Nanodetektion von Kopf-Hals-Krebs auf einer Titanoxid-Sensoroberfläche

Einführung

Kopf-Hals-Krebs zeigt das abnormale Zellwachstum im Bereich von Kopf und Hals und wird weithin berichtet. Es stammt aus Rachen, Mund, Schleimhaut, Epithelien der Mundhöhle, Speicheldrüsen und Nasenhöhle [1]; ist weltweit der am sechsthäufigsten gemeldete Krebs; und betrifft jedes Jahr mehr als 644.000 Menschen [2]. Die meisten der betroffenen Patienten werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und beeinflussen ihr Überleben stark. Die Früherkennung von Kopf-Hals-Tumoren ist zwingend erforderlich, um das Überleben und den Lebensstil zu verbessern. Serologische Tumormarker wurden verwendet, um die Nachsorge von Kopf-Hals-Tumoren zu diagnostizieren und zu steuern. Die Plattenepithelkarzinomzelle setzt ein vorherrschendes Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) frei, dessen Anwesenheit bei Krebspatienten erhöht ist, und SCC-Ag hat sich als vielversprechender Tumormarker bei Plattenepithelkarzinomen wie gynäkologischen, Lungen-, Speiseröhren- und Analkarzinomen erwiesen [3, 4]. In Bezug auf Kopf-Hals-Krebs wurden höhere SCC-Ag-Spiegel mit Krankheitsmetastasen, Rezidiven und Mortalität in Verbindung gebracht, wie in verschiedenen Studien mit Krebspatienten nachgewiesen wurde [5,6,7]. Forscher haben festgestellt, dass das Serum-SCC-Ag ein signifikantes Risiko für Krebs im Hypopharynx, in der Mundhöhle und im Larynx aufwies [8, 9]. Darüber hinaus bestand bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren eine Korrelation zwischen dem SCC-Ag-Spiegel und dem Tumorvolumen [10]. Es ist ratsam, den SCC-Ag-Spiegel zu quantifizieren, um den Zustand von Kopf-Hals-Krebs zu identifizieren und eine frühere Behandlung bereitzustellen. Die aktuelle Forschung konzentrierte sich auf den Nachweis von SCC-Ag auf niedrigerem Niveau unter Verwendung des Nanopartikel-auf-Interdigitalelektroden-(IDE)-Sensors durch SCC-Ag-Antikörper.

IDE ist ein elektrochemischer Biosensor mit vielversprechenden Eigenschaften wie kostengünstig, tragbar und empfindlich, der ein breites Anwendungsspektrum insbesondere bei der Umweltüberwachung und medizinischen Diagnose findet [11, 12]. Die Verbesserung der elektrischen Eigenschaft auf der Sensoroberfläche verbessert den Nachweis von Biomolekülen. Die Anwendung von Nanomaterialien wurde im Biosensor weit verbreitet verwendet, um die biomolekulare Detektion auf Sensoroberflächen zu verbessern. Nanomaterialien sind kleiner, haben eine größere Oberfläche, haben eine gute thermische und elektrische Leitfähigkeit, sind mit Biomolekülen kompatibel und zeigen eine enorme Anwendungsfähigkeit im Bereich der Biosensorik [13, 14]. Nanomaterial wurde auf zwei verschiedene Arten zu Zwecken eingesetzt:Zum einen zur Oberflächenfunktionalisierung und zum anderen zur Konjugation des Analyten oder Ziels, um den Nachweis zu verbessern [15]. Gold ist eines der etablierten Nanomaterialien und wird in verschiedenen Sensoren eingesetzt, darunter Oberflächenplasmonenresonanz, Wellenleitermodussensor, elektrochemischer Sensor und Kolorimetrie [16,17,18]. Daneben wurden auch Silber-, Graphen-, Kupfer- und Titan-Nanomaterialien in verschiedenen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Als umweltfreundlicher und kostengünstiger Halbleiter ist Titanoxid (TiO₂ ) hat eine große Bandlücke, die hier für die Oberflächenmodifikation auf IDE verwendet wird, um SCC-Ag zu erkennen. Aufgrund der hohen elektrischen und optischen Eigenschaften von TiO₂ , wird es häufig für Superkapazitätszwecke, photokatalytische und photoelektrische Umwandlungen verwendet [19,20,21,22,23]. Darüber hinaus eignen sich seine Hydrophilie und seine größere Oberfläche für die Oberflächenmodifikation und helfen, die Biomoleküle auf einem niedrigeren Niveau zu detektieren. In dieser Untersuchung wurde TiO₂ wurde auf die IDE-Sensoroberfläche beschichtet, um den elektrischen Fluss zu verbessern, wenn die Interaktion von Biomolekülen stattfindet. Um den Nachweis von SCC-Ag zu verbessern, wurde ein Antikörper mit Gold Nanostar (GNS-Antikörper) konjugiert und auf TiO₂ . immobilisiert -beschichtete Oberfläche. Da nachgewiesen wurde, dass Gold-Nanomaterial-konjugierte Biomoleküle eine höhere Stabilität aufweisen und die richtig ausgerichteten oberflächenimmobilisierten Biomoleküle liefern, hat es die Fähigkeit, die Nachweisgrenze zu verbessern [24, 25]. Darüber hinaus können mehr Biomoleküle auf einem einzigen Goldpartikel immobilisiert werden, was dazu führt, dass die erhöhten Konzentrationen des Zielmoleküls angezogen werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Nanomaterialien, nämlich TiO₂ (zur Oberflächenmodifikation) und GNS (zur Antikörperkonjugation) wurden verwendet, um den Nachweis von SCC-Ag auf der IDE-Sensoroberfläche zu verbessern. Es wird erwartet, dass die Anwendung von GNS die Leistung des aktuellen Sensors durch seine größere Oberfläche verbessert, um die höhere Anzahl von Antikörpern einzufangen.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

SCC-Antigen (ein Glykoprotein mit Isoformen im Bereich von 45 bis 55 kDa) wurde von Randox Life Sciences (Malaysia) erworben. Anti-SCC-Antikörper wurde von Next Gene (Malaysia) bezogen. (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), Ethanolamin, Albumin (ein wichtiges Blutprotein mit 45 mg/ml; 50–70 % des Blutproteins mit einem Molekulargewicht von 66,5 kDa), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4) und Titan IV Isopropoxid stammten von Sigma Aldrich (USA). Serpin (eine häufig verbreitete Serinprotease-Hemmung mit einem Molekulargewicht von 40 bis 50 kDa) stammte von Sino Biological (China). Gold-Nanostern wurde wie von Shan et al. [26]. Alle erhaltenen Reagenzien und Chemikalien wurden gemäß den Empfehlungen des Herstellers gelagert.

Fertigung interdigitaler Elektroden

Das grundlegende Design und die Herstellung von IDE wurden wie zuvor beschrieben verfolgt [27]. Anfänglich wurde der Siliziumwafer mit den Standardreinigungslösungen gereinigt und eine Aluminium-IDE-Elektrode wurde durch das traditionelle Nassätzverfahren auf dem Siliziumwafer abgeschieden. Dann wurde der positive Photoresist auf der Oberfläche des Siliziumwafers abgeschieden, gefolgt von einer thermischen Oxidation. Die Abscheidung von Aluminium wurde durch die Photolithographietechnik durchgeführt. Es waren drei Schritte erforderlich, wobei Schritt 1 mit 1200 U/min für 10 Sekunden war, dann Schritt 2 mit 3500 U/min für 20 Sekunden, gefolgt von 500 U/min für 10 Sekunden. Anschließend wurde die Sensoroberfläche mit ultraviolettem (UV) Licht belichtet, um das IDE-Muster auf die Probenoberfläche zu übertragen. Danach wurde RD-6 Entwickler für 15 Sekunden verwendet, um den Entwicklungsprozess durchzuführen. Photoresisting wurde durchgeführt, um die unbelichteten Bereiche zu eliminieren. Die entwickelte Probe wurde bei 100 °C gebrannt, um die unnötige Feuchtigkeit zu entfernen und die Haftung zwischen dem SiO₂ . zu verbessern Schicht und das Aluminium. Schließlich wurde der unbelichtete Bereich unter Verwendung von 23 µs Aluminiumätzmittel entfernt und mit Aceton gereinigt. Die endgültige Oberfläche wurde durch TiO₂ . modifiziert SCC-Ag nachzuweisen. Die hergestellte IDE-Oberfläche wurde unter Hochleistungsmikroskopie und 3D-Nanoprofiler beobachtet. Die Bilder wurden mit dem zugehörigen System bei einer Vergrößerung von × 50 aufgenommen.

Beschichtung mit TiO₂ auf der IDE-Erfassungsoberfläche

Auf der hergestellten IDE-Oberfläche TiO₂ Lösung wurde aufgetragen und Titan IV Isopropoxid wurde als Vorläufer verwendet, um die Lösung von TiO₂ . herzustellen . Dazu wurde Ethanol mit Titan IV Isopropoxid vermischt und 5 min kräftig gerührt. Dann wurde der Stabilisator (100 μl Essigsäure) unter Rühren zugetropft und dann auf einer Heizplatte bei einer Temperatur von 85 °C erhitzt. Das Molverhältnis der Mischung wurde auf 9:1:0,1 (Ethanol zu TIP zu Essigsäure) festgelegt. Nach 3 h Mischen wurde eine klare Lösung erhalten. Nach 24 Stunden Alterungsprozess wurde die Lösung auf Siliziumdioxid (SiO₂ ) Substrate mit dem Spin-Coater mit einer Geschwindigkeit von 2000 U/min. Nach der Beschichtung wurde die Oberfläche 15 min bei einer Temperatur von 175 °C getrocknet und 1 h bei 450°C getempert. Das TiO₂ Der dünne Film erhält eine ausreichende Dicke, nachdem er drei Schichten aufgetragen hat.

Herstellung von GNS-konjugiertem Anti-SCC-Ag

Der SCC-Ag-Antikörper wurde auf GNS immobilisiert, indem der Linker 16-Mercaptoundecansäure (16-MDA) verwendet wurde. Zunächst wurden 5 mM verdünntes 16-MDA mit 100 μL GNS gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt. Das gebundene 16-MDA mit GNS wurde durch Zentrifugation bei 13.000 × g . entfernt , 5 Minuten. Dann wurde das gesammelte Goldpellet durch EDC (400 mM) und NHS (50 mM) im Verhältnis 1:1 durch Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur aktiviert. Das ungebundene EDC und NHS aus der Lösungsmischung wurden durch Zentrifugation bei 13.000 × g . entfernt , 5 Minuten. Das das aktivierte GNS enthaltende Pellet wurde gesammelt, um den Antikörper zu konjugieren. Anschließend wurden 200 nM SCC-Ag-Antikörper mit EDC-NHS-aktiviertem GNS gemischt und 1 h bei RT gehalten. Schließlich wurden die ungebundenen Antikörper durch Zentrifugation bei 13.000 × g . entfernt , 5 Minuten. Der mit GNS konjugierte Antikörper wurde für die weitere Verwendung bei 4 °C aufbewahrt und die Konjugation wurde durch UV-Vis-Spektroskopie-Scannen bestätigt. Das Scannen wurde im Bereich zwischen 480 und 560 nM durchgeführt und die Peakmaxima wurden gefunden.

Immobilisierung auf GNS-Antikörper auf TiO₂ -IDE-Oberfläche

Das TiO₂ -beschichtete IDE-Oberfläche wurde durch APTES weiter in Amin modifiziert, um GNS-Antikörper zu immobilisieren. APTES mit 3% (verdünnt in 30% Ethanol) wurde auf TiO₂ . getropft Oberfläche und 3 h bei RT aufbewahrt. Die Oberfläche wurde dreimal mit 30% Ethanol gewaschen, um ungebundenes APTES zu entfernen. Um den Antikörper zu immobilisieren, wurde der Aktivierungsschritt wie oben erwähnt gefolgt. Der Antikörper oder GNS-Antikörper wurde auf die Oberflächen getropft und 1 Stunde gewartet, um den Immobilisierungsprozess abzuschließen. Schließlich wurde die Oberfläche fünfmal mit PBS-Puffer gewaschen, um die ungebundenen Antikörper vollständig zu entfernen. Diese Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen wurden verwendet, um das SCC-Ag nachzuweisen und zu vergleichen. Das GNS-Antikörper-immobilisierte TiO₂ Die Oberfläche wurde mit Rasterkraftmikroskopie (AFM), Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie (FETEM) und energiedispersivem Röntgenanalysegerät (EDX) analysiert, wie zuvor beschrieben [15]. AFM-Beobachtungen erfolgten im 5 μm-Maßstab, während SEM im 100 nM-Maßstab mit 15 kV betrieben wurde. Das Vorhandensein der Elemente wurde von EDX gefunden.

Nachweis von SCC-Antigen auf Antikörper-/Gold-Nanostar-Antikörperoberflächen

Zum Nachweis von SCC-Ag, Antikörper- oder Gold-Nanostar-Antikörper-modifiziertem TiO₂ -IDE-Oberflächen wurden mit 1 µM Ethanolamin blockiert, um die antikörperfreien Oberflächenbereiche zu maskieren, und 30 Minuten lang bei RT gehalten. Auf der mit Ethanolamin blockierten Oberfläche interagierten 1 &mgr;nM SCC-Ag und die Stromreaktionen wurden vor und nach der Zugabe von SCC-Ag beobachtet. Um die Nachweisgrenze zu bewerten, wurde SCC-Ag von 10 fM auf 1 nM titriert und einzeln auf die Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen getropft und die Reaktionen mit dem Strom wurden notiert. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Statistik berechnet. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde als die niedrigste Konzentration eines Analyten (von der Kalibrierungslinie bei niedrigen Konzentrationen) gegenüber dem Hintergrundsignal (S /N = 3:1), also LOD = Standardabweichung der Basislinie + 3σ .

Selektiver Nachweis von SCC-Ag

Um die selektive Interaktion von SCC-Ag mit seinem Antikörper zu überprüfen, wurden Kontrollexperimente mit zwei verschiedenen Proteinen, nämlich Serpin und Albumin, durchgeführt. Eine Konzentration von 1 nM dieser Kontrollproteine ​​wurde auf Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierte Oberflächen getropft, und die Änderungen des Stroms wurden vor und nach der Wechselwirkung festgestellt. Diese aktuellen Spiegel wurden mit dem spezifischen Nachweis von SCC-Ag durch seinen Antikörper und GNS-Antikörper verglichen. Andere Versuchsanordnungen zur Kontrolle umfassen die Interaktion von SCC-Ag mit GNS allein und SCC-Ag mit TiO₂ -IDE-Oberfläche beschichtet mit nicht-immunantikörpermarkiertem GNS. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Statistik berechnet. Für die Messungen wurde eine lineare Sweep-Spannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt.

Ergebnisse und Diskussion

Kopf-Hals-Tumoren wurden als verschiedene Tumoren beschrieben, die sich in oder um Nase, Mund, Kehlkopf und Nebenhöhlen entwickeln [28]. Eine frühzeitige Diagnose und Behandlung mit einem geeigneten Biomarker sind zwingend erforderlich, um die Überlebensrate der Patienten zu verbessern. SCC-Ag wurde als geeigneter Serum-Biomarker für Kopf-Hals-Krebs gefunden; hier wurden die Experimente durchgeführt, um den SCC-Ag-Spiegel auf TiO₂ . nachzuweisen und zu quantifizieren -modifizierter interdigitaler Elektrodensensor (IDE) durch seinen Antikörper. TiO₂ wird hier verwendet, um die aktuelle Reaktion bei der Interaktion von Biomolekülen zu verbessern. Im Vergleich zu anderen Nanomaterialien ist TiO₂ wird im elektrochemischen Sensor aufgrund seines aktiven Verhaltens auf der Oberfläche entlang von Elektroden und der Verbesserung der elektrokatalytischen Aktivität als attraktiv angesehen. Darüber hinaus verleiht es der Oberfläche mehr Stabilität, was die Wiederholbarkeit der Reaktion der Elektrode und eine Verbesserung der Nachweisgrenze durch Erhöhung des Spitzenstroms ermöglicht [29,30,31]. Um diese positive Eigenschaft zu nutzen, wurde in dieser Studie mit TiO₂ . beschichtet auf der IDE-Oberfläche (IDE-TiO₂ ) verbessert den Stromfluss. Ein weiteres Nanomaterial-GNS wurde verwendet, um Anti-SCC-Ag-Antikörper auf dem IDE-TiO₂ . zu immobilisieren Oberfläche und um die Deletionsgrenze zu erhöhen. Da nachgewiesen wurde, dass eine goldkonjugierte biomolekül-immobilisierte Oberfläche die Detektion des Targets verbessert [32, 33], wurde hier SCC-Ag nachgewiesen und mit Antikörper- und GNS-Antikörper-modifiziertem IDE-TiO₂ Oberflächen. Wie an anderer Stelle verallgemeinert, kommt es mit einer Vergrößerung der Oberfläche des Nanopartikels zu einer Verbesserung der biomolekularen Bindung. Dabei hat GNS im Vergleich zum kugelförmigen Gold-Nanopartikel eine größere Oberfläche. Um diese Idee umzusetzen, wurde das aktuelle Experiment mit GNS durchgeführt, um die Empfindlichkeit zu erhöhen.

Oberflächencharakterisierung und GNS-Antikörperimmobilisierung

Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des Nachweises von SCC-Ag auf IDE-TiO₂ Sensorfläche. Wie in Abb. 1a dargestellt, wurde die IDE-Sensoroberfläche zunächst mit TiO₂ . beschichtet und dann wurde der Antikörper mit oder ohne GNS-Konjugation immobilisiert. Diese Antikörper-modifizierten Oberflächen wurden verwendet, um den SCC-Ag-Spiegel nachzuweisen. Vor der Durchführung des Nachweises wurde die Konjugation von GNS mit Antikörper durch UV-Vis-Spektroskopie bestätigt. Die GNS-Scanprofile mit dem gewünschten Wellenlängenbereich vor und nach Konjugation mit Antikörper wurden bestimmt. Es war deutlich zu erkennen, dass die Verschiebung nach der Immobilisierung von 535 auf 545  nM verschoben wurde (Abb. 1b). Dieses Ergebnis bestätigt die Konjugation von Antikörpern auf der Oberfläche des GNS. Andererseits wurde die hergestellte Sensoroberfläche morphologisch beobachtet. Abbildung 2a zeigt das Hochleistungsmikroskopiebild, während Abbildung 2b das Bild beschreibt, das mit der 3D-Nanoprofiler-Bildgebung aufgenommen wurde. Beide Abbildungsprofile sind deutlich mit Lücken- und Elektrodenbereichen dargestellt, die die Finger bilden. Die Anordnung der Lücken und Finger schien einheitlich und intakt zu sein.

a Schematische Darstellung zum Nachweis von SCC-Ag. IDE-TiO₂ Oberfläche wurde durch APTES in Amin modifiziert, gefolgt von der Immobilisierung von Antikörper oder GNS-Antikörper. Die Amingruppe von APTES reagiert mit der Carboxylgruppe des Antikörpers. SCC-Ag wurde durch die Interaktion an der antigenen Region nachgewiesen und verglichen. b UV-Vis-Spektroskopie-Messungen mit GNS. Die Abtastung lag im Bereich zwischen 480 und 560 nM, und die Peakmaxima lagen bei ~ 530 nM. GNS mit und ohne Antikörper sind durch die Pfeile gekennzeichnet

a Hochleistungsmikroskopisches Bild auf der IDE-Oberfläche. Die Bilder wurden mit 50 ×  aufgenommen. b 3D-Nanoprofiler-Bild auf der IDE-Oberfläche. Bilder wurden bei × 50 aufgenommen. Elektroden- und Lückenbereiche sind gezeigt. Die Lücken sind durch Sterne gekennzeichnet. Einheitliche Anordnungen zeigen die erfolgreiche Herstellung an. c Rasterkraftmikroskopische Aufnahme. AFM zeigt eine klare Unterscheidung zwischen TiO₂ und GNS durch dunkle bzw. helle Flecken. d Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopiebild. e Energiedispersive Röntgenanalyse. Zeigt die auf der Oberfläche gefundenen Elemente an

Vergleich von Antikörper- und GNS-Antikörper-Immobilisierung TiO₂ -IDE-Erfassungsoberflächen

SCC-Ag wurde auf TiO₂ . nachgewiesen -IDE-Oberfläche durch Antikörper- oder GNS-Antikörper-immobilisierte Oberflächen. Die Anlagerung von GNS an TiO₂ Oberfläche wurde durch AFM, SEM-Beobachtungen und EDX-Analyse bestätigt (Abb. 2c). Unter AFM-Beobachtung wurde eine klare Unterscheidung zwischen TiO₂ . festgestellt und GNS durch dunkle bzw. helle Flecken. Dies wurde durch SEM- und EDX-Analysen gestützt, bei denen markante Gold- und moderate Titan-Peaks beobachtet wurden. Diese Ergebnisse belegen das Vorkommen von GNS auf dem TiO₂ Oberfläche. Abbildung 3 zeigt die Immobilisierungsprozesse von Antikörper und GNS-Antikörper auf dem Amin-modifizierten IDE-TiO₂ sensierende Oberflächen. TiO₂ -modifizierte IDE-Erfassungsoberfläche zeigt den aktuellen Pegel als 4,65E-12 an (Abb. 3a). Nach der Zugabe von APTES wurde das aktuelle Niveau auf 5,37E-11 erhöht; dieser Stromzuwachs zeigte an, dass die Oberfläche durch APTES in Amin modifiziert wurde. Wenn der Antikörper immobilisiert war, wurde der aktuelle Spiegel von 5,375E-11 auf 1,05E-9 geändert. Der Unterschied im Strom wurde als 1,04E−9 festgestellt (Abb. 3a). Diese Immobilisierung erfolgte aufgrund der chemischen Wechselwirkung der Amingruppe der APTES- und COOH-Gruppe im Antikörper [18]. Die Stromänderungen bestätigten die Antikörperbindung an die APTES-modifizierte Oberfläche. Danach wurde die verbleibende Oberfläche mit 1 µM Ethanolamin bedeckt, um den Biofouling-Effekt durch die unspezifische Bindung von Biomolekülen auf der Sensoroberfläche zu reduzieren. Auf ähnliche Weise wurde der GNS-Antikörper auf TiO₂ . immobilisiert -IDE-Oberfläche, und wenn GNS-Antikörper auf der APTES-modifizierten Oberfläche immobilisiert wurde, wurde das aktuelle Niveau von 4,41E-12 auf 1,23E-9 erhöht (Abb. 3b). Es wurde eindeutig festgestellt, dass der Antikörper, wenn er auf der GNS-Oberfläche immobilisiert war, die stärkere Reaktion auf der aminmodifizierten Oberfläche zeigt. Dies könnte auf die größere Anzahl von Antikörpern, die an die Oberfläche einzelner GNS binden, und die starke Bindung dieses Komplexes an die aminmodifizierte Oberfläche zurückzuführen sein. Diese Bindung geschah aufgrund der Amino-terminalen Gruppe in den APTES, die die Citratgruppen auf GNS verdrängt und auf der APTES-modifizierten IDE-Oberfläche chemisch fixiert wurde [34]. Es ist allgemein bekannt, dass der Nachweis von Biomolekülen auf den Sensoroberflächen hauptsächlich von zwei Faktoren abhängt, nämlich der Bindungsaffinität interaktiver Moleküle und der richtigen Oberflächenimmobilisierung von Molekülen auf der Sensoroberfläche. Eine höhere biomolekulare Immobilisierung auf der Sensoroberfläche verbesserte die Detektion eines Ziels auf seiner niedrigeren Ebene drastisch. In dieser Forschung wurde GNS verwendet, um Anti-SCC-Ag-Antikörper auf IDE-TiO₂ . zu immobilisieren Oberfläche, um die Wahrscheinlichkeit einer höheren Antikörperbindung zu erhöhen, was zu einem effizienten SCC-Ag-Nachweis führt.

Immobilisierungsprozesse auf IDE-TiO₂ Oberflächen. a Mit Antikörper. b Mit GNS-Antikörper. Oberflächenmodifikationen wurden durch 3% APTES gestartet, gefolgt von EDC- und NHS-Aktivierung, um den Antikörper zu immobilisieren; 1 &mgr;M Ethanolamin wurde verwendet, um die ungebundene Antikörperregion zu blockieren. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. Korrekte Stromänderungen nach jeder Immobilisierung wurden durch die Bindung von Antikörper und GNS-Antikörper an den Sensoroberflächen bestätigt

Vergleichende Detektion von SCC-Ag auf IDE-TiO₂ Oberfläche durch Antikörper oder GNS-Antikörper

Da Antikörper GNS die effiziente Immobilisierung auf IDE-TiO₂ . zeigt Oberfläche wurde eine ähnliche 1 &mgr;nM-Konzentration von SCC-Ag sowohl auf Antikörper- als auch auf GNS-Antikörperoberflächen nachgewiesen und die Veränderungen des aktuellen Spiegels verglichen. Abbildung 4a zeigt 1 nM SCC-Ag-Nachweis auf einer Antikörper-modifizierten Oberfläche. Vor der Durchführung des Nachweises wurde die antikörpermodifizierte Oberfläche mit dem Blockierungsmittel Ethanolamin bedeckt, um eine unspezifische Bindung von Biomolekülen zu vermeiden. Ethanolamin zeigt die aktuelle Änderung als 4,65E-12 an. Nach Zugabe von 1 nM SCC-Ag wurde das aktuelle Niveau auf 1,33E-09 erhöht. Diese aktuellen Veränderungen zeigten eindeutig die Bindung von SCC-Ag an seinen Antikörper. Im Fall der GNS-Antikörperoberfläche zeigt das Ethanolamin den aktuellen Wert als 1,33E-11 an; nach Zugabe von 1 nM SCC-Ag wurde sie auf 1,62E-09 erhöht (Abb. 4b). Die aktuellen Veränderungen mit GNS-Antikörper waren höher als mit nur Antikörper-modifizierter Oberfläche für eine ähnliche Konzentration von SCC-Ag. Dies könnte an der höheren Anzahl von Antikörpern liegen, die in IDE-TiO₂ . gebunden sind Oberfläche durch GNS.

SCC-Ag-Erkennung mit a Antikörper und b GNS-Antikörper. Getestet auf IDE-TiO₂ Oberflächen mit den obigen Schritten, bis 1 &mgr;M Ethanolamin blockiert. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. Nach Interaktion mit 1 µm SCC-Ag wurden die Stromspiegel in beiden Fällen erhöht; gleichzeitig zeigt es eine höhere Stromänderung mit GNS-Antikörper

Grenze des Nachweises von SCC-Ag auf IDE-TiO₂ Oberfläche durch Antikörper oder GNS-Antikörper

Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierte Oberflächen zeigen einen klaren Nachweis von SCC-Ag, und die Nachweisgrenze wurde zum Vergleich auf beiden Oberflächen geschätzt (Abbildung 5a, b). Dazu wurden die Konzentrationen von 10 fM bis 1 nM SCC-Ag verdünnt und einzeln auf diese Oberflächen getropft und die Stromänderungen notiert. Abbildung 5a zeigt die unterschiedlichen Konzentrationen der SCC-Ag-Bindung auf der antikörpermodifizierten Oberfläche. Nach Ethanolamin interagierten 10 fM SCC-Ag, und es wurde keine aktuelle Änderung festgestellt. Bei einer Erhöhung der Konzentration auf 100 fM gab es eine geringfügige Änderung des Stroms von 4,65E-12 auf 6,54E-11. Außerdem wurden die Konzentrationen auf 1 pM, 10 pM, 100 pM und 1 nM erhöht, und die aktuellen Werte wurden auf 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10 bzw. 1,33E-09 erhöht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass mit einer Erhöhung der Konzentrationen auch die Bindung zunimmt. Die Nachweisgrenze wurde basierend auf 3σ . berechnet , und es war bei 100 fM (Abb. 6a).

Dosisabhängige Wechselwirkungen mit a Antikörper und b GNS-Antikörper auf IDE-TiO₂ Oberflächen. Die Oberfläche ist mit den obigen Schritten, bis 1 &mgr;M Ethanolamin blockiert. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. SCC-Ag-Konzentrationen von 10 fM bis 10 nM interagierten auf beiden Oberflächen, und die aktuellen Veränderungen wurden bemerkt. Das Waschen wurde in fünf Reaktionsvolumina bei jedem Schritt unter Verwendung von 10&supmin;&sup6; mM PBS (pH 7,4) durchgeführt. Mit einem Anstieg der SCC-Ag-Konzentrationen wurden die aktuellen Werte in beiden Fällen schrittweise erhöht. Der GNS-Antikörper zeigt die aktuellen Änderungen ab 10 fM, während Änderungen ab 100 fM nur mit Antikörper festgestellt wurden. In beiden Fällen (Antikörper und GNS-Antikörper) zeigte 1 µm SCC-Ag die Sättigung. Wenn die Konzentration weiter erhöht wird, konnten keine signifikanten Änderungen des Stroms beobachtet werden

Vergleich aktueller Veränderungen bei unterschiedlichen Konzentrationen von SCC-Ag auf Antikörper- und GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. a Lineares Regressionsdiagramm für die Nachweisgrenze von SCC-Ag. Mit Antikörper (rote Linie) und mit GNS-Antikörper (blaue Linie) werden angezeigt. Die Nachweisgrenze wurde bei 10 fM mit GNS-Antikörper und 100 fM mit nur Antikörper gefunden. b Aktuelle Veränderungen mit SCC-Ag und Antikörper-Interaktion. Bei allen Konzentrationen wurde ein höheres Maß an Stromänderungen auf der GNS-Antikörperoberfläche gefunden. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. Der Fehlerbalken zeigt die gemittelten Werte aus Triplikaten (n = 3) mit den Standardabweichungen im Bereich von ± 0,1 bis 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde als die niedrigste Konzentration eines Analyten (von der Kalibrierungslinie bei niedrigen Konzentrationen) gegenüber dem Hintergrundsignal (S /N = 3:1), also LOD = Standardabweichung der Basislinie + 3σ

Dieselben Konzentrationen von SCC-Ag interagierten unabhängig auf GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. Als 10 fM SCC-Ag auf die Oberfläche getropft wurden, änderte sich der Strom deutlich von 1,33E-11 auf 3,74E-11. Dieses Ergebnis zeigt, dass selbst 10 fM SCC-Ag eindeutig mit der Oberfläche der GNS-Antikörper-immobilisierten interagieren können, die im Fall nur mit Antikörpern nicht nachgewiesen werden kann. Wenn die Konzentrationen auf 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM und 1 nM erhöht wurden, wurden die aktuellen Werte außerdem weiter auf 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09 und . erhöht 1.62E-09 bzw. (Abb. 5b). Die statistischen Berechnungen mit den Standardabweichungen liegen im Bereich von ± 0,1 bis 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Im Vergleich zur Erfassung auf den beiden oben genannten Oberflächen zeigt die GNS-Antikörper-modifizierte Oberfläche die stärkeren Änderungen des Stroms bei allen getesteten Konzentrationen von SCC-Ag (Abb. 6b). Basierend auf 3σ , es könnte die Nachweisgrenze bei 10 fM finden (Abb. 6a), dies ist eine 10-mal bessere (niedrigere) Detektion im Vergleich zu nur der Antikörper-modifizierten Oberfläche. Die statistische Berechnung mit den Standardabweichungen liegt im Bereich von ± 0,1 bis 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Zuvor wurde SCC-Ag an verschiedenen Nanomaterialien wie Strontium-Nanopartikel und Graphen evaluiert; diese Oberflächen zeigten jedoch im Vergleich zur aktuellen Studie eine ~ 1000-fach geringere Empfindlichkeit [35].

Selektiver Nachweis von SCC-Ag auf Antikörper-/GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen

Der selektive Nachweis von SCC-Ag wurde mit zwei Kontrollproteinen verglichen, nämlich Serpin und Albumin, die im Blutkreislauf reichlich vorhanden sind. Serpin ist ein Protease-Inhibitor, der verschiedene menschliche physiologische Funktionen und biologische Prozesse ausübt, während Albumin für 45 mg mL ⁻¹ . verantwortlich ist und trägt zu 50–70 % zum Blutserum bei. Wie in der Abbildung gezeigt, wurde eine 1 nM-Konzentration dieser beiden Kontrollproteine ​​und SCC-Ag einzeln auf den Oberflächenantikörper oder GNS-Antikörper getropft (Fig. 7a); es war deutlich zu erkennen, dass die aktuellen Veränderungen in beiden Fällen nur bei SCC-Ag beobachtet wurden, was darauf hindeutet, dass der Antikörper nur SCC-Ag erkennen kann. Es werden keine signifikanten Veränderungen im Strom mit der Interaktion von Kontrollproteinen festgestellt. Dieses Experiment bestätigt, dass der aktuelle Versuchsaufbau SCC-Ag spezifisch nachweisen/diagnostizieren kann. Weitere Unterstützung lieferten andere Kontrollexperimente durch die Wechselwirkungen von SCC-Ag mit GNS allein und SCC-Ag mit TiO₂ -IDE-Oberfläche beschichtet mit nicht-immunantikörpermarkiertem GNS. Es wurden keine signifikanten Änderungen des Stroms im Vergleich zur spezifischen Interaktion festgestellt (Abb. 7b).

a Selektiver Nachweis von SCC-Ag auf Antikörper- und GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. Interaktionen mit C1-Serpin und C-2-Albumin wurden durchgeführt. Die Oberfläche ist mit den obigen Schritten, bis 1 &mgr;M Ethanolamin blockiert. Die Werte wurden dreifach gemittelt. In beiden Fällen erkannte der Antikörper nur das SCC-Ag, was den spezifischen Nachweis anzeigt. b Kontrollmessungen. Spezifitätsinteraktionen werden mit unspezifischen Interaktionen verglichen. Es wurden deutliche Diskriminierungen festgestellt. Für die Messungen wurde eine lineare Wobbelspannung von 0 bis 2 V bei einer Stufenspannung von 0,01 V verfolgt. Der Fehlerbalken zeigt die gemittelten Werte aus Triplikaten (n = 3) mit den Standardabweichungen im Bereich von ± 0,1 bis 0,15 × 10 ⁻⁹ A

Schlussfolgerung

Kopf- und Halskrebs ist eine häufige Krebserkrankung, die die Bereiche des Mundes, des Rachens und der Speicheldrüsen betrifft. Diagnosing head and neck cancer with a suitable biomarker is mandatory to give the necessary treatment to the patients and improve their lifestyle. SCC-Ag has been found to be one of the important biomarkers for cancers; herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO₂ ). Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO₂ surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO₂ surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO₂ sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All of the data are fully available without restriction.

Abkürzungen

16-MDA:

16-Mercaptoundecanoic acid

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

GNS:

Gold nanostar

IDE:

Interdigitated electrode

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

RT:

Raumtemperatur

SCC-Ag:

Squamous cell carcinoma antigen

SiO₂ :

Silicon dioxide

TiO₂ :

Titanium oxide

UV:

Ultraviolett