Vorläufige Studien zu mit Fe dotierten biologisch abbaubaren Zinkoxid-Nanopartikeln als potenzielle Form der Eisenabgabe an den lebenden Organismus

Einführung

Eisen ist einer der wichtigsten Bausteine ​​für lebende Organismen auf der Erde, einschließlich der menschlichen Bevölkerung. Die Bedeutung dieses Elements hängt mit einer wesentlichen Rolle von Eisen in vielen Strukturen und Prozessen im Körper zusammen, z.B. Transport von Sauerstoff um das gesamte Körpergewebe und -zellen (Teil von Hämoglobin und Myoglobin), Produktion von Energie (Bestandteil der mitochondrialen Atmungskettenproteine ​​im Inneren) und vieles mehr [1, 2]. Somit ist Eisen an entscheidenden Lebensprozessen der Zellen und des gesamten Organismus beteiligt und sein Mangel kann zu erheblichen Funktionsstörungen des lebenden Körpers führen.

Wie weltweite Berichte zeigen, wird der Eisenmangel zu einem ernsthaften Problem der öffentlichen Gesundheit der menschlichen Bevölkerung. Nach Angaben der WHO waren in den Jahren 1993–2005 fast 30 % der Weltbevölkerung von Anämie betroffen. Die Prävalenz der Anämie ist bei Kleinkindern und Schwangeren noch viel höher [3]. Die Bedeutung der Eisenergänzung in der Schwangerschaft hängt damit zusammen, dass Eisenmangel ein Risikofaktor für Frühgeburten, ein niedriges Geburtsgewicht von Neugeborenen und ihren allgemeinen schlechteren Gesundheitszustand ist [4]. Bei Säuglingen und Kleinkindern im Vorschulalter wird der Risikofaktor Eisenmangel durch das schnelle Wachstum des gesamten Körpers und den anschließenden Verbrauch der Eisenspeicher verursacht; daher wird eine Eisenergänzung auch für Kinder zwischen 0 und 5  Jahren empfohlen [5]. Interessanterweise gibt es wissenschaftliche Berichte, die auf die Korrelation des richtigen Eisenspiegels bei Kindern und ihrer emotionalen und neuropsychologischen Entwicklung hinweisen [6]. Darüber hinaus ist Eisenmangel auch bei anderen Säugetierarten eine schwerwiegende Ernährungsstörung, insbesondere bei Saugferkeln, bei denen eine begrenzte intrauterine Zufuhr dieses Elements mit einem niedrigen Eisengehalt in der Sauenmilch gekoppelt ist [7, 8]. Auch ein schnelles Wachstum der Ferkel erschöpft schnell die Reste der Eisenspeicher, da neugeborene Ferkel innerhalb weniger Tage ihr Körpergewicht verdoppeln und somit die Anzahl der roten Blutkörperchen und das allgemeine Blutvolumen erhöhen. Daher wurde eine effektivere und sicherere Eisensupplementierungsstrategie für Mensch und Tier heutzutage zu einer der wichtigsten Herausforderungen bei der Prävention und Therapie von Ernährungsmängeln.

Es gibt drei Hauptwege, um dem lebenden Organismus zusätzliches Eisen zuzuführen:intravenös, intramuskulär und oral. Jeder von ihnen zeigt sowohl Vor- als auch Nachteile der Methode. Die orale Verabreichung scheint für den Körper einfach und natürlicher zu sein, da sie physiologische Wege der Eisenaufnahme und des Transportsystems umfasst. Außerdem bewahrt diese Methode ein natürliches System, das die Menge an zirkulierendem Eisen im Körper auf der Grundlage von Hepcidin kontrolliert [9]. Die orale Supplementation wird jedoch oft von einer schlechten Absorption und einer geringen letztendlichen Wirksamkeit geplagt. Wissenschaftliche Studien berichteten auch, dass die standardmäßige, orale Nahrungsergänzungsstrategie mit löslichem Eisen einen starken Einfluss auf die Zusammensetzung und metabolische Aktivität des tierischen Darmmikrobioms hat [10]. Andererseits werden intravenöse oder intramuskuläre Wege der Eisenabgabe an den Organismus durch das Risiko toxischer Nebenwirkungen behindert [11]. Darüber hinaus ist in der industriellen Schweinehaltung die Standardmethode der Eisenergänzung, die auf der individuellen intramuskulären Verabreichung einer Einzeldosis von Eisen-Dextran basiert, für Tiere stressig und für Züchter lästig. Außerdem kann eine unsachgemäß durchgeführte Injektion bei Tieren zu Entzündungen und anderen Komplikationen führen sowie zur Verbreitung verschiedener Krankheiten in der Herde beitragen, wenn die Sterilitätsbedingungen nicht eingehalten werden.

Die oben genannten toxischen Nebenwirkungen der exogenen Eisenabgabe an den lebenden Organismus sind mit dem Vorkommen von freiem und ungebundenem Eisenelement im Körper verbunden, das als Übergangsmetall (durch Valenzänderung) zur Bildung schädlicher freier Radikale (nämlich reaktiver Sauerstoff .) führen kann Spezies – ROS) durch Fenton-Reaktion [12]. Wissenschaftliche Berichte weisen auf das Risiko eines erhöhten Gehalts an freien Radikalen im Organismus als Faktor hin, der zu verschiedenen Erkrankungen beiträgt, darunter:bakterielle Infektionen, Neoplasien oder Lebererkrankungen [13]. Die natürliche, physiologische Strategie zur Verhinderung der Bildung von ROS durch freies Eisen basiert auf der Bindung von Eisenelementen mit bestimmten Proteinen bei jedem Schritt seiner Absorptions- und Transportwege im Körper. Im Falle einer oralen Eisenüberladung und ihrer intravenösen/intramuskulären Verabreichung sind die physiologischen Bahnen der Eisenzirkulation im Allgemeinen überfordert, was zu einem schnellen Anstieg des ROS führt [14].

Eisenbasierte Nanopartikel (Fe-basierte NPs) wurden weithin als vielversprechende Werkzeuge für biomedizinische Zwecke untersucht. Die umfangreichste Verwendung dieser Nanostrukturen hängt mit ihren magnetischen Eigenschaften zusammen; daher wurden sie meistens als Kontrastmittel für klinische Diagnoseverfahren getestet, die auf die Tumorbildgebung oder Anreicherung in bestimmten Geweben abzielen [15]. In jüngster Zeit wurden auch Nanostrukturen als neuartige, effektivere Form der Abgabe bioaktiver Substanzen an den Organismus untersucht. NP-Träger können gegenüber Substanzen in Bulk-Form eine deutlich erhöhte Bioverfügbarkeit für den lebenden Organismus aufweisen, was meist mit ihrer geringeren Größe zusammenhängt [16, 17]. In einer der Studien wurde die Wirksamkeit von eisenhaltigen NPs mit Eisensulfat (Standardergänzung zur Behandlung von Anämie) bei anämischen Ratten verglichen. Basierend auf den Blutanalysen zeigten die erhaltenen Ergebnisse eine erhöhte Eisenbioverfügbarkeit nach oraler Einzeldosis von NPs mit Eisen bei anämischen Tieren. Bei Mehrfachdosen von Nanopartikeln und Eisen(II)-sulfat waren die erhaltenen Ergebnisse ähnlich [18]. Eine andere Studie beschrieb erhaltene Ergebnisse von Nanomaterialien auf Fe-Basis als alternative Eisenlieferanten beim Menschen und einem Nagetiermodell. Die Autoren hoben insbesondere die überlegene Sicherheit von NanoFe im Vergleich zu löslichen Formen von Eisen hervor, was zu einer fehlenden Eisenakkumulation in der Darmschleimhaut und zur Förderung einer nützlichen Mikrobiota führte [19]. Ähnlich vielversprechende Ergebnisse wurden in der Studie an anämischen Ratten erzielt, die mit NPs auf Fe-Basis behandelt wurden, die mit Vitamin C bedeckt waren, wodurch der Standardweg der Fe-Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt vermieden werden konnte. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass sich die getesteten Tiere von der anämischen Erkrankung erholten und ihre Blutparameter innerhalb kurzer Zeit verbesserten, verglichen mit der Standardmethode der Eisenmangeltherapie [20].

Material und Methoden

Synthese von Nanopartikeln

Mit Eisen dotierte Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO:Fe-NPs) wurden mittels Mikrowellen-Hydrothermaltechnik synthetisiert. Das Verfahren ist gut etabliert, relativ kostengünstig, biofreundlich und industriell skalierbar und kann verschiedene Fremdionen als funktionelle Dotierstoffe [21,22,23,24,25] in eine Vielzahl von Oxiden einführen [26,27,28]. Die Eisenkonzentration in den vorliegenden Nanopartikeln wurde auf 5 molar eingestellt. Die Synthese wurde ausgehend von Nitraten (V) durchgeführt:Zn(NO₃ )₂ ·6H₂ O (99%, Sigma–Aldrich) und Fe(NO₃ )₃ ·9H₂ O (96%, Carl Roth). Wir haben verschiedene Lieferanten getestet und diejenigen ausgewählt, die das einheitlichste Produkt anbieten, das keine messbaren Mengen an unlöslichen Resten enthält. Die Verbindungen wurden in destilliertem Wasser gelöst:17,63 g Zinknitrat (V) und 1,25 g Eisen(III)-nitrat (V). Anschließend wurde die klare Lösung mit 25 % wässriger Ammoniaklösung (Carl Roth) auf pH 8 alkalisch gestellt. Der entstandene rote Rückstand wurde mit einem Büchner-Trichter mit ~ 1 l destilliertem Wasser gewaschen und abgesaugt. Der Niederschlag wurde in ein 100-ml-Teflongefäß gegeben, mit Wasser auf 80 % des Volumens gefüllt und dann in der Ertec Magnum II-Reaktorkammer verschlossen. Der hydrothermale Mikrowellenprozess wurde bei 4 MPa in 20 Minuten durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das blassrote Produkt gesammelt und über Nacht bei 60 °C getrocknet.

Charakterisierung von Nanopartikeln

Die Charakterisierung des Produkts wurde unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (REM), Photolumineszenz (PL) und Kathodolumineszenz (CL) Spektroskopie und energiedispersiver Elementaranalyse (EDX) durchgeführt. SEM-Messungen wurden mit einem hochauflösenden (1 nm) Hitachi SU-70-Mikroskop durchgeführt, das mit einem charakteristischen Strahlungsdetektor und einem Kathodolumineszenzsystem GATAN Mono CL3 im Sekundärelektronen- (SE) und Transmissionsmodus (TE) ausgestattet war. Die Photolumineszenz-Emissions- und Anregungsspektren wurden mit einem Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3 Spektrofluorimeter, ausgestattet mit einer Xenonlampe als Anregungsquelle und Hamamatsu R928P Photomultiplier, aufgezeichnet. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotential wurden mit dem DelsaMax Pro Partikelcharakterisierungssystem gemessen. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) wurde mit dem NETZSCH STA 449 F1 Jupiter Thermogravimeter unter Argonströmung durchgeführt. SEM-Messungen wurden nach der Abscheidung der Nanopartikel auf dem mit Agar-Polycarbonat beschichteten 400-Kupfer-Netz durchgeführt. Die Probe wurde in destilliertem Wasser unter Verwendung des Ultraschallprozessors Sonics VCX500 suspendiert, und dann wurde ein Tropfen der Suspension auf das Netz gegeben und dann getrocknet. Probe wurde nach 2-stündiger Sedimentation schwerer Partikel hergestellt.

In-vitro-Modell

Für die aktuelle Studie wurde die Zelllinie Caco-2 (Kaukasische Kolon-Adenokarzinom-Zellen) als Modell für Epithelzellen des Magen-Darm-Trakts verwendet. Die Zelllinie wurde von The European Collection of Authenticated Cell Cultures – ECACC (Sigma-Aldrich, Kat.-Nr. 86010202) erhalten. Zellen wurden mit 0,5 × 10 ⁶ . ausgesät Zellen/ml auf 6-Well- oder 96-Well-Platten und gehalten in Dulbecco's Modification of Eagle's Medium – DMEM (Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum – FBS (Gibco), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren – NEAA (Gibco ), 1 % Penicillin-Streptomycin-Neomycin-PSN (Gibco) und 0,2 % Natriumbicarbonat (Gibco) bei 37 °C und 5 % CO₂ . Wenn eine Konfluenz von 95–100 % beobachtet wurde, wurde das Zellkulturmedium entfernt und eine Suspension von ZnO:Fe-NPs in frischem Wachstumsmedium zugegeben. Die Zellen wurden mit vier verschiedenen Konzentrationen von ZnO:Fe-NPs (1,0; 0,1; 0,01; und 0,001 mg ZnO:Fe-NPs/ml) 24 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ . inkubiert .

Zelllebensfähigkeitsanalysen

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde für Caco-2 unter Verwendung von zwei Methoden bewertet:XTT-Test und Trypanblau-Färbung. Alle für den XTT-Assay benötigten Reagenzien wurden aus dem kommerziellen Kit (Cell Proliferation Kit II, Roche) bereitgestellt. Nach der Inkubation von Zellen, die auf 96-Well-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen von ZnO:Fe-NPs gewachsen waren, wurden die Zellen mit 50 µl XTT-Markierungsmischung für 4 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂ . inkubiert . Anschließend wurde die Formazankonzentration mit einer spektrophotometrischen Methode bestimmt. Die Absorption wurde bei 470/650 nm gemessen und die Ergebnisse wurden mit der Anzahl lebensfähiger Zellen korreliert. Im folgenden Experiment wurde das höchste Absorptionsergebnis als 100% Lebensfähigkeit der Zellen angenommen. Die endgültigen Ergebnisse wurden anhand von vier separaten Versuchswiederholungen berechnet (n =4)).

Um eine Trypanblau-Färbung durchzuführen, wurden die auf 6-Well-Platten gewachsenen Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an ZnO:Fe-NPs inkubiert, die Zellen gesammelt (0,05% Tripsin und 0,2% EDTA für 10 min), zentrifugiert und das Pellet erneut in 1 &mgr;ml Wachstumsmedium suspendiert. Einhundert Mikroliter sterile 0,4% Trypanblau-Lösung wurden mit 100 µl Zellsuspension vermischt. Zehn Mikroliter Probe wurden auf den Zählobjektträger geladen und unter Verwendung der JuLi Br Couting Software (NanoEnTek) analysiert, um die Anzahl lebensfähiger Zellen zu bestimmen. Die endgültigen Ergebnisse wurden auf der Grundlage von drei separaten Versuchswiederholungen berechnet (n =3)).

Tiermodell

Für diese vorläufige Studie wurden erwachsene, männliche Balb-c-Mäuse (n =6) wurden einzeln unter normalen und kontrollierten Lebensbedingungen (12/12 h Hell-Dunkel-Periode, 25 °C, Luftfeuchtigkeit 30 %) mit Standardfutter und Wasser (ad libitum bereitgestellt) gehalten. Alle Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission akzeptiert, Vereinbarungs-Nr. WAW2/59/2017. Nach 7-tägiger Akklimatisierung wurde Tieren der Versuchsgruppe (n =4) . Mäuse aus der Kontrollgruppe erhielten 0,3 ml Trinkwasser von IG (n =2). Während des Experiments konnten wir weder Verhaltensänderungen bei den getesteten Tieren noch Gewebeanomalien feststellen. Nach 24 h wurden Mäuse aus der Versuchs- und Kontrollgruppe in CO₂ . getötet -O₂ Kammer (CO2 Box, Bioscape, Merazet) mit anschließender Gewebeentnahme. Die Hälfte der frisch gesammelten Proben wurde für die Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) bei – 20 °C eingefroren. Die zweite Hälfte der Gewebe wurde in 4 % gepuffertem Formalin fixiert und in 70 % Ethanol (nach 24 h) überführt. Anschließend wurden die Proben in steigenden Ethanolkonzentrationen entwässert, in Paraffin eingebettet (Leica TP1020, Leica EG1150) und 6 µm dünne (bzw. 4 µm dünn für histopathologische Untersuchungen) Objektträger mit Mikrotom (Leica RM2255) präpariert.

Eisenakkumulation, bewertet durch Perls Färbung

Mikroskopie-Objektträger von Milz, Leber und Gehirn wurden mit der Perl-Methode (Preußisch Blau) auf Eisen gefärbt. Die Proben wurden entparaffiniert und zu destilliertem Wasser rehydratisiert, dann in eine Arbeitslösung mit gleichen Teilen 5% Kaliumferricyanid (Sigma-Aldrich) und 5% Salzsäure (Sigma-Aldrich) gegeben und 30 min gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte in Wasser gespült und mit Nuklear-Echtrot (Sigma-Aldrich) für 5 min gegengefärbt, in Wasser gespült und mit Permount (Fisher Scientific) unter die Deckgläser montiert. Bilder von gefärbten Proben wurden mit dem Mikroskop Olympus BX60 und der Bilderfassungssoftware Cell^P aufgenommen. Von jeder getesteten Probe wurden 16 zufällig ausgewählte Bilder für weitere Untersuchungen mit MicroImage v.4.0 (Olympus) gemäß dem In-Home-Bildanalyseprotokoll ausgewählt [29]. Bei Milzuntersuchungen wurde bei den Analysen nur die rote Pulpa innerhalb des Gewebes berücksichtigt. Der Eisengehalt wurde als Verhältnis der Fläche und Intensität der eisenpositiven Färbungen (blaue Farbe) zur Fläche der Zellkerne innerhalb eines Bildes berechnet.

Eisenkonzentration in getesteten Geweben gemessen mit Atomabsorptionsspektrometrie

Zuvor entnommene, bei -20 °C gelagerte und anschließend aufgetaute Gewebeproben wurden für die weitere quantitative Bestimmung der Eisenkonzentration mit der Methode der Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) gemäß dem zuvor ausführlich beschriebenen Protokoll vorbereitet [24]. Kurz gesagt, die Gewebe wurden gewogen und für> 16 h in der Lösung gehalten, die 5 ml 65 % Salpetersäure und 1 ml 30 % Wasserstoffperoxid (Merck) enthielt. Anschließend wurden die Proben im Mikrowellensystem Ethos 900 (Milestone, USA) zu einer flüssigen Lösung mineralisiert und mit AAS (Perkin-Elmer) auf Eisengehalt bewertet.

Statistische Analyse

Die in der Studie erhaltenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Für die statistische Auswertung der Eisenakkumulation, die mit der Perl-Färbung erhalten wurde, wurde für alle Gruppen eine Einweg-ANOVA mit dem Tukey-Kramer-Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test durchgeführt. Zur Bewertung eines signifikanten Unterschieds zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen aus AAS-Analysen wurde ein ungepaartes t Test verwendet wurde. Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Versuchsgruppen in In-vitro-Experimenten wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit Dunnett-Mehrfachvergleichstest bewertet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad InStat 3.10 berechnet. Bei allen Tests wurden die erhaltenen Ergebnisse mit P . als statistisch signifikant betrachtet ≤ 0,05 und P ≤ 0,01 und P ≤ 0,001 als hoch und extrem signifikant.

Ergebnisse

Charakterisierung von Nanopartikeln

Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Bilder von ZnO:Fe-Nanokristallen, wie sie im Mikrowellen-Hydrothermalprozess kristallisiert wurden, sind in Abb. 1 gezeigt. Das nach der Synthese gelagerte trockene Pulver wurde mit einem Ultraschallbad in Wasser dispergiert und dann auf dem Kupfer 400 mesh abgeschieden. Die aus der Ultraschallbehandlung resultierende Suspension wurde 2 h zur Agglomeration und Sedimentation der großen Körner belassen. In der Probe sieht man gewöhnlich ZnO-Kristalle in Form von länglichen hexagonalen Prismen. Kristalle sind in Richtung des c-Ebenen-Wachstums verlängert – [001]. Der Schnittpunkt der Prismen ist auf dem Bild deutlich zu sehen:Sechsecke sind 50–100 nm groß. Grundsätzlich sind Nanopartikel agglomeriert und bilden größere Strukturen. In Fig. 1b ist eine solche Struktur von stark agglomerierten und gruppierten ZnO:Fe-Kristallen gezeigt. Die Probe besteht auch aus ungleichmäßigen Körnern, deren Größenverteilung zwischen Hunderten von Nanometern und Mikrometern liegt. Es gibt keinen klaren Hinweis auf die Existenz einer anderen als der ZnO-Phase, was auf das Fehlen einer eisenbasierten Phasenkristallisation (z. B. Eisenoxid) hindeutet [30].

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von ZnO:Fe-NPs, die nach Sedimentation großer Aggregate auf Kupfernetzen abgeschieden wurden. Vergrößerung 100 kx (a ) und 20 kx (b ). Eine Suspension mit 1 mg ZnO-Nanopartikeln pro Milliliter Wasser wurde tropfenweise auf das mit Polycarbonat beschichtete Kupfernetz gegeben, um hochauflösende Rastermikroskopie-Beobachtungen zu ermöglichen

Thermogravimetrische Analyse (TGA) und Differentialscanningkalorimetrie (DSC) wurden unter Argonstrom von Raumtemperatur bis 800 °C durchgeführt und die erhaltenen Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Der erste Massenverlust fand bis 200 °C statt und es verursachte eine Abnahme der Probenmasse um 4,78% bezogen auf ihre ursprüngliche Masse. Der zweite Verlust wurde zwischen 200 und 400°C registriert und sein Wert beträgt etwa 7,36 %. Bis 800°C gab es keine weiteren Massenabnahmen. Der erste war mit der Verdunstung von oberflächenadsorbierten Wassermolekülen verbunden und der zweite wurde wahrscheinlich durch eine Reduktion von Hydroxylgruppen verursacht. Die DSC-Kurve zeigt einen endothermen Peak bei 118,3 °C (− 0,6175 µmW/mg, Wasserverdampfung) und einen exothermen Peak bei 283,1 °C (0,4356 µmW/mg, Zersetzung von Hydroxylgruppen). Ein kleiner Effekt im Zusammenhang mit der Zersetzung deutete darauf hin, dass eine fast vollständige Kristallisation von ZnO:Fe-Nanopartikeln im Mikrowellen-Hydrothermalprozess auftrat.

TGA/DSC von in Argon erhitzten ZnO:Fe-NPs

Abbildung 3 zeigt Photolumineszenzspektren von ZnO:Fe-NPs bei Raumtemperatur. Das Emissionsspektrum (Abb. 3a) besteht aus zwei Merkmalen:Schmaler Near-Band-Edge-(NBE)-Lumineszenz geringer Intensität und sehr intensiver Deep-Level-Emissions(DLE)-Lumineszenz. Der erste erreicht seinen Höhepunkt bei ~ 380 nm, der zweite bei 600 nm. Die Dominanz der DLE-Intensität im Spektrum deutet darauf hin, dass die erhaltenen Nanokristalle auf kristallographischer Ebene stark defekt waren [31,32,33]. Das Anregungsspektrum (Abb. 3b) zeigt den Mechanismus der Emission aus tiefen Niveaus in der Bandlücke von ZnO:Fe.

Photolumineszenz (PL)-Emission (a , λ_exc =260 nm) und Anregung (b , λ_em =595 nm) Spektren von ZnO:Fe-NPs. Die Proben wurden lose in die Aluminiummatrix gegossen und dann neu ausbalanciert, um PL-Messungen zu ermöglichen. Zweite und höhere Ordnungen der Anregungswellenlänge wurden mit einem Spektralbandpassfilter gefiltert

Das Kathodolumineszenzspektrum von ZnO:Fe-NPs ist in Abb. 4 gezeigt; Das DLE/NBE-Intensitätsverhältnis beträgt ≈ 25. Die NBE-Bandspitzen liegen bei ca. 380 nm, DLE-Band enthält vier Komponenten mit einem Spitzenwert von ~570, 625, 653 nm und einer sehr schwachen bei 770 nm. Nach McCluskey und Jokela [34] steht die 570-nm-Bande in Zusammenhang mit Sauerstoffleerstellen, während andere Zinkleerstellen im Wurtzit-Gitter zugeordnet wurden [35].

Kathodolumineszenz(CL)-Spektrum von ZnO:Fe-NPs. Trockenes Nanopulver wurde pelletisiert, um ein CL-Spektrum zu erhalten, das aus einem großen Volumen der Probe stammte. Die gezeigten Banden veranschaulichen Quantität und Qualität von kristallographischen Defekten, die in Zinkoxid-Nanokristallen vorhanden sind

Die Eisenmenge in der Probe wurde unter Verwendung von zwei Techniken bestimmt:Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX). Im Fall von AAS wurde die ähnlich hergestellte Suspension wie beim Nagetierexperiment analysiert, um 3,98 Atom-% Fe im ZnO:Fe anzuzeigen. Durch das EDX-Verfahren wurde trockenes Pulver im Kupfernetz analysiert, um eine Eisenkonzentration von 4,5% zu finden. in Bezug auf die Zinkionen.

Die Suspensionseigenschaften wurden mit DLS- und TEM-Methoden gemessen, wobei die Verteilung der Nanopartikeldurchmesser in Abb. 5 dargestellt ist. Die Verteilung ist bimodal:Für eine Population lag der häufigste Durchmesser zwischen 20 und 100 nm (TEM) sowie zwischen 50 und 200 nm (DLS). Die zweite Population enthält eine geringere Menge an größeren Objekten von 100–500 nm (TEM) und ca. 150–500 nm (DLS). Der bimodale Charakter von Nanopartikeln wird durch beide gezeigten Methoden deutlich beobachtet. Eine hohe Größenstreuung in der größeren Population weist darauf hin, dass sie agglomerierten Nanopartikeln entspricht. Statistiken für Durchmesser über 100 nm zeigen viele verschiedene Arten der Agglomeration von ZnO:Fe-Nanopartikeln. Die Nanopartikel in der Wassersuspension waren negativ geladen, wie durch ein Zetapotential unter 0 V gezeigt wurde. Ein Wert von ungefähr -40 mV zeigte auch an, dass die endgültige Wassersuspension stabil war und die Nanopartikel keine Agglomerationsaffinität aufwiesen.

Verteilung der hydrodynamischen Radien der Nanopartikel, gemessen in Wassersuspension (Punkte) und direkt aus TEM-Bildern entlang kürzerer und längerer Seiten der Nanokristalle (siehe Text). Nanopartikel wurden durch ein Hochleistungs-Ultraschallhorn in eine Wassersuspension überführt. Die Konzentration des Trockenmaterials betrug 1 mg pro 1 ml Wasser. Nachdem die Sedimentation abgeschlossen war, wurden zehn Mobilitätsmessungen durchgeführt, um eine glaubwürdige Darstellung der Mobilität im Vergleich zum Nanopartikeldurchmesser zu erhalten. TEM-Größen wurden direkt aus Bildern entnommen:entlang c Achse (längere Seiten der ZnO-Kristalle) und entlang m und a Achsen (kürzere Seiten der Kristalle)

Toxikologische In-vitro-Bewertung von ZnO:Fe-Nanopartikeln

Beide Zelllebensfähigkeitsanalysen (XTT und Trypan Blue) zeigten eine verringerte Absorption von Caco-2-Zellen, die mit ZnO:Fe-NPs inkubiert wurden, was direkt mit der Anzahl lebensfähiger Zellen korrelierte. Statistisch signifikante Veränderungen wurden nur nach 24-stündiger Exposition der inkubierten Zellen gegenüber den höchsten Konzentrationen von NPs (1,0 und 0,1 µg/ml) beobachtet, während physiologische Konzentrationen von NPs (0,01 und 0,001 µg/ml) keinen signifikanten Einfluss auf Zellkulturen hatten (Abb. 6 und 7).

Zelllebensfähigkeit (Caco-2-Linie) getestet durch die XTT-Methode. Die Zellen wurden 24 h einer Suspension von mit Eisen dotierten ZnO-NPs in verschiedenen Konzentrationen wie folgt ausgesetzt:0,001 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; und 1 µg/ml. Die Ergebnisse stellen den mittleren Prozentsatz lebensfähiger Zellen (±SEM) für Kontroll- und Versuchsgruppen (n =4). Signifikanter Unterschied von **P ≤ 0,01 vs. Kontrolle wurde in der Grafik markiert

Zelllebensfähigkeit (Caco-2-Linie) getestet mit Trypanblau-Färbung. Die Zellen wurden 24 h einer Suspension von mit Eisen dotierten ZnO-NPs in verschiedenen Konzentrationen wie folgt ausgesetzt:0,001 mg/ml; 0,01 mg/ml; 0,1 mg/ml; und 1 µg/ml. Die Ergebnisse stellen den mittleren Prozentsatz lebensfähiger Zellen (±SEM) für Kontroll- und Versuchsgruppen (n =3). Signifikanter Unterschied von **P ≤ 0,01 vs. Kontrolle wurde in der Grafik markiert

Eisenverteilung im Tiermodell

Zur Bewertung einer In-vivo-Eisenzugänglichkeit von ZnO:Fe-NPs, Mäusen (n =4) oral erhaltene Suspension von ZnO:Fe-NPs und nach 24 Stunden wurden die Tiere mit weiteren Entnahmen von entscheidenden Geweben skarifiziert. Die quantitative Bewertung des Eisengehalts in den untersuchten Geweben wurde mit der AAS-Methode für alle entnommenen Organe analysiert und mit der Micro Image-Software (basierend auf der Perl-Färbung) für Leber-, Milz- und Hirngewebe berechnet. Die in Abb. 8 dargestellten Daten zeigen einen erhöhten Eisengehalt (im Vergleich zur Kontrolle) in Herz-, Skelettmuskel-, Milz- und Dünndarmgewebe 24 h nach oraler Verabreichung von ZnO:Fe-NPs (kein statistisch signifikanter Anstieg). Bei Knochen war der mittlere Eisengehalt innerhalb der Versuchsgruppe nur geringfügig höher als im Kontrollergebnis. Der Eisengehalt in Leber- und Hirngewebe war hoch signifikant erhöht (P ≤ 0,01) 24 h nach IG von ZnO:Fe-NPs im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 8). In den Nieren, dem viszeralen und subkutanen Fettgewebe sowie der Lunge sank der Fe-Spiegel 24 h nach der Verabreichung von ZnO:Fe-NPs.

Verteilung von Eisen im analysierten Gewebe 24 h nach IG-Gabe von ZnO:Fe-NPs. Die Daten stellen einen durchschnittlichen Prozentsatz von Fe in getesteten Organen der Versuchsgruppe dar (n = 4) im Vergleich zur Kontrollgruppe (100% – horizontale Linie). Der Eisengehalt wurde mit AAS analysiert. Signifikanter Unterschied von **P ≤ 0,01 vs. Kontrolle

Die Auswertung des mit der Perl-Methode angefärbten Eisengehalts in der Leber ergab einen äußerst signifikanten (P ≤ 0,001) erhöhter Fe-Spiegel bei allen Versuchs- und Kontrolltieren (Abb. 9b). In ähnlicher Weise zeigten die Ergebnisse für die rote Pulpa des Milzgewebes eine äußerst signifikante (P ≤ 0,001) Erhöhung des Eisengehalts bei allen Versuchs- vs. Kontrolltieren (Abb. 10b). Daten aus der Analyse von Hirngewebe zeigten keinen Anstieg von Fe in der Versuchsgruppe 24 Stunden nach der IG von ZnO:Fe-NPs (Abb. 11b).

Eisengehalt in der Leber berechnet mit der Färbe- und MicroImage-Software von Perl. Ergebnisse berechnet als Verhältnis von Fläche und Intensität der eisenpositiven Färbungen zur Fläche der Zellkerne. Daten als Mittelwert (±SEM) für jedes untersuchte Tier (a ) und als Mittelwert (±SEM) sowohl für die Kontroll- als auch für die Versuchsgruppe (b ). Signifikanter Unterschied von *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 und ***P 0,001

Eisengehalt in der roten Pulpa der Milz berechnet mit der Färbe- und MicroImage-Software von Perl. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens

Discussion

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

Schlussfolgerungen

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.

Abkürzungen

NPs:

Nanopartikel

ZnO:Fe NPs:

Zinc oxide nanoparticles doped with iron

IG:

Intra-gastric

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

PL:

Photoluminescence spectroscopy

CL:

Cathodoluminescence spectroscopy

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

Caco-2 cells:

Caucasian colon adenocarcinoma cells

DMEM:

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

FBS:

Fetal bovine serum

NEAA:

Non-essential amino acids

PSN:

Penicillin–streptomycin–neomycin

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

AAS:

Atomic absorption spectrometry

SEM (in statistical analysis):

Standard error of the mean