Biotin-funktionalisierte, redox-sensitive Chitosan-Nanopartikel mit Phycocyanin-Beschichtung für gezielten Curcumin-Transport

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurden Phycocyanin (PC)-funktionalisierte und Curcumin (CUR)-beladene Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin (BCSC) Nanopartikel, bezeichnet als CUR-BCSC@PCs, entwickelt, um die Biokompatibilität von CUR zu verbessern. Die Struktur von BCSC wurde mittels ¹H-NMR bestätigt. CUR-BCSC@PCs wiesen einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 160,3 ± 9,0 nm auf; die biomimetische Proteinkorona verlieh den Nanopartikeln hervorragende Stabilität und das Potenzial, Proteinadsorption im Blutkreislauf zu vermeiden. In-vitro-Freisetzungsexperimente zeigten, dass CUR-BCSC@PCs mit redox-empfindlichen Hüllen empfindlich auf hohe Glutathion-Konzentrationen reagieren. Zudem steigerten CUR-BCSC@PCs die hemmende Aktivität auf die Proliferation von A549-Zellen durch verbesserte zelluläre Aufnahme von CUR. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CUR-BCSC@PCs als wirksame Drug-Delivery-Systeme großes Anwendungspotenzial in der Krebstherapie besitzen.

Hintergrund

Chitosan-Oligosaccharid (COS) mit der Struktur β-(1→4)-verknüpfter D-Glucosamine ist ein Depolymerisationsprodukt, das hauptsächlich durch Deacetylierung und enzymatische Hydrolyse von Chitosan oder Chitin aus Arthropoden-Exoskeletten oder Pilzzellwänden gewonnen wird [1, 2]. Bemerkenswert ist, dass Schwermetalle und Farbstoffe durch Chitosan und seine modifizierten Formen als Adsorbens entfernt werden können [3]. Zahlreiche Studien belegen, dass COS diverse biologische Eigenschaften aufweist: anti-kanzerogen, entzündungshemmend, antioxidativ und immunstimulierend [4]. Aufgrund seiner Biokompatibilität, hohen Wasserlöslichkeit und chemischen Modifizierbarkeit gilt COS als ungiftiger Drug-Delivery-Träger [5, 6].

Um die Löslichkeit hydrophober Antikrebsmedikamente zu verbessern und die Toxizität für gesundes Gewebe zu verringern, erforschen Mediziner Copolymere, die sich zu Mizellen bestimmter Partikelgröße selbstassemblieren [7, 8]. Diese ko-polymeren Aggregate können Tumorstellen passiv oder aktiv erreichen und penetrieren. Mizellen bestehen aus zwei funktionalen Bereichen: dem Kern, in dem hydrophobe Medikamente eingekapselt sind, und der äußeren Schale (Korona), die die pharmakokinetischen Eigenschaften in vivo steuert [8]. Wang et al. [9] grafteten Desoxycholsäure an COS-Ketten, um amphiphile Blockcopolymere zu bilden, die sich in kostengünstigen anorganischen Lösungsmitteln zu Mizellen selbstassemblieren. Der hydrophobe Mizellenkern enthielt Quercetin, was die Wasserlöslichkeit von Antikrebsmedikamenten stark verbesserte und deren Bioverfügbarkeit erhöhte.

Curcumin (CUR) ist ein Hauptbestandteil von Kurkuma [10]. In den letzten Jahren wurde seine anti-kanzerogene Wirkung intensiv untersucht; Studien bestätigen, dass CUR das Tumorzellwachstum über verschiedene Signalwege beeinflusst und das Immunsystem stärkt [11]. Zudem wirkt CUR als Photosensibilisator mit guten photodynamischen Eigenschaften [12]. Somit ist CUR ein vielversprechendes Medikament für die Krebstherapie. Seine schlechte Löslichkeit, Stabilität und Bioverfügbarkeit limitieren jedoch die klinische Anwendung [13]. Um diese Nachteile zu mildern, haben Forscher Drug-Delivery-Systeme entwickelt. Beispielsweise entwarfen Chen et al. [14] einen doppelt pH-sensitiven Drug-Carrier, der die Wasserlöslichkeit von CUR erhöhte und die Tumorbekämpfung verbesserte.

Phycocyanin (PC), hauptsächlich aus Cyanobakterien gewonnen, ist ein wasserlösliches, lichtabsorbierendes Pigmentprotein, das bei der Photosynthese Lichtenergie in chemische Energie umwandelt [15]. PC zeigt vielfältige biologische Eigenschaften wie anti-kanzerogen, entzündungshemmend und antioxidativ, was in Lebensmittel- und Medizinbereichen Aufmerksamkeit erregt [15, 17]. Hao et al. [16] zeigten, dass PC das Wachstum von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen durch Downregulation von TIRAP hemmt. PC wird auch in der photodynamischen Therapie (PDT) von Tumoren als nebenwirkungsfreies Mittel eingesetzt [18–20]. Für die Nutzung als fluoreszierende Sonden muss PC mit spezifischen Erkennungselementen wie Biotin, Antikörpern oder Streptavidin konjugiert werden [21, 22]. Biotin, ein wasserlösliches Vitamin, ist ein essenzieller Mikronährstoff mit tumorzielenden Eigenschaften [23]. Biotin-spezifische Rezeptorproteine (Avidin, Neutravidin, Streptavidin) sind auf verschiedenen Krebszellen im Vergleich zu Normalzellen stark überexprimiert [24, 25]. Daher werden biotinylierte Nanopartikel intensiv für rezeptorvermittelte Endozytose-basierte Drug-Delivery untersucht [24].

In der vorliegenden Studie wurde ein neuartiger PC-funktionalisierter Nanocarrier konstruiert; die Herstellung von CUR-BCSC@PCs ist in Abb. 1 dargestellt. Die Disulfidbindung zwischen COS und CUR verleiht dem amphiphilen Trägermaterial Redox-Sensitivität [26]. CUR befindet sich im hydrophoben Kern, geschützt durch die COS/PC-Schale. Die Interaktion zwischen Biotin und PC sowie die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenem COS und negativ geladenem PC dienen der PC-Modifikation auf der Oberfläche von CUR-BCSCs. CUR-BCSC@PCs sollen Tumorgewebe durch verbesserte Permeabilität, den Enhanced Permeability and Retention (EPR)-Effekt und den Biotin-Rezeptor-zielenden Effekt erreichen [27]. In der Tumormikroumgebung mit höherer Glutathion-Konzentration als in Normalzellen zerfallen CUR-BCSC@PCs durch Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen, wodurch eine hohe Medikamentenkonzentration in Tumorzellen erreicht wird [23, 28, 29]. Das beschriebene CUR-BCSC@PC-Nano-Delivery-System verbessert nicht nur die Bioverfügbarkeit von CUR, sondern hat auch Potenzial für die klinische Tumortherapie.

Materialien und Methoden

Materialien

CUR wurde von Zhanyun Chemical Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. COS stammte von Shandong Weikang Biomedical Science and Technology Co., Ltd. PC wurde von Zhejiang Binmei Biotechnology Co., Ltd. geliefert. 3,3-Dithiodipropionsäure kam von Adamas Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). EDCI, DMAP, THF, Oxalylchlorid und Biotin wurden von Aladdin Chemistry Co., Ltd. bezogen. L-Glutathion (GSH) und Hoechst 33342 wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) gekauft. Dialysetuben (MWCO 300 Da) kamen von Beijing Biotopped Technology Co., Ltd. Formamid wurde von Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. hergestellt. Deionisiertes Wasser wurde im Labor selbst hergestellt.

Eine A549-Zelllinie (humane Lungenkarzinomzellen) (Bena Culture Collection, Peking, China) wurde zur Bewertung der Zytotoxizität des neuartigen Nanocarriers verwendet. A549-Zellen wurden in DMEM (Saiersi Biotechnology Co., Ltd., Shandong, Yantai, China) kultiviert. Fetales Rinderserum (FBS) stammte von Hyclone (Logan, UT, USA). Penicillin und Streptomycin wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen. MTT wurde ebenfalls von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) erworben.

Synthese von CUR-BCSC@PCs

Die synthetischen Wege zur Herstellung von CUR-BCSC@PCs sind in Abb. 2 dargestellt. Die detaillierten experimentellen Verfahren werden im Folgenden beschrieben.

Synthese von COS-S-S-CUR

3,3-Dithiodipropionsäure-funktionalisiertes COS wurde durch eine zweistufige Esterifizierung, katalysiert durch Säurechlorid, synthetisiert.

Schritt 1: 3,3-Dithiodipropionsäure (42,05 mg, 0,25 mmol) und trockenes THF (4 mL) wurden in einen braunen Rundkolben mit Rührer gegeben, um die Säure zu lösen. Anschließend wurde Oxalylchlorid (0,3 mmol) in THF verdünnt und in einen im Eisbad stehenden Kolben gegeben. Die Reaktion wurde bei 35 °C gehalten. Nach 3 Stunden Rühren wurde das unverreacte Oxalylchlorid durch Rotationsverdampfung entfernt. Produkt 1 wurde durch die obigen Schritte erhalten. CUR wurde in 3 mL THF mit 34 μL Triethylamin gelöst und tropfenweise in den Kolben mit Produkt 1 unter Eisbadbedingungen gegeben, dann 15 min gerührt. Daraufhin wurde das Gemisch 6 Stunden bei 50 °C unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Das erhaltene Produkt wurde rotativ destilliert, um Triethylamin und THF zu entfernen, und anschließend durch Säulenchromatographie gereinigt, um reines HOOC-S-S-CUR zu erhalten.

Schritt 2: Das reine HOOC-S-S-CUR wurde mit EDCI (1,2 Äq.) und DMAP (1,2 Äq.) in Formamid 2 Stunden aktiviert. Anschließend wurde in 4 mL Formamid gelöstes COS hinzugefügt und 12 Stunden bei 55 °C gerührt. Nach Reaktionsende wurde die Lösung mit einem Dialysebeutel (MWCO 300 Da) dialysiert und 12 Stunden gefriertrocknet.

Synthese von BCSC und Biotin-COS

Kurz gesagt: Biotin, EDCI und DMAP wurden in 3 mL Formamid gelöst und in einen braunen Rundkolben gegeben. Nach 2 Stunden Rühren bei 30 °C wurde in 3 mL Formamid gelöstes COS-S-S-CUR tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktion wurde 2 Tage bei 45 °C fortgesetzt. Die Endprodukte wurden in deionisiertem Wasser dialysiert (MWCO 300 Da), zentrifugiert und lyophilisiert, um redox-sensitives BCSC zu erhalten. Die Synthese von Biotin-COS erfolgte analog, um Biotin an die COS-Ketten zu binden.

Die ¹H-NMR-Spektren von COS-S-S-CUR, BCSC und Biotin-COS wurden mit einem Gemisch aus DMSO-D₆ und D₂O als Lösungsmittel gemessen.

Herstellung von CUR-beladenen BCSC-Mizellen (CUR-BCSCs)

CUR-BCSCs wurden durch Selbstassemblierung hergestellt. 10 mg BCSC wurden in 4 mL Formamid gelöst und mit 1 mL CUR-Lösung (1 mg/mL) in Formamid gemischt. Die Mischung wurde 24 Stunden in deionisiertem Wasser dialysiert (MWCO 300 Da), wobei das Wasser alle 2 Stunden gewechselt wurde. CUR-BCSCs wurden durch Millipore-Membranen (800 nm, 450 nm, 220 nm) filtriert.

Herstellung von CUR-BCSC@PCs

Die hergestellten CUR-BCSCs wurden mit einer wässrigen PC-Lösung (1,0 mg/mL) gemischt und 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde PC mittels 100 kDa Zentrifugalfilter entfernt und dreimal mit Wasser gewaschen. Das Endprodukt (CUR-BCSC@PC) wurde bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Untersuchung aufbewahrt.

Charakterisierung

Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde mit einem Partikelanalysator Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.) durchgeführt, um Partikelgröße, Zeta-Potenzial und Polydispersitätsindex (PI) zu bestimmen. Die Morphologie von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurde durch Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japan) untersucht.

Einkapselungseffizienz (EE) und Drug Loading Capacity (DL)

HPLC (Agilent 1260GB12C) wurde zur Bestimmung von EE und DL der Nanopartikel eingesetzt. Zunächst wurden 2 mL CUR-BCSCs oder CUR-BCSC@PCs mit 3 mL Acetonitril vermischt und durch Ultraschall emulgiert, dann auf 10 mL mit Acetonitril aufgefüllt. Vor der Messung wurde die Säulentemperatur der Phenomenex C18-Säule (250 mm × 4,6 mm, 5 μm) auf 25 °C eingestellt, die Fließrate der mobilen Phase auf 1,0 mL·min⁻¹. Das Verhältnis von 0,5 % Essigsäure zu Acetonitril betrug 40:60 (v/v). Bei einer Detektionswellenlänge von 425 nm wurden 20 μL Proben injiziert [30]. EE und DL wurden nach folgenden Formeln berechnet:

EE % = (Gewicht von Cur in den Nanopartikeln / Gewicht des zugeführten Cur) × 100 %

DL % = (Masse von Cur in den Nanopartikeln / Masse der Nanopartikel) × 100 %

In-vitro-Stabilitätstest

Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit GSH (0, 20 μM, 10 mM) wurde hergestellt und 4 Stunden mit CUR-BCSC@PCs bei 37 °C inkubiert, um Partikelgrößenänderungen bei unterschiedlichen Glutathionkonzentrationen zu beobachten. Zusätzlich wurde der hydrodynamische Durchmesser von CUR-BCSC@PCs in PBS-Lösung bei 37 °C zu verschiedenen Zeitpunkten (4, 8, 12, 24 h) mit dem Partikelanalysator Delsa Nano C gemessen.

In-vitro CUR-Freisetzung aus CUR-BCSC@PCs

Das Freisetzungsverhalten wurde mit der Dialysemethode untersucht. PBS-Lösungen mit Glutathion (GSH: 20 μmol/L, 1 mmol/L, 5 mmol/L, 10 mmol/L) wurden hergestellt, 0,5 % Tween 80 zugesetzt. 45 mL PBS-Puffer mit unterschiedlichen GSH-Konzentrationen wurden in 50 mL Zentrifugenröhrchen gegeben; ein Dialysebeutel mit 1 mL CUR-BCSC@PCs wurde in jedes Röhrchen gelegt und bei 37 °C geschüttelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0,2, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72 h) wurden 2 mL Freisetzungsmedium entnommen und durch frisches Medium gleicher Art ersetzt, um das Volumen konstant zu halten. HPLC bestimmte die CUR-Konzentration im gesammelten Medium.

Zellkultur

Humane Lungenkarzinom-A549-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in 5 % CO₂-Atmosphäre kultiviert [31, 32].

In-vitro Zellproliferationshemmung

Die zytotoxische Wirkung von freiem CUR, BCSC-Mizellen (BCSCs), CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs auf A549-Zellen wurde mittels Standard-MTT-Assay bewertet [33]. A549-Zellen wurden in 96-Well-Platten (5000 Zellen/Well) 24 Stunden anhaften gelassen. Das Medium wurde entfernt, 100 μL frisches Medium mit freiem CUR, BCSCs, CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (0,1; 1; 5; 10; 15; 20 μg/mL bezogen auf CUR) wurde zugegeben und 24 Stunden inkubiert. Unbehandelte Wells dienten als Blankokontrolle. Der MTT-Assay erfolgte durch Entfernen des Mediums und Zugabe von 20 μL MTT-Lösung (5 mg/mL). Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 °C in 5 % CO₂ wurde die MTT-Lösung durch 150 μL DMSO ersetzt, um das violette MTT-Formazan zu lösen. Die Absorption jedes Wells wurde bei 570 nm mit einem Mikroplattenleser (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) gemessen.

In-vitro Zellaufnahme und Lokalisation

Die zelluläre Aufnahme von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop (FM, Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokio, Japan) untersucht. A549-Zellen wurden in 24-Well-Platten (4 × 10⁴ Zellen/Well) ausgesät und mit CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (CUR-Konzentration: 20 μg/mL) bei 37 °C in feuchter 5 % CO₂-Atmosphäre für 1, 2 und 4 Stunden koinkubiert. Die Zellen wurden nach Entfernen der medienhaltigen Medikamente dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde PBS mit 4 % Paraformaldehyd 20 Minuten hinzugefügt und dreimal mit PBS gewaschen. Zellkerne wurden 15 Minuten mit Hoechst 33342 gefärbt und mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt und als Mittelwert ± SD angegeben. Statistische Tests erfolgten mit dem Student'schen t-Test. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant, P < 0,01 als hochsignifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von COS, COS-S-S-CUR, Biotin-COS und BCSC

Die Hauptsignale von CUR und CH₂-S-S-CH₂ erschienen im ¹H-NMR-Spektrum von COS-S-S-CUR, was die erfolgreiche Konjugation von CUR an die COS-Ketten belegt. Im Vergleich zu den Peaks von COS in Abb. 3(A) zeigten sich die charakteristischen Signale von CUR in Abb. 3(B) im Bereich 6,7–7,5 ppm und bei 3,75 ppm (−OCH₃), während die Resonanz von CH₂-S-S-CH₂ bei 2,5 ppm unverändert blieb. In Abb. 3(C, a, b) wiesen die Biotin-Peaks im ¹H-NMR-Spektrum von Biotin-COS 0,99 ppm (−CH₂–) und 3,39 ppm (−CH–S–) auf. Das ¹H-NMR-Spektrum von BCSC ist in Abb. 3(D) dargestellt. Die Resonanzen von CUR (Abb. 3(D), a, e) erschienen an den entsprechenden Positionen, und der charakteristische Peak von CH₂-S-S-CH₂ (Abb. 3(D), b) wurde erneut bei 2,5 ppm beobachtet. Zusätzlich bestätigten Signale bei 0,09 ppm und 3,39 ppm (Abb. 3(D), c, d) das Vorhandensein von Biotin, das an die COS-S-S-CUR-Ketten gebunden ist. Die charakteristischen Resonanzen von CUR, CH₂-S-S-CH₂ und Biotin in Abb. 3(D) stimmen mit denen in Abb. 3(B) und 3(C) überein, was die erfolgreiche Synthese des amphiphilen Materials BCSC belegt.

Charakterisierung von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs

Die Morphologien von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs wurden durch TEM untersucht (Abb. 4(A, B)). CUR-BCSCs zeigten unter dem Elektronenmikroskop eine glatte kugelförmige Gestalt (Abb. 4(A), a), während CUR-BCSC@PCs eine annähernd kugelförmige Form mit einer blütenartigen Schicht um die Partikel aufwiesen (Abb. 4(B), b). Dies deutet darauf hin, dass PC eine Proteinkorona-Struktur bildet, indem es die Oberflächen der CUR-BCSCs überzieht. Ein deutlicher Tyndall-Effekt von CUR-BCSC@PCs war aufgrund der zahlreichen Nanopartikel sichtbar (Abb. 4(C)). Partikelgröße, PI, Zeta-Potenzial, DL (%), EE (%) von CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs sind in Tabelle 1 zusammengefasst. In Abb. 5 betrug die durchschnittliche Größe von CUR-BCSCs 97,8 ± 4,2 nm und von CUR-BCSC@PCs 160,3 ± 9,0 nm. Die PI-Werte lagen bei 0,181 ± 0,014 bzw. 0,114 ± 0,024 (beide < 0,2), was auf eine gleichmäßige Größenverteilung hinweist. Die Zeta-Potenziale betrugen 21,57 ± 0,53 mV (CUR-BCSCs) und 12,90 ± 1,93 mV (CUR-BCSC@PCs). Durch die elektronegative PC-Beschichtung war das Zeta-Potenzial von CUR-BCSCs höher als das von CUR-BCSC@PCs. Die EE von CUR-BCSC@PCs war höher als die von CUR-BCSCs.

Stabilität von CUR-BCSC@PCs

Wie in Abb. 6a gezeigt, wurde die Disulfidbindung aufgrund ihrer reduktiven Natur in PBS mit 10 mM GSH gespalten, wodurch CUR-BCSC@PCs in Polymerfragmente zerfielen, die agglomerierten und die Partikelgröße erhöhten. In PBS mit 20 μM GSH waren die Partikelgrößenänderungen gering, ähnlich wie in PBS ohne GSH. Abb. 6b zeigt die Partikelgröße zu verschiedenen Zeitpunkten zur Stabilitätsuntersuchung in PBS; die Partikelgröße von CUR-BCSC@PCs nahm langsam über die Zeit zu [14].

Redox-Responsivität von CUR-BCSC@PCs

Es ist bekannt, dass Disulfidbindungen in der reduktiven Tumormikroumgebung instabil sind. Forscher nutzen Disulfidbindungen, um hydrophile Polymere und hydrophobe Medikamente zu verbinden und amphiphile Fragmente zu bilden, die sich in Wasser zu Nano-Mizellen selbstassemblieren. Aufgrund der Unterschiede zwischen physiologischer und Tumorumgebung brechen Disulfidbindungen am Tumorort auf und setzen das Medikament frei [34]. In dieser Studie wurde die in-vitro-Freisetzung durchgeführt, um zu prüfen, ob CUR-BCSC@PCs die erwartete Freisetzungseigenschaft zeigen. Die Redox-Responsivität der Disulfidbindungen in CUR-BCSC@PCs wurde durch GSH-Aktivierung untersucht. Wie in Abb. 7 dargestellt, war die CUR-Freisetzung aus CUR-BCSC@PCs im Medium mit 20 μM GSH bei pH 7,4 (simuliert extrazelluläre Umgebung) extrem langsam im Vergleich zu 10 mM GSH bei pH 7,4. Im Vergleich zum 20 μM GSH-Medium zeigten 1, 5 und 10 mM GSH signifikante Unterschiede im Freisetzungsverhalten. Mit steigender GSH-Konzentration wurde die CUR-Freisetzung gefördert, was auf eine GSH-konzentrationsabhängige Medikamentenfreisetzung hinweist.

In-vitro Zytotoxizität

Der MTT-Assay diente zur Untersuchung der zytotoxischen Wirkung von freiem CUR, BCSCs, CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs auf A549-Zelllinien [35]. Die Zellüberlebensdaten sind in Abb. 8 zusammengefasst. Alle CUR-Präparate zeigten dosisabhängige Hemmung der Zellproliferation. Wie in Abb. 8 zu sehen, hatte freies CUR nach 24-stündiger Inkubation eine etwas geringere hemmende Wirkung auf die Proliferation aller A549-Zellen im Vergleich zu CUR-BCSC@PCs und CUR-BCSCs. Für A549-Zellen war die anti-kanzerogene Aktivität von CUR-BCSC@PCs besser als die von BCSCs und CUR-BCSCs, was wahrscheinlich auf die exzellente zelluläre Aufnahme zurückzuführen ist. Zudem zeigte CUR-BCSC@PCs eine höhere Zytotoxizität als CUR-BCSCs, was darauf hindeutet, dass PC eine potenziell hemmende Wirkung auf die Proliferation von A549-Zellen besitzt.

In-vitro Zellaufnahmestudie

Wie in Abb. 8 gezeigt, wurden Fluoreszenzsignale von CUR in A549-Zellen, die mit CUR-BCSCs und CUR-BCSC@PCs (CUR: 20 μg/mL) bei 1, 2 und 4 Stunden inkubiert wurden, mit dem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet. CUR dient als grüner Fluoreszenzsonden und Antikrebsmedikament, häufig als hydrophobes Modellmedikament zur Entwicklung effizienter Drug-Delivery-Systeme. Wie in Abb. 9a dargestellt, wurden sowohl CUR-BCSCs als auch CUR-BCSC@PCs in A549-Zelllinien aufgenommen, wobei die Aufnahmerate zeitabhängig war. Aufgrund der überexprimierten Biotin-Rezeptoren auf Krebszelloberflächen wiesen biotinbeladene Nano-Mizellen eine Affinität zu A549-Zellen auf. Die Fluoreszenzsignale von CUR-BCSC@PCs waren nach 4 Stunden hoch, was auf eine hohe zelluläre Aufnahmerate hindeutet. Die Signale waren nach 4 Stunden höher als nach 1 oder 2 Stunden, was die zeitabhängige Aufnahme belegt.

Die Zellkerne der A549-Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt. Wie in Abb. 9b gezeigt, waren grüne Fluoreszenzsignale im Zytoplasma der 1-Stunden-Gruppe von CUR-BCSC@PCs sichtbar, und die Fluoreszenz trat allmählich in den Zellkernen der 4-Stunden-Gruppe auf, was eine zelluläre Aufnahme über Caveolae-vermittelte Endozytose demonstriert.

Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurde ein Typ protein-funktionalisierter COS-Nanopartikel durch Kondensationsreaktionen, Selbstassemblierung und Wechselwirkung zwischen PC und CUR-BCSCs hergestellt. Nach vorläufigen Untersuchungen wurden die amphiphilen Trägermaterialien (BCSCs) mit Redox-Sensitivität erfolgreich synthetisiert und mittels ¹H-NMR verifiziert. Die Oberflächen von CUR-BCSCs wurden mit einer Phycocyanin-Korona modifiziert, die die zelluläre Aufnahmeeffizienz verbessert und CUR-BCSC@PCs vor Plasmaproteinadsorption schützt. Die zelluläre Zytotoxizitäts- und Aufnahmeanalyse zeigte, dass CUR-BCSC@PCs CUR in A549-Zellen transportieren können und eine hervorragende anti-proliferative Eigenschaft besitzen. In Anbetracht des PDT-Effekts von PC und CUR werden wir in der nächsten Forschungsphase die photodynamischen Eigenschaften und die anti-kanzerogene Aktivität von CUR-BCSC@PCs unter Phototherapie bewerten. Diese Studie ebnet den Weg für die Verbesserung der Wirksamkeit von Antikrebsmedikamenten und die Einführung einer funktionalen Proteinkorona. Zusammenfassend bietet das nanomedizinische Träger-Biomaterial CUR-BCSC@PCs auf COS-Basis mit Mehrfachfunktionen eine neue Strategie für die Tumorbehandlung und zeigt großes Anwendungspotenzial.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in diesem Manuskript gezogenen Schlussfolgerungen basieren auf den Daten, die alle in diesem Artikel präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

BCSC:

Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin

COS:

Chitosan-Oligosaccharid

COS-S-S-CUR:

Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin

CUR:

Curcumin

CUR-BCSC@PCs:

Phycocyanin-funktionalisierte und Curcumin-beladene Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin-Mizellen

CUR-BCSCs:

Curcumin-beladene Biotin-Chitosan-Oligosaccharid-Dithiodipropionsäure-Curcumin-Mizellen

EPR:

Enhanced Permeability and Retention (erhöhte Permeabilität und Retention)

PC:

Phycocyanin

PDT:

Photodynamische Therapie