Goldnanopartikel modulieren Testosteron-Stoffwechsel in menschlichen Lebermikrosomen: Einfluss von Größe, Oberflächenchemie und Proteinkorona

Zusammenfassung

Goldnanopartikel (AuNP)–Proteinkorona-Komplexe können den durch Cytochrom P450 (CYP) vermittelten Testosteron (TST)-Stoffwechsel verändern, indem sie deren physikochemische Eigenschaften modifizieren. Wir untersuchten, wie Nanopartikelgröße, Oberflächenchemie und die humane Plasmaproteinkorona (PC) den TST-Stoffwechsel in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen (pHLM) beeinflussen. 20–40 nm und 80 nm große AuNPs, funktionalisiert mit verzweigtem Polyethylenimin (BPEI), Liponsäure (LA) oder Polyethylenglykol (PEG), wurden sowohl „nackt“ als auch mit PC untersucht. In pHLM hemmten 40 nm nackte AuNPs die Bildung von fünf hydroxylierten TST-Metaboliten, während 80 nm Partikel einen schwächeren Effekt zeigten. Die PC milderte diese Hemmungen weitgehend ab. Überraschenderweise steigerten nackte AuNPs die Androstendion-Produktion. In Einzelspender-HLM wurde eine interindividuelle Variabilität beobachtet: Die meisten AuNPs unterdrückten den TST-Stoffwechsel bei nicht-inhibitorischen Konzentrationen, während PC-PEG-AuNPs die Androstendion-Produktion stimulierten. Diese Ergebnisse verdeutlichen AuNPs als potenzielle endokrine Disruptoren durch Modulation des TST-Stoffwechsels und liefern einen Rahmen für das Screening anderer Nanomaterialien.

Einleitung

AuNPs finden aufgrund ihrer einzigartigen optischen und physikalischen Eigenschaften breite Anwendung in der Arzneimittelabgabe, Diagnostik und Konsumgütern (Refs. 1–3). Bei Kontakt mit biologischen Flüssigkeiten lagern AuNPs rasch Proteine an und bilden eine Korona, die Oberflächenchemie, Proteinkonformation und nachgeschaltete biologische Reaktionen verändert – einschließlich Zytotoxizität, zellulärer Aufnahme und CYP-Enzymaktivität (Refs. 4–7). In-vitro-Studien zeigten, dass AuNPs für menschliche Hepatozyten, die C3A-Hepatomzelllinie und Spermien toxisch sein können (Refs. 6–8), wobei die Anwesenheit einer PC diese Effekte je nach Oberflächenchemie abschwächen oder verstärken kann (Refs. 6–7). Die PC-Bildung beeinträchtigt zudem die zelluläre Aufnahme in verschiedenen Zelltypen unabhängig von NP-Größe oder -Ladung (Refs. 6–12).

CYP-Enzyme in der Leber metabolisieren endogene und exogene Substanzen. Verschiedene Wirkstoffe – darunter Medikamente, Pestizide und Nanopartikel – können die Synthese und den Stoffwechsel von Steroidhormonen stören und so physiologische Funktionen verändern (Refs. 13–17). Testosteron (TST) ist ein primäres Androgen und Substrat für CYP3A4, das es zu 6β-OH-TST hydroxyliert. Weitere Hydroxylierungen durch CYP3A4 ergeben 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST und 16β-OH-TST, während CYP2D6 TST zu Androstendion (AD) dealkyliert (Refs. 17, 19, 27). Frühere Arbeiten zeigen, dass nackte und PC-beschichtete AuNPs ein breites Spektrum von CYP-Enzymen modulieren, einschließlich CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 und 3A4 (Refs. 6, 7, 20–21). AgNPs unterdrücken ebenfalls die CYP3A4-Aktivität in HLM (Ref. 22). BPEI- und LA-funktionalisierte AuNPs verringern die CYP3A4-Aktivität in C3A-Zellen, wobei die PC diesen Effekt abschwächt (Ref. 7). In vivo reichern sich kleine AuNPs in Leber und Milz an und verändern die hepatische Cyp1a1- und Cyp2b-Expression (Ref. 23). Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliege Studie, wie die PC die AuNP-Größe, -Ladung und -Oberflächenchemie im CYP-vermittelten TST-Stoffwechsel in pHLM und Einzelspender-HLM beeinflusst.

Methoden

Chemikalien

Testosteron, seine Metaboliten und ¹³C₃-markiertes TST wurden von MilliporeSigma (St. Louis, MO) bezogen. Weitere Reagenzien stammten von Steraloids oder MilliporeSigma. LC-MS-taugliche Lösungsmittel kamen von Fisher Scientific; ultrareines Wasser wurde mit einem Merck Synergy® UV-R-System erzeugt.

Humane Lebermikrosomen

Gepoolte HLM (pHLM) von 200 Spendern (100 männlich, 100 weiblich) und Einzelspender-HLM wurden von Corning Inc. (Charlotte, NC) bezogen. Spenderspezifische CYP-Aktivitäten sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt.

Synthese von Goldnanopartikeln

Biopure™ 40-nm und 80-nm AuNPs, funktionalisiert mit BPEI, LA oder PEG, wurden von nanoComposix erworben. Die Kernsynthese erfolgte durch Reduktion von HAuCl₄·3H₂O in K₂CO₃, gefolgt von Reifung und Tangentialstromfiltration (TFF). Zur Oberflächenfunktionalisierung: LA (0,2:1 Gew./Gew.) oder PEG (0,5:1 Gew./Gew.) wurden zugesetzt, gefolgt von TFF und steriler Filtration. BPEI-Oberflächen wurden über EDC/NHS-Chemie durch Verknüpfung von LA-Carboxylgruppen mit BPEI-Aminogruppen hergestellt; ungebundenes BPEI wurde durch TFF und Zentrifugation entfernt.

Proteinkorona-Präparation

Gepooltes humanes Plasma (n=5) wurde mit 40-nm oder 80-nm AuNPs bei 55 % Plasmasvolumen in einem 37 °C-Schüttler (250 rpm, 1 h) inkubiert. PC-AuNPs wurden durch Zentrifugation (20.000×g, 20 °C, 20 min) gesammelt, dreimal mit PBS gewaschen und in PBS zur Charakterisierung resuspendiert.

Physikalische Charakterisierung

DLS und TEM bestimmten Partikelgröße, Polydispersität und Zeta-Potenzial. Messungen erfolgten in DI-Wasser, PBS und mikrosomalem Inkubationspuffer (pH 7,4) bei 0 min und 45 min (37 °C). TEM-Gitter wurden an einem Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 kV) untersucht. UV-Vis-Spektren wurden mit einem Spectra Max i3 Reader aufgezeichnet.

In-vitro-Testosteron-Stoffwechsel

Linearer TST-Stoffwechsel (10 µM) wurde über 1,3–9,3 mg mL⁻¹ mikrosomales Protein für bis zu 60 min bestätigt. pHLM wurden mit TST und variierenden Konzentrationen nackter oder PC-AuNPs (0–571 µg mL⁻¹) inkubiert. Reaktionen wurden mit oder ohne NADPH (0,25 mM NADP, 2,5 mM Glucose-6-phosphat, 2 U mL⁻¹ Dehydrogenase) gestartet und nach 45 min bei 37 °C mit 4 % Phosphorsäure gestoppt. Überstände wurden zentrifugiert, bei –20 °C gelagert und für LC-MS/MS aufbereitet. Einzelspender-HLM wurden analog bei 10 µg mL⁻¹ AuNPs behandelt.

Standards und Probenvorbereitung

Primärstandards (1 mM) und ISTD (¹³C₃-TST) wurden in Methanol hergestellt. Arbeitsstandards reichten von 0,01 bis 200 µM. QC-Proben lagen bei 0,01, 0,05 und 0,1 µM. Proben wurden mit ISTD versetzt, über Oasis PRIME HLB-Platten extrahiert, gewaschen, eluiert, verdünnt und per LC-MS/MS analysiert.

Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie

Die Trennung erfolgte über eine Waters UPLC HSS T3-Säule (2,1 × 50 mm, 1,8 µm) mit 600 µL min⁻¹ Fluss. Gradient: 30 % B auf 98 % B über 8,4 min. ESI⁺-Quelle bei 4000 V, 150 °C; Desolvatisierung bei 450 °C. MRM-Übergänge sind in der ergänzenden Tabelle S2 aufgeführt. Kalibrationskurven umfassten 0,001–20 µM. LOD und LOQ betrugen 0,001 µM bzw. 0,005 µM.

Statistische Analyse

Student’s t-Test prüfte D_H- und PDI-Unterschiede. IC₅₀- und EC₅₀-Werte wurden über die Hill-Gleichung in GraphPad Prism® berechnet. Einfaktorielle ANOVA mit Tukeys HSD (p < 0,05) evaluierte AuNP-Effekte. Pearson-Korrelation (r) verband CYP-Aktivität mit Metabolitbildung.

Ergebnisse und Diskussion

Physikochemische Eigenschaften der AuNPs

TEM bestätigte die Monodispersität aller nackten und PC-AuNPs, außer bei 40-nm und 80-nm PC-BPEI-AuNPs, die in PBS Aggregation zeigten. D_H-Werte stiegen für 40-nm nackte BPEI- und LA-AuNPs sowie PC-PEG-AuNPs über 45 min an, während 80-nm PC-LA-AuNPs abnahmen. PDI nahm für 40-nm nackte und PC-PEG-AuNPs zu, und das Zeta-Potenzial sank über die Zeit für nackte BPEI-AuNPs. Diese Änderungen spiegeln frühere Befunde wider, wonach PC NP-Größe, Absorbanz und Morphologie verändert (Refs. 6, 7, 10, 26).

TST-Stoffwechsel in gepoolten HLM

Sechs TST-Metaboliten (fünf hydroxylierte und AD) wurden in pHLM detektiert. Nackte 40-nm und 80-nm AuNPs hemmten die Bildung von 2β-OH-TST, 6β-OH-TST und 15β-OH-TST dosisabhängig (IC₅₀: 416–1113 µg mL⁻¹). 16α- und 16β-OH-TST wurden nicht inhibiert, außer 40-nm BPEI-AuNP unterdrückte 16β-OH-TST leicht bei höchster Dosis. Interessanterweise steigerten nackte AuNPs die AD-Produktion bei hohen Konzentrationen (4,3 pmol mg⁻¹ min⁻¹ für 40-nm BPEI-AuNP). PC-beschichtete AuNPs hoben diese Hemmungen weitgehend auf; PC milderte auch den stimulierenden Effekt auf AD bei 80-nm LA-AuNP. Insgesamt reduzierten nackte AuNPs die Hydroxylierung, während sie teils die Dealkylierung verstärkten – ein Effekt, der durch PC abgeschwächt wird.

Variabilität in Einzelspender-HLM

Spenderspezifische CYP-Aktivität korrelierte stark mit Metabolitbildung: 6β-OH-TST korrelierte mit CYP2C19 (r = 0,99, p = 0,01) und CYP3A4 (r = 0,99, p = 0,03); AD korrelierte invers mit CYP4A11 (r = –0,98, p = 0,04). AuNPs bei nicht-inhibitorischen Konzentrationen modulierten die Metabolitbildung unterschiedlich zwischen Spendern, was CYP-Polymorphismen und -Phänotypen widerspiegelt (Refs. 33). Größe, Oberflächenbeschichtung und PC-Bildung beeinflussten die Metabolitspiegel signifikant (p < 0,0001). PC-PEG-AuNPs aktivierten beispielsweise die AD-Produktion in Spender HDC3 unabhängig von der Größe.

Schlussfolgerungen

AuNPs, insbesondere nackte 40-nm und 80-nm Partikel, inhibieren die TST-Hydroxylierung und können die Dealkylierung in gepoolten HLM stimulieren. Die Anwesenheit einer biologisch relevanten PC mildert diese Effekte, besonders bei kationischen BPEI-AuNPs. In Einzelspender-HLM sind AuNP-Effekte oberflächenchemie-abhängig und variieren mit der individuellen CYP-Aktivität, was das Potenzial von AuNPs als endokrine Disruptoren unterstreicht. Diese Ergebnisse bieten einen Rahmen zur Bewertung anderer Nanomaterialien hinsichtlich ihres Einflusses auf den Steroidhormonstoffwechsel und zur Identifikation vulnerabler Subpopulationen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel und seiner ergänzenden Informationsdatei enthalten.

Abkürzungen

11β-OH TST

11β-Hydroxytestosteron

15β-OH TST

15β-Hydroxytestosteron

16α-OH TST

16α-Hydroxytestosteron

16β-OH TST

16β-Hydroxytestosteron

2α-OH TST

2α-Hydroxytestosteron

2β-OH TST

2β-Hydroxytestosteron

6α-OH TST

6α-Hydroxytestosteron

6β-OH TST

6β-Hydroxytestosteron

AD

Androstendion

AgNP

Silbernanopartikel

ANOVA

Einfaktorielle Varianzanalyse

AuNP

Goldnanopartikel

BPEI

Verzweigtes Polyethylenimin

CFS

Chlorpyrifos

CYP

Cytochrom P450

DEET

Diethyltoluamid

D_H

Hydrodynamischer Durchmesser

DI

Deionisiertes Wasser

DLS

Dynamische Lichtstreuung

EC₅₀

Halbmaximale Aktivierungskonzentration

EDC/NHS

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid/N-Hydroxysuccinimid

ESI⁺

Elektrospray-Ionisation (positiv)

HLM

Humane Lebermikrosomen

HSD

Tukeys ehrlich signifikanter Unterschied

IC₅₀

Halbmaximale Inhibitorische Konzentration

ISTD

Interner Standard

LA

Liponsäure

LC-MS/MS

Flüssigkeitschromatographie-Tandemmassenspektrometrie

LOD

Nachweisgrenze

LOQ

Bestimmungsgrenze

MRM

Multiple Reaction Monitoring

NADP

Reduziertes Nicotinamidadenindinukleotidphosphat

NADPH

Reduziertes NADP

naked

Ohne PC

NP

Nanopartikel

PBS

Phosphatgepufferte Salzlösung

PC

Humane Plasmaproteinkorona

PDI

Polydispersitätsindex

PEG

Polyethylenglykol

pHLM

Gepoolte humane Lebermikrosomen

QC

Qualitätskontrolle

SWCNT

Eingewandete Kohlenstoffnanoröhren

TEM

Transmissionselektronenmikroskopie

TFF

Tangentialstromfiltration

TiO₂

Titandioxid

TST

Testosteron

UPLC TQD

Ultra-Performance-LC mit Tripelquadrupol-Detektor