Biologisch abbaubare Fe-dotierte Zinkoxid-Nanopartikel: Ein vielversprechendes Eisenzufuhrsystem für biologische Anwendungen

Zusammenfassung

Eisen ist ein entscheidendes Element für Lebewesen, und sein Mangel wird als die häufigste ernährungsbedingte Störung weltweit beschrieben. Heutzutage wird die Entwicklung effektiverer und sicherer Eisenzufuhrstrategien für Mensch und Tier zu einer der wichtigsten Herausforderungen in der Therapie von Nährstoffmängeln. Unsere früheren In-vivo-Studien bestätigten die Sicherheit und biologische Abbaubarkeit von im Haus hergestellten Zinkoxid-basierten Nanopartikeln sowie deren rasche Verteilung auf die meisten Organe und Gewebe im Körper. In-vitro-Untersuchungen an der Caco-2-Zelllinie, einem Modell für Epithelzellen des Gastrointestinaltrakts, zeigten eine geringe Toxizität der untersuchten Nanomaterialien. In der aktuellen Studie untersuchten wir biologisch abbaubare Zinkoxid-Nanopartikel, dotiert mit Fe(III), als vielversprechende Supplementierungsstrategie bei Eisenmangel. Biologisch abbaubare ZnO:Fe-Nanopartikel wurden erwachsenen Mäusen intragastrisch verabreicht, und nach 24 Stunden wurden die Tiere Opfer, wobei innere Organe für weitere Analysen entnommen wurden. Die mit Atomabsorptionsspektrometrie und histologischer Färbung (Perls-Methode) gemessene Eisenkonzentration zeigte eine schnelle Verteilung der eisendotierten Nanopartikel auf Gewebe, die spezifisch mit der Eisenhomöostase zusammenhängen. Eine Anreicherung von Eisen war auch in Hepatozyten und um Blutgefäße in der Milz sichtbar, was auf einen Transfer der Fe-dotierten Nanopartikel aus dem Blutstrom in das Gewebe hindeuten könnte. Zusammenfassend legen die vorläufigen Ergebnisse der aktuellen Studie nahe, dass biologisch abbaubare ZnO-Nanopartikel, dotiert mit Fe, gute Träger für exogenes Eisen im lebenden Körper sein könnten. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die genauen Mechanismen der Eisendeposition im Gewebe und den Einfluss der Nanopartikelträger auf den Eisenstoffwechsel zu bestimmen.

Einleitung

Eisen ist einer der wichtigsten Bausteine lebender Organismen auf der Erde, einschließlich der menschlichen Bevölkerung. Die Bedeutung dieses Elements hängt mit seiner essenziellen Rolle in vielen Strukturen und Prozessen im Körper zusammen, z. B. dem Sauerstofftransport in alle Gewebe und Zellen (Bestandteil von Hämoglobin und Myoglobin), der Energieproduktion (Bestandteil von mitochondrialen Atmungskettenproteinen) und vielem mehr [1, 2]. Daher nimmt Eisen an entscheidenden Lebensprozessen von Zellen und dem gesamten Organismus teil, und sein Mangel kann zu erheblichen Störungen in der Funktion des lebenden Körpers führen.

Weltweite Berichte zeigen, dass Eisenmangel ein ernstes öffentliches Gesundheitsproblem in der menschlichen Bevölkerung darstellt. Laut WHO war fast 30 % der Weltbevölkerung in den Jahren 1993–2005 von Anämie betroffen. Die Prävalenz von Anämie ist bei Kleinkindern und schwangeren Frauen immer noch viel höher [3]. Die Bedeutung der Eisenzufuhr in der Schwangerschaft liegt darin, dass Eisenmangel ein Risikofaktor für Frühgeburten, niedriges Geburtsgewicht von Neugeborenen und deren allgemein schlechteren Gesundheitszustand ist [4]. Bei Säuglingen und kleinen Vorschulkindern wird das Risiko von Eisenmangel durch das schnelle Wachstum des gesamten Körpers und den darauf folgenden Verbrauch der Eisenspeicher verursacht; daher wird eine Eisenzufuhr auch für Kinder zwischen 0 und 5 Jahren empfohlen [5]. Interessanterweise gibt es wissenschaftliche Berichte, die einen Zusammenhang zwischen angemessenem Eisenspiegel bei Kindern und ihrer emotionalen und neuropsychologischen Entwicklung anzeigen [6]. Darüber hinaus ist Eisenmangel auch eine ernste Ernährungsstörung bei anderen Säugetierarten, besonders bei Saugferkeln, wo eine begrenzte intrauterine Versorgung mit diesem Element mit geringem Eisengehalt in der Muttermilch einhergeht [7, 8]. Auch das schnelle Wachstum der Ferkel erschöpft die verbleibenden Eisenspeicher schnell, da neugeborene Ferkel ihr Körpergewicht innerhalb weniger Tage verdoppeln, wodurch die Anzahl der roten Blutkörperchen und das allgemeine Blutvolumen zunehmen. Daher ist heutzutage eine effektivere und sicherere Eisenzufuhrstrategie für Mensch und Tier eine der wichtigsten Herausforderungen in der Prävention und Therapie von Nährstoffmängeln.

Es gibt drei Hauptwege der zusätzlichen Eisenzufuhr in den lebenden Organismus: intravenös, intramuskulär und oral. Jeder zeigt sowohl Vor- als auch Nachteile. Die orale Verabreichung scheint einfach und natürlicher für den Körper zu sein, da sie physiologische Wege der Eisenaufnahme und Transportsysteme einbezieht. Zudem bewahrt diese Methode ein natürliches System zur Kontrolle der Menge zirkulierenden Eisens im Körper basierend auf Hepcidin [9]. Allerdings ist der orale Supplementierungsweg oft von schlechter Absorption und letztlich geringer Effizienz geplagt. Wissenschaftliche Studien berichteten auch, dass die standardmäßige, lösliche orale Eisenzufuhr die Zusammensetzung und metabolische Aktivität des tierischen Darmmikrobioms stark beeinflusst [10]. Andererseits werden intravenöse oder intramuskuläre Wege der Eisenzufuhr durch das Risiko toxischer Nebenwirkungen behindert [11]. Zudem ist in der industriellen Schweinehaltung die Standardmethode der Eisenzufuhr, basierend auf individueller intramuskulärer Verabreichung einer Einzeldosis Eisen-Dextran, stressig für die Tiere und mühsam für die Züchter. Auch unsachgemäß durchgeführte Injektionen können Entzündungen und andere Komplikationen bei Tieren verursachen sowie zur Ausbreitung verschiedener Krankheiten im Bestand beitragen, wenn Sterilitätsbedingungen nicht eingehalten werden.

Die oben genannten toxischen Nebenwirkungen der exogenen Eisenzufuhr sind mit dem Auftreten von freiem, ungebundenem Eisen im Körper verbunden, das als Übergangsmetall (durch Valenzänderung) zur Produktion schädlicher freier Radikale (reaktive Sauerstoffspezies – ROS) über die Fenton-Reaktion führen kann [12]. Wissenschaftliche Berichte wiesen ein erhöhtes Freiraidikalsniveau im Organismus als Faktor nach, der zu verschiedenen Erkrankungen beiträgt, darunter bakterielle Infektionen, Neoplasien oder Lebererkrankungen [13]. Die natürliche, physiologische Strategie zur Verhinderung der ROS-Generierung durch freies Eisen basiert auf der Bindung des Eisens an spezifische Proteine in jedem Schritt seiner Aufnahme- und Transportwege im Körper. Bei oraler Eisenüberladung und intravenöser/intramuskulärer Verabreichung werden die physiologischen Wege der Eisenzirkulation allgemein überfordert, was zu einem schnellen Anstieg von ROS führt [14].

Eisenbasierte Nanopartikel (Fe-basierte NPs) wurden als vielversprechendes Werkzeug für biomedizinische Zwecke breit untersucht. Die umfangreichste Nutzung dieser Nanostrukturen bezieht sich auf ihre magnetischen Eigenschaften; daher wurden sie meist als Kontrastmittel für klinische Diagnosetechniken getestet, die auf Tumorbildung oder Anreicherung in bestimmten Geweben abzielen [15]. Kürzlich wurden Nanostrukturen auch als neuartige, effektivere Form der Bereitstellung bioaktiver Substanzen für den Organismus untersucht. NP-Träger können eine erheblich erhöhte Bioverfügbarkeit für den lebenden Organismus aufweisen, verglichen mit Substanzen in Bulk-Form, was hauptsächlich auf ihre geringere Größe zurückzuführen ist [16, 17]. In einer Studie wurde die Wirksamkeit von NPs mit Eisen mit Eisensulfat (Standardpräparat zur Behandlung von Anämie) bei anämischen Ratten verglichen. Basierend auf Blutanalysen zeigten die Ergebnisse eine erhöhte Eisenbioverfügbarkeit nach oraler Einzeldosis von NPs mit Eisen bei anämischen Tieren. Bei Mehrfachdosen von Nanopartikeln und Eisensulfat waren die Ergebnisse ähnlich [18]. Eine andere Studie beschrieb Ergebnisse von Fe-basierten Nanomaterialien als alternative Eisenzufuhrmittel am Menschen und einem Nagetiermodell. Die Autoren betonten insbesondere die überlegene Sicherheit von nanoFe im Vergleich zu löslichen Eisenformen, was in fehlender Eisenanreicherung in der Darmschleimhaut und Förderung nützlicher Mikrobiota resultierte [19]. Ebenso vielversprechende Ergebnisse wurden in einer Studie an anämischen Ratten erzielt, die mit Fe-basierten NPs, gekappt mit Vitamin C, behandelt wurden, was die Vermeidung des Standardwegs der Fe-Aufnahme aus dem Gastrointestinaltrakt ermöglichte. Die Ergebnisse zeigten eine Erholung der getesteten Tiere von der anämischen Erkrankung bei gleichzeitiger Verbesserung ihrer Blutparameter in kurzer Zeit im Vergleich zur Standardmethode der Eisenmangeltherapie [20].

Material und Methoden

Synthese der Nanopartikel

Mit Eisen dotierte Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO:Fe NPs) wurden mittels Mikrowellen-Hydrothermalverfahren synthetisiert. Die Methode ist gut etabliert, relativ kostengünstig, biofreundlich und industriell skalierbar, fähig zur Einführung verschiedener Fremdionen als funktionale Dotierungen [21,22,23,24,25] in eine Vielzahl von Oxiden [26,27,28]. Die Eisenkonzentration in den vorliegenden Nanopartikeln wurde auf 5 % molar eingestellt. Die Synthese erfolgte ausgehend von Nitraten(V): Zn(NO₃)₂·6H₂O (99 %, Sigma–Aldrich) und Fe(NO₃)₃·9H₂O (96 %, Carl Roth). Wir testeten verschiedene Lieferanten und wählten jene, die das gleichmäßigste Produkt ohne messbare Mengen an unlöslichen Rückständen anboten. Die Verbindungen wurden in destilliertem Wasser gelöst: 17,63 g Zinknitrat(V) und 1,25 g Eisen(III)-nitrat(V). Die klare Lösung wurde anschließend mit 25 % wässriger Ammoniaklösung (Carl Roth) auf pH 8 alkalisiert. Der resultierende rote Rückstand wurde mit einem Büchnerschen Trichter mit ~ 1 l destilliertem Wasser gewaschen und saugfiltrisch abgetrennt. Der Niederschlag wurde in ein 100-ml-Teflongefäß gegeben, zu 80 % mit Wasser gefüllt und in einer Ertec Magnum II Reaktorkammer verschlossen. Der mikrowellen-hydrothermale Prozess wurde bei 4 MPa für 20 Minuten durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das blassrote Produkt gesammelt und über Nacht bei 60 °C getrocknet.

Charakterisierung der Nanopartikel

Die Charakterisierung des Produkts erfolgte mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), Photolumineszenz (PL) und Kathodolumineszenz (CL) Spektroskopie sowie energiedispersiver Elementaranalyse (EDX). REM-Messungen wurden mit einem hochauflösenden (1 nm) Hitachi SU-70 Mikroskop durchgeführt, ausgestattet mit charakteristischem Strahlungsdetektor und Kathodolumineszenzsystem GATAN Mono CL3 in Sekundärelektronen- (SE) und Transmissionsmodus (TE). Die Photolumineszenz-Emissions- und Anregungsspektren wurden mit einem Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3 Spektrofluorimeter aufgezeichnet, ausgestattet mit einer Xenonlampe als Anregungsquelle und einem Hamamatsu R928P Photomultiplier. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zeta-Potenzial wurden mit einem DelsaMax Pro Partikelcharakterisierungssystem gemessen. Thermogravimetrie (TGA) wurde mit einem NETZSCH STA 449 F1 Jupiter Thermogravimeter unter Argonstrom durchgeführt. REM-Messungen erfolgten nach Abscheidung der Nanopartikel auf einem Agar-polycarbonat-beschichteten 400 Kupfernetz. Die Probe wurde mit einem Sonics VCX500 Ultraschallprozessor in destilliertem Wasser suspendiert, ein Tropfen der Suspension auf das Netz gegeben und getrocknet. Die Probenvorbereitung erfolgte nach 2-stündiger Sedimentation schwererer Partikel.

In-vitro-Modell

Für die aktuelle Studie wurde die Caco-2-Zelllinie (kaukasische Kolonadenokarzinomzellen) als Modell für Epithelzellen des Gastrointestinaltrakts verwendet. Die Zelllinie wurde von der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC, Sigma–Aldrich, Kat. Nr. 86010202) bezogen. Zellen wurden mit 0,5 × 10⁶ Zellen/ml auf 6-Well- oder 96-Well-Platten ausgesät und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) kultiviert, supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS, Gibco), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, Gibco), 1 % Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN, Gibco) und 0,2 % Natriumbicarbonat (Gibco) bei 37 °C und 5 % CO₂. Bei Erreichen von 95–100 % Konfluenz wurde das Zellkulturmedium entfernt und eine Suspension von ZnO:Fe NPs in frischem Wachstumsmedium zugegeben. Zellen wurden mit vier verschiedenen Konzentrationen von ZnO:Fe NPs (1,0; 0,1; 0,01; und 0,001 mg ZnO:Fe NPs/ml) 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.

Zellviabilitätsanalysen

Die Zellviabilität wurde für Caco-2 mit zwei Methoden bewertet: XTT-Assay und Trypanblau-Färbung. Alle für den XTT-Assay erforderlichen Reagenzien stammten aus einem kommerziellen Kit (Cell Proliferation Kit II, Roche). Nach der Inkubation der auf 96-Well-Platten gewachsenen Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von ZnO:Fe NPs wurden die Zellen 4 h bei 37 °C und 5 % CO₂ mit 50 µl XTT-Markierungsgemisch inkubiert. Anschließend wurde die Formazankonzentration spektrophotometrisch bestimmt. Die Absorption wurde bei 470/650 nm gemessen und die Ergebnisse mit der Anzahl der lebensfähigen Zellen korreliert. Im folgenden Experiment wurde das höchste Absorptionsergebnis als 100 % Zellviabilität angenommen. Die Endergebnisse basierten auf vier separaten Experimentreplikaten (n = 4).

Für die Trypanblau-Färbung wurden die auf 6-Well-Platten gewachsenen Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von ZnO:Fe NPs abgelöst (0,05 % Trypsin und 0,2 % EDTA für 10 min), zentrifugiert und der Pellet in 1 ml Wachstumsmedium resuspendiert. 100 µl steriler 0,4 % Trypanblau-Lösung wurden mit 100 µl Zellsuspension vermischt. 10 µl der Probe wurden auf ein Zählglas gegeben und mit der JuLi Br Zählsoftware (NanoEnTek) zur Beurteilung der Anzahl lebensfähiger Zellen analysiert. Die Endergebnisse basierten auf drei separaten Experimentreplikaten (n = 3).

Tiermodell

Für diese Vorstudie wurden adulte, männliche Balb-c-Mäuse (n = 6) einzeln unter standardisierten und kontrollierten Lebensbedingungen (12/12-h Licht-Dunkel-Periode, 25 °C, Luftfeuchtigkeit 30 %) mit Standardfutter und Wasser (ad libitum) gehalten. Alle Verfahren wurden vom örtlichen Ethikkomitee genehmigt, Vereinbarung Nr. WAW2/59/2017. Nach 7 Tagen Akklimatisierung wurde eine Suspension von ZnO:Fe NPs in Wasser (10 mg/ml; 0,3 ml/Maus) Tieren der Experimentgruppe (n = 4) per oraler Gavagierung (IG) verabreicht. Mäuse der Kontrollgruppe erhielten 0,3 ml Trinkwasser per IG (n = 2). Während des Experiments wurden keine Verhaltensänderungen bei den Testtieren oder Gewebeanomalien festgestellt. Nach 24 h wurden Mäuse beider Gruppen in einer CO₂-O₂-Kammer (CO2 Box, Bioscape, Merazet) getötet und Gewebe entnommen. Die Hälfte der frisch entnommenen Proben wurde bei −20 °C für Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) eingefroren. Die andere Hälfte wurde in 4 % gepuffertem Formalin fixiert und nach 24 h in 70 % Ethanol überführt. Anschließend wurden Proben in steigenden Ethanolkonzentrationen dehydriert, in Paraffin eingebettet (Leica TP1020, Leica EG1150) und 6-µm-dünne (bzw. 4 µm für histopathologische Untersuchungen) Mikroskopschnitte mit einem Mikrotom (Leica RM2255) angefertigt.

Eisenanreicherung per Perls-Färbung

Mikroskopschnitte von Milz, Leber und Gehirn wurden mit der Perls-Methode (Preußischblau) auf Eisen presence gefärbt. Proben wurden entparaffiniert und bis zu destilliertem Wasser rehydriert, dann in eine Arbeitslösung mit gleichen Teilen 5 % Kaliumferricyanid (Sigma–Aldrich) und 5 % Salzsäure (Sigma–Aldrich) gegeben und 30 Minuten gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte in Wasser gespült und mit Kernschnellrot (Sigma–Aldrich) 5 Minuten gegengefärbt, in Wasser gespült und unter Deckgläsern mit Permount (Fisher Scientific) eingebettet. Bilder der gefärbten Proben wurden mit einem Olympus BX60 Mikroskop und der Cell^P Bildaufnahmesoftware aufgenommen. Von jeder getesteten Probe wurden 16 zufällig ausgewählte Bilder für weitere Untersuchungen mit MicroImage v.4.0 (Olympus) gemäß internem Bildanalyseprotokoll [29] ausgewählt. Für Milzuntersuchungen wurde nur das rote Markgewebe berücksichtigt. Der Eisengehalt wurde als Verhältnis von Fläche und Intensität der eisenpositiven Färbungen (blaue Farbe) zur Fläche der Zellkerne innerhalb eines Bildes berechnet.

Eisenkonzentration in getesteten Geweben per Atomabsorptionsspektrometrie

Zuvor entnommene, bei −20 °C gelagerte und anschließend aufgetaute Gewebeproben wurden für die quantitative Bestimmung der Eisenkonzentration mit Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) vorbereitet, gemäß dem zuvor detailliert beschriebenen Protokoll [24]. Kurz gesagt: Gewebe wurden gewogen und > 16 h in einer Lösung mit 5 ml 65 % Salpetersäure und 1 ml 30 % Wasserstoffperoxid (Merck) belassen. Anschließend wurden Proben im Mikrowellensystem Ethos 900 (Milestone, USA) in Flüssiglösung mineralisiert und mit AAS (Perkin-Elmer) auf Eisengehalt ausgewertet.

Statistische Analyse

Die in der Studie gewonnenen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Zur statistischen Auswertung der Eisenanreicherung per Perls-Färbung wurde ein einseitiger ANOVA mit Tukey-Kramer Mehrfachvergleichspost-hoc-Test für alle Gruppen durchgeführt. Für die Bewertung eines signifikanten Unterschieds zwischen Kontroll- und Experimentgruppen aus AAS-Analysen wurde ein ungepaarter t-Test verwendet. Signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und Experimentgruppen in In-vitro-Experimenten wurden mit einseitigem ANOVA mit Dunnett-Mehrfachvergleichstest bewertet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad InStat 3.10 berechnet. Für alle Tests wurden Ergebnisse als statistisch signifikant bei P ≤ 0,05 und P ≤ 0,01 sowie P ≤ 0,001 als hoch und extrem signifikant betrachtet.

Ergebnisse

Charakterisierung der Nanopartikel

Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bilder der im mikrowellen-hydrothermalen Prozess kristallisierten ZnO:Fe-Nanokristalle sind in Abb. 1 dargestellt. Das trockene Pulver nach der Synthese wurde in Wasser mittels Ultraschallbad dispersiert und anschließend auf ein Kupfer-400-Netz aufgebracht. Die Suspension aus der Ultraschallbehandlung wurde 2 h für Agglomeration und Sedimentation großer Körner belassen. In der Probe sind üblicherweise ZnO-Kristalle in Form von elongierten sechseckigen Prismen zu sehen. Die Kristalle sind in Richtung des c-Ebenen-Wachstums – [001] – elongiert. Die Prismenquerschnitte sind auf dem Bild deutlich sichtbar: Hexagone von 50–100 nm Größe. Im Grunde sind Nanopartikel agglomeriert und bilden größere Strukturen. In Abb. 1b ist eine solche Struktur stark agglomerierter und gruppierter ZnO:Fe-Kristalle gezeigt. Die Probe besteht auch aus nicht-uniformen Körnern, deren Größenverteilung zwischen hunderten Nanometern und Mikrometern liegt. Es gibt keinen klaren Hinweis auf das Vorhandensein einer separaten, anderen als ZnO-Phase, was das Fehlen einer Eisenoxid-Kristallisation nahelegt [30].

Thermogravimetrische Analyse (TGA) und Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) wurden unter Argonstrom von Raumtemperatur bis 800 °C durchgeführt, die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Der erste Massenverlust trat bis 200 °C auf und verursachte eine Abnahme der Probenmasse um 4,78 % bezüglich der Initialmasse. Der zweite Verlust wurde zwischen 200 und 400 °C registriert und beträgt ca. 7,36 %. Es gab keine weiteren Massenabnahmen bis 800 °C. Der erste war auf die Verdampfung oberflächenadsorbierter Wassermoleküle zurückzuführen, der zweite wahrscheinlich auf die Reduktion von Hydroxylgruppen. Die DSC-Kurve zeigt einen endothermen Peak bei 118,3 °C (−0,6175 mW/mg, Wasserverdampfung) und einen exothermen Peak bei 283,1 °C (0,4356 mW/mg, Zersetzung von Hydroxylgruppen). Der kleine Effekt im Zusammenhang mit der Zersetzung deutete darauf hin, dass die ZnO:Fe-Nanopartikel im mikrowellen-hydrothermalen Prozess fast vollständig kristallisiert waren.

Abb. 3 zeigt die Photolumineszenzspektren der ZnO:Fe NPs bei Raumtemperatur. Das Emissionsspektrum (Abb. 3a) besteht aus zwei Merkmalen: einer niedrigintensiven schmalen Bandkanten-Lumineszenz (NBE) und einer sehr intensiven breiten Tiefenniveaumission (DLE). Die erste hat ihr Maximum bei ~ 380 nm, die zweite bei 600 nm. Die Dominanz der DLE-Intensität im Spektrum deutet darauf hin, dass die erhaltenen Nanokristalle auf kristallographischer Ebene stark defekt waren [31,32,33]. Das Anregungsspektrum (Abb. 3b) zeigt den Emissionsmechanismus aus tiefen Niveaus im Bandlücke von ZnO:Fe.

Das Kathodolumineszenzspektrum der ZnO:Fe NPs ist in Abb. 4 dargestellt; das DLE/NBE-Intensitätsverhältnis beträgt ≈ 25. Das NBE-Band hat sein Maximum bei ca. 380 nm, das DLE-Band enthält vier Komponenten mit Maxima bei ~ 570, 625, 653 nm und sehr schwach bei 770 nm. Laut McCluskey und Jokela [34] ist das 570-nm-Band auf Sauerstoffvakanzen zurückzuführen, während die anderen auf Zinkvakanzen im Wurtzit-Gitter zugeordnet wurden [35].

Der Eisengehalt in der Probe wurde mit zwei Techniken bestimmt: Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDX). Im Fall von AAS wurde die ähnlich wie im Nagetierversuch verwendete Suspension analyset, was 3,98 atom-% Fe im ZnO:Fe ergab. Mit der EDX-Methode wurde das trockene Pulver auf dem Kupfernetz analysiert und eine Eisenkonzentration von 4,5 at.% in Relation zu den Zinkionen gefunden.

Die Suspensionseigenschaften wurden mit DLS- und TEM-Methoden gemessen, die Verteilung der Nanopartikeldurchmesser ist in Abb. 5 dargestellt. Die Verteilung ist bimodal: Für eine Population lag der häufigste Durchmesser zwischen 20 und 100 nm (TEM) bzw. 50 und 200 nm (DLS). Die zweite Population enthält eine geringere Anzahl größerer Objekte von 100–500 nm (TEM) und ca. 150–500 nm (DLS). Der bimodale Charakter der Nanopartikel wird durch beide Methoden deutlich. Die hohe Streuung der Größen in der größeren Population deutet darauf hin, dass sie agglomerierten Nanopartikeln entspricht. Statistiken für Durchmesser über 100 nm zeigen viele verschiedene Arten der Agglomeration von ZnO:Fe-Nanopartikeln. Die Nanopartikel in Wassersuspension waren negativ geladen, wie durch ein Zeta-Potenzial unter 0 V gezeigt. Ein Wert von ca. −40 mV deutete auch darauf hin, dass die endgültige Wassersuspension stabil war und die Nanopartikel keine Affinität zur Agglomeration hatten.

In-vitro-Toxikologische Bewertung der ZnO:Fe-Nanopartikel

Beide Zellviabilitätsanalysen (XTT und Trypanblau) zeigten eine verringerte Absorption von Caco-2-Zellen, die mit ZnO:Fe NPs inkubiert wurden, was direkt mit der Anzahl lebensfähiger Zellen korrelierte. Statistisch signifikante Veränderungen wurden nur nach 24-stündiger Exposition der inkubierten Zellen gegenüber den höchsten NP-Konzentrationen (1,0 und 0,1 mg/ml) beobachtet, während physiologische NP-Konzentrationen (0,01 und 0,001 mg/ml) keine signifikante Auswirkung auf Zellkulturen hatten (Abb. 6 und 7).

Eisenverteilung im Tiermodell

Zur Beurteilung der in-vivo-Eisenzugänglichkeit aus ZnO:Fe NPs erhielten Mäuse (n = 4) oral eine Suspension von ZnO:Fe NPs und wurden nach 24 h geopfert, wobei wichtige Gewebe entnommen wurden. Die quantitative Bewertung des Eisengehalts in den untersuchten Geweben wurde mit der AAS-Methode für alle entnommenen Organe und mit der MicroImage-Software (basierend auf Perls-Färbung) für Leber, Milz und Gehirn durchgeführt. In Abb. 8 dargestellte Daten zeigen einen erhöhten Eisengehalt (vs. Kontrolle) in Herz, Skelettmuskel, Milz und Dünndarmgewebe 24 h nach oraler Verabreichung von ZnO:Fe NPs (kein statistisch signifikanter Anstieg). Im Knochen war der mittlere Eisengehalt in der Experimentgruppe nur leicht höher als im Kontrollergebnis. Der Eisengehalt in Leber- und Gehirngewebe war 24 h nach IG von ZnO:Fe NPs signifikant erhöht (P ≤ 0,01) vs. Kontrollgruppe (Abb. 8). In Nieren, viszeralem und subkutanem Fettgewebe sowie Lunge sanken die Fe-Werte 24 h nach Verabreichung von ZnO:Fe NPs.

Die Bewertung des mit Perls-Methode gefärbten Eisengehalts in der Leber ergab einen extrem signifikanten (P ≤ 0,001) Anstieg des Fe-Gehalts in allen Experiment- vs. Kontrolltieren (Abb. 9b). Ähnlich zeigten die Ergebnisse für das rote Mark der Milz einen extrem signifikanten (P ≤ 0,001) Anstieg des Eisengehalts in allen Experiment- vs. Kontrolltieren (Abb. 10b). Die aus der Analyse des Gehirngewebes gewonnenen Daten wiesen keinen Anstieg von Fe in der Experimentgruppe 24 h nach IG von ZnO:Fe NPs auf (Abb. 11b).

Im Fall des Eisengehalts jedes Tieres der Experiment- und Kontrollgruppen wurden die Ergebnisse in Abb. 9a, 10a und 11a gesammelt. Der höchste und signifikant unterschiedliche (P ≤ 0,05 und P ≤ 0,01) Eisengehalt im Lebergewebe wurde für Maus 2 (24 h 2) detektiert, verglichen mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe (Abb. 9a). Die Eisenfärbungen im roten Mark der Milz innerhalb der Experimentgruppe waren ähnlich; die meisten waren jedoch statistisch höher (P ≤ 0,05 oder P ≤ 0,01) als bei Maus 1 (CTRL 1) aus der Kontrollgruppe (Abb. 10a). Die Ergebnisse für Gehirngewebe waren zwischen jedem Tier der Experiment- und Kontrollgruppen ähnlich (Abb. 11a).

Leber- und Milzgewebeschnitte, gefärbt mit der Perls-Methode, wurden auch qualitativ beurteilt. Eine erhöhte Anzahl von Eisendepots (hellblaue Färbungen) war in Hepatozyten aus Leberschnitten der Experimentgruppe sichtbar (Abb. 12).

Eine allgemein stärkere Anreicherung von Eisen (blaue Färbungen) im roten Mark als im weißen Mark der Milz wurde in beiden Kontroll- und Experimentgruppen beobachtet (Abb. 13). Nach Applikation von ZnO:Fe NPs war der höhere Eisengehalt besonders im roten Mark sichtbar, verglichen mit Bildern der Kontrollgruppe (Abb. 13c, d). In der Experimentgruppe war eine erhöhte Eisenkonzentration auch um Blutgefäße herum erkennbar (Abb. 13b, d).

Diskussion

Wie im Abschnitt „Einleitung“ erwähnt, ist Eisenmangel eine beträchtliche Ernährungsstörung in der menschlichen Bevölkerung sowie in anderen Säugetierarten [3, 7, 8]. Folglich erscheint die Implementierung neuer, effizienterer und sichererer Eisenzufuhrstrategien hochwünschenswert. Die aktuell vorgestellten Ergebnisse stammen aus Vorstudien, die auf weitere, detaillierte Untersuchungen zur potenziellen Nutzung biologisch abbaubarer ZnO-NPs, dotiert mit Fe, als neuartige Strategie für Eisenzufuhr abzielen. Wie zuvor bestätigt, durchlaufen im Haus hergestellte zinkbasierte NPs nach oraler Verabreichung eine sehr effiziente Absorption mit anschließender schneller Verteilung auf Hauptorgane und Gewebe im lebenden Organismus [22,23,24]. Zudem berichteten wir, dass diese Nanostrukturen Bio-Sicherheit und biologische Abbaubarkeit im Körper sowie schnelle Clearance aus dem Organismus demonstrierten [36]. Die in der aktuellen Studie eingesetzte orale NP-Verabreichung bietet einen hocheffizienten Weg der schnellen Lieferung exogener Nanostrukturen an den Körper, basierend auf dem Persorptionsprozess [37, 38]. Darüber hinaus verringert diese Strategie die Chance eventueller toxischer Effekte im Zusammenhang mit der Verabreichung eisendotierter Substanzen, aufgrund der Existenz physiologischer „Sicherheitsmechanismen“ im Zusammenhang mit der Zn- und Fe-Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt. Diese entscheidenden physiologischen Wege der Eisenverteilung können bei intravenöser/intramuskulärer Applikation eisendotierter Substanzen umgangen werden [14], was die Möglichkeit eisenbedingter toxischer Nebenwirkungen erhöhen kann. Die Untersuchung der Internalisierungswege der Nanopartikel, ihrer Dynamik und der daran beteiligten zellulären Systeme wird derzeit im Rahmen einer anderen Publikation erforscht. In der vorliegenden Arbeit entschieden wir uns, den Gesamteffekt unserer Nanopartikel auf den lebenden Organismus darzustellen, mit Fokus auf den Effekt von Eisen.

Toxizität von Nanostrukturen kann mit verschiedenen Materialeigenschaften zusammenhängen, nicht nur mit der chemischen Zusammensetzung, sondern auch z. B. mit Größe, Form oder ihrer Fähigkeit zur Agglomeration [39]. Dennoch wurde bestätigt, dass kleinere NPs besser absorbiert werden als größere und ein hohes Oberflächen-Volumen-Verhältnis Partikel mancher Metalle außergewöhnlich reaktiv und zytotoxisch macht [40, 41]. Nanostrukturen konnten in Zellen eindringen und deren Komponenten beeinflussen, was die Zellviabilität veränderte [42, 43]. In einer früheren Untersuchung zur Zytotoxizität von ZnO- oder FeO-NPs beobachteten die Autoren keine toxischen Effekte (basierend auf der Fähigkeit der untersuchten Zellen zu wachsen und sich zu teilen), selbst bei hohen NP-Dosen [44]. Die hier vorgestellte, an der Caco-2-Zelllinie durchgeführte Studie, als Modell für Epithelzellen des Gastrointestinaltrakts, zeigte eine geringe Toxizität der verwendeten Nanomaterialien. ZnO:Fe NPs in kleinen/physiologischen Dosen (0,001 mg/ml und 0,001 mg/ml) veränderten die Zellviabilität nicht (Abb. 6 und 7). Nach Inkubation von Caco-2-Zellen mit hohen Dosen von ZnO:Fe NPs wurde ein statistisch signifikanter Viabilitätsabfall beobachtet. Der IC50-Wert (halbmaximale inhibitorische Konzentration) als Maß für die Wirksamkeit einer Substanz zur Hemmung einer spezifischen biologischen oder biochemischen Funktion blieb jedoch überraschend hoch – bei ca. 1 mg/ml (Abb. 6 und 7). Der beobachtete Viabilitätsabfall war wahrscheinlich mit der physischen Ablagerung von Nanopartikeln auf der Oberfläche und Überlastung der Zellen assoziiert, nicht mit einem zytotoxischen Effekt der Nanopartikel selbst. In einer anderen Studie kamen Autoren zu dem Schluss, dass der IC50 von Zellen einer Krebszelllinie nach Inkubation mit ZnO- und ZnO:Fe₃O₄-NPs abnahm und ein relativ geringer zytotoxischer Effekt (und nicht dosisabhängig) der untersuchten NPs auf nicht-krebsartige Zellen bestand [45]. Ähnliche Beobachtungen wurden auch für ZnO- und Platin-NPs berichtet [46, 47]. Dennoch müssen weitere Untersuchungen zum chronischen Toxizitätsprofil solcher Komposite einschließlich Antioxidantienaktivitätsprofil, Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Verwendung anderer Zellen und Zelllinien durchgeführt werden.

Die im In-vivo-Experiment gewonnenen Ergebnisse wiesen auf eine schnelle Verteilung von ZnO:Fe NPs auf Gewebe hin, diemostly mit Eisenhomöostase zusammenhängen (Abb. 8, 9 und 10). Ähnliche Studien zur Bioverfügbarkeit von Eisen aus „nano“-Form wurden meist an anämischen Tieren oder nach Eisenentzugsperioden durchgeführt [18, 19, 48], während unsere Vorstudien an gesunden, normal gehaltenen Mäusen erfolgten. Ein Vergleich der im vorliegenden Werk präsentierten Daten mit ähnlichen Studien könnte irreführend sein aufgrund von Unterschieden in den eingesetzten NPs, z. B. ihrer Größe, Form und Zusammensetzung oder Verabreichungsweg, Dosis und Frequenz. Die Ergebnisse des Eisengehalts in der Leber zeigten 24 h nach Applikation von ZnO:Fe NPs einen signifikant erhöhten Wert im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 8 und 9). Die Eisenanreicherung war in Hepatozyten des Lebergewebes sichtbar (Abb. 12), wo der Hauptspeicherort des Elements liegt [49]. Ebenso führten frühere Studien mit intrapitoneal injizierten Eisenoxid-Magnet-NPs bei Ratten zu 55 % Anreicherung dieser Nanomaterialien in der Leber 6 h nach Injektion [50]. Ebenfalls war der Milzeisengehalt in der aktuellen Studie in der Experimentgruppe deutlich höher als in der Kontrolle (Abb. 8 und 10). Interessanterweise wurde eine Tendenz zur Eisenanreicherung um Blutgefäße in der Milz detektiert, was auf einen Transfer von ZnO:Fe NPs aus dem allgemeinen Blutstrom in das Gewebe hindeuten könnte (Abb. 13b, d). Die primäre Anreicherung von Nanostrukturen in Leber und Milz nach ihrer Applikation könnte auch auf Clearance durch mononukleäre Phagozyten in diesen Geweben zurückzuführen sein, wie zuvor postuliert [50,51,52].

Im Fall des Gehirngewebes zeigte die Messung des Gesamteisengehalts (AAS-Methode) einen signifikant höheren Elementgehalt bei Tieren mit zuvor verabreichten ZnO:Fe NPs (Abb. 8), was durch die Perls-Färbung nicht bestätigt wurde (Abb. 11). Die Inkonsistenz zwischen beiden im Studium eingesetzten Methoden könnte mit der Empfindlichkeit der Perls-Färbung zusammenhängen. Diese histologische Methode zur Eisenvisuierung ist darauf ausgelegt, Eisenaggregate zu detektieren. Eisen in „nano“-Form, zusätzlich im Gewebe verteilt ohne physiologische Depots dieser Elemente, könnte nicht empfindlich genug sein, um diese extrem kleinen Eisendepots zu färben. Die Möglichkeit, die Blut-Hirn-Schranke mit unseren hergestellten Nanostrukturen zu überwinden, wurde bereits beschrieben [23, 24, 53]. In einer anderen Studie mit intrapitoneal verabreichten superparamagnetischen Maghemit-Eisenoxid-NPs an Mäusen wurde keine Anreicherung von Eisen in der Experimentgruppe detektiert, weder im Gehirn noch im Herzgewebe, was mit unseren Ergebnissen inkonsistent ist [52]. Eine weitere Studie, fokussiert auf das Verteilungsmuster von Eisenoxid-Magnet-NPs im lebenden Organismus, zeigte einen ähnlichen Zirkulationsmechanismus von Nanostrukturen wie in unserer Studie – erhöhten Fe-Gehalt im Gehirn und Herz nach NP-Verabreichung [51]. Der erhöhte Eisengehalt im Herzgewebe könnte durch das Vorhandensein von ZnO:Fe NPs im allgemeinen Blutstrom und dessen höheren Gehalt im Gewebe verursacht sein. Ebenso ist der höhere Eisengehalt in der Skelettmuskulatur, detektiert in AAS-Analysen, wahrscheinlich auf intensive Blutzirkulation in diesem Muskel zurückzuführen, und im Dünndarm ist der verbesserte Eisengehalt durch Reste oral verabreichter NPs bedingt.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend führten wir eine Vorstudie zur Verteilung biologisch abbaubarer ZnO:Fe NPs als vielversprechende, neue Supplementierungsstrategie bei Eisenmangel durch. Die Ablagerung von Eisen im Körper von Mäusen nach oraler Verabreichung der Nanostrukturen wurde in entscheidenden Geweben detektiert, wo der Hauptspeicherort des Elements liegt. Wir nehmen an, dass die im Studium erhaltenen Ergebnisse darauf hindeuten könnten, dass biologisch abbaubare ZnO:Fe NPs gute Träger für exogenes Eisen im lebenden Körper sind. Allerdings ist weitere Forschung erforderlich, um die genauen Mechanismen der Deposition, Elimination und den Einfluss von ZnO:Fe NPs auf den Körper vollständig zu verstehen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen der folgenden Studie basieren auf den in diesem Manuskript präsentierten Daten.

Abkürzungen

NPs:

Nanopartikel

ZnO:Fe NPs:

Mit Eisen dotierte Zinkoxid-Nanopartikel

IG:

Intragastrisch

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

PL:

Photolumineszenzspektroskopie

CL:

Kathodolumineszenzspektroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

Caco-2-Zellen:

Kaukasische Kolonadenokarzinomzellen

DMEM:

Dulbecco's Modifikation von Eagle's Medium

FBS:

Fötales Kälberserum

NEAA:

Nicht-essentielle Aminosäuren

PSN:

Penicillin-Streptomycin-Neomycin

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

AAS:

Atomabsorptionsspektrometrie

SEM (in statistischer Analyse):

Standardfehler des Mittelwerts