Protoporphyrin IX-beladene Laminarin-Nanopartikel für die Krebsbehandlung, ihr Zellverhalten, ROS-Erkennung und Tierstudien

Einführung

Die photodynamische Therapie (PDT) [1,2,3] ist eine etablierte Therapieform, die durch Lichtquellen, Photosensibilisatoren und molekularen Sauerstoff beeinflusst wird [4], die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) vermittelt [5, 6] direkt tödlich sein können Auswirkungen auf Krebszellen innerhalb des beleuchteten Bereichs unter der Bedingung minimal-invasiver Natur [6] und geringer Toxizität. Es kann zu DNA-Schäden führen [7], Signalwege aktivieren, um eine vaskulotoxische Reaktion zu ermöglichen, die die Blutversorgung des Tumorbereichs unterbindet [8] und die Erkennung und Zerstörung von Tumorzellen durch das Immunsystem hervorrufen [9]. Der ultimative Effekt ist die Überwindung der Arzneimittelresistenz [10, 11] und das Auslösen einer selektiven Antitumorwirkung, die zum Absterben von Krebszellen führt.

Gegenwärtig werden traditionelle Behandlungen von Tumoren [12], wie Strahlentherapie, Chemotherapie und Chirurgie, in der Klinik weit verbreitet, aber diese Methoden haben große toxische Wirkungen und Nebenwirkungen, großes Trauma, großes Risiko, gewisse Einschränkungen und leichtes Wiederauftreten. Die PDT wird bei der Behandlung von ausgedehntem Krebs, einschließlich Brust- [13,14,15], Hepatozyten- [14], Lungen- [16], Melanom [17] und Hautkrebs [18] eingesetzt und rückt zunehmend in den Fokus in- und ausländischer Forscher . Die Erfahrung hat gezeigt, dass die PDT in der Therapie verschiedener Krankheiten und Tumoren [20] die bessere Wahl gegenüber herkömmlichen Methoden wie Chemotherapie [19] und Chirurgie [20] ist, da sie Vorteile wie die Hemmung der Krebsmetastasierung [21] sowie die Selektivität und Anpassungsfähigkeit bietet. Die Anwendung der meisten Photosensibilisatoren in der Krebstherapie war jedoch aufgrund ihrer begrenzten Akkumulation an der Tumorstelle begrenzt [22].

Protoporphyrin IX (Pp IX) ist ein hydrophober Photosensibilisator [23, 24] mit großem Potenzial für den Einsatz in der Diagnostik und PDT. Pp IX ist ein Hämatoporphyrin-Derivat, das auch ohne externen Stimulus (wie Laserlicht [25]) Apoptose auslösen kann, was zeigt, dass es wahrscheinlich eine neuartige Funktion zur Heilung des Krebses hat [26].

Die topische Akkumulation von Pp IX in prämalignen und malignen Läsionen ist daher eine interessante Strategie [27], da seine Fluoreszenz eine bequeme Methode zur Tumororientierung bietet [28].

Pp IX hat jedoch einige Nachteile, die gelöst werden müssen [29], wie z. B. eine schlechte Löslichkeit und eine leichte Aggregation in wässriger Lösung, was zu einer verringerten Wirksamkeit führt. Daher ist Laminarin [30] ein marines Nanomedizin-Trägerbiomaterial, das als hydrophiler Gruppenträger verwendet wird, um die ungünstigen Eigenschaften von Photosensibilisatoren zu verbessern. Es wurde bewiesen, dass Laminarin wirksame biologische Aktivitäten besitzt, einschließlich Antitumor, antiviral und so weiter. Immer mehr Beweise deuten darauf hin [31], dass es eine gute therapeutische Wirksamkeit bei verschiedenen Arten von Krebszellen in vitro und in vivo aufweist (wie Brust- und Dickdarmkrebszellen [32]).

Auf Stimulation ansprechende Polymer-Nanopartikel wie Liposomen und Mizellen können die Wirkstoffabgabe weiter sicherstellen und Nebenwirkungen reduzieren. Liposomen [33] können als diagnostische und therapeutische Werkzeuge verwendet werden, und Amphotericin B kann in Liposomen eingebaut werden, um Pilzinfektionen zu behandeln [34]. Polymere mizellare Nanopartikel [35] sind ein intelligenter Wirkstofftransport [36]. Die Pp IX-beladenen Hämatin-Laminarin-Dithiodipropionsäure-MGK (HLDM) Mizellen mit dualer pH/Redox-Sensibilität und Photoreaktion enthalten einen hydrophoben Kern zum Beladen von Pp IX sowie eine hydrophile Laminarin-Hülle. Sie waren eine der wichtigsten nanoskopischen Wirkstoffabgaben, um die ungünstigen Eigenschaften von Photosensibilisatoren zu verbessern [37], wie z. B. die Bioverteilung des Wirkstoffs, Nebenwirkungen und die Wirkstofffreisetzung [38, 39].

Aus diesem Grund haben wir eine multifunktionale Nanoplattform für die Wirkstoffabgabe [40] auf Basis von Laminarin als Reaktion auf den pH-Wert [41] und die Redoxeigenschaften [42] entwickelt, die die Löslichkeit in Wasser aufrechterhalten und das Pp IX im Blutkreislauf des menschlichen Körpers löschen könnte, während Dequenching von Pp IX an Zielorten [43]. Auf interne und externe Stimuli ansprechende Art der Arzneimittelabgabe hat umfangreiche Aufmerksamkeit erhalten, wie Temperatur [44], Ultraschall [45], pH und Redox. Ein thermoresponsives System wurde untersucht, um die Wirkstoffabgabe zu kontrollieren, was das Potenzial für eine bessere Wirkstoffabgabe zeigt [46]. Das stimuli-responsive Drug-Delivery-System hat die kontinuierliche Freisetzung von Arzneimitteln nach Bedarf [47] irreversibel und schnell gefördert.

In dieser Studie wurden Pp IX-beladene HLDM-Mizellen hergestellt, um einige Nachteile von Pp IX [48] zu überwinden, wie Instabilität und Aggregation in der wässrigen Lösung. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Pp IX-beladenen HLDM-Micellen, die sich aus HLDM-Nanocarriern selbstorganisieren [49], akkumuliert und Pp IX in der Tumormikroumgebung freigesetzt werden sollten [50]. Pp IX wurde stimuliert, um die ROS-Erzeugung nach der Akkumulation von Pp IX in Tumorzellen zu erleichtern, was zum Tod von Krebszellen führen könnte (wie in Fig. 1). Die Synthese und Charakterisierung von HLDM-Materialien wurde durch 1H-NMR nachgewiesen, wie zuvor berichtet [51]. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die zelluläre Aufnahme, Phototoxizität, ROS-Erzeugung, nukleare morphologische Beobachtung und der in-vivo-PDT-Effekt von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen untersucht.

Schematische Darstellung der auf Laminarin basierenden Nanomedizin (HLDM), die verwendet wird, um den Photosensibilisator für die Tumortherapie zu liefern

Methoden

Materialien

Laminarin wurde von Sigma-Aldrich (Shanghai, VR China) bezogen. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde von Tianjin Bodi Co. Ltd. geliefert. 1-Glutathion (GSH), Hoechst 33342 wurde von Sigma-Aldrich (Shanghai, VR China) bereitgestellt. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Science Biotechnology Co. Ltd. (Shangdong, Yantai, China) bezogen. Der Testkit für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurde von Beyotime Biotechnology (Shanghai, China) bereitgestellt. H& E wurden von Bioworld Technology Co. Ltd. (Nanjing, China) bezogen. Pp IX wurde von Aladdin Reagent Net (Shanghai, China) geliefert. Alle anderen Reagenzien und Lösungsmittel waren von chemischer Qualität.

Humane Brustkrebszellen (MCF-7) wurden vom Laboratory of Molecular Pharmacology der School of Pharmacy der Yantai University (Shandong, China) bereitgestellt.

Weibliche Nacktmäuse mit einem Gewicht von 14–18 g (3–4 Wochen) wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. gekauft.

Synthese und Charakterisierung von HLDM-Materialien

Die HLDM-Materialien wurden synthetisiert und bereitgestellt, indem die Methoden verwendet wurden, die in früheren Berichten vorgestellt wurden [51]. Zuerst wurde Oxaloylchlorid verwendet, um Dithiopropionsäure zu Acylchlorid zu aktivieren, das mit MGK acyliert wurde, um HOOC-S-S-MGK zu erhalten. Danach wurden 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) verwendet, um HOOC-S-S-MGK zu aktivieren, und dann wurde die Veresterungsreaktion mit Laminarin bei 40 °C durchgeführt. Schließlich synthetisierten wir die HLDM-Materialien durch Veresterung mit EDC/DMAP als Katalysator. Das DMSO-D₆ und D₂ O wurden als Lösungsmittel gewählt, um die Zusammensetzung der Verbindungen zu analysieren. Und ¹ H-NMR (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, USA) Spektren, IR-Spektren und UV-Vis-Absorptionsspektren (200–700 nm) für HLDM-Materialien wurden bei Raumtemperatur getestet und bestimmt.

Vorbereitung von Selbstmontage-Mizellen (PP IX-beladene HLDM-Mizellen)

Die mit Pp IX beladenen HLDM-Mizellen wurden über ein Dialyseverfahren verwertet. Kurz gesagt, ein hydrophober Kern besteht aus MGK, Dithiodipropionsäure und Hämatin sowie eine hydrophile Laminarin-Hülle, die sich in Wasser zu Polymicellen anordnen könnte. Pp IX wurde während des Rührens in den hydrophoben Kern geladen, um Pp IX-beladene HLDM-Mizellen zu erhalten. HLDM und Pp IX wurden in entionisiertem Wasser (MWCO 2000 Da) auf einem 90-1-Rührer bei 600 U/min dialysiert, nachdem eine angemessene Zeit zum Auflösen in organischem Reagens gerührt worden war, gefolgt von einer anschließenden Verarbeitung, um Pp IX-beladene HLDM-Mizellen zu erhalten. Der gesamte Vorgang fand bei Raumtemperatur statt.

Charakterisierung von Mizellen

Partikelgröße und Zeta-Potential für die Pp IX-beladenen HLDM-Micellen wurden unter Verwendung des Beckman Coulter Particle Analyzer (Teilenummer:A35878) bei Raumtemperatur bestimmt. Die Morphologie der mit Pp IX beladenen HLDM-Mizellen wurde durch ein H-600-Transmissionselektronenmikroskop (H-600 TEM; Hitachi, Tokio, Japan) sichtbar gemacht. Um die Beladungsfähigkeit zu bestimmen, wurden mit Pp IX beladene HLDM-Micellen durch eine Ultraschallvorrichtung in einem organischen Reagens aufgebrochen. Die Konzentration von freiem Pp IX in Mizellen wurde durch UV-sichtbare Absorptionsspektren bei 630 nm gemessen. Die Einschlusseffizienz (EE) und der Wirkstoffbeladungsgehalt (DL) wurden gemäß der Formel berechnet.

EE (%) =(Gewicht von Pp IX in den Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen/Gewicht des gesamten Pp IX) × 100 %

DL (%) =(Gewicht von Pp IX in den Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen/Gewicht der Mizellen) ×100 %

Zellkultur

Die menschlichen Brustkrebszelllinien (MCF-7), Dickdarmkrebszelllinien (CT-26) (Fig. 5) und Lungenkrebszelllinien (A549) (Fig. 5) wurden verwendet, um Pp IX-beladene HLDM-Mizellen zu bestimmen durch invertiertes Fluoreszenzmikroskop (AxioVert.A1). Es war vorläufig allgemein bewiesen, dass diese Materialien eine Antitumorwirkung haben. Aber das Experiment zeigte, dass MCF-7 mehr Aufnahme als die anderen beiden Krebszelllinien haben könnte. Daher wurde MCF-7, kultiviert in DMEM (Hyclone) mit 10 % fötalem Rinderserum, ausgewählt, um die heilende Wirkung bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . zu überwachen .

Zellenaufnahme

Das frische Medium, das freies Pp IX, Pp IX-beladene Laminarin-Hämatin (LH)-Mizellen oder Pp IX-beladene HLDM-Mizellen enthielt, wurde zugegeben, um das ursprüngliche Medium nach jeweils 24 h zu ersetzen. Die MCF-7-Zellen wurden dann 1 h, 2 h und 4 h (Pp IX-Konzentration:20 µg/mL) oder 4 h mit folgenden unterschiedlichen Konzentrationen von Pp IX:10 µg/mL, 20 µg/mL kultiviert, und 50 μg/ml in obiger Atmosphäre. Die Konsequenz der zellulären Aufnahme wurde mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japan) für eine qualitative Analyse beobachtet [52].

Zellenstandortstudie

In dieser Studie war Pp IX nicht nur ein Krebsmedikament, um den Tod von Krebszellen hervorzurufen, sondern auch eine rote Fluoreszenzsonde, um die Aufnahme zu lokalisieren. Die MCF-7-Zellen in frischem Medium, das freies Pp IX, Pp IX-beladene LH-Mizellen oder Pp IX-beladene HLDM-Mizellen enthielt, wurden 4 h bei einer Konzentration von 20 ug/ml über der Atmosphäre kultiviert. Nach Fixierung mit 4% Paraformaldehyd wurde das Fixiermittel durch Hoechst 33342 (10 µg/mL) ersetzt, um den Kern für 15 min zu färben. Das Ergebnis für die Lokalisierung wurde mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

Messung der reaktiven Sauerstoffspezieserzeugung

Die Erzeugungsfähigkeit für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurde intrazellulär unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gemessen, das die ROS-Sonde 2′,7′-Dichlorfluorescindiacetat (DCFH-DA) verwendet. MCF-7 wurde in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät und inkubiert. Nach 24 h wurde das Medium entfernt und für 2 h durch frisches Medium ersetzt, das freie Pp IX- oder Pp IX-beladene HLDM-Mizellen (20 &mgr;g/ml) enthielt. Die Zellen wurden mit DMEM-Medium gewaschen, gefolgt von einer halbstündigen Bestrahlung (630 nm). Nach zweimaligem Waschen wurden MCF-7-Zellen mit DCFH-DA (10 μmol/L) bei obiger Atmosphäre für 30 min inkubiert, die dann nach erneutem Waschen mit einem Fluoreszenzmikroskop (Anregungswellenlänge:488 nm, Emissionswellenlänge:525 nm) abgebildet wurden mit DMEM-Medium.

Phototoxizitäts- und Lebensfähigkeits-Assays

MCF-7 wurde in eine 96-Well-Pflanze eingeimpft, um die Zytotoxizität verschiedener Dosierungsformen für die Lebensfähigkeitstests nachzuweisen. Dann wurde das frische DMEM einschließlich verschiedener Konzentrationen von freiem Pp IX, Pp IX-beladenen LH-Mizellen oder Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen (1, 2, 5 und 10 µg/ml) in jede Vertiefung gegeben. Für die Gruppe der Phototoxizität wurden die Zellen 4 Stunden lang inkubiert, um sie zu absorbieren, und sie wurden 30 Minuten lang weiter bestrahlt, gefolgt von einer Inkubation für 24 Stunden bei der obigen Atmosphäre. Andererseits wurden die Wells eingerichtet, um die Zytotoxizität und Lebensfähigkeit im Dunkeln als Kontrollgruppe zu analysieren. Sie wurden weitere 24 h bei der obigen Atmosphäre geimpft.

Zwanzig Mikroliter 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT)-Lösung (5 mg/ml) und 180 μL PBS (pH 7,4) wurden dann in 96-Wells . zugegeben Platte und weitere 3 h inkubiert. Anschließend wurden 150 &mgr;L DMSO verwendet, um das Formazanprodukt zu lösen, und die Extinktion (OD) wurde unter Verwendung eines enzymmarkierten Instruments (SpectraMax M 5) bei 490 nm gemessen. Die Lebensfähigkeit von MCF-7 wurde unter Verwendung der folgenden Formel ausgedrückt:

Lebensfähigkeit =((OD Probe – OD schwarz)/(OD Kontrolle – OD schwarz)) × 100 %.

Die Werte der OD-Probe wurden von den arzneimittelbehandelten Zellen geliefert, während die Werte der OD-Kontrolle von den Zellen ohne Arzneistoff geliefert wurden, und die Werte von OD black wurden aus den Vertiefungen ohne Arzneistoff und Zellen erhalten.

Kernmorphologische Beobachtung

Die MCF-7-Zelllinie wurde 24 h inkubiert und dann 4 h mit Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen stimuliert. Nach dem Spülen und Fixieren wurden die Zellen mit einer Kernfluoreszenzsonde für 20 min bei 37 °C gefärbt, gefolgt von der Entfernung des Farbstoffs aus der Umgebung mit PBS. Die entsprechenden Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht.

In-vivo-Wirksamkeits- und Sicherheitsbewertung

Anschließend wurden weibliche Nacktmäuse verwendet, um die Anwendbarkeit von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen in vivo zu untersuchen. MCF-7-Zellen (1,5 × 10 ⁶ Zellen/0,1 ml) wurden in Oxter weiblicher Nacktmäuse als Tiermodelle injiziert, und dann wurde Östrogen durch eine Magensonde verabreicht, um das Tumorwachstum zu fördern. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt, sobald das Tumorvolumen etwa 70–100 mm ³ . erreichte , die als normale Kochsalzlösung bezeichnet wurden, freies Pp IX (5 mg/kg), mit Pp IX beladene HLDM-Mizellen (5 mg/kg freie Pp IX-Äquivalente), freies Pp IX (5 mg/kg) plus Lichtbestrahlung und Pp IX-beladene HLDM-Mizellen (5 mg/kg freie Pp IX-Äquivalente) plus Lichtbestrahlung. Die lichtbehandelten Gruppen wurden in einem 630-nm-Laser mit 30 min 24 h nach der Injektion belichtet. Die therapeutische Wirksamkeit wurde bewertet, indem das Tumorvolumen in fünf behandelten Gruppen jeden zweiten Tag überwacht und der histopathologische Objektträger nach 20 Tagen analysiert wurde. Und das Körpergewicht wurde alle 2 Tage in fünf behandelten Gruppen gemessen, um die Arzneimittelsicherheit zu beurteilen [53].

Statistische Analyse

Alle Daten in dieser Studie wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (n =3). Darüber hinaus wurden signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen mittels Einweg-Variationsanalyse (ANOVA) analysiert. Die Unterschiede wurden bei Wahrscheinlichkeiten von *P < . als statistisch signifikant erachtet 0,05 (signifikant), **P < 0,01 (hochsignifikant).

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von HLDM-Materialien

¹ H-NMR-Spektren für die HLDM-Materialien wurden in früheren Berichten gezeigt [51]. Der Methylpeak für MGK wurde bei etwa δ:0,8 beobachtet (Fig. 2h). ¹ H-NMR-Spektren zeigten einen Absorptionspeak bei etwa δ:2,8 (Abb. 2g), was CH₂ . war in 3,3-Dithiodipropionsäure. Das Auftreten des Signalpeaks bei δ:6,5 (Fig. 2j) bestätigte die Anwesenheit von Hämatin. Der charakteristische Peak für Laminarin in amphiphilen Polymermaterialien wurde im Bereich zwischen 3 und 4 ppm gefunden, was darauf hindeutet, dass das neue Produkt von HLDM erfolgreich synthetisiert wurde.

Die ¹ H-NMR-Spektren von HLDM

IR-Spektren für HLDM

IR-Spektren von HLDM-Materialien wurden in früheren Berichten gezeigt [51]. Die Doppelspitze im Bild zeugte von der Verbundenheit des MCK. Darüber hinaus wurde der charakterisierte Peak der Estercarbonylgruppe in IR-Spektren beobachtet.

UV-sichtbare Absorptionsspektren von HLDM

In 3a hatte Hämatin eine ultraviolette Absorptionswellenlänge (etwa 580 nm) und in 3b hatte Laminarin-Dithiodipropionsäure-MGK keine Absorption an derselben Position. Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden erstellt, um die Verbindung von Hämatin auf dieser Grundlage zu überprüfen. Das Ergebnis zeigte, dass die charakterisierte Absorptionswellenlänge bei 580 nm in HLDM-Materialien beobachtet wurde (Abb. 3c). Hämatin wurde erfolgreich mit HLDM-Materialien verbunden.

UV-sichtbare Absorptionsspektren von Hämatin (a ), Laminarin-S-S-MGK (b ) und HLDM (c )

Charakterisierung von Pp IX-beladenen Mizellen

Die Größe und das Zetapotential von Pp IX-beladenen HLDM-Micellen sind in 4a, b gezeigt. Es zeigte sich, dass die Mizellen besser von den Krebszellen aufgenommen wurden, um die Effizienz zu steigern und Nebenwirkungen zu reduzieren (Enhanced Permeability and Retention Effect, EPR). Die Micellen wurden mit bloßem Auge nach dem Millipore-Membranfilter in Fig. 4c gesehen. Auf dieser Grundlage wurde das Bild von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) gescannt, wie in 4d gezeigt. Die Morphologie bestand aus ungleichmäßigen Partikeln, was daran lag, dass die Zeit für Ultraschall nicht ausreichend war. Andererseits wurde im Bild die Agglomeration von Partikeln beobachtet, wahrscheinlich aufgrund der höheren Konzentration (Abb. 5).

a , b Die Größe und das Zetapotential von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen. c Die mit Pp IX beladenen HLDM-Mizellen in Wasser. d Das TEM-Bild von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen

Aufnahme von freiem Pp IX, Pp IX-beladenem LH und Pp IX-beladenem HLDM-Micellen in CT-26 (links) und A549 (rechts)

Die Einschlusseffizienz (EE) und der Wirkstoffbeladungsgehalt (DL) wurden nach der Formel (Tabelle 1) berechnet. Nach vielen Experimenten wurde entdeckt, dass die Fluktuation von EE und DL instabil war, da wir spekuliert hatten, dass die Pp IX-beladenen HLDM-Micellen in wässriger Lösung aggregieren könnten.

Mobilfunkaufnahme

In dieser Studie wurde die Fluoreszenz von Pp IX nachgewiesen, um die Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit zu untersuchen. Wie aus dem Diagramm ersichtlich, wurden die mit Pp IX beladenen HLDM-Mizellen in MCF-7-Zellen absorbiert und ihre Fluoreszenzintensität nahm mit der Zeit und Konzentration zu. Durch Vergleich der drei Micellen in Fig. 6a wiesen die Krebszellen, denen Pp IX-beladene HLDM-Micellen gegeben wurden, mehr Fluoreszenz auf. Dies lag daran, dass pH/Redox-Einheiten mit den Materialien verbunden waren, um auf die Tumormikroumgebung zu reagieren. Die Krebszellen, denen freies Pp IX verabreicht wurde, wiesen aufgrund der Aggregation in DMEM eine schwächere Fluoreszenz auf.

a Aufnahme von freiem Pp IX, Pp IX-beladenem LH und Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen. b Zellortung von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen

Aus dem oben Besprochenen können wir sicher den Schluss ziehen, dass HLDM-Materialien, einschließlich pH- und Reduktionsempfindlichkeitseinheiten, die Agglomeration von Pp IX verbessern und ihre Absorption und Freisetzung in Tumorzellen verbessern können.

Zellstandortstudie

Wie in Fig. 6b gezeigt, wurde der Kern durch einen Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, und dann konnten wir das Phänomen der roten Fluoreszenz sehen, das sich außerhalb der blauen Fluoreszenz präsentierte. Wir hatten spekuliert, dass die Zellaufnahme mit dem Zytoplasma zusammenhängen könnte, daher wurde diese Hypothese durch die vorherige Studie bestätigt, dass Pp IX in den Mitochondrien und im Zytoplasma von Tumorzellen akkumuliert und lokalisiert wurde [54].

Messung der reaktiven Sauerstoffspezieserzeugung

Wie in Fig. 7 gezeigt, wurde die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in MCF-7-Zellen unter Verwendung von DCFH-DA als Indikator überwacht, bei dem im Fluoreszenzmikroskop eine grüne Fluoreszenz beobachtet wurde. Mit Pp IX beladene HLDM-Mizellen wiesen eine stärkere Intensität der grünen Fluoreszenz unter dem Licht auf, während freies Pp IX kaum fluoreszierte. Wir hatten spekuliert, dass freies Pp IX agglomerieren könnte, um einen selbstlöschenden Effekt in DMEM zu verursachen. Die grüne Fluoreszenz von drei Gruppen war ohne Licht (wie Kontrollgruppe) vernachlässigbar. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Pp IX Sauerstoff stimulieren kann, um ROS als Photosensibilisator unter Lichtbedingungen zu erzeugen.

Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Lichtbedingungen

Phototoxizitäts- und Lebensfähigkeits-Assay

Der Zellzytotoxizitäts- und Lebensfähigkeitstest wurde mit den menschlichen MCF-7-Krebszellen der Brust unter zwei verschiedenen äußeren Umgebungen unter Verwendung des MTT-Tests durchgeführt. Wie in 8a gezeigt, war der signifikante Zellschädigungsunterschied bei allen Proben im Dunkeln vernachlässigbar. Als die Pp IX-Konzentration auf 50 µg/ml erhöht wurde, blieb die von uns nachgewiesene Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen auf hohem Niveau. Das Phänomen zeigte, dass die Zytotoxizität gegenüber Zellen oder Organen mit einer erhöhten Konzentration von Pp IX nicht signifikant gesteigert wurde.

a Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen von freiem Pp IX, Pp IX-beladenen LH-Mizellen oder Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen unter Lichtbedingungen. b Relative Lichttoxizität von freiem Pp IX, Pp IX-beladenen LH-Mizellen oder Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen nach Bestrahlung. n =3; * zeigt P < . an 0,05

Wie in Abb. 8b dargestellt, 5 μg/ml Pp IX wiesen einen signifikanten Unterschied in den Gruppen mit freien Arzneimitteln und Micellen auf. Die Zytotoxizität gegenüber Zellen oder Organen war in der Micellen-Gruppe signifikant erhöht, da die Konzentration von Pp IX unter Licht anstieg, während die freien Pp IX-Gruppen bis zu einer Konzentration von 10 µg/ml nur geringe Veränderungen zeigten. Diese Daten zeigten, dass die phototoxische Effizienz von Pp IX-beladenen Micellen deutlich höher war als die von freiem Pp IX. Das Experiment zeigte erneut, dass sich freier Photosensibilisator ansammeln kann, um einen selbstlöschenden Effekt zu bewirken. Daher können wir schlussfolgern, dass die Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen ein enormes Potenzial haben, Krebszellen durch Lichtbestrahlung abzutöten.

Kernmorphologische Beobachtung

In der Zelllokalisierungsstudie entdeckten wir unwissentlich, dass der gefärbte Kern weiße Flecken aufwies und die höhere Konzentration von Pp IX bei diesem Phänomen deutlicher war. Vielleicht lag dies an einem DNA-Schaden im Zellkern. Wie in Abb. 8 gezeigt, könnten 20 µg/ml Pp IX-beladene HLDM-Micellen im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle in MCF-7 DNA-Schäden verursachen. Wenn die Konzentration 50 µg/ml erreichte, würde der Schaden in Krebszellen schwerwiegend sein. Die nuklearmorphologische Beobachtungsstudie legte nahe, dass DNA-Schäden ein früher Marker für den Tod von MCF-7-Zellen waren, der durch Pp IX induziert wurde [26] (Abb. 9).

DNA-Schädigung von MCF-7-Zellen nach Pp IX-Behandlung

In-vivo-Wirksamkeits- und Sicherheitsbewertung

Wie in 10a , b gezeigt, wurde das Tumorwachstum von fünf Gruppen gemessen, um die Wirksamkeit in vivo zu bewerten. Die mit Kochsalzlösung behandelte Gruppe zeigte ein kontinuierliches Wachstum mit einer relativ hohen Rate. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen, die mit freiem Pp IX und Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen behandelt wurden, und der Kochsalzlösungsgruppe. Diese Daten zeigten, dass das Tumorvolumen durch Pp IX ohne Bestrahlung weniger beeinflusst wurde. Unterdessen erzeugte die mit freiem Pp IX plus Licht behandelte Gruppe eine leichte Veränderung des Tumorvolumens. Die Ursache für dieses Phänomen war, dass das freie Arzneimittel in vivo instabil und somit leicht im Blut zu sammeln war. Daher könnte es eliminiert worden sein, bevor das Tumorgewebe erreicht wurde. Im Gegensatz dazu wurde das Tumorwachstum, das mit Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen behandelt wurde, in 10a signifikant gehemmt. Dieses Phänomen bewies, dass die Mizellen eine signifikante Antitumorwirkung zeigten, nachdem sie eine bestimmte Wellenlänge des Lichts zur Stimulierung gegeben hatten. Zusammenfassend zeigte dieses Experiment, dass sich die Antitumorwirkungen von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen unter Lichtbedingungen offensichtlich verbessert hatten.

In-vivo-Antitumoraktivität und Sicherheitsbewertung. a Das Tumorvolumen ändert sich über die Behandlungszeiten. b Tumorvolumen von fünf Gruppen:(a ) normale Kochsalzlösung, (b ) freies Pp IX (5 mg/kg), (c ) Pp IX-beladene HLDM-Mizellen (5 mg/kg freie Pp IX-Äquivalente), (d ) freies Pp IX (5 mg/kg) plus Lichteinstrahlung und (e ) Pp IX-beladene HLDM-Micellen (5 mg/kg freie Pp IX-Äquivalente) plus Lichtbestrahlung. c Die Körperveränderung von tumortragenden Nacktmäusen

Andererseits wurde das relative Körpergewicht gemessen, um die Sicherheit von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen zu bewerten ( 10c ). Es gab keinen offensichtlichen Körpergewichtsverlust und vernachlässigbare Veränderungen in allen Gruppen, was auf die gute biologische Sicherheit dieser Behandlungen für die Mäuse hindeutet.

Darüber hinaus zeigte der histopathologische Objektträger einen deutlichen nuklearen Polymorphismus in der Kochsalzlösungsgruppe in Abb. 11. Die pathologischen Veränderungen im mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Tumorgewebe wiesen signifikante Unterschiede in fünf Gruppen auf. Die Ergebnisse zeigten eine leichte Kernkondensation in den Pp IX-beladenen HLDM-Micellen und freien Pp IX-Gruppen. Die Tumorgewebe aus der Gruppe der Pp IX-beladenen HLDM-Micellen (plus Licht) zeigten eine offensichtliche Kernschädigung. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass diese Ergebnisse mit den obigen Ergebnissen für die In-vivo-Wirksamkeits- und Sicherheitsbewertung übereinstimmen.

H&E-Tumorfärbung mit verschiedenen Formulierungen. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. n =3; * zeigt P < . an 0,05

Bis heute wurde eine Vielzahl von Materialien für die Wirkstoffabgabe untersucht [55]. In der vorherigen Studie synthetisierten wir erfolgreich duale pH/Redox-sensitive [56] marine Polysaccharid-Laminarin-Konjugate, und in dieser Forschung wurden die Konjugate als Abgabesystem für Pp IX verwendet, um Antitumorwirkungen zu erzielen. In-vivo-Experimente zeigten, dass mit Pp IX beladene HLDM-Micellen Pp IX effektiv in Krebszellen abgeben und ROS-vermittelte direkte tödliche Wirkungen auf Krebszellen erzeugen könnten. Die Zytotoxizitätsexperimente zeigten, dass die Micellen ohne Lichtbestrahlung eine leichte Zytotoxizität aufwiesen, während niedrigkonzentrierte Micellenlösungen einen merklichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb einer bestimmten Beleuchtung hatten. Auf Tierebene übten Pp IX-beladene HLDM-Mizellen eine phototoxische Wirkung aus, um eine relevante Anti-Tumor-Wirkung zu erzeugen. Daher wurden die Aktivitäten von Pp IX-beladenen HLDM-Mizellen in vitro und in vivo überzeugend bestätigt.

Schlussfolgerungen

A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels unterstützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

HLDM:

Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK

LH:

Laminarin-Hematin

Pp IX:

Protoporphyrin IX

PDT:

Photodynamische Therapie

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies