Magnetit-Nanocluster-basierte theranostische Agenten für T2-gewichtete MRI und pH-responsive Doxorubicin-Abgabe

Zusammenfassung

Multifunktionale Nanostrukturen, die Antikrebsmedikamente mit anorganischen Nanokristallen verbinden, entwickeln sich zu leistungsstarken Plattformen für Tumordiagnose und -therapie. In dieser Studie fertigten wir Magnetit (Fe₃O₄) Nanocluster (NCs) durch Kombination einer Öl-in-Wasser-Mikroemulsion und einer Schicht-für-Schicht (LBL) Assembly an. Die Fe₃O₄ NCs wurden zunächst aus Oleinsäure-kappierten Fe₃O₄ Nanopartikeln (NPs) assembliert. Sequenzielle Adsorption von Poly(allylamin hydrochlorid) (PAH), Poly(natrium 4-styrolsulfonat) (PSS) und Doxorubicin hydrochlorid (DOX) ergab Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen. Diese Träger zeigen pH-responsive DOX-Freisetzung, verstärkte Zytotoxizität gegen A549 Lungenkarzinomzellen und überlegene T₂-gewichtete MRI-Kontrast (r₂ = 651 mM⁻¹ s⁻¹). Fluoreszente DOX-Emission (λ_ex = 490 nm) ermöglicht zelluläre Bildgebung. Unsere Arbeit etabliert eine robuste Fe₃O₄-basierte theranostische Plattform, die MRI, Fluoreszenzbildgebung und kontrollierte Medikamentenabgabe integriert.

Einleitung

Jüngste Fortschritte in multifunktionalen Medikamentenabgabesystemen haben gleichzeitige Bildgebung und Therapie ermöglicht, insbesondere durch stimuliresponsive Designs, die Tumormikroumgebungsreize wie Säure (pH ≈ 6,5–6,8) ausnutzen. Magnetit-Nanopartikel (Fe₃O₄) sind für biomedizinische Anwendungen besonders attraktiv aufgrund ihrer Superparamagnetismus, Biokompatibilität und niedrigen Zytotoxizität. Einzelne Fe₃O₄ NPs leiden jedoch oft unter geringer magnetischer Responsivität und begrenzter Medikamentenbeladung. Die Assemblierung von Fe₃O₄ NPs zu Nanoclustern (NCs) verstärkt kollektive magnetische Effekte, erhöht die T₂ Relaxivität und ermöglicht höhere Medikamentennutzlasten in Kombination mit Polyelektrolyt-Multilagen. Trotz dieser Vorteile haben wenige Studien Fe₃O₄ NCs berichtet, die mit PAH/PSS für pH-getriggerte Medikamentenfreisetzung funktionalisiert sind.

Hier berichten wir über eine skalierbare Fertigungsroute für Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen, die eine Mikroemulsions-Selbstassemblierung und LBL elektrostatische Adsorption kombiniert. Die resultierenden Träger liefern DOX mit kontrollierter, pH-abhängiger Freisetzung, demonstrieren starken T₂ MRI-Kontrast und töten A549-Zellen in vitro effizient ab.

Materialien und Methoden

Materialien

FeCl₃·6H₂O (99,99 %), FeCl₂·4H₂O (99,99 %), Oleinsäure (OA, 90 %), 1-Octadecen (ODE, 90 %), Natriumoleat (NaOA), Ethanol, Hexan, Cyclohexan, Isopropanol, Natriumdodecylbenzolsulfonat (SDBS), Ammoniumfluorid (NH₄F), NaOH, DMSO und Ammoniak wurden von Alfa Aesar und Sinopharm bezogen. PAH (MW 15 kDa), PSS (MW 70 kDa) und Doxorubicin hydrochlorid (DOX, > 98 %) stammten von Sigma-Aldrich und Shanghai Sangon Biotech. APMI 1640 Medium und fötales Kälberserum (FBS) kamen von Hyclone. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Präparation von Ferric-Oleat

FeCl₃·6H₂O (2,59 g), NaOA (14,6 g), Ethanol (32 mL), H₂O (24 mL) und Hexan (56 mL) wurden in einem 150 mL Kolben gemischt und 4 h bei 70 °C unter Rückfluss erhitzt, um eine transparente Ferric-Oleat-Lösung zu bilden. Die Ölphase wurde abgetrennt, Hexan durch Rotationsverdampfung bei 70 °C entfernt und der Rückstand unter Vakuum gelagert.

Synthese von Fe₃O₄ NPs

Ferric-Oleat (7,2 g), OA (1,28 mL) und ODE (50 mL) wurden auf 300 °C für 40 min unter Ar erhitzt; das Gemisch wurde dann abgekühlt und >12 h an Luft oxidiert. Nanokristalle wurden mit Isopropanol gefällt, zweimal mit Ethanol-Wasser (1:1 v/v) gewaschen und in 200 mL Cyclohexan dispergiert.

Präparation von Fe₃O₄ NCs

200 µL Fe₃O₄ NPs in Cyclohexan wurden zu 4 mL wässriger SDBS (14 mg) gegeben. Ultraschallbehandlung (5 min × 4) bildete eine Fest-in-Öl-in-Wasser-Emulsion. Rühren bei Raumtemperatur für 6 h verdampfte Cyclohexan, was Selbstassemblierung in quasi-sphärische NCs ermöglichte. Das Produkt wurde dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen.

Präparation von Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen

Fe₃O₄ NCs (3 mL) wurden zunächst mit PAH (10 g/L, 4 mM NaCl) durch tropfenweises Zugabe und 24 h Rühren beschichtet; überschüssiges PAH wurde durch Zentrifugation entfernt. Die PAH-beschichteten NCs wurden dann mit PSS (10 g/L, 4 mM NaCl) unter identischen Bedingungen beschichtet, gefolgt von Zentrifugation. DOX (5 mg/mL) wurde hinzugefügt (60 µL) zur Fe₃O₄ NC/PAH/PSS Lösung (3 mL) und 24 h im Dunkeln gerührt. Die finalen Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen wurden durch Zentrifugation isoliert.

MRI-Messungen

Hybrid-Nanostrukturen wurden in 1,2 mL Agarose (1 % Gew./Vol.) bei Fe-Konzentrationen von 0 bis 0,065 mM dispergiert. Bildgebung erfolgte an einem 11,7 T Bruker Mikro-MRI-System (TR = 300 ms, TE = 4,5 ms, 128 × 128 Matrix, 1,2 mm Schicht, 2,0 × 2,0 cm FOV, 2 Durchläufe).

Zelluläre Aufnahme und MR-Bildgebung

A549-Zellen wurden mit Hybrid-Nanostrukturen (Fe = 0–13,5 µM) für 2 h inkubiert, gewaschen und durch T₂-gewichtete MRI abgebildet.

Standardkurve von DOX

DOX-Fluoreszenz (λ_ex = 490 nm) wurde für Konzentrationen 0–0,03 mg/mL gemessen. Die lineare Regression ergab Y = 447,44 + 69.745 X (R² = 0,9992).

DOX-Beladung und -Freisetzung

Beladungseffizienz wurde aus dem Unterschied zwischen initialer DOX-Masse (W₀) und der Masse im Überstand (W_s) nach Zentrifugation berechnet. Kumulative Freisetzung wurde in PBS (pH 5,0 oder 7,4) bei 37 °C mittels Dialysebeutel überwacht, Probenahme 100 µL alle 1–3 h.

In-vitro-Zytotoxizität

A549-Zellen wurden in 96-Well-Platten (8 × 10³ Zellen/Well) ausgesät und mit freiem DOX, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS oder Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0,1–2,0 µM DOX-Äquivalent) behandelt. Nach 24 h wurde MTT (5 mg/mL) hinzugefügt, 4 h inkubiert und Absorption bei 490 nm gemessen.

Charakterisierung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, 200 kV) beurteilte Morphologie; Dynamische Lichtstreuung (DLS) maß hydrodynamische Größe und ζ-Potenzial; UV-Vis-Spektroskopie bestimmte DOX-Beladung; Fluoreszenzspektroskopie überwachte DOX-Freisetzung; ICP-AES quantifizierte Fe-Gehalt.

Ergebnisse und Diskussion

Nanostruktur-Morphologie und -Größe

TEM-Bilder zeigten, dass Fe₃O₄ NCs quasi-sphärische Aggregate (~57 nm, DLS) sind, gebildet durch Selbstassemblierung von 15-nm primären Fe₃O₄ NPs. Schichtabscheidung (PAH, PSS, DOX) wurde durch ζ-Potenzial-Verschiebungen bestätigt: −19,7 mV (NC), +32 mV (NC/PAH), −34 mV (NC/PAH/PSS), +1,9 mV (NC/PAH/PSS/DOX). Die finalen Hybrid-Nanostrukturen wiesen eine monodisperse Größe von ~84 nm (DLS) auf.

Verbesserter T₂ MRI-Kontrast

Transversale Relaxivität (r₂) betrug 651,38 mM⁻¹s⁻¹, was viele kommerzielle Agenten übertrifft. Lineares 1/T₂ versus Fe-Konzentration bestätigte effizienten T₂ Kontrast.

DOX-Beladung und pH-responsive Freisetzung

UV-Vis- und Fluoreszenzspektren bestätigten DOX-Adsorption. Die Beladungseffizienz erreichte 24,4 %. In PBS (pH 7,4) wurden nur ~20 Gew.% DOX über 30 h freigesetzt, wohingegen bei pH 5,0 ~80 Gew.% innerhalb von 15 h freigesetzt wurden, was starke pH-Responsivität durch Protonierung von DOX und verringerte elektrostatische Bindung demonstriert.

Zelluläre Aufnahme und Zytotoxizität

Konfokalmikroskopie zeigte zeitabhängige Internalisierung von DOX-beladenen Hybriden, mit starker roter Fluoreszenz nach 24 h. MTT-Assays ergaben vernachlässigbare Zytotoxizität von Fe₃O₄ NC/PAH/PSS allein (Zellviabilität > 85 % bei 2 µM). Freies DOX und DOX-beladene Hybride zeigten dosisabhängige Abtötung von A549-Zellen (IC₅₀ ≈ 1–2 µM). Die verstärkte Zytotoxizität der Hybride wird auf nachhaltige, endosomale pH-getriggerte DOX-Freisetzung zurückgeführt.

Zelluläre MRI

Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybride wurden in A549-Zellen internalisiert und erzeugten signifikante T₂ Signalreduktion, was ihre Nützlichkeit als zelluläre MRI-Kontrastmittel bestätigt.

Schlussfolgerung

Wir haben Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX Hybrid-Nanostrukturen entwickelt, die hohen T₂ MRI-Kontrast, pH-getriggerte DOX-Freisetzung und potente antitumorale Aktivität in vitro kombinieren. Ihr modulares Design ermöglicht weitere Funktionalisierung (z. B. Targeting-Liganden) für In-vivo-Anwendungen und positioniert sie als vielseitige theranostische Plattformen für Krebsbildgebung und -therapie.