Herstellung hybrider Nanostrukturen basierend auf Fe3O4-Nanoclustern als theranostische Wirkstoffe für die Magnetresonanztomographie und die Wirkstoffabgabe

Einführung

In den letzten Jahren wurden verschiedene multifunktionale Drug-Delivery-Systeme für die zukünftige Diagnose und Therapie in der biomedizinischen Anwendung entwickelt [1,2,3,4]. Multifunktionale hybride Nanostrukturen mit integrierten günstigen Eigenschaften werden bedeutende Anwendungen wie multimodale Bildgebung und gleichzeitige Diagnose und Therapie besitzen [5,6,7,8,9,10,11]. Darüber hinaus sind diese Nanostrukturen stimuliresponsive Arzneimittelabgabesysteme für eine verbesserte Arzneimittelakkumulation, verbesserte therapeutische Wirksamkeit und/oder reduzierte Nebenwirkungen. Insbesondere diese pH-responsiven Arzneimittelabgabesysteme haben ein umfangreiches Forschungsinteresse auf sich gezogen. Dies liegt daran, dass die meisten menschlichen Tumoren einen saureren pH-Wert aufweisen, was eine Möglichkeit bietet, die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffmolekülen zu gestalten [12,13,14,15,16].

In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene hybride Nanostrukturen durch Kombination anorganischer Nanomaterialien mit organischen Polymeren [17,18,19,20] entwickelt, darunter magnetische Partikel [21,22,23], Upconversion-Nanopartikel (NPs) [17, 24] , und mesoporöse Silica-Partikel [25]. Unter diesen sind magnetische Hybrid-Nanostrukturen auf der Basis von Eisenoxiden mit relativ großer Magnetisierung bei Raumtemperatur in den biomedizinischen Bereichen weit verbreitet [26,27,28,29]. Die Funktionalisierung anorganischer Nanomaterialien, die mit Polyelektrolytschichten beschichtet sind, kann eine pH-responsive Einkapselung und Freisetzung von Wirkstoffmolekülen realisieren [12, 17, 30]. In jüngerer Zeit wurden Polyelektrolytschichten aus Natriumpoly(styrolsulfonat) (PSS) und dem Polykation Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH) umfassend untersucht [31,32,33,34,35,36]. Kürzlich wurde auch über Polyelektrolytschichten in Kombination mit magnetischen und lumineszierenden NPs oder Wirkstoffmolekülen für multifunktionale Wirkstofftransportsysteme berichtet [37,38,39]. Eisenoxid (Fe₃ .) O₄ ) Nanopartikel erhalten aufgrund ihrer einzigartigen superparamagnetischen Eigenschaften, Biokompatibilität, geringen Zytotoxizität und Flexibilität im Bereich der Magnetresonanztomographie (MRT) und der Wirkstoffabgabe immer mehr Aufmerksamkeit [9, 11, 28, 29, 40, 41, 42 ]. Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden, um die magnetische Reaktionsfähigkeit von Fe₃ . zu verbessern O₄ NPs. Die erste besteht darin, die mikrometergroßen Magnetitpartikel zu synthetisieren. Aufgrund ihrer großen Größe neigen sie jedoch dazu, in wässriger Lösung zu aggregieren, was für biomedizinische Anwendungen nicht vorteilhaft ist. Der andere Ansatz besteht darin, Fe₃ . zusammenzubauen O₄ NPs in Nanocluster (NCs). Diese Fe₃ O₄ NCs verbesserten die magnetische Reaktionsfähigkeit im Vergleich zu einzelnem Fe₃ . erheblich O₄ NPs [22, 43]. Wenn also das selbstorganisierte Fe₃ O₄ NCs werden als Kern zur Herstellung multifunktionaler hybrider Nanostrukturen verwendet, die MRT-Leistung wird durch die kollektive Wirkung von Fe₃ . verbessert O₄ NPs [43,44,45]. Unseres Wissens ist das selbstorganisierte Fe₃ O₄ Mit PAH/PSS-Multilayern funktionalisierte NCs für die pH-responsive Wirkstofffreisetzung wurden selten beschrieben.

In dieser Arbeit wird eine vielseitige theranostische Nanoplattform basierend auf Fe₃ O₄ NPs wurde für MRT und Medikamentenabgabe aufgebaut. In unserem Ansatz ist Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden durch Kombination einer Öl-in-Wasser-Mikroemulsionsmethode und einer Schicht-für-Schicht-(LBL)-elektrostatischen Adsorptionsmethode erhalten. Es wird erwartet, dass das gepackte Fe₃ O₄ NC-System kann zu einem verbesserten T . führen ₂ Relaxivität und Bildkontrast sowie die große spezifische Oberfläche von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen ermöglichen eine hohe Beladung mit Krebsmedikamenten. Darüber hinaus zeigt ein In-vitro-Experiment, dass der zelluläre MRT-Kontrast von menschlichen Lungenkrebszellen (A549) mit Fe₃ . inkubiert wurde O₄ NC/PAH/PSS/DOX wurde erheblich verbessert.

Materialien und Methoden

Materialien

FeCl₃ ·6H₂ O (99,99%), FeCl₂ ·4H₂ O (99,99%), Ölsäure (OA, 90%) und 1-Octadecen (ODE, 90%) wurden von Alfa Aeasar bezogen. Natriumoleat (NaOA), Ethanol, Hexan, Cyclohexan, Isopropanol, Natriumdodecylbenzolsulfonat (SDBS), Ammoniumfluorid (NH₄ .) F), Natriumhydroxid (NaOH), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Ammoniak wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (China) bezogen. Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH), Poly(styrolsulfonat) (PSS) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Das Krebsmedikament Doxorubicinhydrochlorid (DOX,> ~98%) wurde von der Shanghai Sangon Biotech Company (Shanghai, China) bezogen. APMI 1640-Wachstumsmedium und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Hyclone bezogen. Alle Reagenzien wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet.

Zubereitung von Eisen(III)-oleat

Die Synthese magnetischer NPs begann mit der Synthese von Eisen(III)-Oleat. FeCl₃ ·6H₂ O (2,59 µg), NaOA (14,6 µg), C₂ H₅ OH (32 mL), H₂ O (24 ml) und Hexan (56 ml) wurden in einem 150-ml-Dreihalskolben vermischt und 4 h lang zum Rückfluss auf 70 °C erhitzt, um eine transparente Eisen(III)-oleat-Komplexlösung zu bilden. Danach wurde die Flüssigkeit durch einen Scheidetrichter abgetrennt und die obere Ölschicht konserviert. Hexan in der Flüssigkeit wurde bei 70 °C durch Rotationsverdampfung verdampft und 48 h unter Vakuum getrocknet. Die vorbereiteten Proben wurden zur weiteren Verwendung in einer Vakuum-Handschuhbox aufbewahrt.

Synthese von Fe₃ O₄ NPs

Wir synthetisierten Fe₃ O₄ NPs nach zuvor berichteten Verfahren mit leichten Modifikationen [46]. Eisen(III)-oleat (7,2 g), OA (1,28 ml) und ODE (50 ml) wurden in einem 100-ml-Dreihalskolben zusammengemischt und 40 min unter Argonschutz auf 300 °C erhitzt; danach wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt und mehr als 12 h an der Luft oxidiert. Die resultierenden Nanokristalle wurden durch Zugabe von Isopropanol ausgefällt, zentrifugiert und zweimal mit einer Ethanol-Wasser-Mischung gewaschen (1:1 v /v ). Das mit Ölsäure überzogene Fe₃ O₄ Die NPs wurden schließlich in 200 ml Cyclohexan dispergiert, und der Überstand wurde verschlossen und für die nachfolgenden Experimente aufbewahrt.

Vorbereitung von Fe₃ O₄ NCs

Fe₃ O₄ NCs wurden durch eine einfache und unkomplizierte Mikroemulsions-Selbstorganisationstechnik hergestellt, wie zuvor mit Modifikation beschrieben [47]. Kurz gesagt, eine 200-μl-Lösung von Fe₃ O₄ Nanokristalle in Cyclohexan wurden in 4 ml einer wässrigen Lösung gegossen, die 14 mg SDBS enthielt. Die gemischte Lösung wurde 4 mal 5 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Die gebildete Feststoff-in-Öl-in-Wasser-Emulsion (S/O/W) wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, um das organische Lösungsmittel zu verdampfen, gefolgt von der Selbstorganisation von Fe₃ . O₄ NPs, um 3D-NCs zu bilden. Die Endprodukte wurden dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen, um überschüssiges SDBS, nicht eingebaute Nanokristalle und einige mögliche größere Verunreinigungen zu entfernen.

Vorbereitung von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen

Das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden durch elektrostatische anziehende Wechselwirkungen hergestellt. Das so hergestellte Fe₃ O₄ NCs sind aufgrund der Verkapselung der anionischen Tenside negativ geladen. Sie wurden zuerst durch Adsorption einer Schicht aus positiv geladenem Polyelektrolyt, Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH, MW 15 000), positiv geladen. Insbesondere ein 300-μl-Fe₃ O₄ Die NC-Probe wurde zuerst mit entionisiertem Wasser 10 mal auf 3 ml verdünnt. Das Fe₃ O₄ Anschließend wurde das NC-Gemisch tropfenweise zu einer wässrigen PAH-Lösung (1 &mgr;l, 10 &mgr;g/l, 4 &mgr;mM NaCl) unter kräftigem Rühren zugegeben. Nachdem die Lösung 24 Stunden lang gerührt worden war, wurde das überschüssige PAH durch Zentrifugation entfernt und das resultierende PAH-beschichtete Fe₃ O₄ NC (Fe₃ .) O₄ NC/PAH) wurden in Wasser (3 mL) redispergiert.

Das Fe₃ O₄ NC/PAH wurden dann durch Adsorption einer Schicht aus negativ geladenem Polyelektrolyt, Poly-(Natrium-4-styrolsulfonat) (PSS, MW 70.000) negativ geladen. Insbesondere ein 3-ml-Fe₃ O₄ NC/PAH-Probenlösung wurde tropfenweise zu einer wässrigen PSS-Lösung (1 &mgr;l, 10 &mgr;g/l, 4 &mgr;mM NaCl) unter kräftigem Rühren zugegeben. Nachdem die Lösung 24 Stunden lang gerührt worden war, wurde das überschüssige PSS durch Zentrifugation entfernt und das resultierende PSS-beschichtete Fe₃ O₄ NC/PAK (Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS) wurden in Wasser (3 mL) redispergiert.

Zuerst wurde die wässrige DOX-Stammlösung hergestellt [17]. Die Konzentration betrug 5,0 mg/ml. Die hybride Nanostrukturlösung wurde durch Mischen des Fe₃ . erhalten O₄ NC/PAH/PSS-Lösung (3 ml, 32 mg/ml) und die DOX-Stammlösung (60 μl) in einem kleinen Plastikröhrchen unter Rühren für 24 h in der Dunkelkammer. Nach der Zentrifugation wird das Fe₃ O₄ Schließlich wurden NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen erhalten.

MRT-Messungen

Die MRT-Messungen wurden in einem 11,7 T micro 2,5 Mikrobildgebungssystem (Bruker, Deutschland) durchgeführt. Die unterschiedliche Menge an Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden in 1,2 ml wässriger Agarose-Lösung dispergiert und dann für MRT-Messungen in die Mikroröhrchen geladen. Die endgültige Fe-Ionenkonzentration betrug 0 µM, 0,013 µM, 0,026 µM, 0,032 µM, 0,041 µM, 0,052 µM bzw. 0,065 µM. Die Messparameter sind wie folgt:Repetitionszeit (TR) =300 µms, Echozeit (TE) =4,5 µms, Bildgebungsmatrix =128 × 128, Schichtdicke =1,2 µm, Sichtfeld (FOV) =2,0 × 2,0 µm, und Anzahl der Mittelwerte (NA) =2.

Zelluläre Aufnahme und MR-Bildgebung

Um eine effiziente zelluläre Aufnahme zu demonstrieren, wurden die A549-Zellen auf das Deckglas in der konfokalen Schale ausgesät und in einem befeuchteten 5 % CO₂ . inkubiert Atmosphäre für 4 h bei 37 °C. Dann wird das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen in das Inkubationsmedium gegeben und 2 h lang inkubiert. Die endgültigen Fe-Ionenkonzentrationen wurden als 0, 2,2, 4,5, 9,0 bzw. 13,5 µM erhalten. Nachdem das Medium entfernt wurde, wurden die Zellen zweimal mit PBS (pH =7,4, 20 mM) gewaschen und direkt für die MR-Bildgebung verwendet.

Standardkurve von DOX

Durch Oszillation wurde eine geeignete Menge DOX in Wasser gelöst. Dann wurde eine Reihe von verschiedenen Konzentrationen einer wässrigen DOX-Lösung hergestellt (0–0,03 mg/ml). Die Fluoreszenzintensität verschiedener Konzentrationen der DOX-Lösung wurde gemessen (λ _ex =490 nm). Schließlich wurde die Standardkurve von DOX durch die Kurvenanpassung der Fluoreszenzintensität vs . bestimmt die DOX-Konzentration.

Die Flächenstandardkurve:Y =447,4423 + 69745.08457X.

Präzisionsrate der Standardkurve:R ² =0,9992.

DOX-Laden und -Freigeben

Um die Belastbarkeit des Fe₃ . zu messen O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen, die überstehende Lösung wurde nach Zentrifugation der so hergestellten Hybrid-Nanostrukturen gesammelt. Das Fluoreszenzspektrum von DOX-Molekülen in der Überstandslösung wurde untersucht und die Konzentration von DOX im Überstand wurde durch Vergleich der Standardkurve von DOX berechnet. Der im Fe₃ . verbleibende DOX-Anteil O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden nach der folgenden Gleichung berechnet:

wo W ₀ und W _s repräsentieren die anfängliche DOX-Masse bzw. die DOX-Masse in den Überständen.

Für die kumulativen DOX-Freisetzungsstudien in PBS-Pufferlösungen (pH 5,0 und 7,4) mit der gleichen NaCl-Konzentration von 0,15 M wurde der Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden in 1,0 ml Pufferlösung dispergiert und dann in einen Dialysebeutel überführt. Dann wurde es in Pufferlösung aufbewahrt und bei 37 °C in der Dunkelkammer vorsichtig geschüttelt. In ausgewählten Zeitintervallen wurden 100 µl Lösung entnommen und anhand des Fluoreszenzspektrums analysiert und dann in die ursprüngliche Lösung zurückgeführt.

In-vitro-Zytotoxizität von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen

In-vitro-Zytotoxizität des Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden gegen A549-Zellen basierend auf dem Standard-Methylthiazolyltetrazolium (MTT)-Assay bewertet. A549-Zellen wurden in APMI 1640-Wachstumsmedium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), Streptomycin mit 100 µg/ml und Penicillin mit 100 µg/ml ergänzt war. Die Zellen wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ . gehalten in der Luft. Der Assay wurde dreifach auf die gleiche Weise durchgeführt. Kurz gesagt, A549-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 8 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Well in 100 µl Medium. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Zellen dann bei verschiedenen Konzentrationen an freiem DOX, Fe₃ . inkubiert O₄ NC/PAH/PSS und Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 µM) für 24 Stunden. Nach einer Inkubation für 24 Stunden wurden die 10 µl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Lösung (5 µg/ml) in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden weitere 4 Minuten lang inkubiert h bei 37 °C. Nachdem die 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Lösung entfernt wurde, wurden 150 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde zum Auflösen 10 Minuten lang leicht geschüttelt die ausgefallenen violetten Kristalle. Die optische Dichte (OD) wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Perkin Elmer, Victor X4) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz im Vergleich zu Kontrollzellen bewertet.

Charakterisierung

Die Größen und Morphologien von Fe₃ O₄ NPs und Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden mit einem FEI Tecnai G2-F20 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht. Dynamische Lichtstreuung (DLS)-Messungen wurden an einem Partikelgrößen- und Zetapotential-Analysator von Malvern (Zetasizer Nano ZS90) durchgeführt. Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit einem Perkin Elmer Lambda-25 UV-Vis-Spektrometer aufgenommen. Die Fluoreszenzspektren wurden mit einem Hitachi F-4600 Fluoreszenz-Spektrophotometer aufgenommen. Induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektroskopie (ICP-AES) (Agilent 5100) wurde verwendet, um die Element-Fe-Konzentrationen im Fe₃ . zu analysieren O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen.

Ergebnisse und Diskussion

Das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen werden durch Selbstorganisation von primärem Eisenoxid (Fe₃ O₄ ). Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der Synthese von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen. Hydrophober ölsäurebeschichteter Magnetit Fe₃ O₄ NPs wurden zunächst durch den thermischen Zersetzungsprozess in organischen Lösungsmitteln hergestellt [46]. Fe₃ O₄ NPs sind kugelförmig und haben eine einheitliche Größe mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von etwa 15 nm (Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Für die Montage magnetischer NCs ist das OA-beschichtete Fe₃ O₄ NPs wurden in Cyclohexan dispergiert und dann tropfenweise zu einer wässrigen Lösung mit SDBS gegeben. Die Komplexlösung wurde mit Ultraschall behandelt, um eine stabile Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden. Nach dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels in der Emulsion wird Fe₃ O₄ NPs wurden durch hydrophobe Wechselwirkung selbstorganisiert, um kugelförmige Nanocluster zu bilden. Als nächstes wird das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden über eine LBL-Methode durch elektrostatisch anziehende Wechselwirkungen hergestellt, die in Abb. 1 schematisch dargestellt ist.

Schematische Darstellung der Synthese von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen als theranostische Wirkstoffe für MRT und Wirkstoffabgabe

Die Morphologien und Größen des Fe₃ O₄ NCs und das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen wurden mit TEM bzw. DLS untersucht. Wie in Abb. 2a und b gezeigt, ist das Fe₃ O₄ NCs demonstrieren die quasi-sphärischen Cluster. Die mit DLS gemessene durchschnittliche Partikelgröße beträgt etwa 57 nm (Abb. 2e). In früheren Berichten wird PAH mit positiver Ladung oder PSS mit negativer Ladung aufgrund ihrer hervorragenden elektrostatischen Eigenschaften abwechselnd auf der Templatoberfläche abgeschieden [48,49,50,51]. Um die Bildung jeder auf dem Fe₃ . abgeschiedenen Polyelektrolytschicht zu untersuchen O₄ NCs wurden die Zeta-Potential-Experimente durchgeführt. Der Verlauf des Zetapotentials mit der Polyelektrolytschicht für PSS/PAH- und DOX-Beschichtungen ist in Zusatzdatei 1:Abbildung S2 dargestellt. Das unberührte Fe₃ O₄ NCs haben aufgrund der Existenz von SDBS ein negatives Zeta-Potential von − 19,7 mV. Die Absorption einer positiv geladenen PAH-Einzelschicht auf Fe₃ O₄ NCs kehrt das Oberflächenpotential von − 19,7 auf + 32 mV um. Anschließend bewirkt die Abscheidung der negativ geladenen PSS-Schicht eine weitere Oberflächenpotentialumkehr von + 32 auf – 34 mV. Dies deutet auf ein schrittweises Schichtwachstum während der Herstellung der magnetischen NC-Hybrid-Nanostrukturen hin. Diese Ergebnisse zeigen, dass die PAH- und PSS-Schichten erfolgreich auf das Fe₃ . aufgetragen wurden O₄ NCs. Schließlich wurde DOX erfolgreich an der Oberfläche des Fe₃ . adsorbiert O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen, was durch das positive Zetapotential (+ 1.91 mV) bestätigt wurde (Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Die TEM-Bilder mit einer anderen Vergrößerung des Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen sind in Abb. 2c und d gezeigt. Nach Polyelektrolytbeschichtungen wird kein signifikanter Struktur- und Morphologieunterschied beobachtet. Im Vergleich zu Abb. 2a und b ist der helle Kontrast zu erkennen und die Größe des Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen wird durch die Beschichtung von PAH- und PSS-Schichten leicht erhöht. Die synthetisierten magnetischen Hybrid-Nanostrukturen zeigen nach den Ergebnissen der DLS-Messung eine nahezu monodisperse quasi-sphärische Form mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 84 nm (Abb. 2f).

TEM-Bilder von Fe₃ O₄ NCs (a , b ) und Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS (c , d ) bei niedrigerer bzw. höherer Vergrößerung. Größenverteilung von Fe₃ O₄ NCs (e ) und Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen (f )

Um die potenzielle Anwendung von Fe₃ . zu bewerten O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen in der MRT, die transversalen Relaxationsraten von Protonen (1/T ₂ ) als Funktion der Fe-Ionenkonzentration wurden mit dem Bruker AVANCE 500WB Spektrometer bei 11,7 T bestimmt.Eine lineare Beziehung zwischen Relaxationsraten und Fe-Ionenkonzentration wurde beobachtet, wie in Abb. 3b gezeigt. Darüber hinaus sind die transversalen Relaxationsraten (1/T ₂ ) erhöht mit steigender Konzentration von Fe₃ O₄ NCs aufgrund des hohen Aggregationsgrads des Fe₃ O₄ magnetischer NPs-Kern, was zeigt, dass die magnetischen Hybrid-Nanostrukturen ein effektives T . sein könnten ₂ -gewichtetes MRT-Kontrastmittel (Abb. 3a). Basierend auf der Steigung des Diagramms in Abb. 3b ist der transversale Relaxivitätswert (r ₂ ) wurde mit 651,38 mM ⁻¹ . bestimmt S ⁻¹ , die höher ist als die der berichteten Arbeit [22]. Im Vergleich zu kommerziellen T ₂ Kontrastmittel können die Nanocluster die Kontrastfähigkeit von Fe nach der Selbstorganisation der magnetischen NPs auf der Grundlage des kollektiven Effekts signifikant verbessern, wodurch der angiographische Effekt stark verbessert wird. In der vorherigen Arbeit zeigten die zusammengesetzten Magnetit-Nanokristalle aufgrund der kollektiven Wirkung magnetischer Nanokristalle eine höhere Sättigungsmagnetisierung als einzelne Nanokristalle [43, 52].

a T ₂ -gewichtete MRT-Bilder des Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen in verschiedenen Konzentrationen in Wasser. b Diagramm der Relaxationsrate r ₂ gegen Fe-Konzentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen. Der Relaxivitätswert r ₂ wurde aus der Steigung der linearen Anpassung der experimentellen Daten erhalten

Um die Wirkstoffbeladungskapazität von Fe₃ . zu bewerten O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen als Drug-Delivery-Träger, ein wasserlösliches Anti-Krebs-Medikament (DOX) wurde als Modellarzneimittel ausgewählt. Die Einlagerung von DOX in den hybriden Nanostrukturen mit hoher Effizienz zeigte sich zunächst durch den Farbumschlag der Lösung. Die Farbe der Lösung von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS und die reine DOX-Lösung waren gelblich bzw. rot (Abb. 4a und b). Nach der Bildung des Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen, die Farbe der Lösung wurde orange (Abb. 4c). Aufgrund des Vorhandenseins von Fe₃ O₄ NPs, die DOX-beladenen Nanostrukturen in der Suspension konnten durch einen externen Magneten getrennt werden, was auf das große Potenzial der erhaltenen hybriden Nanostrukturen für den magnetisch gezielten Wirkstofftransport hindeutet (Abb. 4d). Zur Bestimmung der effektiven DOX-Speicherkapazität wurde UV-Vis-Absorptionsspektroskopie verwendet. Abbildung 4e zeigt die UV-Vis-Absorptionsspektren der wässrigen DOX-Lösung vor und nach der Wechselwirkung mit Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen. Im Vergleich zu freiem DOX wurden ähnliche Absorptionspeakcharakteristika bei Fe₃ . beobachtet O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen, das ist der Rekombinations-Absorptionspeak von Fe₃ O₄ NCs und DOX. Die Probe ohne DOX zeigt nur den Absorptionspeak von Fe₃ O₄ NCs. Diese Daten weisen darauf hin, dass DOX als Wirkstoff erfolgreich auf der Oberfläche der hybriden Nanostrukturen absorbiert werden kann. Es wurde auch festgestellt, dass es eine obere Grenze der Adsorptionskonzentration von DOX, das auf die Oberfläche der Hybridnanostrukturen geladen ist, gibt. Abbildung 4f zeigt das PL-Spektrum von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen nach Zentrifugation, wenn verschiedene Konzentrationen von DOX in das Fe₃ . gegeben wurden O₄ NC/PAH/PSS-Lösung. Die Lumineszenzintensität von DOX steigt mit zunehmender DOX-Zugabe bis zum Erreichen einer Obergrenze (8 mg/mL) bei der Konzentration von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS (1,30 × 10 ⁻² mg/ml) unverändert. Danach nimmt die Einschlussmenge aufgrund des überschüssigen DOX ab, das nicht an der Oberfläche von Fe₃ . adsorbiert werden kann O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen. Die stärkste Fluoreszenzintensität von DOX entspricht der Konzentration bei 8 mg/ml, und die entsprechende Probe würde für weitere Untersuchungen verwendet, um biomedizinische Experimente durchzuführen. Die gesicherte Wirkstoffbeladungseffizienz der hybriden Nanostrukturen ist entscheidend für die klinische Anwendung. Die Beladungseffizienz wurde durch das Flächenintegral der DOX-Fluoreszenzintensität unter Verwendung der Standardkurvenmethode von DOX berechnet [53, 54]. Die Beladungseffizienz wurde für das Fe₃ . auf 24,39 % berechnet O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen. Daher wurde eine theranostische Plattform basierend auf dem Fe₃ . aufgebaut O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen aufgrund der effektiven Absorption des Antitumorwirkstoffs DOX.

Fotos (a –d ) der verschiedenen absorbierten Stufen von DOX auf dem Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturen. Die UV-Vis-Absorptionsspektren (e ) von DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS und Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen. Die Lumineszenzspektren (f ) von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen, wenn die unterschiedliche Konzentration von DOX in das Fe₃ . gegeben wurde O₄ NC/PAH/PSS-Hybrid-Nanostrukturlösung

Die In-vitro-Wirkstofffreisetzungsprofile von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen unter verschiedenen Umgebungs-pH-Werten sind in Abb. 5 gezeigt. Die Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden durch eine Dialysemembran in Phosphatpuffern bei 37 °C dialysiert. Das freigesetzte DOX aus den Hybrid-Nanostrukturen wurde gesammelt und dann wurde die freigesetzte DOX-Menge anhand der Fluoreszenzintensität des Überstands berechnet. Bei physiologischem pH 7,4 ist die beobachtete Wirkstofffreisetzung ein langsamer Freisetzungsprozess. Ungefähr 20 Gew.-% DOX wurden bei den anfänglichen 5 Stunden freigesetzt und traten dann in das stabile Stadium der langsamen Freisetzung ein. Bei pH 5,0 wurden ungefähr 80 Gew.-% DOX aus den Hybrid-Nanostrukturen in den anfänglichen 15 Stunden freigesetzt, bevor ein Freisetzungsplateau erreicht wurde. Die Plateau-Prozentsätze der DOX-Freisetzung, die über einen Zeitraum von 30 h beobachtet wurden, betrugen 80 ± 3 Gew.-% bzw. 20 ± 3 Gew.-% bei pH 5,0 bzw. 7,4. Es ist zu erkennen, dass das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen haben ein Profil mit anhaltender Freisetzung und eine höhere DOX-Freisetzungsrate bei pH 5,0 als bei pH   7,4 gezeigt. Der niedrige pH-Wert der Umgebung beschleunigt die DOX-Freisetzung aus dem Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen. Das liegt an der Protonierung des –NH₂ Gruppe von DOX unter sauren Bedingungen, die die elektrostatische Wechselwirkung zwischen DOX- und PSS-Polymeren bei niedrigen pH-Werten verringert [55]. Die Studien zur Wirkstofffreisetzung zeigen die gute Stabilität elektrostatisch gebundener Wirkstoffmoleküle bei physiologischem pH und die ausgelöste Freisetzung bei sauren Bedingungen, ähnlich den berichteten Arbeiten [56,57,58]. Daher ist das erhaltene Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen sind die pH-responsiven Systeme für die DOX-Wirkstoffabgabe und eignen sich für die spezifische Behandlung von soliden Tumoren [59].

Darstellung der Freisetzung von DOX aus dem Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen in PBS-Puffer bei pH 7.4 bzw. 5.0

Die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität sind Schlüsselfaktoren, um das Potenzial eines neuen Wirkstoffabgabesystems zu bewerten. Die zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen auf A549-Zelllinien wurden untersucht. Die interzelluläre Aufnahme von Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen wurden mit optischer und Fluoreszenzmikroskopie untersucht, die hauptsächlich durch die Überwachung der Fluoreszenz von DOX realisiert wurde. Das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen haben sich als wirksam bei der Abgabe von DOX an Krebszellen erwiesen. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurde in Krebszellen nach 24 h Inkubation eine starke rote Fluoreszenz von DOX beobachtet. Die Hybridnanostrukturen wurden hauptsächlich durch Endozytose internalisiert [60]. Nach der Zellaufnahme setzten die hybriden Nanostrukturen DOX in der sauren Umgebung um das Endosom/Lysosomen frei, in der ein ausreichend niedriger pH (4.3) eine effektive DOX-Freisetzung (pH   5.0, Abb. 5) auslösen könnte. Das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen zeigten eine zeitabhängige Aufnahme in A549-Krebszellen, wie in 6 gezeigt. 0,5 h nach der Inkubation war um die Zellen rote Fluoreszenz sichtbar. Die Ergebnisse zeigen, dass die DOX-haltigen Hybrid-Nanostrukturen hauptsächlich um die A549-Zellen herum verblieben. Wenn die Inkubationszeit jedoch auf 24 h verlängert wurde, nahm das interzelluläre Fluoreszenzsignal von den A549-Zellen zu. Offensichtlich können viele hybride Nanostrukturen im Laufe der Zeit in die Krebszellen eindringen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX-Hybrid-Nanostrukturen können DOX effizient in A549-Zellen übertragen. DOX, das von den hybriden Nanostrukturen im Zytoplasma freigesetzt wird, passiert die Kernmembran und reichert sich schließlich im Zellkern an, wodurch Zellen durch Veränderungen der DNA-Konformation abgetötet werden [61].

Konfokale fluoreszenzmikroskopische Bilder von A549-Zellen, die mit dem Fe₃ . inkubiert wurden O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at 37 °C for a 0.5 h and b 24 h. Scale bar, 20 μm

In order to evaluate the pharmacological activity of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cytotoxicity to A549 cells in vitro was determined by MTT method. Figure 7 shows the cell activity of free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ O₄ concentrations. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ O₄ concentration in Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

T ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively

Conclusion

The multifunctional Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe₃ O₄ NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe₃ O₄ NPs. The Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. The Fe₃ O₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.

Availability of Data and Materials

Data sharing is not applicable to this article as no datasets were generated or analyzed during the current study. Please contact the author for data requests.

Abkürzungen

1/T ₂ :

The proton transverse relaxation rates

A549:

Human lung cancer

DLS:

Dynamic light scattering

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

FBS:

Fetal bovine serum

Fe₃ O₄ :

Iron oxide

FOV:

Field of view

LBL:

Layer-by-layer

MRI:

Magnetic resonance imaging

MTT:

Methyl thiazolyltetrazolium

NA:

Number of averages

NaOA:

Sodium oleate

NaOH:

Sodium hydroxide

NC:

Nanocluster

NCs:

Nanoclusters

NH₄ F:

Ammonium fluoride

NPs:

Nanoparticles

OA:

Oleic acid

OD:

Optical density

ODE:

1-Octadecene

PAH:

Poly(allylamine hydrochloride)

PSS:

Poly(sodium 4-styrenesulfonate)

S/O/W:

Solid-in-oil-in-water

SDBS:

Sodium dodecyl benzene sulfonate

TE:

Echo time

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

TR:

Repetition time