Ein effizientes Zell-Targeting Drug Delivery System basierend auf Aptamer-modifizierten mesoporösen Silica-Nanopartikeln

Einführung

Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist ein heterogener bösartiger Tumor, der die menschliche Gesundheit ernsthaft gefährdet [1, 2, 3]. In den USA werden jährlich etwa 6000 Fälle von akuter lymphatischer Leukämie diagnostiziert, insbesondere bei Kindern und Jugendlichen. ALL ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern und die häufigste Krebstodesursache vor dem 20. Lebensjahr [4].

Chemoradiotherapie und die Transplantation von hämatopoetischen Knochenmarkstammzellen sind Standardbehandlungen für ALL. Die Strahlentherapie ist mit erheblichen systemischen Nebenwirkungen verbunden und die optimalen Expositionsorte sind unklar. Die Transplantation von hämatopoetischen Knochenmarkstammzellen ist aufgrund der Kosten, des Alters des Patienten und des Mangels an Spendermark oft nicht durchführbar. Eine Chemotherapie kann entfernte Herde effektiv beseitigen und so ein Wiederauftreten verhindern, aber nur ein Bruchteil der meisten Antitumormittel erreicht den Tumor über den Kreislauf. Dies führt zu einer geringen Bioverfügbarkeit des Arzneimittels und einer schlechten Selektivität für erkrankte Zellen gegenüber normalen, was das Risiko schwerwiegender Nebenwirkungen und Arzneimittelresistenz erhöht.

Nano-Drug-Delivery-Systeme können Anti-Tumor-Medikamente viel effektiver und gezielter abgeben als die Medikamente allein, einschließlich der Wirkstofffreisetzung, die durch die spezifischen Bedingungen der Tumormikroumgebung ausgelöst wird [5, 6]. Unter diesen Systemen haben mesoporöse Siliciumdioxid-Nanopartikel (MSNs) wegen ihrer großen, modifizierbaren Oberfläche Aufmerksamkeit auf sich gezogen; ihr einstellbares Porenvolumen, das unterschiedliche Mengen und Arten von Medikamenten aufnehmen kann; und ihre gute Biokompatibilität [7, 8]. Oberflächenmodifikationen mit funktionellen Reaktionsgruppen ermöglichen die Schaffung von MSNs, die ihr Medikament unter bestimmten Bedingungen freisetzen, während Modifikationen mit Targeting-Molekülen dazu führen, dass die MSNs ihr Medikament selektiv an das gewünschte Gewebe abgeben [9, 10].

Eine Art von Zielmolekülen, die mit MSNs kompatibel sind, sind Aptamere, bei denen es sich um einzelsträngige DNA oder RNA handelt, die als „chemische Antikörper“ fungieren, um spezifisch und fest an Ziele zu binden. Aptamere sind kleiner und leichter herzustellen und zu modifizieren als monoklonale Antikörper, sie dringen besser in das Gewebe ein und zeigen eine geringere Toxizität und Immunogenität. Daher werden Aptamere häufig zur Tumorerkennung und gezielten Chemotherapie eingesetzt [11,12,13]. Die SELEX-Methode wurde verwendet, um ein Aptamer, Sgc8, zu identifizieren, das spezifisch an humane akute T-Lymphozyten-Leukämiezellen von CEM bindet [14, 15]. Sgc8 erkennt Protein-Tyrosin-Kinase-7 (PTK-7) auf der CEM-Zellmembran. Die Zugabe von Sgc8 zu Chemotherapeutika und bestimmten Nanomaterialien kann das Targeting und das Abtöten von Leukämiezellen verbessern [16, 17].

Wir haben ein Sgc8-Aptamer-modifiziertes fluoreszierendes Silica-Nanopartikel-System (Sgc8-FSNPs) zum Nachweis von Leukämiezellen mit hoher Sensitivität und Spezifität entwickelt, das sich nicht nur für die Diagnose von Leukämie, sondern auch für die gezielte Verabreichung von Anti-Leukämie-Medikamenten als nützlich erweist [18 ]. Basierend auf dieser Arbeit haben wir in der vorliegenden Studie Doxorubicin (Dox) in MSNs eingekapselt, die wir mit Sgc8 dekoriert haben (Abb. 1). Das resultierende Sgc8-MSN/Dox zeigte eine gute Morphologie und Größe für die Wirkstoffabgabe, und die Nanopartikel wurden selektiv von Leukämiezellen in Kultur aufgenommen, was zu einer effektiven Abtötung von Tumorzellen führte. Der Zweck dieser Studie besteht darin, aufzuzeigen, dass Aptamer-modifizierte mesoporöse Siliziumdioxid-Nanopartikel nicht nur auf die Diagnose von Tumoren abzielen, sondern auch Tumore durch das Laden von Medikamenten abtöten können, um Ideen für tumorgerichtete Theranostika zu liefern.

Schematische Darstellung von Sgc8-Aptamer-modifizierten mesoporösen Siliciumdioxid-Nanopartikeln für ein effizientes System zur gezielten Wirkstoffabgabe auf Zellen. CEM-Zelle, CCRF-CEM-menschliche akute T-Lymphozyten-Leukämiezellen; Dox, Doxorubicin; MSN, modifizierter Siliziumdioxid-Nanopartikel; PTK-7, Protein-Tyrosinkinase-7

Experimentelle Materialien und Methoden

Reagenzien und Materialien

Doxorubicinhydrochlorid (Dox) wurde von Beijing Huafeng United Technology (Beijing, China) bezogen. Tetraethylorthosilicat (TEOS) und 3-Triethoxysilylpropylamin (APTES) in analytischer Qualität wurden von Shanghai Chemical Reagent Factory I (Shanghai, China) und Cetyl-Trimethylammoniumbromid (CTAB, 99% Reinheit) von Shanghai Jizhi Biochemical Technology (Shanghai, China) bezogen. . Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität. Carboxyl-modifiziertes Sgc8-Aptamer (5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀ -COOH-3′)[16]wurde von Shanghai Bioengineering (Shanghai, China) synthetisiert.

Zelllinien

Die folgenden Zelllinien wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben:die humane akute T-Lymphozyten-Leukämie-Zelllinie CCRF-CEM, die humane Ramos-Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie, die humane normale Leberzelllinie L02 , und die 293Thuman embryonale Nierenzelllinie. Alle Zelllinien wurden bei 37 °C unter 5 % CO₂ . kultiviert in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Hyclone) und Penicillin-Streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Vorbereitung von Sgc8-MSN/Dox

MSNs wurden wie beschrieben [19] durch Auflösen von 0,50 µg CTAB in 240 µl Reinstwasser, Zugabe von 1,75 µl 2 µM NaOH-Lösung und Erhitzen auf 80 °C in einem Ölbad hergestellt. Unter starkem Rühren wurden langsam 2,50 ml TEOS zugetropft, und die Mischung wurde 2 Stunden lang kontinuierlich gerührt, bis ein weißer Niederschlag erhalten wurde. Dann wurde das Gemisch 10 min bei 10.000 UpM zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, der Niederschlag wurde dreimal abwechselnd mit Reinstwasser und wasserfreiem Ethanol gewaschen und dann wurde der Niederschlag in einem Vakuumofen bei 60 °C über Nacht getrocknet, um MSNs zu erhalten.

Sgc8-MSN/Dox wurde durch Mischen von 0,2365 g MSNs in einem Dreihalskolben mit 23,65 ml absolutem Ethanol, tropfenweise Zugabe von 710 &mgr;l APTES und 24 h Rückflusskochen erhalten. Die Mischung wurde dreimal abwechselnd mit Methanol-HCl-Lösung (4:1) und entionisiertem Wasser gewaschen, dann getrocknet, um MSNs-NH₂ . zu ergeben . Bei Raumtemperatur wurde MSNs-NH2-Material in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und in einer geeigneten Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) dispergiert, dann wurde Dox (5 mg/ml) tropfenweise zugegeben und die Mischung wurde für 1 Stunde gerührt 24 h. Schließlich wurde Carboxyl-modifiziertes Sgc8-Aptamer (100 µm/ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt, zentrifugiert und mit PBS gewaschen, bis es farblos wurde, was Sgc8-MSN/Dox ergab.

Charakterisierung von Sgc8-MSN/Dox

Röntgenbeugungsmuster (XRD) der Nanopartikel wurden mit einem XRD D4-Diffraktometer (Bruker Inc., Deutschland) gemessen. Die N2-Adsorptions-Desorptions-Isothermen wurden mit einem spezifischen Oberflächen- und Porengrößenanalysator (TriStar 3000, GA Inc., USA) gemessen. Die BET-Oberflächen wurden aus dem BET-Plot berechnet. Die Porengrößenverteilung wurde aus dem Adsorptionszweig der Isotherme nach der BJH-Methode abgeschätzt. Die Partikelgröße und das elektrostatische Potential wurden unter Verwendung des dynamischen Lichtstreuungsanalysators Nano S (Malvern Instruments, UK) gemessen. Die Messungen wurden dreimal für jede Probe durchgeführt und gemittelt. Teilchengröße und Morphologie wurden auch durch Transmissionselektronenmikroskopie (H-7650, Tokio, Japan) bei einer Elektronenstrahlbeschleunigungsspannung von 100 kV bestimmt. Inzwischen wurde die Konjugation von Sgc8-Aptamer an die MSN-Oberfläche durch FT-IR-Spektroskopie (Nicolet-5700, USA) bestimmt. Um die Wirksamkeit von Aptamer-modifiziertem MSN/Dox nachzuweisen, haben wir den Waschüberstand bei der Herstellung von Sgc8-MSN/Dox gesammelt und den UV-Absorptionswert bei 260 nm gemessen und dann mit der Standardkurvenmethode die Menge bestimmt von ungebundenem Aptamer. So kann die Menge der Modifikation des Aptamers berechnet werden, indem die Menge an ungebundenem von der Gesamtmenge abgezogen wird.

Dox-Version von Sgc8-MSN/Dox

Die Freisetzung von Dox aus Sgc8-MSN/Dox wurde in vitro gemessen folgendermaßen. Sgc8-MSN/Dox (10 mg) wurde in 10 ml Puffer bei pH 5,0 oder 7,4 bei 37 °C gelöst und bei 100 Upm geschüttelt. Zu vorbestimmten Zeiten wurden Proben entnommen, 10 min bei 5000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde mittels Spektrophotometrie auf Dox untersucht, wie von Thermo Scientific Microplate Reader (81 Wyman Street, Waltham, USA) bei 482 nm beschrieben [9].

Targeting-Fähigkeit von Sgc8-MSN/Dox

CEM- oder Ramos-Zellen (3 × 10 ⁶ ) in PBS wurden in 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und mit Sgc8-MSN/Dox oder MSN/Dox (Aptamerkonzentration, 200 &mgr;nM) gemischt. Die Röhrchen wurden 20–30 min bei 37 °C inkubiert, und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, dreimal mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd 30 min lang fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden 5 min mit 1 mg/ml DAPI inkubiert, dreimal mit PBS gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in PBS resuspendiert und zur Analyse durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie ((Nikon DS-Ri1; Tokio, Japan) auf Objektträger gelegt.

In separaten Experimenten wurden CEM- und Ramos-Zellen (3 × 10 ⁵ ) in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in einer Mischung aus 50 µL PBS, 45 µL Bindungspuffer [PBS ergänzt mit 5 µM MgCl2, 4,5 µg/L Glucose und 1 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA)] und 10 µL . resuspendiert von FBS [PBS ergänzt mit 1 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA)], das die angegebenen Materialien in einer Aptamerkonzentration von 200 µm enthält. Die Mischung wurde im Dunkeln 30 min bei 4 °C geschüttelt. Die Zellen wurden in Waschpuffer gewaschen, 5 min bei 1000 U/min zentrifugiert und dann noch dreimal gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in 500 µl Waschpuffer resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie (Beckman Coulter Epics XL; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA) analysiert.

Zytotoxizität von MSNs

Die Zytotoxizität von MSNs ohne Dox oder Aptamer wurde mit der MTT-Methode bewertet. CEM-, Ramos-, 293T- und L-02-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in 96-Well-Platten (1,5 × 10 ⁴ /Gut). MSNs (100 µl) wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden in 5% CO₂ . kultiviert Inkubator bei 37 °C für 24 oder 48 Stunden. MTT (20 µl) wurde in jede Vertiefung gegeben, die Platten wurden weitere 30 Minuten bei 37 °C inkubiert, dann wurden die Platten 10 Minuten bei 1500 Upm zentrifugiert und die Kulturüberstände wurden verworfen. DMSO (200 µl) wurde in jede Vertiefung gegeben, die Platten wurden 10 min im Dunkeln geschüttelt, und dann wurde die optische Dichte (OD) bei 570 nm mit einem automatisierten Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Jede Probe wurde mit sechs Wiederholungen getestet und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.

Zelltötung durch Sgc8-MSN/Dox

CEM-, Ramos-, 293T- und L-02-Zellen in 96-Well-Platten (1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung) wurden 24 h lang mit freiem Dox, MSN/Dox oder Sgc8-MSN/Dox bei Dox-Konzentrationen von 1, 5, 10, 15 oder 20 &mgr;g/ml inkubiert. Um weiter zu bestätigen, dass Sgc8-MSN/Dox tatsächlich darauf abzielte, CEM-Zellen durch den Aptamer-Rezeptor abzutöten, inkubieren wir zuerst ausreichend Sgc8-Aptamer mit CEM-Zellen für 2 Stunden, dann inkubierten wir mit sgc8-MSN/Dox bei einer Dox-Konzentration von 20 µg/ ml für 24 Stunden. Die Lebensfähigkeit wurde mit dem MTT-Test verglichen, wie im Abschnitt „Zytotoxizität von MSNs“ beschrieben.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden statistisch mit dem t . von Student analysiert Test und einseitige Varianzanalyse mit dem kleinsten Signifikanzdifferenztest. Alle Analysen wurden mit GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von Sgc8-MSN/Dox

Röntgenbeugungsdaten zeigen, dass die synthetisierten Nanopartikel einen typischen Beugungspeak hexagonaler Mesoporen im X-Bereich aufweisen (Abb. 2a), was die Struktur von MSN bestätigt. Um die spezifische Oberfläche, die Porengrößenverteilung und die mesoporösen Parameter von MSN weiter zu untersuchen, führten wir einen Stickstoffadsorptions-Desorptionstest an MSN durch. Die N2-Adsorptions-Desorptions-Isothermen von MSN (Abb. 2b) weisen eine Typ-IV-Isothermencharakteristik auf, die auf mesoporöse Charakteristika hinweist. Die vom BET-Modell berechnete Oberfläche beträgt 1389 m ² /g. Die BJH-Kurve zeigt, dass die Porengrößenverteilung der Partikel eng ist (Abb. 2b, Einschub). Die Porengröße beträgt 5,23 nm und das Porenvolumen beträgt 2,51 cm ³ /g. Die große spezifische Oberfläche und das Porenvolumen sowie die reichen Mesoporen ermöglichen eine stärkere Wirkstoffbeladungskapazität und haben das Potenzial, ein hervorragender Wirkstoffträger zu sein. Elektronenmikroskopie zeigte, dass Sgc8-MSN/Dox eine gute Dispergierbarkeit und einheitliche Größe mit kugelförmiger oder elliptischer Form aufweist (Fig. 3a). Das durchschnittliche Zetapotential von MSN/Dox in PBS betrug −26,53 mV, welches bei Sgc8-MSN/Dox auf −33,87 mV absank (Abb. 3b), was die negative Ladung des Sgc8-Aptamers widerspiegelt [20]. Porenkanäle auf der Oberfläche des mesoporösen Siliziums wurden beobachtet. In PBS zeigte MSN/Dox eine durchschnittliche Hydratationspartikelgröße von 98,35 nm, die nach der Verknüpfung des Sgc8-Aptamers zu Sgc8-MSN/Dox auf 103,24 nm anstieg (Abb. 3 c, d). Um die erfolgreiche Konjugation von Sgc8-MSN/Dox weiter zu bestätigen, wurde eine FT-IR-Spektroskopieanalyse durchgeführt. Das Infrarotspektrum ist in Abb. 3 e dargestellt. Peaks von 3400 cm ⁻¹ , 1100 cm ⁻¹ , und 500 cm ⁻¹ sind charakteristische Spitzen von Kieselsäure. Der Peak etwa 2400 cm ⁻¹ ist der Peak des CTAB-Templatmittels. Der Peak etwa 1600 cm ⁻¹ ist NH₂ Gipfel. Der Peak erscheint bei etwa 1700 cm ⁻¹ wird als der charakteristische Peak der C =0-Bindungsdehnung der Clusterbasis von Dox betrachtet, die in MSNs geladen ist. Der neue Peak bei 1650 cm ⁻¹ ist auf die Schiffsche Base (–C=N–) zurückzuführen, die durch die Reaktion von Sgc8 mit NH2-MSN/Dox erzeugt wird. Diese Beweise beweisen, dass das Sgc8-MSN/Dox-Medikamentenverabreichungssystem erfolgreich vorbereitet wurde. Um die Effizienz von Aptamer-modifiziertem Sgc8-MSN/Dox nachzuweisen, haben wir ein Ultraviolett-Spektrophotometer verwendet, um die Absorptionsdichte (OD) von Aptamer bei 260 nm zu messen, und die Aptamermodifikation zur Nanopartikeleffizienz basierend auf der Änderung des OD-Werts berechnet vor und nach der Aptamermodifikation an der Oberfläche des Nanopartikels. Die ultravioletten Absorptionsspektren (UV-Vis) der Aptamerlösung und des Überstands sind in Abb. 3e dargestellt. Der Berechnung zufolge betrug die Menge der Sgc8-Aptamer-Modifikation zu Sgc8-MSN/Dox etwa 6,87 nmol mg ^–1 Sgc8-MSN/Dox.

a XRD und b Stickstoffsorptionsisothermen von MSN; (Einschub) Porenvolumen- und Porengrößenverteilungs-Plots von MSN

Charakterisierung von Nanomaterialien. a Elektronenmikroskopische Aufnahme von Sgc8-MSN/Dox. b Potenzialdiagramm von Nanopartikeln. Partikelgrößenverteilung von c MSN/Dox und d Sgc8-MSN/Dox. e FT-IR-Spektren von Nanomaterialien:a MSN, b MSN/Dox und c Sgc8-MSN/Dox. f UV-Vis-Spektren von a Sgc8-Aptamer-Lösung, b Waschüberstand im Herstellungsprozess Sgc8-MSN/Dox

Dox-Release von Sgc8-MSN/Dox in Vitro

MSN/Dox und Sgc8-MSN/Dox setzten ihre Wirkstofffracht bei pH 7,4 langsam frei:nicht mehr als 50 % des Wirkstoffs wurden innerhalb von 96 h freigesetzt (Abb. 4). Dies deutet darauf hin, dass MSNs eine langsame Wirkstofffreisetzung von 96  h unterstützen können, wahrscheinlich weil sich das Medikament durch die inneren Kanäle des mesoporösen Siliziums ausbreitet. Die Freisetzung war bei pH 5,0 viel schneller, wobei die Freisetzungsraten 60 % nach 48 Stunden und> 80 % nach 96 Stunden erreichten. Die Dox-Freisetzungskurven waren für Sgc8-MSN/Dox und MSN/Dox nahezu identisch, was darauf hindeutet, dass die Aptamerligation die Nanopartikelstruktur nicht beeinflusst. Die stärkere Freisetzung bei saurem pH ist nützlich, da sich Tumorzellen in einer schwach sauren Umgebung befinden und Sgc8-beschichtete Nanopartikel in Endosomen internalisiert werden [15]. Unsere Ergebnisse unterstützen die Idee, dass mesoporöses Silizium die Wirkstofffreisetzung in einer sauren Umgebung beschleunigen kann [21, 22].

Freisetzung von Doxorubicin aus Sgc8-MSN/Dox und MSN/Dox in vitro bei pH  5,0 oder 7,4

Targeting von Leukämiezellen durch Sgc8-MSN/Dox in vitro

Wir untersuchten die Nanopartikelaufnahme durch CEM-T-Lymphozyten-Leukämiezellen als Zielzellen und Ramos-B-Lymphomzellen als Nicht-Zielzellen. Basierend auf der Durchflusszytometrie internalisierten Nicht-Zielzellen MSN/Dox in einem ähnlichen Ausmaß wie Sgc8-MSN/Dox, wohingegen Zielzellen die Aptamer-beschichteten Nanopartikel in einem viel größeren Ausmaß internalisierten als MSN/Dox (Abb. 5a). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte die konfokale Fluoreszenzmikroskopie eine starke Dox-Fluoreszenz (rot) in CEM-Zellen, die Sgc8-MSN/Dox ausgesetzt waren, jedoch nicht in Ramos-Zellen, die auf die gleiche Weise behandelt wurden ( 5b ). Diese Ergebnisse spiegeln die nachgewiesene Fähigkeit von Sgc8-Aptamer wider, Leukämiezellen anzugreifen [20]. Sgc8 erkennt PTK-7 auf der Oberfläche von CEM-Zellen [18], rekrutiert Nanopartikel an die Oberfläche und macht so deren Aufnahme effizienter [23]. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Sgc8-MSN/Dox PTK-7-exprimierende Krebszellen sowohl an primären als auch an sekundären Stellen oder im Blutkreislauf angreifen könnte, was es für die Kontrolle von Metastasen nützlich macht. Es ist möglicherweise möglich, unseren MSN-Ansatz auf andere Aptamere mit anderen Targeting-Spezifitäten auszuweiten [24, 25].

In-vitro-Targeting von Leukämiezellen durch Sgc8-MSN/Dox, analysiert mit a Durchflusszytometrie und b Fluoreszenzmikroskopie. CCRF-CEM- und Romas-Zellen wurden mit MSN/Dox oder Sgc8-MSN/Dox inkubiert und dann mit DAPI (blau) gefärbt. Dox erschien rot. Maßstabsleiste, 100 μm

Zytotoxizität von MSNs

Angesichts der Bedeutung der biologischen Sicherheit für Nanowirkstoffabgabesysteme [25] untersuchten wir zunächst die Toxizität von Leer-MSNs gegenüber CEM-, Ramos-, 293T- und L-02-Zellen. Die Lebensfähigkeit aller Zelllinien blieb selbst nach 48-stündiger Inkubation mit bis zu 100 µg/ml MSNs über 90% (Abb. 6). Dies deutet darauf hin, dass MSNs eine nahezu vernachlässigbare Zytotoxizität aufweisen.

In-vitro-Zytotoxizität von MSNs. a CEM, b Ramos, c 293T und d L-02-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von MSN behandelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gemessen

Als nächstes untersuchten wir die Fähigkeit von Sgc8-MSN/Dox, Zieltumorzellen (CEM-Zellen) und Nicht-Zielzellen (Ramos-, 293T- und L-02-Zellen) abzutöten. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von freiem Dox, MSN/Dox oder Sgc8-MSN/Dox für 24 h inkubiert, und dann wurde die Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assays bewertet. Gegen CEM-Zielzellen zeigte freies Dox eine etwas größere Toxizität als die beiden MSN-Formulierungen, während Sgc8-MSN/Dox bei derselben Arzneimittelkonzentration signifikant toxischer war als MSN/Dox ( 7 ). Gegen Ramos-, 293T- und L-02-Zellen zeigte freies Dox eine signifikant höhere Toxizität als die MSN-Formulierungen, die eine ähnliche Toxizität mit oder ohne Sgc8 zeigten. Um weiter zu bestätigen, dass Sgc8-MSN/Dox tatsächlich darauf abzielte, CEM-Zellen über den Aptamerrezeptor PTK-7 abzutöten, inkubieren wir zuerst ausreichend Sgc8-Aptamer mit CEM-Zellen für 2 h, um die Bindungsstelle zu blockieren, und koinkubierten dann mit dem Sgc8- -MSN/Dox. Der MTT-Assay zeigte, dass freies Aptamer keine Toxizität für CEM-Zellen aufwies, und nachdem ausreichend Sgc8-Aptamer die Bindungsstelle blockiert hatte, zeigte Sgc8-MSN/Dox eine signifikant geringere Toxizität als die freie Sgc8-MSN/Dox-Gruppe ( 7e ). Diese Ergebnisse unterstreichen die Fähigkeit des Aptamers zur gezielten Wirkstoffabgabe und zur Verstärkung des Abtötens von Zielzellen. Ein solches Targeting kann dazu beitragen, die Aufnahme des Arzneimittels durch Nicht-Zielzellen zu reduzieren sowie die Verwendung niedrigerer Dosen zu ermöglichen; beide Effekte können das Risiko toxischer Nebenwirkungen verringern [26].

Fähigkeit von kostenlosem DOX, MSN/Dox und Sgc8-MSN/Dox, a zu töten CEM-Zellen, b Ramos-Zellen, c 293T-Zellen und d L-02 Zellen. e CEM-Zellen töten Fähigkeit von freiem Aptamer, Block (CEM-Zellen inkubieren zuerst ausreichend Sgc8 für 2 h, dann inkubiert mit sgc8-MSN/Dox) und Sgc8-MSN/Dox

Aptamere können als Leitmoleküle für den Transport von Medikamenten und verschiedenen Makromolekülen oder Nanocarriern zu Tumorzellen verwendet werden, manchmal kann Aptamer auch als Therapeutikum wirken. Zum Beispiel kann das Aptamer AS1411 spezifisch an Nukleolin binden, und Nukleolin wird in und auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert, die an der Zelldifferenzierung, dem Überleben, der Entzündung, der Angiogenese und der Tumorentwicklung beteiligt sind. AS1411 Aptamer kann durch Bindung an Nukleolin eine Wachstumshemmung von Xenotransplantatmodellen (Nierenkrebs, Lungenkrebs, MX1-Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs) induzieren [27]. Darüber hinaus wurden AS1411 Aptamer-funktionalisierte, Doxorubicin-beladene Liposomen (Apt-Dox-Lip) auf Brustkrebs getestet und die Ergebnisse zeigten ein großes Anwendungspotenzial [28]. Aptamere waren aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften in einer Vielzahl von klinischen Studien erfolgreich. Das erste Aptamer wurde 2005 von der FDA zugelassen [29], seitdem gelangen immer mehr Aptamere in klinische Studien. Aptamere wurden in klinischen Antitumorstudien eingesetzt, darunter Prostatakrebs [30], Lungenkrebs [31], akute myeloische Leukämie [32] und so weiter. Es besteht kein Zweifel, dass diese Aptamer-bezogenen klinischen Studien neue Hoffnung geben, den konventionellen Therapiestil zu ändern.

In den letzten Jahren wurden Aptamere mit unterschiedlichen Nanomaterialien zur gezielten Therapie von Tumoren kombiniert. Es ist ersichtlich, dass Aptamere über außergewöhnliche molekulare Erkennungs- und Targeting-Fähigkeiten verfügen. Es gibt jedoch noch einige Probleme, die bei der Entwicklung der Anwendung von Aptameren nicht zu vernachlässigen sind, beispielsweise ob Nuklease die Stabilität von Aptameren in vivo beeinflusst, ob die Aptamere von niedermolekularen Substanzen in den Körper gelangen und durch die Nierensystem, und ob die tatsächliche Targeting-Leistung in vivo durchführbar ist. Um das volle Potenzial von Aptamer-basierten zielgerichteten Nanomaterialien auszuschöpfen, bleiben weitere In-vivo-Tests und klinisch relevante Experimente im Fokus der aktuellen Forschung. Gleichzeitig ist die Theranostik von Tumoren eine wichtige Richtung für die zukünftige Entwicklung, und das Design und die Herstellung multifunktionaler biologischer Funktionsmaterialien sind zweifellos der Entwicklungstrend.

Schlussfolgerung

Wir haben ein Aptamer-modifiziertes MSN-Liefersystem konstruiert, das Leukämiezellen effizient angreifen und die Aufnahme von Dox fördern kann. Dieses Targeting, gepaart mit der Fähigkeit von MSNs, Wirkstofffracht langsam und bevorzugt unter sauren Bedingungen freizusetzen, kann dazu beitragen, dass sich das Abgabesystem an Tumorstellen ansammelt und die Zellen kontinuierlich abtötet. Es ist möglich, mit diesem MSN-Ansatz durch die Auswahl geeigneter Aptamere nahezu jede Art von Tumorzellen anzugreifen. Es kann jedoch nicht übersehen werden, dass auch das Sgc8-MSN/Dox die oben genannten Probleme aufweisen kann und seine in-vivo-Stabilität und das Targeting noch weiter untersucht werden müssen. Im nächsten Schritt werden wir die bisherige Forschung kombinieren, um das Drug-Delivery-System sowohl mit diagnostischen Reagenzien als auch mit Medikamenten zu beladen, um ihm die theranostische Funktion einer gezielten Diagnose und zielgerichteten Behandlung zu verleihen.

Abkürzungen

MSN:

Mesoporöse Silizium-Nanopartikel

Dox:

Doxorubicin

Sgc8-MSN/Dox:

Aptamer-modifiziertes mesoporöses Siliciumdioxid-Wirkstoffabgabesystem

PTK-7:

Protein-Tyrosinkinase-7

TEOS:

Tetraethylorthosilikat

APTES:

3-Triethoxysilylpropylamin

CTAB:

Cetyl-trimethylammoniumbromid

CEM:

CCRF-CEM-Zellen

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung