Plasmonischer ELISA zum sensiblen Nachweis von Krankheitsbiomarkern mit einem Smartphone-basierten Lesegerät

Einführung

Akuter Myokardinfarkt (AMI) ist die medizinische Bezeichnung für einen Herzinfarkt, der auftritt, wenn der Blutfluss zum Herzmuskel abrupt unterbrochen wird, was zu Gewebeschäden führt [1]. Zu den Symptomen von AMI gehören schwere und anhaltende Schmerzen nach dem Brustbein, Herzrhythmusstörungen, Schock und Herzinsuffizienz, die tödlich sein können [2]. AMI ist eine der häufigsten Erkrankungen in Europa und Amerika. Allein in den USA erleiden jährlich etwa 1.500.000 Menschen einen Herzinfarkt. Auch in China ist in den letzten Jahren mit mindestens 500.000 neuen Patienten pro Jahr ein deutlicher Anstiegstrend von AMI zu beobachten. Der Point-of-Care-Test von Biomarkern ist von großer Bedeutung für die frühzeitige Überwachung und Behandlung von AMI. Das Serummyoglobin (Myo) steigt in 1–2 h nach einem AMI an und erreicht nach 6–9 h den Höchstwert. Myo gilt als einer der frühesten Serummarker für die Früherkennung von AMI [3,4,5].

Kürzlich wurden plasmonische Immunoassays durch die Kombination von traditionellem Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Nanomaterialien entwickelt [6, 7]. Plasmonische Immunoassays werden häufig in der klinischen Diagnose [8], der Überwachung der Umweltverschmutzung [9] und der Erkennung der Lebensmittelsicherheit [10] eingesetzt. Im Vergleich zu anderen Immunoassays sind plasmonische Immunoassays hochempfindlich und ermöglichen die Ablesung mit bloßem Auge ohne den Einsatz von hochentwickelten Instrumenten. Metallnanopartikel, wie Gold- und Silbernanomaterialien, werden aufgrund ihrer ausgezeichneten lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) häufig in plasmonischen Nanosensoren verwendet. Bei plasmonischen Immunoassays katalysiert der enzymmarkierte Antikörper seine Substrate, um ein Produkt zu erzeugen, das die Aggregation oder Formänderung der Nanomaterialien auslöst. Chens Gruppe [11] berichtete über einen plasmonischen Immunoassay zum Nachweis von Krankheitserregern unter Verwendung einer durch Acetylcholinesterase (AChE) katalysierten Hydrolysereaktion, um die Aggregation von Goldnanopartikeln (AuNPs) zu induzieren. Die Sensitivität des plasmonischen Immunoassays ist mit der der RT-PCR vergleichbar. Die robuste, ultraschnelle und hochstabile Aggregation von AuNPs in kolorimetrischen Assays bleibt jedoch eine Herausforderung, da das Aggregationsverfahren von AuNPs dynamisch ist [12, 13]. Eine andere Art von plasmonischen Immunoassays basiert auf der Induktion einer Formänderung von plasmonischen Nanopartikeln. Für den Nachweis von Krebs-Biomarkern wurden auf Ätzen basierende plasmonische Biosensoren mit dreieckigen Silber-Nanoprismen (AgNPRs) berichtet, die Wasserstoffperoxid (H₂ .) verwenden O₂ ) produziert von Glucoseoxidase (GOx) zum AgNPR-Ätzen [14, 15]. Um jedoch ein molekulares Ziel quantitativ zu testen, sind neben den plasmonischen Immunoassays relativ ausgeklügelte und sperrige Instrumente zur Messung des Spektrums von Nanomaterialien erforderlich. Die mit diesen Instrumenten verbundenen Unannehmlichkeiten machen sie für die Point-of-Care-Analyse ungeeignet. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung eines tragbaren, kostengünstigen und einfach zu verwendenden plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts für eine Point-of-Care-Testung (POCT)-Diagnose.

Goldnanostäbchen (AuNRs) wurden aufgrund ihrer einzigartigen physikalischen, optischen und elektronischen Eigenschaften in großem Umfang in Biosensoren [16,17,18], plasmonischer Bildgebung [19], photothermischer Tumortherapie [20] und photodynamischer Therapie [21] eingesetzt [22 ,23,24]. In dieser Arbeit berichteten wir über einen sensitiven plasmonischen Immunoassay basierend auf der enzymvermittelten LSPR-Änderung von AuNRs zum Nachweis von Myo. Um die POCT-Diagnose von AMI zu erleichtern, haben wir ein neuartiges plasmonisches Immunoassay-Lesegerät entwickelt, das den Umgebungslichtsensor (ALS) eines Smartphones verwendet. Die hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen des plasmonischen Immunoassays und denen des traditionellen ELISA an Serumproben zeigte die Anwendungspotenziale dieser neuen Methode zur frühen POCT-Diagnose von AMI, insbesondere in Regionen mit begrenzten technologischen Ressourcen.

Materialien und Methoden

Materialien und Reagenzien

Myo (aus menschlichem Herzgewebe) wurde von Abcam (Cambridge, UK) bezogen. Monoklonale Anti-Myo-Antikörper (mAb1 und mAb2) wurden in unserem Labor hergestellt (zusätzliche Datei 1). Silbernitrat (AgNO₃ .) , 99,8 %) und Natriumborhydrid (NaBH₄ .) ) wurden von Sinoreagent (Shanghai, China) bezogen. Das Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ , 30 Gew.-%) und H₂ SO₄ wurden von der chemischen Reagenzienfabrik GZ (Guangzhou, China) gekauft. Leuchtdiode (LED, 850 nm) wurde von Shenzhen OCtai Co., Ltd. (Shenzhen, China) bezogen. Chlorgoldsäure (HAuCl₄ ), TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin), Tween-20 und Cetyltrimethylamm-Oniumbromid (CTAB) wurden von Amresco (Houston, TX, USA) bezogen. Glucoseoxidase Typ VII aus Aspergillus niger (GOx), Meerrettichperoxidase Typ VI (HRP) und Rinderserumalbumin (BSA) wurden von Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) bezogen. Entionisiertes Wasser (Milli-Q-Qualität, Millipore) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ cm wurde während dieser Studie verwendet. Serumproben wurden vom Guangzhou Overseas Chinese Hospital (Guangzhou, China) entnommen.

Vorrichtung

Die LSPR-Spektren von AuNRs in 96-Well-Platten wurden mit einem Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc. USA) gesammelt. Die Extinktion des HRP-basierten ELISA wurde bei 450 nm unter Verwendung eines MK3-Mikroplattenlesegeräts (Bio-Tek Instruments, Inc. USA) gemessen. Die Charakterisierung von AuNRs wurde mit einem PHILIPS TECNAI-10 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV durchgeführt. Die Proben für TEM-Messungen wurden durch Aufbringen eines Tropfens wässriger Dispersion auf ein mit dünnen Kohlenstoffschichten beschichtetes Kupfergitter hergestellt und das Lösungsmittel durch Verdampfen an der Luft entfernt. Ein 3D-Drucker wurde von SHINING 3D (Hangzhou, China) gekauft. Als Basis-Smartphone für das plasmonische Immunoassay-Lesegerät wurde ein HUAWEI P9-Smartphone (Shenzhen, China) gewählt.

Design des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Readers

Das Design des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts wurde mit Software erstellt (Solidworks 2014) und anschließend von der Software 3D Star verarbeitet. Für die Druckeinrichtung wurde der Druckmodus auf Qualität eingestellt und der unterstützende Weg wurde auf internen und externen Support konfiguriert. Eine kostenlose Smartphone-Anwendung, Light Meter, wurde verwendet, um die Messergebnisse auf dem Bildschirm anzuzeigen. In dieser Arbeit läuft das plasmonische Immunoassay-Lesegerät auf einem Android-Telefon (Open Source). Dieses Lesegerät kann auch auf dem iPhone verwendet werden, wenn der Benutzer eine iOS-Versionssoftware (Light Meter) verwendet hat.

Synthese von AuNRs

AuNRs wurden durch Saatgold-vermitteltes Wachstum hergestellt [25]. Goldkeimpräparation:Es wurde frisches 0,01 M Natriumborhydrid in 0,01 M Natriumhydroxid hergestellt. Dann wurden 600 μl Natriumborhydrid-Lösung zu einem HAuCl₄ . gegeben Lösung (0,25 mM) in 10 ml 0,1 M CTAB unter Rühren (300 U/min min ⁻¹ ). Die Farbe des Goldsamens änderte sich von grünlich zu hellbraun. Synthese von Nanostäbchen:AgNO₃ (70 μl, 0,1 M) Lösung wurde zu 10 ml HAuCl₄ . gegeben Lösung (0,5 mM) in 0,1 M CTAB. Anschließend wurden 140 μL Ascorbinsäure (0,0788 M) unter Rühren (300 U/min min ^–1 ). Schließlich wurden 12 μl Goldsamen zugegeben und die Lösung unter Rühren gemischt (300 U/min min ^-1 ) für 12 Stunden vor der Verwendung.

Verfahren des AuNR-basierten plasmonischen Immunoassays zum Myonachweis

Für den plasmonischen Immunoassay wurde zur Herstellung der 96-Well-Polystyrolplatten mit Anti-Myo-Antikörper 1 (Ab1) verdünnter Ab1 in 96-Well-Polystyrolplatten bei 4 °C über Nacht inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden die 96-Well-Polystyrolplatten mit Blockierungspuffer (1 mg ml ^-1 .) blockiert BSA in PBST) bei 37 °C für 1 h. Dann wurden die 96-Well-Polystyrolplatten dreimal mit Waschpuffer gewaschen und bei – 20 °C gelagert. Der mit GOx (GOx-Ab2) markierte Anti-Myo-Antikörper 2 wurde nach den in der Zusatzdatei 1 gezeigten Verfahren hergestellt.

Für den Myo-Nachweis wurden den Ab1-beschichteten 96-Well-Polystyrolplatten verschiedene Konzentrationen von Myo-Lösungen (100 μL) zugesetzt. Nach 1 h Inkubation wurden die Platten dreimal mit PBST-Puffer und dann 0,01 mg ml ^–1 . gewaschen GOx-Ab2 wurde zugegeben und bei 37 °C für weitere 1 h inkubiert. Dann wurden die Platten dreimal mit PBST-Puffer gewaschen, und es wurden 50 μL Glucose (0,5 mM) zugegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand mit 50 μl Citratpuffer (40 mM, pH 4,0) mit AuNRs ([Au0] 0,24 mM), CTAB (12,5 mM) und HRP (3 μM) gemischt und 30 min inkubiert. Das entsprechende LSPR-Spektrum der AuNRs wurde mit einem kommerziellen Mikroplatten-Lesegerät gesammelt und die durchgelassene Lichtintensität (850 nm) der AuNRs wurde mit dem Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegerät gemessen. Die Kalibrierungskurve der plasmonischen Immunoassays für Myo wurde konstruiert, indem die gemessene Intensität des durchgelassenen Lichts an die zugehörige Myo-Konzentration angepasst wurde. Zum Nachweis von Myo wurden Serumproben mit PBS-Puffer zehnfach verdünnt. Dann wurden 100 μl der verdünnten Serumproben auf die Ab1-beschichteten 96-Well-Polystyrolplatten gegeben. Die Konzentration von Myo wurde wie oben beschrieben getestet. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar.

Das Verfahren für HRP-basierte ELISA ist in der Zusatzdatei 1 dargestellt.

Datenanalysemethode

Die lineare Regressionsanalyse wurde mit Ursprung 9.0 verarbeitet. Alle Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar.

Ergebnisse und Diskussion

Prinzip des AuNRs-basierten Immunoassays zur Myo-Detektion

Der plasmonische Immunoassay kombiniert Sandwich-Immunoassay mit der plasmonischen Eigenschaft von AuNRs. Ab1 und Ab2 wurden mit Glucoseoxidase (GOx-Ab2) konjugiert (Abb. 1). Nach der Bindung könnte der GOx-markierte Ab2 sein Substrat Glucose katalysieren, um Gluconsäure und Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ). Die H₂ O₂ wirkt als Oxidationsmittel zum Ätzen der AuNRs unter bestimmten Konzentrationen von HRP und Br ⁻ , was zu einer erheblichen Blauverschiebung im SPR-Spektrum von AuNRs und einer Abnahme der Absorption von AuNRs bei 850 nm führt. Beim plasmonischen Immunoassay ist die GOx-Menge proportional zur Zielkonzentration. Der Grad der Blauverschiebung im SPR-Spektrum von AuNRs und die Absorptionsreduktion von AuNRs bei 850 nm korrelierten positiv mit den Zielkonzentrationen. Die Ergebnisse des plasmonischen Immunoassays könnten qualifiziert werden, indem ein Mikroplatten-Lesegerät verwendet wird, um die Blauverschiebung des SPR-Spektrums von AuNRs zu messen, oder indem man das Smartphone-Lesegerät verwendet, um die Änderung der Absorption von AuNRs bei 850 nm zu messen.

Schematische Darstellung des AuNRs-basierten plasmonischen Immunoassays zum Myo-Nachweis

Optimierung des plasmonischen Immunoassays für den Myo-Nachweis

HRP- und CTAB-Konzentrationen wirken sich direkt auf die nachgewiesenen Ergebnisse aus. In dieser Arbeit wurden AuNRs mit einer Lösung geätzt, die 100 μM H₂ . enthielt O₂ , und verschiedene Konzentrationen von HRP und CTAB in Citratpuffer (40 mM, pH 4.0), von denen die LSPR-Verschiebung von AuNRs aufgezeichnet wurde. In dieser Studie wurden 1,5 μM HRP und 6,25 μM CTAB aufgrund der bei diesen Konzentrationen beobachteten maximalen LSPR-Verschiebung der AuNRs ausgewählt (Abb. 2a). Bei den optimierten HRP- und CTAB-Konzentrationen wurden AuNPs mit 100 μM H₂ . geätzt O₂ in Citratpuffer (20 mM, pH 4,0). Das LSPR-Spektrum von AuNRs war blauverschoben und die Absorption von AuNRs bei 850 nm nahm mit der Zeit ab (Abb. 2b). Nach 30 Minuten stabiler LSPR der AuNRs. Daher wurden 30 Minuten als Zeit für H₂ . ausgewählt O₂ Ätzen von AuNRs. AuNPs wurden durch unterschiedliche Konzentrationen von H₂ . geätzt O₂ . Das LSPR-Spektrum der AuNRs war mit abnehmendem H₂ . blauverschoben O₂ Konzentration (Abb. 2c). TEM-Bilder von AuNRs zeigten, dass mit zunehmendem H₂ O₂ Konzentration änderte sich die Form der AuNRs von einem Rechteck zu einer Ellipse (Abb. 2d–f). Diese Ergebnisse zeigten, dass das LSPR-Spektrum der AuNRs von der Konzentration von H₂ . abhängt O_2.

Optimierung und Charakterisierung von AuNRs basierend auf einem plasmonischen Immunoassay zur Myo-Detektion. a Optimierung der HRP- und CTAB-Konzentration in AuNRs basierend auf einem plasmonischen Immunoassay. Unterschiedliche Farblinien stellen unterschiedliche Konzentrationen von CTAB dar, von denen 6,25 mM CTAB und 1,5 μM HRP bevorzugt wurden. b Zeitoptimierung für H₂ O₂ Ätzen von AuNRs, für die 1,5 μM HRP, 6,25 mM CTAB und 100 μM H₂ O₂ in Citratpuffer (20 mM, pH 4,0) für 30 Minuten enthalten, wurde bevorzugt. c LSPR-Spektrum von AuNRs mit Zugabe von 50 μl verschiedener H₂ .-Konzentrationen O₂ . d –f TEM-Bilder von AuNRs, die durch verschiedene Konzentrationen von H₂ . geätzt wurden O₂ (0 μM, 10 μM und 100 μM) für 30 Minuten. g LSPR-Verschiebung von AuNRs unter verschiedenen Konzentrationen von GOx. h LSPR-Spektrum von AuNRs in Gegenwart von GOx-Ab2 bei verschiedenen Verdünnungsverhältnissen. ich LSPR-Spektrumverschiebung von AuNRs im direkten plasmonischen Immunoassay beschichtet mit verschiedenen Konzentrationen von Myo. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar

GOx könnte Glukose katalysieren, um H₂ . zu produzieren O₂ , die AuNRs ätzen könnten. In dieser Arbeit wurde 0,5 mM Glukose durch verschiedene Konzentrationen von GOx katalysiert und das produzierte H₂ O₂ wurde zum Ätzen von AuNRs verwendet (Abb. 2g). Wenn die GOx-Konzentration 100 pg ml ^–1 . betrug (6,66 × 10 ⁻¹¹ mol L ⁻¹ ) zeigte das LSPR-Spektrum der AuNRs eine deutliche Blauverschiebung, was auf die hohe Sensitivität des AuNR-basierten plasmonischen Immunoassays hindeutet. GOx wurde mit Ab2 konjugiert und dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Die katalytische Aktivität von GOx-Ab2 wurde durch zersetztes GOx und geätzte AuNRs validiert. Das LSPR-Spektrum von AuNRs war mit steigender GOx-Ab2-Konzentration blauverschoben (Abb. 2h), was darauf hinwies, dass GOx-Ab2 eine gute katalytische Aktivität beibehält. Außerdem wurde Myo auf Mikrotiterplatten beschichtet und mit GOx-Ab2 inkubiert. Nach 30 Minuten wurde GOx-Ab2 dreimal mit PBST-Puffer gewaschen. Glukose wurde dann in die Mikrovertiefung gegeben, gefolgt von der Zugabe von AuNRs zur Glukoselösung nach 30 Minuten. Die Blauverschiebung des LSPR-Spektrums von AuNRs nahm mit steigender GOx-Ab2-Konzentration zu (Abb. 2i), was zeigt, dass Ab2 seine immunologische Aktivität beibehält, während GOx seine katalytische Aktivität beibehält.

Smartphone-basierter plasmonischer Immunoassay-Reader zur Myo-Erkennung vor Ort

Häufig beschriebene plasmonische Immunoassays werden quantitativ von einem kommerziellen Mikroplatten-Lesegerät oder einem Spektrometer interpretiert, was ihre Verwendbarkeit in Regionen mit begrenzten Ressourcen einschränkt. Um die Zugänglichkeit unseres plasmonischen Immunoassays zu verbessern, haben wir ein Smartphone-basiertes plasmonisches Immunoassay-Lesegerät entwickelt, das auf einem Umgebungslichtsensor (ALS) eines Smartphones basiert, um die durchgelassene Lichtintensität von AuNRs zu messen. Bei den meisten Smartphones ist ALS eine Standardkonfiguration, die verwendet wird, um die Lichtintensität des Bildschirms abhängig von verschiedenen Umständen automatisch anzupassen. Wir haben zuvor über die Verwendung von ALS in einem kolorimetrischen Assay-Reader berichtet [26, 27, 28]. Das Prinzip und die Anleitung für den plasmonischen Immunoassay-Reader wurden in der Vorveröffentlichung dokumentiert [29]. Das 3D-gedruckte plasmonische Immunoassay-Lesegerät besteht aus zwei Teilen:Teil 1 (100 mm × 40 mm × 40 mm) könnte auf einem Smartphone befestigt werden, um eine stabile Lichtquelle mit zwei Batterien (1,5 V) zu liefern, und Teil 2 ( 76 mm × 13 mm × 12 mm) könnte verwendet werden, um Mikrovertiefungen aufzunehmen. Sobald der plasmonische Immunoassay abgeschlossen war, wurde die Mikrovertiefung auf Teil 2 montiert, wie in Abb. 3a gezeigt, und dann wurde Teil 2 auf Teil 1 fixiert. Teil 1 wurde dann am ALS des Smartphones befestigt. Bei diesem Design wurde die LED auf den ALS des Smartphones ausgerichtet. Nach dem Einschalten des Schalters wurde das Licht der LED über AuNRs übertragen und vom ALS gemessen. Die durchgelassene Lichtintensität jedes Mikrowells konnte durch Verschieben von Teil 2 abgelesen werden. Über die Android-Anwendung Light Meter konnten die gemessenen Ergebnisse auf dem Bildschirm eines Smartphones angezeigt werden. Im plasmonischen Immunoassay betrug das maximale Absorptionsspektrum von AuNRs 850 nm und mit zunehmendem H₂ O₂ Konzentration wurde die Absorption von AuNRs bei 850 nm allmählich verringert. Daher wurde 850 nm als Wellenlänge des Anregungslichts der LED im plasmonischen Immunoassay-Lesegerät ausgewählt. Die Gesamtkosten des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts betrugen etwa zwei Dollar. Um die Messergebnisse des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts mit denen eines kommerziellen Mikroplatten-Lesegeräts zu vergleichen, wurden die Intensität des durchgelassenen Lichts und die Absorption von AuNRs in Mikrotiterplatten gemessen. Die mit diesen Geräten erhaltenen Ergebnisse wurden angepasst und zeigten eine Korrelation von 99,1 % (Abb. 3b), was darauf hindeutet, dass das Smartphone-basierte plasmonische Immunoassay-Lesegerät in Bezug auf die Genauigkeit ein vergleichbares Werkzeug war.

Mechanismus eines Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts. a Schema des 3D-gedruckten Zubehörs des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegeräts. Die durchgelassene Lichtintensität von AuNRs wurde durch ALS des Smartphones gemessen und der Wert wurde auf einem Bildschirm angezeigt. b Die Korrelation zwischen den Ergebnissen des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Readers und denen des kommerziellen Mikroplatten-Readers. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar

Analytische Leistung des plasmonischen Immunoassays zum Myonachweis

Für die Leistung des AuNRs-basierten plasmonischen Immunoassays wurden verschiedene Konzentrationen von Myo analysiert. Das LSPR-Spektrum von AuNRs wurde mit einem kommerziellen Spektrometer aufgezeichnet, und die durchgelassene Lichtintensität des LSPR-Spektrums von AuNRs wurde mit dem Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegerät gemessen. Mit steigender Myo-Konzentration war das LSPR-Spektrum von AuNRs blauverschoben und die Absorption des LSPR-Spektrums von AuNRs verringert (Abb. 4a). Die LSPR-Blauverschiebung von AuNRs wurde für die quantitative Analyse der Myo-Konzentration verwendet. Wenn die Myo-Konzentration 0 pg ml ^–1 . betrug , betrug die LSPR-Blauverschiebung von AuNRs 0 nm. Mit steigender Myo-Konzentration waren die LSPR-Peaks der AuNRs blauverschoben (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Die gemessenen Durchlichtintensitäten wurden verwendet, um die Konzentrationen von Myo zu quantifizieren. Der lineare Nachweisbereich von AuNRs, basierend auf dem plasmonischen Immunoassay, der durch die Blauverschiebung des LSPR-Spektrums quanifiziert wurde, betrug 0,1–1000 ng mL ⁻¹ (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2-S3) mit der Nachweisgrenze bei 57,81 pg mL ⁻¹ . Die gemessene Durchlichtintensität von AuNRs nahm mit steigender Myo-Konzentration ab (Abb. 4b). Die gemessenen Durchlichtintensitäten wurden verwendet, um die Konzentrationen von Myo zu quantifizieren. Der lineare Nachweisbereich des plasmonischen Immunoassays, der anhand der durchgelassenen Lichtintensität von AuNRs quantifiziert wurde, betrug 0,1–1000 ng mL ^–1 (Abb. 4c) mit der Nachweisgrenze bei 64,13 pg ml ⁻¹ . AMI wurde als Serumkonzentration von Myo über 90 ng ml ^–1 . definiert . Zum Nachweis von Myo in klinischen Proben wurde das Serum vor der Analyse zehnfach verdünnt, um die Konsistenz der Messergebnisse zu verbessern.

Plasmonischer Immunoassay zum Myo-Nachweis. a LSPR-Peakverschiebungen von AuNRs bei verschiedenen Myo-Konzentrationen. b Absorption von AuNRs zum Nachweis verschiedener Myo-Konzentrationen. c Kalibrierungslinie des plasmonischen Immunoassays für den Myo-Nachweis, wie von einem Smartphone-basierten Lesegerät gelesen. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar

Vergleich von Plasmonic Immunoassay und ELISA

ELISA ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken in der klinischen Diagnostik. In dieser Arbeit haben wir die Nachweisleistung von ELISA und dem plasmonischen Immunoassay für die Myo-Analyse verglichen. In beiden Verfahren wurden die gleichen Antikörper und Antigene verwendet. Der lineare Nachweisbereich des ELISA betrug 25–1000 ng mL ^–1 und die LOD betrug 22,7 ng ml ^–1 (Abb. 5a, Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Im Vergleich zum ELISA war der plasmonische Immunoassay sensitiver und wies einen breiteren Nachweisbereich auf. Um die Machbarkeit der Verwendung des plasmonischen Immunoassays für die klinische Anwendung zu demonstrieren, wurde Myo in klinischen Serumproben durch den plasmonischen Immunoassay und ELISA gemessen. Die Ergebnisse des plasmonischen Immunoassays wurden von einem kommerziellen Mikroplatten-Lesegerät bzw. einem Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Lesegerät gelesen. Die Ergebnisse dieser beiden Methoden waren gut korreliert (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass der auf AuNRs basierende plasmonische Immunoassay für die klinische AMI-Diagnose verwendet werden könnte.

Vergleich des plasmonischen Immunoassays und des konventionellen ELISA zum Myo-Nachweis. a Kalibrationslinie des ELISA für den Myo-Nachweis. b Vergleich des plasmonischen Immunoassays und des konventionellen ELISA beim Testen von Serumproben. Die transversale Achse repräsentiert die Ergebnisse des ELISA und die vertikale Achse repräsentiert die Ergebnisse des plasmonischen Immunoassays. Jeder Wert stellt den Mittelwert aus drei Wiederholungen dar

Schlussfolgerungen

Durch die Nutzung der einzigartigen optischen Eigenschaften von AuNRs haben wir erfolgreich einen plasmonischen Immunoassay zum Nachweis eines akuten Myokardinfarkts in klinischen Proben entwickelt. Um den Nutzen des Immunoassays bei Vor-Ort-Tests zu verbessern, haben wir ein Smartphone-basiertes plasmonisches Immunoassay-Lesegerät entwickelt, das auf der ALS des Smartphones beruht, um die durchgelassene Lichtintensität von AuNRs zu messen. Die Nachweisgrenze des AuNR-basierten plasmonischen Immunassays, die vom Smartphone-Lesegerät gelesen wurde, betrug 0,057 ng mL ^-1 . Dieser Biosensor war empfindlicher als herkömmliche ELISA, was ihn zu einer vielversprechenden Plattform für biomedizinische Anwendungen macht. Darüber hinaus erfordert der Biosensor durch die Verwendung des Smartphone-basierten plasmonischen Immunoassay-Readers keine hochentwickelte experimentelle Ausrüstung, was ihn in Regionen mit begrenzten Ressourcen leichter zugänglich macht.

Abkürzungen

Ab1:

Anti-Myo-Antikörper

Ab2:

Anti-Myo-Antikörper 2

AgNPRs:

Dreieckige Silber-Nanoprismen

ALS:

Umgebungslichtsensor

AMI:

Akuter Myokardinfarkt

AuNPs:

Goldnanopartikel

AuNRs:

Gold-Nanostäbe

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

GOx:

Glukoseoxidase

H₂ O₂ :

Wasserstoffperoxid

HRP:

Meerrettichperoxidase

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

Myo:

Serummyoglobin

POCT:

Point-of-Care-Tests