PtPor-Komposit, was darauf hindeutet, dass die CQDs und PtPor im Bindungszustand blieben, nachdem das CQDs@PtPor-Komposit in die Zellen eingetreten war. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das CQDs@PtPor-Komposit in der zellulären Umgebung stabil ist und dennoch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer in Zellen durchführen könnte.

Die konfokalen Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von HeLa-Zellen unter 405-nm-Anregung nach Behandlung mit 50 μg/ml reinen CQDs (a –c ), PtPor (d –f ) und CQDs@PtPor (g –ich ) für 24 Stunden. a , d , g Helles Feld. b , e , h Der CQDs-Bildgebungskanal, detektiert im Wellenlängenbereich von 410–450 nm. c , f , ich Der PtPor-Bildgebungskanal, detektiert mit dem 590 nm langen Passbereich; (Maßstab =20 μm)

Schlussfolgerungen

Ein neuer theranostischer Nanowirkstoff (CQDs@PtPor) wurde erfolgreich durch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem tetraplatinierten Porphyrinkomplex (PtPor) und den negativ geladenen CQDs entworfen und entwickelt. Das so hergestellte CQDs@PtPor-Komposit wies eine hohe Wasserdispergierbarkeit, gute Stabilität und Biokompatibilität sowie eine verbesserte Photosensibilisator-Fluoreszenzdetektion auf. Die PDT-Wirkung von CQDs@PtPor wurde im Vergleich zu der von PtPor allein signifikant verstärkt, was darauf hindeutet, dass CQDs@PtPor aufgrund der verbesserten Effizienz von ¹ . gegenüber der herkömmlichen Formulierung vorteilhaft ist O₂ Generierung von PtPor durch CQDs. Somit zeigte dieser auf CQDs basierende Nanowirkstoff eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit bei Krebszellen sowie geringe Nebenwirkungen in vitro, was ein großes Potenzial für Anwendungen in der Klinik zur Behandlung von Krebspatienten in naher Zukunft zeigt.

Änderungsverlauf

Abkürzungen

CA:

Zitronensäure

CQDs:

Kohlenstoff-Quantenpunkte

DPBF:

1,3-Diphenylisobenzofuran

EDA:

Ethylendiamin

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

PDT:

Photodynamische Therapie

PSs:

Photosensibilisatoren

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

UV:

Ultraviolett

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung