Auswirkungen von Goldnanopartikeln auf den Testosteronstoffwechsel in menschlichen Lebermikrosomen

Einführung

Goldnanopartikel (AuNP) werden aufgrund ihrer einzigartigen optischen und physikalischen Eigenschaften in großem Umfang in der Arzneimittelabgabe, medizinischen Diagnose und Krebstherapie sowie in Konsumgütern wie Kosmetika und Lebensmittelverpackungen eingesetzt [1,2,3]. Bei Exposition gegenüber einer Mischung von Proteinen assoziieren NP mit Proteinen und bilden eine Proteinkorona, die die Oberflächenchemie, die Konformation eines adsorbierten Proteins und die nachfolgenden biologischen Reaktionen, dh NP-Toxizität, zelluläre NP-Aufnahme, katalytische Aktivität von Cytochrom P450 (CYP ) Enzyme gegenüber Medikamenten [4,5,6,7]. In-vitro-Studien mit primären Epithelzellen und Krebszelllinien legen nahe, dass AuNP für menschliche Hepatozyten, die Hepatomzelllinie C3A und Spermien toxisch war [6,7,8]. Aber die Bildung von Proteinkorona um NP schwächte oder verstärkte die Toxizität von AuNP in einer von der Oberflächenchemie abhängigen Weise [6, 7]. Proteinkorona störte die zelluläre Aufnahme von AuNP in menschlichen Hepatozyten, proximalen Nierentubuluszellen, HepG2-Zellen, C3A-Zelllinie, unabhängig von ihrer Größe und Oberflächenladung [6, 7, 9,10,11,12].

Hepatische CYP-Enzyme sind hauptsächlich an der Synthese und/oder dem Metabolismus von endogenen und exogenen Verbindungen beteiligt, aber eine breite Palette von Wirkstoffen, dh Medikamente, Pestizide oder NP, beeinflussen die Steroidhormonsynthese, den Metabolismus und/oder die Entgiftung umgekehrt, was zu pharmakologischen Wirkungen führt und die physiologische Funktion [13,14,15,16,17]. Testosteron (TST) ist ein wichtiges Androgen- und CYP3A4-spezifisches Substrat (eine Hauptumwandlung in 6β-OH-TST) in regio- und stereoselektiver Weise [18]. Während des Phase-I-Metabolismus wird TST auch durch CYP3A4 zu 2β-OH-TST hydroxyliert und durch CYP2D6 zu Androstendion (AD) dealkyliert [17, 19]. In-vitro-Studien mit humanen Hepatozyten, C3A-Zelllinien, humanen Lebermikrosomen (HLM) und rekombinanten CYP-Enzymen legten nahe, dass nacktes und proteinkoronabeschichtetes AuNP eine breite Palette von CYP-Enzymen moduliert, darunter CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, und 3A4 [6, 7, 20, 21]. Andere metallische NP, nacktes AgNP, unterdrückten auch die CYP3A4-vermittelte Produktion von 6β-OH TST in HLM [22]. AuNP, das mit verzweigtem Polyethylenimin (BPEI) und Liponsäure (LA) funktionalisiert war, verringerte die CYP3A4-Aktivität in der C3A-Zelllinie, aber die menschliche Plasmaproteinkorona (PC) schwächte sie ab [7]. Im Gegensatz dazu hemmten nackte (kein PC) und PC BPEI-AuNP CYP2C9 und 3A4 in menschlichen Hepatozyten, unabhängig von der NP-Größe [6].

In-vivo-Studien berichteten, dass eine geringe Größe von AuNP (4 und 13 nm) hauptsächlich in der Leber und Milz bei männlichen BALB/c-Mäusen akkumuliert wurde und die Expression der hepatischen Cyp1a1- und 2b-Gene induzierte [23]. Andere metallische NP, Zinkoxid-NP, hemmten die hepatische CYP1A2-, 2C11- und 3A2-Aktivität bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einer Zunahme pathologischer Veränderungen in der Leber [24].

Bis heute ist wenig bekannt, wie AuNP den CYP-vermittelten TST-Metabolismus (Hydroxylierung und Dealkylierung von TST) in Abwesenheit und/oder Anwesenheit einer biologisch relevanten Proteinkorona assoziiert. Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss von PC auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften des 40- und 80-nm-kationischen BPEI-AuNP, des anionischen LA-AuNP und des neutralen Polyethylenglykol-(PEG)-AuNP zu untersuchen. Der Einfluss von AuNP auf den CYP-vermittelten TST-Stoffwechsel mit und ohne PC wird mit pHLM charakterisiert. Die individuelle Variation des TST-Metabolismus wird auch innerhalb von Einzelspender-HLM untersucht, die verschiedene Grade an CYP-Enzymen enthielten.

Methoden/Experimental

Chemikalien

Die 2,3,4- ¹³ C₃ Testosteron (CAS#327048-83-9) und 6β-Hydroxytestosteron (6β-OH TST, CAS#62-99-7) wurden von MilliporeSigma (St. Louis, MO) bezogen. Testosteron (TST, CAS# 58-22-0), 2α-Hydroxytestosteron (2α-OH TST, CAS#004075-14-3), 2β-Hydroxytestosteron (2β-OH TST, CAS#10390-14-4), 6α -Hydroxytestosteron (6α-OH TST, CAS#2944-87-8), 11β-Hydroxytestosteron (11β-OH TST, CAS#1816-85-9), 15β-Hydroxytestosteron (15β-OH TST, CAS#39605-73- 7), 16α-Hydroxytestosteron (16α-OH TST CAS#63-01-4), 16β-Hydroxytestosteron (16β-OH TST, CAS#17528-90-4), 11-Ketotestosteron (CAS#564-35-2) , Androstendion (AD, CAS#63-05-8), 4-Hydroxy-Androstenedion (CAS#566-48-3) und 11β-Hydroxy-Androstendion (CAS#382-44-5) wurden von Steraloids (Newport, RI .) bezogen ). Acetonitril und Ameisensäure in LC-MS-Qualität wurden von Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ) bezogen, während Reinstwasser intern durch das Synergy® UV-R-System von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland) hergestellt wurde. Falls nicht anders angegeben, wurden alle anderen Reagenzien von MilliporeSigma (St. Louis, MO) bezogen.

Mikrosomen der menschlichen Leber

Gepoolte menschliche Lebermikrosomen (pHLM) (200 Spender, 100 Männer und 100 Frauen) und Lebermikrosomen eines einzelnen Spenders wurden von Corning Inc. (Charlotte, NC) erhalten. Die pHLM werden vom Lieferanten gepoolt, jedoch kein Pool eines einzelnen Spender-HLM. Eigenschaften und ausgewählte Cytochrom-P450-(CYP)-Enzymaktivität des in dieser Studie verwendeten Einzelspender-HLM sind in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 dargestellt.

Gold-Nanopartikel-Synthese

Biopure™ 40 und 80 nm sphärisches AuNP, funktionalisiert mit kationischem verzweigtem Polyethylenimin (BPEI), anionischer Liponsäure (LA) und neutralem Polyethylenglycol (PEG) wurden von nanoComposix (San Diego, CA) bezogen. Kernmaterialien wurden durch die Reduktion von Hydrogentetrachloroaurat (III)-Hydrat (HAuCl₄ .) synthetisiert 3H₂ O) in wässriger Kaliumcarbonatlösung und wurde dem Alterungsprozess und der Tangentialflussfiltration (TFF) unterzogen. Die AuNP-Oberfläche wurde mit LA oder PEG durch Zugabe von Dihydroliponsäure (0,2:1, w /w ) oder Thiol-Methoxy-terminiertes PEG (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /w ) bzw. mit TFF-Waschung und Sterilfiltration. BPEI-funktionalisierte Oberflächen wurden mittels EDC/NHS-Chemie synthetisiert, indem die Carbonsäure von LA mit Aminen von BPEI verknüpft wurde. Das ungebundene BPEI wurde durch TFF-Waschen und anschließender Zentrifugation entfernt.

Herstellung von menschlichen Plasmaprotein-Coronas

Gepooltes Humanplasma (HP, n =5) wurde von Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) erhalten. Die 40- und 80-nm-AuNP wurden mit menschlichem Plasma bei einem physiologischen Plasmavolumen des Gesamtblutvolumens von 55 % (v /v ) in einem orbitalen Schüttel-/Rotationsinkubator bei 37 °C und 250 U/min für 1 h. Am Ende der Inkubation wurde die menschliche Plasmaproteinkorona (PC), die NP umgibt, durch Zentrifugation bei 20.000 × g . gewonnen bei 20 °C für 20 Minuten, gefolgt von drei Waschungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die ungebundenen und lose gebundenen Proteine ​​wurden durch eine Zentrifugation verworfen. Die resultierenden PC AuNP wurden in PBS dispergiert und zur Charakterisierung der physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihrer Wechselwirkung mit TST verwendet.

Physische Charakterisierung von AuNP

Partikelgröße und Oberflächeneigenschaften wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gemessen. Hydrodynamische Durchmesser (D_H .) ) und das Zeta-Potential der 40 und 80 nm nackten (kein PC) BPEI-, LA- und PEG-AuNP in deionisiertem (DI) Wasser und PC AuNP in PBS wurden mit dem Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) bei 0 h bei 25 °C. Die D_H , Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potential wurden auch für nackte und PC AuNP in einem mikrosomalen Inkubationspuffer (pH 7,4) bei 0 min und 45 min bei 37 °C erhalten. Die Proben wurden fünfmal mit 11 Teilläufen von jeweils 10 s gemessen. TEM charakterisierte die Morphologie von nacktem und PC-AuNP. Alle AuNP wurden auf Formvar-beschichteten Kupfergittern platziert und auf einem Tecnai G2 Spirit BioTWIN mit einem Oxford-Detektor (FEI Company, Hillsboro, OR) bei einer Beschleunigungsspannung von 120 kV betrachtet. Die GATAN-Mikroskopie-Suite (GATAN Inc., Pleasanton, CA) maß AuNP-Durchmesser. Ein optisches Absorptionsspektrum wurde mit dem Spectra Max i3 Multimode-Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen.

In-vitro-Stoffwechsel von Testosteron in Abwesenheit und Gegenwart von nacktem und PC-AuNP

Vorläufige Studien wurden durchgeführt, um die Inkubationszeit und die mikrosomalen Proteinkonzentrationen zu bestimmen, um eine lineare Stoffwechselrate für TST (eine Endkonzentration von 10 μM) bereitzustellen. Die Produktion von TST-Metaboliten war zwischen 1,3 und 9,3 mg mikrosomalem Protein ml ⁻¹ . linear für bis zu 60 Minuten Die metabolischen Assays wurden wie vollständig beschrieben durchgeführt [25]. Kurz gesagt, pHLM in einem mikrosomalen Inkubationspuffer wurde mit 10 μM TST behandelt und anschließend wurden die 40 und 80 nm nackten (kein PC) AuNP bei 0, 7, 32, 63, 143, 250, 400 und 571 μg ml zugegeben ⁻¹ ; für PC AuNP pHLM 0, 7, 32, 63 und 143 μg ml ⁻¹ . Ein mikrosomaler Inkubationspuffer enthielt 100 mM Phosphatpuffer, 3,3 mM MgCl₂ , und 1 mM EDTA (pH 7,4). Die Stoffwechselreaktion wurde mit und ohne NADPH-Regenerationssystem initiiert, das 0,25 mM NADP, 2,5 mM Glucose-6-Phosphat und 2 E ml ⁻¹ . enthielt Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Nach 45-minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 % (v /v ) wässrige Phosphorsäurelösung (1:1, v /v ). Nach einer Zentrifugation bei 3500 U/min für 20 Minuten wurde ein Probenüberstand gesammelt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Darüber hinaus wurde Einzelspender-HLM in einem mikrosomalen Inkubationspuffer mit 10 μM TST behandelt, gefolgt von einer Inkubation mit 63 μg ml ⁻¹ von allen nackten und PC-AuNP für 45 min bei 37 °C. Am Ende der Inkubation wurde die Probe wie oben beschrieben verarbeitet und bei −20 °C gelagert.

Standards und Probenvorbereitung

Primärstandard-Stammlösungen von TST, seinen Metaboliten und ¹³ C₃ -markierter TST als interner Standard (ISTD) wurden in Methanol in einer Konzentration von 1 mM hergestellt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Die Konzentrationen für Arbeitsstandardlösungen von TST und seinen Metaboliten betrugen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100 und 200 μM mit seriellen Verdünnungen der primären Stammlösung. Für Standardkalibratoren wurde ein 50 μl-Aliquot jeder Arbeitsstandardlösung zu 450 μl Reaktionspuffer hinzugefügt, was zu einer 1:10-Verdünnung führte, während 0,1 μM ISTD-Lösung auch unter Verwendung von 4%iger Phosphorsäure-Wasserlösung hergestellt wurde. Qualitätskontrollproben (QC) wurden in Konzentrationen von 0,01, 0,05 und 0,1 μM hergestellt.

Nach dem Auftauen wurden die Proben bei 3500 U/min für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 50 μl 0,1 μM ISTD versetzt und einer Oasis PRIME HLB 96-Well-μ-Elutionsplatte und einer Sammelplatte im Waters-Positivdruck-96-Prozessor bei 80 psi für 1–2 Minuten unterzogen. (Waters Corp., Milford, MA). Nach Waschen mit 300 μl Wasser mit 5 % Methanol und Elution mit 50 μl Acetonitril/Methanol-Gemisch (90/10, v /v ) wurde der resultierende Eluent in 50 μl Wasser (ein Endvolumen von 100 μl) verdünnt und einer Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) unterzogen.

Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie

Alle Proben wurden auf einer Waters UPLC HSS T3-Säule (2,1 × 50 mm, 1,8 μm) mit dem Waters Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography System with Triple Quadrupole Detector (UPLC TQD) (Waters Corp., Milford, MA) getrennt. Die mobilen Phasen A und B waren 0,1 % Ameisensäure in Wasser bzw. 0,1 % Ameisensäure in Methanol. Es wurde eine Gradienten-LC-Methode mit einer Flussrate von 600 μL min ^–1 . verwendet für 0–8,4 Minuten Der Gradient betrug 0–1 min (30 % B), 1–3 min (bis 50 % B), 3–3,5 min (50 % B), 3,5–7 min (bis 80 % B), 7–7,01 min ( bis 98 % B), 7,01–7,5 Minuten (98 % B) und 7,51–8,4 Minuten (30 % B). Die MS-Bedingungen wurden unten kurz beschrieben. Die Ionisationsquelle wurde im Elektrospray positiv betrieben (ESI ⁺ ) Modus mit Kapillarspannung 4000 V; für Quellentemperatur 150 °C; und für Desolvatationstemperaturen 450 °C. Die Durchflussraten des Desolvatisierungsgases (N₂ ), Kegelgas (N₂ ) und Kollisionsgas (Argon) waren 900 L h ⁻¹ , 100 l h ⁻¹ , und 0,1 ml min ⁻¹ , bzw. Der Scantyp war Multiple Reaction Monitoring (MRM) und die MS-Laufzeit betrug 8,4 Minuten. Die für die Analyse verwendeten MRM-Übergänge wurden in Zusätzliche Datei 1:Tabelle S2 und Abb. 2 zusammengefasst. Das Injektionsvolumen betrug 2 μl und die Säule wurde während der gesamten Analyse bei 50 °C gehalten. Alle Quantifizierungsmethoden basierten auf einer Sieben-Punkte-Kalibrierkurve über Konzentrationsbereiche von 0,001 bis 20 μM. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) von 0,001 μM und 0,005 μM wurden für TST und gezielte Metaboliten festgelegt.

Statistische Analyse

Die Wirkung von Dispergiermitteln auf D_H und PDI von nacktem und PC auf AuNP wurden mit dem t . des Schülers bewertet Test mit einer zweiseitigen Verteilung. Halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀ ) und halbmaximale Aktivierungskonzentration (EC₅₀ ) von AuNP zur Produktion von CYP-abhängigen TST-Metaboliten in pHLM wurden durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten mit GraphPad Prism® bestimmt. Mit GraphPad Prism® wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, um die Auswirkungen der AuNP-Behandlung auf den TST-Stoffwechsel bei Einzelspender-HLM zu beurteilen. Wenn die Effekte signifikant waren, wurde ein Mehrfachvergleich mit dem ehrlichen signifikanten Unterschied (HSD)-Test von Tukey auf einem Signifikanzniveau von 5 % durchgeführt. Korrelationskoeffizient nach Pearson (r ) zwischen der CYP-Aktivität von Einzelspender-HLM und der Produktion von CYP-abhängigen TST-Metaboliten wurde mit GraphPad Prism® Version 6.07 (La Jolla, CA) bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Physikochemische Charakterisierung von nacktem und menschlichem Plasmaprotein Corona-AuNP

Der Einfluss der menschlichen Plasmaproteinkorona (PC) auf NP-Größe, Oberflächenladung und Morphologie sowie eine spektrale Eigenschaft wurde mit DLS-, TEM- und UV-Vis-Spektroskopie charakterisiert (Abb. 1). TEM-Bilder zeigten, dass alle nackten (kein PC) und PC AuNP mit Ausnahme von 40 und 80 nm PC BPEI-AuNP monodispers mit der stetigen Größenverteilung und einzigartigen UV-Vis-Spektrumbereichen (520–557 nm) waren (Abb. 1a, b) . Deutliche PC um AuNP in PBS wurden auch durch TEM gefunden. Die Aggregation des 40 und 80 nm PC-beschichteten verzweigten Polyethylenimin (BPEI)-AuNP in PBS bei 0 min bei 25 °C korrelierte mehrere Peaks in der Größenverteilung und Rotverschiebungen der Absorptionsspektren relativ zu nacktem BPEI-AuNP (Abb. 1b). Der hydrodynamische Durchmesser (D_H ) Werte von 40 und 80 nm PC BPEI-AuNP, gelöst in PBS bei 0 min bei 25 °C und in mikrosomalem Inkubationspuffer bei 0 und 45 min bei 37 °C, wurden nicht durch DLS bestimmt, zusammen mit mehreren Peaks in der Größenverteilung. Die D_H Werte des 40 nm nackten BPEI- und LA-AuNP und PC PEG-AuNP und des 80 nm nackten BPEI-AuNP in mikrosomalem Inkubationspuffer bis zu 45 min bei 37 °C deutlich erhöht, während der Wert für 80 nm PC LA . abnahm -AuNP (Tabelle 1). Der Polydispersitätsindex (PDI) von 40 nm nacktem und PC PEG-AuNP und 80 nm PC PEG-AuNP stieg nach 45 min bei 37 °C an. Darüber hinaus nahmen die Zeta(z)-Potentialwerte des 40 nm und 80 nm großen nackten BPEI-AuNP und des 40 nm großen nackten PEG-AuNP im Laufe der Zeit erheblich ab. Frühere Studien berichteten, dass AuNP (7 und 70 nm) in Verbindung mit mikrosomalen Proteinen der menschlichen Leber das charakteristische Absorptionsmaximum im UV-sichtbaren Bereich veränderte [21]. Diese Ergebnisse wurden durch die jüngsten Studien in unserem Labor gestützt, dass PC und Humanserumalbumin-Corona die NP-Größe, die Rotverschiebung der maximalen Extinktion und die Morphologie unabhängig von einem Auflösungsmedium und einer Inkubationszeit veränderten [6, 7, 10, 26]. Basierend auf Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften von PC-vermittelten NP und der enzymatischen Funktion der CYP-Aktivitäten [6, 7] wurde die potenzielle Wirkung des 40- und 80-nm-AuNP auf den CYP-vermittelten mikrosomalen TST-Stoffwechsel der menschlichen Leber in Gegenwart eines stärker biologischen entsprechenden PC.

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von (a ) die 40 und 80 nm großen nackten AuNP in entionisiertem Wasser und b die 40 und 80 nm PC AuNP in PBS bei 0 h bei 25 °C, das UV-Absorptionsspektrum (oberer Einschub) und die dynamische Lichtstreuungsverteilung (unterer Einschub). Pfeile zeigen die PC-Bildung an. BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol, ND nicht bestimmt, PC menschliche Plasmaproteinkorona, nackt kein PC

AuNP-vermittelter Testosteronstoffwechsel in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen

Insgesamt wurden 11 Metaboliten von TST gescreent und sechs Metaboliten wurden in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen (pHLM) bei 10 μM TST gefunden. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse von TST und den sechs ausgewählten Metaboliten ist in Abb. 2 dargestellt. Die Liste der ausgewählten Metaboliten umfasste fünf hydroxylierte TST-Metaboliten (2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 16α -OH TST, 16β-OH TST) und ein dealkylierter Metabolit (Androstenedion, AD). Dies korreliert mit früheren Studien mit humanen Hepatozyten und HLM, dass TST hauptsächlich zu 6β-OH TST und in geringerem Maße zu 2β-OH TST, 15β-OH TST, 16α-OH TST und 16β-OH TST sowie a . hydroxyliert wurde dealkylierter Metabolit, AD [17, 19, 27].

Das extrahierte Ionenchromatogramm (XIC) für Testosteron (TST), ¹³ C3-markiertes TST, Androstendion, 2β-Hydroxytestosteron (2β-OH TST), 16α-Hydroxytestosteron (16α-OH TST), 16β-Hydroxytestosteron (16β-OH TST), 6β-Hydroxytestosteron (6β-OH TST) und 15β -Hydroxytestosteron (15β-OH TST), produziert in gepooltem HLM in einer Endkonzentration von 10 μM Testosteron in Gegenwart von NADPH für 45 Minuten bei 37 °C. HLM menschliche Lebermikrosomen, NADPH ein reduziertes Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

Das Ergebnis der Koinkubation von TST mit dem 40 und 80 nm nackten AuNP in pHLM wurde in den Abb. 3 und 4. Alle 40- und 80-nm-nackten AuNP veränderten die Produktion von 2β-OH TST, 6β-OH TST und 15β-OH TST in pHLM mit unterschiedlichem Hemmungsgrad (Abb. 3a–f). Halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀ ) Werte des 40 nm BPEI-AuNP für die Produktion von 6β-OH TST waren 416 μg mL ⁻¹ ; für 80 nm BPEI-AuNP 438 μg mL ⁻¹ ; und für 80 nm PEG-AuNP 387 μg mL ⁻¹ (Abb. 3c, d). Für die 15β-OH-TST-Produktion IC₅₀ Werte des 40 nm BPEI-AuNP betrugen 1113 μg mL ⁻¹ ; für 80 nm BPEI-AuNP 415 μg mL ⁻¹ ; und für 80 nm PEG-AuNP 480 μg mL ⁻¹ (Abb. 3e, f). Diese Ergebnisse wurden durch In-vitro-Studien mit menschlichen Krebszelllinien und Lebergewebe gestützt, dass ein metallisches NP, AgNP und poröses Silizium-NP die 6β-OH-TST-Produktion in menschlichen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom-Caco2-Zellen, hepatozellulären Karzinom-HepG2-Zellen und menschlichen Lebermikrosomen behinderten [22, 28]. Die nackten 40-nm- und 80-nm-AuNP hemmten die Produktion von 16α-OH-TST und 16β-OH-TST nicht, mit Ausnahme des 40-nm-BPEI-AuNP, das die 16β-OH-TST-Produktion bei der höchsten Konzentration (517 μg ml ^{- .) unterdrückte 1} ) (Abb. 4a–d). Die 40 und 80 nm BPEI-AuNP erhöhten die Produktion von Androstendion (AD) in der höchsten Konzentration mit den entsprechenden Stoffwechselraten von 4,3 und 2,1 pmol mg Protein ⁻¹ min ⁻¹ , bzw. im Vergleich zur Kontrolle (0,7 pmol mg Protein ⁻¹ min ⁻¹ ) (Abb. 4e, f). Aber das 80-nm-LA-AuNP hemmte die AD-Produktion mit IC₅₀ Wert von 233 μg ml ⁻¹ . Diese Ergebnisse zeigten, dass das nackte AuNP die Produktion des ausgewählten TST-Metaboliten in der Oberflächenbeschichtung und auf größenabhängige Weise vermittelt. Darüber hinaus hemmten alle 40- und 80-nm-PC-AuNP die Produktion von sechs ausgewählten Metaboliten aus TST in pHLM bei bis zu 143 μg ml ⁻¹ . nicht , unabhängig von Oberflächenbeschichtungen (Abb. 5 und 6). Insbesondere linderte PC die durch 40 nm nackte BPEI-AuNP-vermittelte Hemmung der Produktion von 6β-OH-TST und 15β-OH-TST bei höheren Konzentrationen (32 μg ml ⁻¹ bis 143 μg ml ⁻¹ ) (Abb. 3c, e und 5c, e). Diese Ergebnisse zeigten, dass die nackten 40- und 80-nm-BPEI-, LA- und PEG-AuNP die TST-Hydroxylierung (2β-OH-TST, 6β-OH-TST und 15β-OH-TST) dosisabhängig verringerten (Abb. 7 .). ). Darüber hinaus erhöhte das 40- und 80-nm-nackte BPEI-AuNP die AD-Produktion, das erstere verringerte jedoch den 16β-OH-TST. In-vitro-Studien berichteten, dass die hauptsächlich durch CYP3A4 vermittelte 6β-OH-TST-Produktion durch einwandige Kohlenstoffnanoröhren (SWCNT) dosisabhängig gehemmt wurde, aber die Korona aus Rinderserumalbumin linderte sie [17, 29]. Unser Labor hat kürzlich berichtet, dass das 40- und 80-nm-nackte und PC-BPEI-AuNP als Inhibitor für CYP1A2, 2C9 und 3A4 auf zellulärer und transkriptioneller Ebene dienten [6, 7]. In-vivo-Studien berichteten, dass PEG-AuNP (4 und 13 nm) hauptsächlich in der Leber von männlichen BALB/c-Mäusen akkumuliert wurde und die Transkriptionsspiegel der hepatischen Cyp1a1- und 2b-Gene veränderte [23]. Männliche ICR-Mäuse mit i.v. Injektion von PEG-NH₂ -AuNP zeigte NP-erhöhte Plasma-TST-Spiegel ohne Spermienmorphologie und Fertilität [30]. Andere metallische NP, Titandioxid (TiO₂ ) wurde in den Hoden von männlichen CD1-Mäusen akkumuliert und verringerte die Expression von cyp1b1 und 2e1 [31]. Eine epidemiologische Studie ergab, dass erwachsene Männer in der Unfruchtbarkeitsklinik von Massachusetts niedrige Plasma-TST-Spiegel aufwiesen, die mit einem hohen Gehalt an 3,5,6-Trichlor-2-pyridinol (TCP) verbunden waren, das aus einer hohen Exposition von Chlorpyrifos (CFS), einem bekannten endokrinen Disruptor, stammte, und ein Inhibitor des CYP-vermittelten TST-Stoffwechsels [32]. Frühere Studien berichteten, dass die bekannten endokrin wirksamen Insektizide CFS, CFS-Oxon, Fonofos, Phorat, Diethyltoluamid (DEET) und Permethrin die Produktion der hydroxylierten und/oder desalkylierten TST-Metaboliten, dh 2β-OH ., wesentlich hemmten und/oder aktivierten TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST und AD und 4-Hydroxy AD in der menschlichen Leber [17]. Vor diesem Hintergrund ist es vernünftig zu postulieren, dass AuNP ein potenzieller endokriner Disruptor sein könnte, indem es eine hemmende und/oder aktivierende Wirkung gegen den CYP-vermittelten Metabolismus von TST vermittelt.

Hemmwirkung von nacktem (kein PC) AuNP auf die Produktion von 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) und 15β-OH TST (e , f ) in pHLM. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , halbmaximale Hemmkonzentration; pHLM , gepoolte menschliche Lebermikrosomen; ND , nicht bestimmt durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten unter Verwendung von GraphPad Prism®; PC , menschliches Plasmaprotein; BPEI , verzweigtes Polyethylenimin; LA , Liponsäure; PEG, Polyethylenglycol; Konz, Konzentration; 2β-OH-TST, 2β -Hydroxytestosteron; 6β-OH-TST, 6β -Hydroxytestosteron; 15β-OH-TST, 15β -Hydroxytestosteron

Eine hemmende und stimulierende Wirkung von nacktem (kein PC) AuNP auf die Produktion von 16β-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) und AD (e , f ) in pHLM. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , halbmaximale Hemmkonzentration; EC ₅₀ , halbmaximale Aktivierungskonz.; pHLM , gepoolte menschliche Lebermikrosomen; ND , nicht bestimmt durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten unter Verwendung von GraphPad Prism®; PC , menschliches Plasmaprotein; BPEI , verzweigtes Polyethylenimin; LA , Liponsäure; PEG , Polyethylenglykol; Konz, Konzentration; 16α-OH-TST, 16α -Hydroxytestosteron; 16β-OH-TST, 16β -Hydroxytestosteron; ANZEIGE , Androstendion.

Auswirkungen von PC AuNP auf die Produktion von 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) und 15β-OH TST (e , f ) in pHLM. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , halbmaximale Hemmkonzentration; pHLM , gepoolte menschliche Lebermikrosomen; ND , nicht bestimmt durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten unter Verwendung von GraphPad Prism®; PC , menschliche Plasmaproteinkorona; BPEI , verzweigtes Polyethylenimin; LA , Liponsäure; PEG , Polyethylenglykol; Konz, Konzentration; 2β-OH-TST, 2β -Hydroxytestosteron; 6β-OH-TST, 6β -Hydroxytestosteron; 15β-OH-TST, 15β-Hydroxytestosteron.

Auswirkungen von PC AuNP auf die Produktion von 16α-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) und AD (e , f ) in pHLM. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± S.D. (n =3). IC ₅₀ , halbmaximale Hemmkonzentration; pHLM , gepoolte menschliche Lebermikrosomen; ND , nicht bestimmt durch Anpassen einer Hill-Gleichung mit variabler Steigung an die beobachteten Daten unter Verwendung von GraphPad Prism®; PC , menschliche Plasmaproteinkorona; BPEI , verzweigtes Polyethylenimin; LA , Liponsäure; PEG , Polyethylenglykol; Konz, Konzentration; 16α-OH-TST, 16α -Hydroxytestosteron; 16β-OH-TST, 16β -Hydroxytestosteron; ANZEIGE , Androstendion.

Vorgeschlagenes Schema des Testosteron-Metabolismus in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen und AuNP-vermittelter Metabolitenproduktion. AuNP Goldnanopartikel, BPEI verzweigtes Polyethylenimin, LA Liponsäure, PEG Polyethylenglykol, PC menschliche Plasmaproteinkorona. Roter Pfeil, hemmende Wirkung; blauer Pfeil, stimulierende Wirkung

TST-Stoffwechsel in menschlichen Lebermikrosomen einzelner Spender und seine Modulation durch AuNP

Die Produktion von sechs ausgewählten Metaboliten wurde mit Einzelspender-HLM charakterisiert, die aus Spendern mit unterschiedlichem Grad an CYP-Aktivität bei der pHLM-basierten nicht-hemmenden Konzentration des 40 und 80 nm nackten und PC-AuNP (10 μg mL ^{-1<.) isoliert wurden /sup> ). Bei drei verschiedenen Einzelspender-HLM wurde eine individuelle Variation des TST-Stoffwechsels beobachtet (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Die Beziehung zwischen der katalytischen Aktivität jedes CYP-Enzyms und der Produktion von TST-abgeleiteten Metaboliten wurde in drei verschiedenen Einzeldonor-HLM charakterisiert, die eine niedrige, eine mittlere und eine hohe katalytische Aktivität von CYP enthielten (Zusatzdatei 1:Tabelle S1). Die Produktion von 6β-OH TST korrelierte positiv mit der Aktivität von CYP2C19 (r =0,99 und p =0,01) und CYP3A4 (r =0,99 und p =0,03) innerhalb von Personen (Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Die AD-Produktion korrelierte negativ mit CYP4A11 (r =− 0,98 und p =0,04) (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S3). Diese Ergebnisse stimmten mit einer früheren Studie überein, in der berichtet wurde, dass CYP3A4 und CYP2D6 eine Schlüsselrolle bei der Produktion eines Haupt-TST-Metaboliten, 6β-OH TST bzw. AD, spielten [17]. Diese Studie legte auch nahe, dass eine individuelle Variation des CYP-abhängigen Metabolismus von TST von den Genotypen der CYP-Enzyme und ihren phänotypischen Aktivitäten abhängt. Eine frühere Studie berichtete, dass CYP-Polymorphismen und -Phänotypen die Schlüsselmerkmale der CYP-Funktion sind und zu einem kategorischen pharmakogenetischen Phänotyp als schlechte, mittlere, extensive und ultraschnelle Metabolisierer führen, die zu einer individuellen Anfälligkeit für unerwünschte Arzneimittelwirkungen und/oder Arzneimittelwirksamkeit und -dosierung beitragen dass ein schwacher Metabolisierer des CYP-Enzyms, dh CYP3A4, durch Exposition gegenüber dem CYP-Inhibitor AuNP für den TST-Metabolismus anfällig sein kann [33].}

Wie in den Abb. 8 und 9 verursachte die Koinkubation von TST mit AuNP bei nicht-hemmender Konzentration eine Zunahme und/oder Abnahme des CYP-vermittelten Metabolismus von TST bei Einzelspender-HLM als Funktion der Größen- und Oberflächenänderungsmodifikation. Die ANOVA zeigte, dass signifikante Veränderungen durch die AuNP-Größe (p <0,0001), Oberflächenbeschichtungen (p <0,0001) und PC-Bildung (p <0.0001) were observed for the production of six selected metabolites of TST in single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3).

Effects of 40 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI branched polyethylenimine, LA lipoic acid, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

Effects of 80 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI branched polyethylenimine, LA lipoic acid, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

All 40 nm naked and PC AuNP decreased both 2β-OH TST and 6β-OH TST production in HDA1 and HDC3 except for PC PEG-AuNP in the former and naked LC-AuNP in the latter, whereas in HDB2, only PC AuNP potentiated inhibition of their productions, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–B3)). The 40 nm naked LA-AuNP was an inhibitor for 15β-OH TST production in HDA1; for HDB2 PC PEG-AuNP; and for HDC3 naked BPEI- and PEG-AuNP and PC LA- and PC PEG-AuNP (Fig. 8(C1–C3)). All 40 nm naked AuNP were an activator for 16α-OH TST production in HDA1 but PC attenuated it except for PC BPEI-AuNP which potentiated its inhibition (Fig. 8(D1)). All 40 nm naked and PC AuNP did not influence the production of 16β-OH production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). AD production was modulated by the 40 nm naked and PC AuNP with varying degrees of inhibition except for PC PEG-AuNP which served an activator in HDC3 (Fig. 8(F1–F3)).

The 80 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST production was observed within individuals except for 80 nm naked and PC PEG-AuNP which served as the activators in HDB2 and HDC3, respectively (Fig. 9(A1–A3)). These results were not consistent with all naked and PC 40 nm AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–A3)). For 6β-OH TST, the 80 nm naked AuNP were the activators except for LA-AuNP but PC potentiated its inhibition in HDB2 (Fig. 9(B2)), which was similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition and/or activation, respectively (Fig. 8(B2)). For 15β-OH TST, 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP and PC PEG-AuNP were the activators in HDB2 and in HDC3, respectively (Fig. 9(C2 and C3)). The 80 nm naked AuNP increased 16α-OH TST production in HDA1, irrespective of surface coatings but PC attenuated it except for PC LA-AuNP which was an inhibitor (Fig. 9(D1)). This is similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated activation and attenuation for 16α-OH TST production in HDA1 (Fig. 8(D1)). All 80 nm naked and PC were not inhibitory to 16β-OH TST production within all individuals, irrespective of surface coatings (Fig. 9(E1–E3)). These results were consistent with the 40 nm naked and PC-mediated its production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). For AD production, the 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP were the inhibitors but PC attenuated and vice versa with naked and PC LA-AuNP in HDA1 (Fig. 9(F1)). The 80 nm naked and PC AuNP decreased its production in HDC3 except for PC PEG-AuNP, which was an activator (Fig. 9(F3)). This study strongly suggests that AuNP interaction with CYP enzymes in HLM cause a decrease and/or increase in TST conversion to hydroxylated and dealkylated metabolites within individuals and the presence of PC played the inhibitive or protective role. In vivo study reported that the male CD-1 mice orally administrated with ketoconazole, a noncompetitive CYP3A4 inhibitor showed that a decrease in serum TST level, gonadal TST secretion, and hepatic TST hydroxylation activity that included 6β-OH TST, 15α-OH TST, 15β-OH TST, and 16β-OH TST [34]. In vitro studies with human hepatocyte, C3A cell line, HepG2 cell line, HLM, and recombinant CYP enzymes suggested that AuNP modulated the activity of various CYP enzymes that included CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 3A4 [6, 7, 20, 21]. PC and human serum albumin corona mitigated an inhibitory effect of BPEI- and LA-AuNP on CYP1A2, 2C9, and 3A4 enzyme activity in human hepatocytes and C3A cell line [6, 7]. That being said, it may be rational to propose that AuNP interference with CYP enzymes relates individual susceptibility to unexpected toxicological effects that may result in an altered circulating TST level tied to endocrine disrupting substance and/or drug-drug interaction sharing the same CYP enzymes [35].

Schlussfolgerungen

These studies exhibit that AuNP interaction with PC definitely modulate CYP-dependent metabolism of TST in HLM derived from a large donor pool that better represents the average American population. The 40 nm naked (no PC) AuNP and to a lesser degree 80 nm naked AuNP inhibited TST hydroxylation but activated TST dealkylation at high concentration. Cationic BPEI-AuNP withheld the production of 6β-OH TST and 15β-OH TST in pooled HLM but the presence of a more biologically relevant PC alleviated their adverse effects as function of size and surface charge modification. In most cases, the 40 and 80 nm naked and PC AuNP are essentially inhibitory to TST metabolism in single donor HLM in a surface chemistry-dependent manner at the noninhibitory concentration. In addition, PC PEG-AuNP caused an activation of AD production in HDC3, irrespective of size. These results may indicate that individual variations in AuNP-mediated TST metabolism could be a factor for their toxicity and could be utilized to identify vulnerable subgroup to TST-disrupting NP.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data generated or analyzed during this study are included in this article and its supplementary information file.

Abkürzungen

11β-OH TST:

11β-hydroxytestosterone

15β-OH TST1:

5β-hydroxytestosterone

16α-OH TST:

16α-hydroxytestosterone

16β-OH TST:

16β-hydroxytestosterone.

2α-OH TST:

2α-hydroxytestosterone

2β-OH TST:

2β-hydroxytestosterone

6α-OH TST:

6α-hydroxytestosterone

6β-OH TST:

6β-hydroxytestosterone

AD:

Androstenedione

AgNP:

Silver nanoparticles

ANOVA:

One-way analysis of variance

AuNP:

Goldnanopartikel

BPEI:

Branched polyethylenimine

CFS:

Chlorpyrifos

CYP:

Cytochrome P450

DEET:

Diethyltoluamide

D_H :

Hydrodynamic diameters

DI:

Entionisiertes Wasser

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

EC₅₀ :

Half maximal activation concentration

EDC/NHS:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide

ESI ⁺ :

Electrospray positive

HLM:

Human liver microsomes

HSD:

Tukey’s honest significant difference

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ISTD:

Internal standard

LA:

Lipoic acid

LC-MS/MS:

Liquid chromatography-mass spectrometry

LOD:

Limit of detection

LOQ:

Limit of quantitation

MRM:

Multiple reaction monitoring

NADP:

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NADPH:

Reduced NADP

naked:

No PC

NP:

Nanopartikel

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PC:

Human plasma protein corona

PDI:

Polydispersity index

PEG:

Polyethylenglykol

pHLM:

Pooled human liver microsomes

QC:

Quality control

SWCNT:

Einwandige Kohlenstoff-Nanoröhrchen

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TFF:

Tangential flow filtration

TiO₂ :

Titanium dioxide

TST:

Testosterone

UPLC TQD:

Ultra performance liquid chromatography system with Triple quadrupole Detector