Ein magnetischer Nanopartikel mit dualer Ausrichtung zur Erkennung von Humankrebs

Einführung

Bösartige Tumoren stellen eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar [1]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Tumormikroumgebung die biologischen Eigenschaften von Tumoren, wie beispielsweise tumorbedingte Metastasen, beeinflusst [2, 3]. Die möglichen Mechanismen, insbesondere der Prozess, durch den lymphatische Endothelzellen (LECs) Tumormetastasen fördern, sind jedoch noch nicht klar [4]. Daher ist es notwendig, diagnostische Strategien für Tumore zu entwickeln, die auf die Lymphgefäße abzielen. Das Fehlen lymphatischer spezifischer Marker, insbesondere solcher, die LECs von vaskulärem Endothel unterscheiden, schränkt die Erforschung der Funktionen von LECs ein. In den letzten Jahren wurden LECs-spezifische Marker, wie der endotheliale Hyaluronanrezeptor 1 der Lymphgefäße (LYVE-1) [5, 6], Podoplanin [7], vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor 3 (VEGFR-3) [8] und Prox -1 wurden identifiziert [9]. Dies hat die Erforschung von Tumorlymphgefäßen beschleunigt, insbesondere durch gezielte Ausrichtung auf endolymphatische Tumorgefäße, um Tumore zu diagnostizieren. Es hat auch Studien zum Mechanismus der Tumormetastasierung durch Sortieren von endolymphatischen Endothelzellen von Tumoren mit immunomagnetischen Beads ermöglicht [10]. Wie viele andere Marker, die in der Molekularpathologie verwendet werden, ist jedoch keiner der LECs-assoziierten molekularen Marker vollständig spezifisch für LECs. Aufgrund der vorübergehenden Expression von Prox-1 im Zellkern [11] ist es für klinische Anwendungen nicht geeignet. Obwohl VEGFR-3 in LECs exprimiert wird, fehlt ihm die lymphatische Spezifität bei Krebs, da es auch im Gefäßepithel exprimiert wird [8]. LYVE-1 wird spezifisch in LECs sowie in normalen hepatischen Sinusoiden, Milz-Endothel, hochendothelialen Venolen sowie aktivierten Gewebemakrophagen exprimiert, aber es wird nicht in vaskulärem Epithel exprimiert [7]. Podoplanin wird nicht in vaskulären Epithelzellen exprimiert, ist jedoch ein spezifischer Marker für LECs [7, 12].

Magnetisches Ferroeisenoxid, Nanogold, Quantenpunkte, Liposomen und Titanoxid werden aufgrund ihrer hohen Biokompatibilität, großen spezifischen Oberfläche und der einfachen Modifizierung mit anderen biologischen funktionellen Molekülen häufig in der Krebsdiagnose und -behandlung eingesetzt [13, 14]. Zusätzlich zu den oben genannten Eigenschaften kann magnetisches Ferroeisenoxid (Fe₃ O₄ ) hat eine enge Größenverteilung, gute Dispergierbarkeit, hohen Paramagnetismus und kontrollierbare Größe, wodurch es für die Magnetresonanztomographie geeignet ist [15]. Unter ihnen ist superparamagnetisches Eisenoxid, das mit Antikörpern beschichtet ist, weit verbreitet bei der Zelltrennung, Erkennung und Frühdiagnose von Tumoren [16, 17]. Als natürliche hochmolekulare Substanz ist die Chitosan-Oberfläche reich an Hydroxyl- und Aminogruppen und wird aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften wie Biokompatibilität, Blutkompatibilität, Sicherheit und mikrobielle Abbaubarkeit weit verbreitet verwendet [18]. Daher ist die Kombination von Chitosan oder Chitosan-Derivat und magnetischem Fe₃ O₄ ist für biologische Anwendungen förderlicher, da es verhindern kann, dass magnetische Kügelchen miteinander agglomerieren, um magnetische Flüssigkeiten zu bilden. Aus diesem Grund erzeugt es eine bessere Dispersionsleistung.

In der Tumorforschung basiert der Nachweis von Lymphgefäßen in Tumoren auf der direkten Markierung mit Antikörpern oder durch einen Antikörper in Kombination mit magnetischen Beads zur Sortierung von lymphatischen Endothelzellen. Um hier genauer auf intratumorale Lymphgefäße zu zielen, haben wir eine Multi-Target-Nanosonde entwickelt, d. h. zwei hochspezifische Antikörper gegen lymphatische Endothelzellen, Anti-Lyve-1-Antikörper und Anti-Podplanin-Antikörper. Diese Antikörper wurden an mit Chitosan beschichtete Eisentetroxid-Nanopartikel gebunden. Im Vergleich zu anderen Nanosonden sind die in dieser Studie entwickelten Nanosonden mit zwei Antikörpern genauer für den Nachweis von Lymphgefäßen und die isolierten lymphatischen Endothelzellen sind daher reiner.

In dieser Studie wurde zur schnellen Anreicherung und Isolierung von LECs aus menschlichen Krebszellen ein Ligand mit einer relativ hohen Spezifität für Anti-LYVE-1-Antikörper und Anti-Podplanin-Antikörper verwendet, um die Bindung an die chitosanbeschichteten superparamagnetischen Nanopartikel zu erleichtern, um magnetische Perlen für die Auswahl von LECs. Es wurde auch bestätigt, dass die Sonde in der Lage ist, solide Tumoren bimodal zu diagnostizieren.

Materialien und Methode

Zelllinien- und Zellkulturbedingungen

Die Kolonkrebszelllinie (HT29), die von der ATCC-Zellbank bezogen wurde, wurde bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum enthält ( Gibco, Grand Island, NY, USA), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, unter 5 % CO₂ .

Versuchstiermodell

Vierzig weibliche NOD/SCID-Mäuse (4–6 Wochen alt) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, China) gekauft. In log-Phase gewachsene HT29-Zellen wurden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Nach dem Verdauen mit Trypsin wurden die Zellen 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in PBS resuspendiert und die Zellkonzentration wurde auf 2 × 10 ⁷ . eingestellt /ml. Jeder Maus wurden 200 μl der Zellsuspension injiziert. Alle Versuchsprotokolle wurden vom Animal Ethics Committee der Guangxi Medical University (Guangxi, China) genehmigt.

Herstellung und Charakterisierung von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelte Antikörper-Magnet-Nanosonden

Chitosan (Xi’an Ruixi Biotechnology) wurde mit α-Ketoglutarsäure carboxyliert, um auf seiner Oberfläche CO-reiches α-Ketoglutarat-Carboxymethyl-Chitosan (KCTS) zu erhalten [19]. Fe₃ O₄ (Xi’an Ruixi Biotechnology) wurde als Kern verwendet und KCTS wurde als Grundgerüst verwendet. Nach der Aktivierung von Fe₃ O₄ Nanopartikel mit Carbodiimid, Fe₃ O₄ @KCTS wurde durch Kombinieren der kovalenten Bindung von KCTS-COOH und Oberflächen-OH gebildet. Die ausgewählten LECs-Antikörper waren spezifisch gegen humanen LYVE-1 APC-konjugierten Antikörper (R&D Systems®, Kat.-Nr. FAB20892A) und Anti-Podoplanin-Antikörper (FITC) (Abcam, Kat.-Nr. ab205333). Diese Antikörper wurden kovalent mit carboxyliertem Fe₃ . vernetzt O₄ @KCTS mit aktiviertem EDC/NHS. Folglich sind magnetische Nanosonden, die mit LECs modifiziert sind, doppelte Antikörper, die als Fe₃ . bezeichnet werden O₄ @KCTS-LECs-Magnetische Nanosonde mit doppeltem Antikörper (0,1 mg/ml) wurde erhalten. Die doppelten Antikörper-konjugierten Nanopartikel wurden im Dunkeln bei 4 °C aufbewahrt.

Morphologie und Größenverteilung von präpariertem Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Magnetische Nanopartikel mit doppeltem Antikörper wurden unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM; H-7650, Japan) bewertet. Die Partikelgröße (Größe), das Zeta-Potential und der Partikeldispersionsindex (PDI) des Fe₃ O₄ @KCTS-Double-Antikörper wurden mit dynamischer Lichtstreuung (DLS; PRO3000, Japan) gemessen und ihre Photolumineszenz wurde mit einem Fluoreszenzspektrophotometer (FL-7000, Perkin Elmer, USA) gemessen.

Immunhistochemie und Immunfluoreszenz

Gefrorene Gewebeschnitte wurden hergestellt und für 10 Minuten in Eisaceton gelegt und dann für 10 Minuten in PBS-Lösung eingetaucht. Nach dem Blockieren in 1 % BSA und dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit humanem LYVE-1-APC-konjugiertem Antikörper und Anti-Podoplanin-Antikörper (FITC) bei 4 °C für 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Schnitte dreimal in PBS-Lösung eingetaucht, wonach eine 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbelösung zum Tumorgewebe zugegeben wurde, um die Gewebe vollständig zu bedecken. Die Schnitte wurden erneut 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden sie dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe eines Anti-Fluoreszenz-Quenchmittels, wenn die Schnitte vollständig trocken waren. Schließlich wurden die Schnitte auf einem Deckglas montiert und unter einem konfokalen Mikroskop (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokio, Japan) betrachtet.

In Formalin konservierte Dickdarmkrebsgewebe wurden für diese Studie in Paraffin eingebettet. Entwachste Schnitte von HT29-Krebs-Xenotransplantaten wurden mit 3% Wasserstoffperoxid blockiert, in 5% normalem Serum blockiert und mit Anti-LYVE-1-Antikörper (Abcam, ab10278, UK) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Als nächstes wurde der Biotin-markierte Sekundärantikörper Ziege-anti-Kaninchen-IgG H&L (HRP) (ab205718) im Markierungsreagenz von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Superstreptavidin für 30 Minuten inkubiert. Die Farbe wurde mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung gemessen.

Zellreinigung

Das durchschnittliche Volumen der Tumoren betrug etwa 1,5 × 1 × 1 cm ³ . . Vor der Entfernung der Tumore wurden die Mäuse desinfiziert, indem sie 3–5 Minuten lang in 75 % Ethanol eingetaucht wurden. Die desinfizierte Mäusehaut wurde mit einer sterilen Schere und einer sterilen Pinzette auf einer sauberen Bank geschnitten. Das Tumorgewebe wurde vorsichtig ausgeschnitten und in eine Petrischale mit PBS gegeben. Das getränkte Tumorgewebe wurde dann mit einer Augenschere geschnitten und in eine sterile Platte gelegt. Das geschredderte Gewebe wurde unter Verwendung eines pasteurisierten Röhrchens in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert. Das Dreifache des Volumens an Collagenase I wurde dann in das Röhrchen gegeben und 10 Minuten lang gevortext, um eine Collagenase-I-Tumorgewebe-Mischung zu erhalten. Die Mischung wurde dann für 20 min in ein 37 °C warmes Wasserbad gestellt und dies wurde fünfmal wiederholt. Am Ende der Verdauung wurde Collagenase I durch Zugabe eines vollständigen Mediums gestoppt und die Mischung 2 Minuten stehen gelassen. Nach Zentrifugation bei 300 g für 10 Minuten wurden die Tumore zweimal mit PBS gewaschen, dann in 10 ml PBS resuspendiert und langsam durch ein Sieb mit einer Porengröße von 75 μm (200 mesh) filtriert. Die gefilterten Zellen wurden gezählt, in zwei 15 ml-Zentrifugenröhrchen gemittelt, in PBS resuspendiert, dann 10 min bei 300 g zentrifugiert und dann dreimal gewaschen. (1) MACS-Magnetbead-Sortierverfahren:Die gewaschenen Zellen wurden in 100 μl Puffer resuspendiert. Eine Lösung, die PBS pH 7,2, 0,5% BSA und 2 mM EDTA enthielt, wurde durch Verdünnen der MACS BSA-Stammlösung (Kat.-Nr. 130-091-376) auf 1:20 mit auto MACS™ Spüllösung (Kat.-Nr. 130 .) hergestellt -091-222). Als nächstes wurden 10 μL menschlicher LYVE-1-APC-konjugierter Antikörper zugegeben und dann bei 4 °C für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Schließlich wurde es dreimal mit 2 ml Pufferlösung gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden 80 μl Pufferlösung hinzugefügt, um die Zellen zu resuspendieren, und 20 μl Anti-APC-Fluorescein-Magnetbeads-Lösung wurden hinzugefügt. Die Mischung wurde 15 min inkubiert, dreimal gewaschen, dann zentrifugiert und mit 300 μl Pufferlösung gut vermischt. Schließlich wurden die positiven Zellen in der Säule schnell mit 3 ml Pufferlösung niedergeschlagen. Die resultierenden Zellen wurden in einer Sechs-Well-Platte kultiviert. (2) Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper-Magnet-Nanopartikel-Sortierverfahren:Die gewaschenen Zellen wurden in 200 μL Puffer, gemischt mit Fe₃ ., resuspendiert O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanopartikel, inkubiert bei 4 °C für 20 Minuten im Dunkeln, dann dreimal mit 4 ml Puffer gewaschen, zentrifugiert und in 160 μl Puffer resuspendiert. Schließlich wurden die Zellen mit einem Magneten eluiert und in einer 6-Well-Platte kultiviert.

Immunfluoreszenz von Zellen nach verschiedenen Methoden sortiert

Die nach verschiedenen Sortierverfahren sortierten Zellen wurden auf eine Zellkonzentration von 5 × 10 ⁴ . eingestellt /mL mit PBS und gleichmäßig in einer 12-Well-Platte verteilt. Ein   Milliliter der Zellsuspension wurde in jede Vertiefung gegeben und dann bei 37 °C für 24 h in 5 % CO₂ . kultiviert Umgebung. Das alte Medium wurde dann verworfen und die Zellen wurden dreimal mit PBS-Lösung gewaschen. Dann wurden 200 μl 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS-Lösung gewaschen, menschlicher LYVE-1 APC-konjugierter Antikörper und Anti-Podoplanin-Antikörper (FITC) wurden zugegeben. Nach 2 h Inkubation im Dunkeln bei 4 °C wurden die Zellen dreimal gewaschen. Darüber hinaus wurden 50 μL DAPI in jede Vertiefung gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Kerne blau zu färben, gefolgt von dreimaligem Waschen mit PBS. Zuletzt wurde der Anti-Fluoreszenz-Quencher in die Mitte des Objektträgers getropft und die mit Zellen bedeckte Seite wurde auf einen Glasobjektträger gelegt und unter Verwendung eines konfokalen Laserscanning-Mikroskops beobachtet.

Durchflusszytometrie von Zellen, die nach verschiedenen Methoden sortiert sind

Die nach verschiedenen Methoden sortierten Zellen wurden mit humanem LYVE-1 APC-konjugiertem Antikörper und Anti-Podoplanin-Antikörper (FITC)-Antikörper in 200 μL Bindungspuffer (10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl) resuspendiert. , und bei 4 °C für 1 h im Dunkeln inkubiert, dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Durchflusszytometrie (BD Accury6; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) nachgewiesen und analysiert und dann mit der FlowJo-Software (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA) analysiert.

Erkennung von LECs-Aktivitäten

Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, die durch verschiedene Verfahren sortiert wurden, wurden gesammelt, verdaut und gezählt. Die Zellkonzentration wurde auf 2 × 10 ⁵ . eingestellt Zellen/ml und 50 μl dieser Zellen wurden in jede Vertiefung einer Matrigel-beschichteten μ-Objektträgerplatte gegeben und in 5 % CO₂ . inkubiert Inkubator bei 37 °C für 6 h. Das Medium wurde abgetrennt und mit einem pasteurisierten Tropfer verworfen, gefolgt von der Zugabe von PBS-Lösung, die 1 µg/ml Calcein AM (Invitrogen, Kat.-Nr. c3099) enthielt. Die Zellen wurden dann 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert, mit PBS gewaschen und unter einem Mikroskop (Nikon, Japan) fotografiert. Danach 1 × 10 ⁵ Zellen wurden mit 500 μl Komplettmedium mit 20 μg/ml DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen) gemischt und dann 4 h lang in eine 24-Well-Platte bei 37 °C geimpft. Die alte Kulturlösung wurde entfernt und die Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen. Dann wurden 50 μl DAPI-Lösung in jede Vertiefung gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Kerne blau zu färben. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden sie schließlich unter einem Mikroskop abgebildet.

MR- und Fluoreszenz-Bildgebung in vivo

Die folgenden Schritte wurden befolgt, um zu bestimmen, ob der Tumor von Fe₃ . angegriffen wurde O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper magnetische Nanopartikel bei Tieren. Das subkutane NOD/SCID-Maus-Xenotransplantat-Modell von Dickdarmkrebs wurde für Magnetresonanz- oder Fluoreszenz-Scans verwendet. Die T2-gewichtete Bildgebung wurde unter einer bestimmten Bedingung durchgeführt, die das Sichtfeld (80 × 80 mm), die Echozeit (69 ms) und die Schichtdicke (2,0 mm) mit einem 3.0T-MRT-Scanner (Discovery 750, gE, Deutschland) umfasste. , mit einer Mausvolumenspule mit einem Durchmesser von 40 mm. Die NOD/SCID-Mäuse wurden in zwei Gruppen (n = 3); die experimentelle Gruppe und die Rezeptorblockierungsgruppe. Allen Mäusen wurde Fe₃ . injiziert O₄ @KCTS-LECs-doppelter Antikörper (0,5 mmol/kg) magnetische Nanopartikel über die Schwanzvene. Jede Maus wurde zu vier bestimmten Zeitpunkten gescannt:vor der Injektion, 0,5  h, 12 h und 24 h nach der Injektion. In der Rezeptorblockergruppe wurde jeder Maus vor der Injektion von Fe₃ . Anti-LYVE-1-Antikörper (Abeam, ab10278, UK) und Anti-Podoplanin-Antikörper (Abcam, ab10288, UK) injiziert O₄ @KCTS-LECs-doppelter Antikörper. MRT-Scans wurden zu den gleichen vier Zeitpunkten durchgeführt. Fluoreszenzbilder wurden unter Verwendung des Kleintier-in-vivo-Bildgebungssystems (Bruker, USA) aufgenommen. Die Zeitpunkte für die Gruppierung, die Medikamenteninjektion und das Scannen waren wie oben erwähnt.

Toxizität von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelte Antikörper-Magnet-Nanoprobe

Toxizität von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanoprobe gegen LECs wurde mit dem CCK-8-Assay bewertet. Zellen (100 μl Medium, 2 × 10 ⁵ /ml) wurden über Nacht in 96-Well-Platten bei 37 °C in einer humanisierten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . kultiviert , dann mit Fe₃ . behandelt O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanoprobe (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg/ml) für 24 oder 48 h unter den gleichen Bedingungen. Nach der Inkubation wurden 10 μL CCK-8-Lösung in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer weiteren Inkubation für 2 Stunden. Die optische Dichte (OD) wurde bei 450 nm mit einem ELISA-Mikroplattenlesegerät (Thermo Scientific, USA) gemessen.

Zur Beurteilung der Toxizität von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper-Magnet-Nanoprobe In vivo erhielten weibliche NOD/SCID-Mäuse eine einzelne Schwanzvene-Injektion von 200 μl PBS (Kontrollgruppe) oder Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanoprobe (2 mg/ml) (n = 3 Tiere pro Gruppe). Nach 1 Woche wurden die Mäuse getötet, Schnitte der wichtigsten Gewebe (Herz, Lunge, Leber, Milz, Niere) wurden entnommen und in 10 % Formaldehydlösung eingetaucht, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Paraffinisierte Schnitte (4 μm dick) wurden geschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt.

Datumsanalyse

Zur Datenanalyse wurde die Statistiksoftware SPSS 16.0 verwendet. Die Messdaten wurden als x ± s ausgedrückt, der Vergleich zwischen den Gruppen erfolgte durch Varianzanalyse und der Vergleich der Zähldaten wurde durch einen Chi-Quadrat-Test durchgeführt. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnis

Prinzip eines Dual-Targeting-Magnet-Nanopartikels zum Nachweis von Krebs beim Menschen

In dieser Studie, wie in Schema 1 gezeigt, Fe₃ O₄ @KCTS, ein Kern-Schale-Typ magnetischer Nanopartikel, wurde durch Aktivierung von Fe₃ . hergestellt O₄ mit Carbodiimid und dessen Vernetzung mit α-Ketoglutarat-Chitosan (KCTS). Die LYVE-1- und Podoplanin-Antikörper wurden dann auf die Oberfläche dieser magnetischen Nanopartikel gegeben, wodurch magnetische Nanosonden mit dualem Targeting gebildet wurden. Diese Sonden wurden Mausmodellen durch die Schwanzvene injiziert, um den Tumor durch T2-gewichtete MR-Bildgebung und Fluoreszenz-Bildgebung zu diagnostizieren. Nach der Exzision wurde der Tumor in eine einzelne Zelle zerdrückt und dann mit der Sonde inkubiert, um die Lymphozyten-Endothelzellen mit höherer Reinheit durch einen Magneten zu identifizieren, um den Mechanismus der Tumormetastasierung zu erforschen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine magnetische Nanosonde mit Dual-Targeting erfolgreich entwickelt wurde, die hochreine LECs aus Tumorgewebe liefert und eine Grundlage für die klinische Anwendung von LECs bei Darmkrebs sowie in der frühen klinischen Diagnose durch Dual-Mode-Bildgebung von Darmkrebs bildet.

Schematische Darstellung von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper magnetische Nanopartikel

Charakterisierung von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelte Antikörper-Magnet-Nanopartikel

TEM-Bilder (Abb. 1a) zeigten, dass nacktes Fe₃ O₄ ist unregelmäßig bis kugelförmig und weist Agglomerate zwischen den Partikeln auf. Wenn Fe₃ O₄ wurde durch KCTS modifiziert (Abb. 1b), die Partikel waren regelmäßig kugelförmig oder oval und die Partikel waren gleichmäßig dispergiert. Wie in Abb. 1c gezeigt, ist Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper magnetische Nanopartikel wurden mit dem negativ geladenen Antikörper auf der Oberfläche von Fe₃ . modifiziert O₄ @KCTS, das negative Ladungen verlieh und so die elektrostatische Abstoßung zwischen Nanopartikeln erhöht. Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanopartikel waren kugelförmig, einheitlich, frei von Partikelaggregation und wurden nicht beschädigt. Der durchschnittliche Durchmesser betrug 91,28 ± 2,31 nm und der PDI 0,207 ± 0,015 (Abb. 1d). Die Abbildung zeigt, dass die Größenverteilung der Nanopartikel eng war und eine gute Dispersion in Wasser zeigte. Die negativ geladene Oberfläche hatte ein Zetapotential von − 32,8 ± 1,51 mV mit einem Absolutwert von über − 30, was auf eine gute Stabilität des Materials hinweist (Abb. 1e).

Charakterisierung der magnetischen Nanosonde. a Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Fe₃ O₄ Nanosonde (Maßstab, 100 nm). b Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Fe₃ O₄ @KCTS-Nanosonde (Maßstab, 100 nm). c Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanoprobe (Maßstab, 100 nm). d Die Teilchengröße wurde durch Größenanalyse bestimmt, und die durchschnittliche Größe der Sonde betrug 91,28 nm. e Das Zeta-Potenzial betrug etwa − 32,8 mv. f Das Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper-Nanoprobe hat Emissionspeaks unter Anregungslicht von 488 und 545

Die Ergebnisse des Fluoreszenzspektrometers sind in Abb. 1f dargestellt. Ein deutlicher Emissionspeak wurde beim Anti-Podoplanin-Antikörper (FITC) unter einem 488-Anregungslicht und beim Anti-LYVE-1-Antikörper (APC) unter einem 545-Anregungslicht beobachtet. Das Vorhandensein von Emissionspeaks im Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelter Antikörperkomplex unter 488- und 545-Anregung zeigt an, dass die Materialien erfolgreich gekoppelt wurden.

Immunhistochemie und Immunfluoreszenz

Wie in Abb. 2a, b gezeigt, wurde die Expression von LYVE-1 in Dickdarmkrebsgeweben und von LYVE-1 und Podoplanin-Antikörper in gefrorenem Tumorgewebe beobachtet. Dies zeigte, dass in Dickdarmkrebsgeweben eine kleine Menge lymphatischer Endothelzellen vorhanden war.

Expression von Lymphgefäßen in Darmkrebsgeweben. a Die erweiterten Gefäße in den Gewebeschnitten waren immunhistochemisch für LYVE-1 auf der Endothelzellmembran positiv (Maßstab, 100 μm). Rechts ist ein vergrößertes Bild. b Die erweiterten Gefäße in den Gewebeschnitten waren positiv für LYVE-1 und Podoplanin auf der Endothelzellmembran, wie durch Immunfluoreszenz (Maßstab, 50 μm) gezeigt wurde

Isolierung und Anreicherung von LECs

An den Zellen, die durch zwei verschiedene Sortierverfahren erhalten wurden, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass die mit LYVE-1 MicroBeads-Magnetbeads sortierten Zellen das Protein LYVE-1 exprimierten, jedoch kein Podoplanin, während Zellen, die durch Fe₃ . erhalten wurden, O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnetische Nanopartikel exprimierten das Protein LYVE-1 und das Protein Podoplanin (Abb. 3a). Darüber hinaus wurden die durchflusszytometrischen Ergebnisse der nach verschiedenen Methoden sortierten Zellen analysiert. Wie in Abb. 3b gezeigt, betrug die Co-Expressionsrate von Protein LYVE-1 und Protein Podoplanin durch LYVE-1 MicroBeads-Magnetbeads 71,2 %, während die Co-Expressionsrate der beiden Marker durch Sortieren mit Fe_{3 . erhalten wurde} O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper magnetische Nanopartikel betrug 88,9 %. Zwei unabhängige Stichproben t Tests zeigten, dass es statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Gruppen gab (P < 0,05) (Abb. 3c).

Analyse der Reinheit lymphatischer Endothelzellen. a Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen Zweifarben-Bildgebung von LYVE-1 (rot) und Podoplanin (grün)/Kernen [4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, blau) in den isolierten menschlichen Darmkrebs-LECs, sortiert mit LYVE-1-Mikrokügelchen und Fe ₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelter Antikörper (Skalenbalken, 100 μm). b Die Koexpression von LYVE-1 (APC) und Podoplanin (FITC) wurde durch durchflusszytometrischen Nachweis nachgewiesen. c Ergebnisse der Durchflusszytometrie, *P < 0.05

Vergleich der biologischen Funktionen von LECs, die durch die zwei verschiedenen Sortiermethoden erhalten wurden

Wir verglichen außerdem die biologischen Eigenschaften von lymphatischen Endothelzellen, die durch zwei verschiedene Sortierverfahren erhalten wurden. Die Testergebnisse für Matrigel-Leimröhrchen sind in Abb. 4a dargestellt. Die durch Sortierung mit Fe₃ . erhaltenen Zellen O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper magnetische Nanopartikel hatten eine stärkere Fähigkeit zur Röhrenbildung. Das in Abb. 4b gezeigte Ergebnis des Dil-ac-LDL-Endothelzell-Aufnahme-Assays zeigt, dass eine rote Fluoreszenz in Zellen beobachtet wurde, die mit LYVE-1 MicroBeads-Magnetbeads sortiert wurden, aber eine stärkere rote Fluoreszenz wurde in den nach Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper magnetische Nanopartikel. Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch das Fe₃ . erhaltenen Zellen O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanopartikel hatten eine höhere Reinheit, eine bessere Fähigkeit zur Bildung von Röhren und eine Phagozytose von Endothelzellen, was darauf hindeutet, dass sie für die Erforschung von lymphatischen Endothelzellen in Tumoren besser geeignet sind.

Vergleich der biologischen Funktionen von LECs. a Bestimmung der Fähigkeit zur Bildung von LECs in vitro durch Calcein AM (grün) in vitro (Maßstab, 50 μm). b Endothelzell-Phagozytose-Assay (DiI-markiert, rot; DAPI, blau) der Endothelzellfunktion mit isolierten LECs von LYVE-1 Microbeads und Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelter Antikörper (Maßstab, 100 μm)

Bimodale Bildgebungsanalyse in Vivo

Die Ergebnisse der In-vivo-Bildgebung sind in Abb. 5a dargestellt. Es wurde festgestellt, dass vor der Injektion von Fe₃ . keine Fluoreszenz des Tumors vorhanden war O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper magnetische Nanopartikel. Nach der Injektion nahm die Fluoreszenz des Tumors zu und erreichte den Höhepunkt nach 12 h. Danach nahm die Fluoreszenz mit der Zeit allmählich ab. In der geschlossenen Kontrollgruppe gab es während des gesamten Experiments fast keine Fluoreszenz des Tumors. Nach 24 h wurde beobachtet, dass das Material aus dem Mäusekörper beider Gruppen vollständig metabolisiert wurde. In ähnlicher Weise zeigte die in Abb. 5b gezeigte Magnetresonanztomographie, dass die Tumorbildgebung allmählich schwächer wurde und nach 12 h ihren schwächsten Wert erreichte, gefolgt von einer allmählichen Erholung mit der Zeit. Die Abbildungsleistung des Tumors in der geschlossenen Kontrollgruppe war jedoch nahezu unverändert. Daraus lässt sich schließen, dass das Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper-Magnet-Nanopartikel hatten in vivo hohe Tumor-Targeting-Eigenschaften.

Fluoreszenz-Bildgebung und MRT von subkutanen Xenotransplantat-Tumormodellen von NOD/SCID-Mäusen für kolorektales Karzinom. a NOD/SCID-Mäuse wurden anästhesiert und mit einem Fluoreszenz-Bildgebungssystem vor und nach der Injektion 0,5 h, 12 h und 24 h abgebildet. b NOD/SCID-Mäuse wurden anästhesiert und mit einem 3,0-T-MRT-Scanner vor und nach der Injektion 0,5 h, 12 h und 24 h abgebildet.

In-vitro- und in-vivo-Toxizität magnetischer Nanopartikel

Die In-vitro-Zytotoxizität der magnetischen Nanosonden wurde in den nach Fe₃ . sortierten LECs untersucht O₄ @KCTS-LECs-doppelte Antikörper magnetische Nanopartikel. Die Ergebnisse des CCK-8-Assays zeigten, dass die Lebensfähigkeit der Zelle nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der magnetischen Nanosonde hoch war (Abb. 6a). Dies deutet darauf hin, dass Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-Doppelantikörper magnetische Nanopartikel haben eine minimale Zytotoxizität. Wir haben außerdem die Toxizität der magnetischen Nanopartikel in vivo untersucht. Weibliche NOD/SCID-Mäuse wurden mit magnetischer Nanosonde behandelt und dann wurden Gewebeschnitte von Hauptorganen nach Färbung mit Hämatoxylin-Eosin untersucht. Wie in Abb. 6b gezeigt, wurden keine offensichtlichen Anzeichen von Nekrose oder Entzündung beobachtet. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die magnetische Nanosonde in vivo keine toxischen Wirkungen hervorruft. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die in dieser Studie entwickelte magnetische Nanosonde für den Einsatz als Nachweissonde in Tier- und Humanuntersuchungen geeignet ist.

Toxizität von Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-magnetische Nanosonde mit doppeltem Antikörper. a LECs wurden mit verschiedenen Konzentrationen magnetischer Nanosonden inkubiert und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 24 h und 48 h gemessen. b NOD/SCID-Mäuse wurden mit PBS oder magnetischer Nanosonde behandelt, und Schnitte von Hauptorganen wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt und lichtmikroskopisch untersucht (Maßstab, 100 μm)

Diskussion

Es ist seit langem bekannt, dass der Transport durch das Lymphsystem ein wichtiger Weg für die Vermehrung von Tumorzellen ist. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe₃ O₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe₃ O₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe₃ O₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

Abkürzungen

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindole

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid

FBS:

Containing no fetal bovine serum

Fe₃ O₄ :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3