Titanoxid-Sensor ermöglicht frühe Nanodetektion von Kopf-Hals-Krebs

Zusammenfassung

Kopf-Hals-Krebs ist eine heterogene Erkrankung, die in den Plattenepithelzellen des Kehlkopfs (Stimmbänder), Mundes, Rachens (Hals), der Nasenhöhle und der Speicheldrüsen entsteht. Eine Diagnose im fortgeschrittenen Stadium beeinträchtigt die Überlebensrate der Patienten erheblich. Es ist daher zwingend erforderlich, diesen Krebs in frühen Entwicklungsstadien mit einem geeigneten Biomarker zu identifizieren. Das Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) ist ein zirkulierender Serum-Tumormarker, dessen erhöhter Spiegel bei Kopf-Hals-Krebs-Patienten gefunden wird und stark mit dem Tumorvolumen korreliert. Die vorliegende Forschung zielte darauf ab, den SCC-Ag-Spiegel auf einem titanoxid (TiO₂)-modifizierten Interdigital-Elektroden-Sensor (IDE) mittels SCC-Ag-Antikörper zu detektieren und zu quantifizieren. Die Detektion von SCC-Ag gelang auf dem Niveau von 100 fM, wurde jedoch auf 10 fM verbessert, als der Antikörper mit Gold-Nanosternen konjugiert war – eine 10-fache Verbesserung. Bemerkenswert ist, dass diese Empfindlichkeitssteigerung 1000-fach höher ist als bei anderen Substraten. Zudem wurde die Spezifität mittels zwei verschiedener Kontrollproteine analysiert; der Antikörper erkannte ausschließlich SCC-Ag, was die spezifische Detektion auf der IDE-TiO₂-Sensoroberfläche belegt.

Einleitung

Kopf-Hals-Krebs zeigt abnormes Zellwachstum im Kopf-Hals-Bereich und wird weltweit häufig berichtet. Er stammt aus Rachen, Mund, Mundschleimhaut, Epithel der Mundhöhle, Speicheldrüsen und Nasenhöhle [1]; ist die sechsthäufigste Krebsart weltweit und betrifft jährlich mehr als 644.000 Menschen [2]. Die meisten Patienten werden im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, was ihre Überlebenschancen stark beeinträchtigt. Eine Früherkennung ist zwingend, um Überleben und Lebensqualität zu verbessern. Serologische Tumormarker werden zur Diagnose und Nachsorge von Kopf-Hals-Krebs eingesetzt. Das Plattenepithel setzt ein prädominantes Plattenepithelkarzinom-Antigen (SCC-Ag) frei, dessen Spiegel bei Krebspatienten erhöht ist. SCC-Ag hat sich als vielversprechender Tumormarker für plattenepithelbezogene Krebserkrankungen wie gynäkologische, Lungen-, Ösophagus- und Analkrebs erwiesen [3, 4]. Bei Kopf-Hals-Krebs wurden höhere SCC-Ag-Spiegel mit Metastasen, Rezidiven und Mortalität in verschiedenen Studien mit Krebspatienten in Verbindung gebracht [5–7]. Forscher fanden, dass Serum-SCC-Ag ein signifikantes Risiko für Krebs im Hypopharynx, in der Mundhöhle und im Kehlkopf darstellt [8, 9]. Zudem bestand eine Korrelation zwischen SCC-Ag-Spiegel und Tumorvolumen bei Kopf-Hals-Krebs-Patienten [10]. Es ist sinnvoll, den SCC-Ag-Spiegel zu quantifizieren, um den Zustand des Kopf-Hals-Krebses zu identifizieren und eine frühzeitige Behandlung zu ermöglichen. Die vorliegende Forschung konzentrierte sich auf die Detektion von SCC-Ag auf niedrigstem Niveau mittels Nanopartikeln auf einem Interdigital-Elektroden-Sensor (IDE) mit SCC-Ag-Antikörper.

IDE ist ein elektrochemischer Biosensor mit vielversprechenden Eigenschaften wie niedrigen Kosten, Portabilität und Empfindlichkeit, was ein breites Anwendungsspektrum ermöglicht, insbesondere in der Umweltüberwachung und medizinischen Diagnostik [11, 12]. Die Verbesserung der elektrischen Eigenschaften auf der Sensoroberfläche erhöht die Biomoleküldetektion. Nanomaterialien werden in Biosensoren breit eingesetzt, um die biomolekulare Detektion auf Sensoroberflächen zu verbessern. Nanomaterialien sind klein, haben große Oberfläche, gute thermische und elektrische Leitfähigkeit, sind biokompatibel und zeigen enormes Potenzial für Biosensoranwendungen [13, 14]. Nanomaterialien werden auf zwei Arten angewendet: zur Oberflächenfunktionalisierung und zur Konjugation des Analyten oder Targets zur Detektionsverbesserung [15]. Gold ist ein etabliertes Nanomaterial, das in verschiedenen Sensoren wie Oberflächenplasmonenresonanz, Wellenleitermodensensoren, elektrochemischen Sensoren und Farbmetrie eingesetzt wird [16–18]. Daneben wurden auch Silber, Graphen, Kupfer und Titannanomaterialien in biomedizinischen Anwendungen genutzt. Als umweltfreundlicher Halbleiter und kostengünstig besitzt Titanoxid (TiO₂) eine breite Bandlücke, die hier zur Oberflächenmodifizierung des IDE zur SCC-Ag-Detektion genutzt wird. Aufgrund der hohen elektrischen und optischen Eigenschaften von TiO₂ wird es breit für Superkondensatoren, Photokatalyse und photoelektrische Umwandlung eingesetzt [19–23]. Zudem sind seine hydrophile Natur und große Oberfläche für die Oberflächenmodifizierung und Detektion von Biomolekülen auf niedrigem Niveau geeignet. In dieser Arbeit wurde TiO₂ auf die IDE-Sensoroberfläche aufgebracht, um den Stromfluss bei Biomolekülwechselwirkungen zu verbessern. Zur Verbesserung der SCC-Ag-Detektion wurde ein Antikörper mit Gold-Nanosternen (GNS-Antikörper) konjugiert und auf der TiO₂-beschichteten Oberfläche immobilisiert. Da bewiesen ist, dass goldnanomaterial-konjugierte Biomoleküle höhere Stabilität aufweisen und ordnungsgemäß orientierte, oberflächenimmobilisierte Biomoleküle liefern, können sie die Nachweisgrenze verbessern [24, 25]. Zudem können mehr Biomoleküle auf einem einzelnen Goldpartikel immobilisiert werden, was erhöhte Mengen des Zielmoleküls anzieht. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Nanomaterialien – TiO₂ (für Oberflächenmodifizierung) und GNS (für Antikörperkonjugation) – eingesetzt, um die SCC-Ag-Detektion auf der IDE-Sensoroberfläche zu verbessern. Die Anwendung von GNS soll die Leistung des aktuellen Sensors durch seine größere Oberfläche zur Bindung mehrerer Antikörper steigern.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

SCC-Antigen (ein Glykoprotein mit Isoformen von 45–55 kDa) wurde von Randox Life Sciences (Malaysia) bezogen. Anti-SCC-Antikörper stammte von Next Gene (Malaysia). (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES), Ethanolamin, Albumin (ein Hauptblutprotein bei 45 mg/mL; 50–70 % der Bluteiweiße, Molekulargewicht 66,5 kDa), Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS; pH 7,4) und Titan(IV)-isopropoxid kamen von Sigma Aldrich (USA). Serpin (ein weit verbreitetes Serinprotease-Inhibitor mit Molekulargewicht 40–50 kDa) wurde von Sino Biological (China) bezogen. Gold-Nanosterne wurden wie von Shan et al. [26] beschrieben synthetisiert. Alle Reagenzien und Chemikalien wurden gemäß Herstellerempfehlung gelagert.

Herstellung der Interdigital-Elektroden

Das Grunddesign und die Fertigung der IDE folgten früheren Berichten [27]. Zunächst wurde der Siliziumwafer mit Standardreinigungslösungen gereinigt, und eine Aluminium-IDE-Elektrode wurde durch traditionelles Nassätzen auf dem Siliziumwafer abgeschieden. Dann wurde positiver Photolack auf die Siliziumwaferoberfläche aufgebracht, gefolgt von thermischer Oxidation. Die Aluminiumabscheidung erfolgte per Photolithografie in drei Schritten: Schritt 1 bei 1200 rpm für 10 s, Schritt 2 bei 3500 rpm für 20 s, gefolgt von 500 rpm für 10 s. Anschließend wurde UV-Licht auf die Sensoroberfläche belichtet, um das IDE-Muster auf die Probenoberfläche zu übertragen. Danach wurde RD-6-Entwickler 15 s für den Entwicklungsprozess verwendet. Photoresistenz wurde durchgeführt, um unbelichtete Bereiche zu entfernen. Die entwickelte Probe wurde bei 100 °C gebacken, um Feuchtigkeit zu entfernen und die Haftung zwischen der SiO₂-Schicht und dem Aluminium zu verbessern. Schließlich wurde mit 23 s Aluminiumätzer der unbelichtete Bereich entfernt und mit Aceton gereinigt. Die finale Oberfläche wurde mit TiO₂ modifiziert, um SCC-Ag zu detektieren. Die gefertigte IDE-Oberfläche wurde unter Hochleistungsmikroskopie und 3D-Nanoprofilometer beobachtet. Bilder wurden mit dem zugehörigen System bei 50-facher Vergrößerung aufgenommen.

Beschichtung von TiO₂ auf der IDE-Sensoroberfläche

Auf der gefertigten IDE-Oberfläche wurde TiO₂-Lösung aufgebracht; Titan(IV)-isopropoxid diente als Vorläufer zur Herstellung der TiO₂-Lösung. Dazu wurde Ethanol mit Titan(IV)-isopropoxid gemischt und 5 min kräftig gerührt. Anschließend wurde der Stabilisator (100 µL Essigsäure) unter Rühren zugegeben und auf einer Heizplatte bei 85 °C erhitzt. Das molare Verhältnis der Mischung wurde auf 9:1:0,1 (Ethanol zu TIP zu Essigsäure) festgelegt. Nach 3 h Mischen wurde eine klare Lösung erhalten. Nach 24 h Alterung wurde die Lösung per Spin-Coater (2000 rpm) auf Siliciumdioxid (SiO₂)-Substrate aufgebracht. Nach dem Beschichten wurde die Oberfläche 15 min bei 175 °C getrocknet und 1 h bei 450 °C geglüht. Der TiO₂-Dünnfilm erreicht nach drei Beschichtungsschichten ausreichende Dicke.

Herstellung von GNS-konjugiertem Anti-SCC-Ag

SCC-Ag-Antikörper wurde mittels des Linkers 16-Mercaptoundecansäure (16-MDA) auf GNS immobilisiert. Zunächst wurde 5 mM verdünnte 16-MDA mit 100 µL GNS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur (RT) belassen. Die gebundene 16-MDA an GNS wurde durch Zentrifugation bei 13.000×g, 5 min entfernt. Der gewonnene Goldpellet wurde mit EDC (400 mM) und NHS (50 mM) im Verhältnis 1:1 durch 15 min Inkubation bei RT aktiviert. Ungebundenes EDC und NHS wurden durch Zentrifugation bei 13.000×g, 5 min eliminiert. Der Pellet mit aktiviertem GNS wurde gesammelt, um den Antikörper zu konjugieren. Anschließend wurde 200 nM SCC-Ag-Antikörper mit EDC-NHS-aktiviertem GNS gemischt und 1 h bei RT belassen. Schließlich wurden ungebundene Antikörper durch Zentrifugation bei 13.000×g, 5 min entfernt. Der mit GNS konjugierte Antikörper wurde bei 4 °C zur weiteren Verwendung aufbewahrt, und die Konjugation wurde durch UV-Vis-Spektroskopie bestätigt. Der Scan erfolgte im Bereich 480–560 nm, und die Peaks wurden bestimmt.

Immobilisierung von GNS-Antikörper auf TiO₂-IDE-Oberfläche

Die TiO₂-beschichtete IDE-Oberfläche wurde durch APTES in Amin-Funktionalität modifiziert, um GNS-Antikörper zu immobilisieren. 3 % APTES (verdünnt in 30 % Ethanol) wurde auf die TiO₂-Oberfläche aufgebracht und 3 h bei RT belassen. Die Oberfläche wurde dreimal mit 30 % Ethanol gewaschen, um ungebundenes APTES zu entfernen. Zur Antikörperimmobilisierung folgte der oben beschriebene Aktivierungsschritt. Der Antikörper oder GNS-Antikörper wurde auf die Oberflächen aufgebracht und 1 h zur vollständigen Immobilisierung belassen. Schließlich wurde die Oberfläche fünfmal mit PBS-Puffer gewaschen, um ungebundene Antikörper vollständig zu entfernen. Diese Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen wurden zur SCC-Ag-Detektion verwendet und verglichen. Die GNS-Antikörper-immobilisierte TiO₂-Oberfläche wurde per Rasterkraftmikroskopie (AFM), Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie (FETEM) und energiedispersiver Röntgenanalyse (EDX) analysiert [15]. AFM-Beobachtungen erfolgten im 5-µm-Maßstab, SEM bei 100 nm bei 15 kV. Die Elementzusammensetzung wurde durch EDX bestimmt.

Detektion von SCC-Antigen auf Antikörper/Gold-Nanostern-Antikörper-Oberflächen

Zur Detektion von SCC-Ag wurden Antikörper- oder Gold-Nanostern-Antikörper-modifizierte TiO₂-IDE-Oberflächen mit 1 M Ethanolamin blockiert, um antikörperfreie Bereiche zu maskieren, und 30 min bei RT belassen. Auf der ethanolamin-blockierten Oberfläche interagierte 1 nM SCC-Ag, und die Stromantworten wurden vor und nach der SCC-Ag-Zugabe notiert. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurde SCC-Ag von 10 fM bis 1 nM titriert und einzeln auf die Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen aufgebracht; die Stromänderungen wurden notiert. Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt und statistisch ausgewertet. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für die Messungen verwendet. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde als niedrigste Analytkonzentration (aus der Kalibriergeraden bei niedrigen Konzentrationen) gegenüber dem Hintergrundsignal (S/N = 3:1) definiert, d.h. LOD = Standardabweichung der Baseline + 3σ.

Selektive Detektion von SCC-Ag

Um die selektive Interaktion von SCC-Ag mit seinem Antikörper zu prüfen, wurden Kontrollexperimente mit zwei verschiedenen Proteinen durchgeführt: Serpin und Albumin. Eine 1-nM-Konzentration dieser Kontrollproteine wurde auf Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierte Oberflächen aufgebracht, und die Stromänderungen vor und nach der Interaktion wurden notiert. Diese Strompegel wurden mit der spezifischen Detektion von SCC-Ag durch seinen Antikörper und GNS-Antikörper verglichen. Weitere Kontrollexperimente umfassten die Interaktion von SCC-Ag mit GNS allein und SCC-Ag mit TiO₂-IDE-Oberfläche, die mit nicht-immunem Antikörper-markiertem GNS beschichtet war. Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt und statistisch ausgewertet. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für die Messungen verwendet.

Ergebnisse und Diskussion

Kopf-Hals-Krebs wird als verschiedene Tumoren in oder um Nase, Mund, Kehlkopf und Nasennebenhöhlen beschrieben [28]. Früherkennung und Behandlung mit einem geeigneten Biomarker sind zwingend, um die Überlebensrate der Patienten zu verbessern. SCC-Ag erwies sich als geeigneter Serum-Biomarker für Kopf-Hals-Krebs; hier wurden Experimente zur Detektion und Quantifizierung des SCC-Ag-Spiegels auf einem titanoxid-modifizierten Interdigital-Elektroden-Sensor (IDE-TiO₂) mittels seines Antikörpers durchgeführt. TiO₂ wird hier verwendet, um die Stromantwort bei Biomolekülwechselwirkungen zu verbessern. Im Vergleich zu anderen Nanomaterialien gilt TiO₂ als attraktiv für elektrochemische Sensoren aufgrund seines aktiven Verhaltens an der Oberfläche entlang der Elektroden und der Verbesserung der elektrokatlytischen Aktivität. Zudem verleiht es der Oberfläche mehr Stabilität, was die Wiederholbarkeit der Elektrodenantwort und die Verbesserung der Nachweisgrenze durch Erhöhung des Spitzenstroms ermöglicht [29–31]. Um diese positive Eigenschaft zu nutzen, wurde in dieser Arbeit TiO₂ auf die IDE-Oberfläche aufgebracht (IDE-TiO₂), was den Stromfluss verbessert. Ein weiteres Nanomaterial, GNS, wurde verwendet, um Anti-SCC-Ag-Antikörper auf der IDE-TiO₂-Oberfläche zu immobilisieren und die Nachweisgrenze zu verbessern. Da bewiesen ist, dass goldkonjugierte Biomoleküle auf immobilisierten Oberflächen die Detektion des Targets verbessern [32, 33], wurde hier SCC-Ag mit Antikörper- und GNS-Antikörper-modifizierten IDE-TiO₂-Oberflächen detektiert und verglichen. Wie allgemein bekannt, führt eine Vergrößerung der Nanopartikeloberfläche zu einer verbesserten biomolekularen Anbindung. In diesem Kontext hat GNS eine größere Oberfläche als kugelförmige Goldnanopartikel. Um diese Idee umzusetzen, wurde das vorliegende Experiment mit GNS zur Sensitivitätssteigerung durchgeführt.

Oberflächencharakterisierung und GNS-Antikörper-Immobilisierung

Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der SCC-Ag-Detektion auf der IDE-TiO₂-Sensoroberfläche. Wie in Abb. 1a dargestellt, wurde die IDE-Sensoroberfläche zunächst mit TiO₂ beschichtet und dann der Antikörper mit oder ohne GNS-Konjugation immobilisiert. Diese Antikörper-modifizierten Oberflächen dienten zur Detektion des SCC-Ag-Spiegels. Vor der Detektion wurde die Konjugation von GNS mit Antikörper durch UV-Vis-Spektroskopie bestätigt. Die GNS-Scanprofile mit dem gewünschten Wellenlängenbereich vor und nach der Antikörperkonjugation wurden bestimmt. Es war deutlich sichtbar, dass nach der Immobilisierung der Peak von 535 auf 545 nm verschoben wurde (Abb. 1b). Dies bestätigt die Antikörperkonjugation auf der GNS-Oberfläche. Andererseits wurde die gefertigte Sensoroberfläche morphologisch untersucht. Abb. 2a zeigt das Hochleistungsmikroskopiebild, Abb. 2b das 3D-Nanoprofilometerbild. Beide Bildprofile zeigen eindeutig Lücken- und Elektrodenbereiche, die die Finger bilden. Die Anordnung der Lücken und Finger erschien einheitlich und intakt.

a Schematische Darstellung der SCC-Ag-Detektion. IDE-TiO₂-Oberfläche wurde durch APTES in Amin modifiziert, gefolgt von Antikörper- oder GNS-Antikörper-Immobilisierung. Die Aminogruppe aus APTES reagiert mit der Carboxylgruppe am Antikörper. SCC-Ag wurde durch Interaktion am antigene Region detektiert und verglichen. b UV-Vis-Spektroskopie-Messungen mit GNS. Scan im Bereich 480–560 nm, Peakmaxima ~ 530 nm. GNS mit und ohne Antikörper sind durch Pfeile markiert

a Hochleistungsmikroskopiebild auf IDE-Oberfläche. Aufnahmen bei 50-facher Vergrößerung. b 3D-Nanoprofilometerbild auf IDE-Oberfläche. Aufnahmen bei 50-facher Vergrößerung. Elektroden- und Lückenbereiche sind dargestellt. Lücken sind durch Sterne markiert. Einheitliche Anordnung zeigt erfolgreiche Fertigung. c Rasterkraftmikroskopiebild. AFM zeigt klare Unterscheidung zwischen TiO₂ und GNS durch dunkle und helle Flecken. d Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopiebild. e Energiedispersive Röntgenanalyse. Zeigt die auf der Oberfläche gefundenen Elemente

Vergleich der Antikörper- und GNS-Antikörper-Immobilisierung auf TiO₂-IDE-Sensoroberflächen

SCC-Ag wurde auf TiO₂-IDE-Oberfläche durch Antikörper- oder GNS-Antikörper-immobilisierte Oberflächen detektiert. Die Anbindung von GNS auf der TiO₂-Oberfläche wurde durch AFM, SEM und EDX-Analyse bestätigt (Abb. 2c). Unter AFM-Beobachtung war eine klare Unterscheidung zwischen TiO₂ und GNS durch dunkle und helle Flecken sichtbar. Dies wurde durch SEM- und EDX-Analysen gestützt, in denen markante Gold- und moderate Titanpeaks beobachtet wurden. Diese Ergebnisse belegen das Vorhandensein von GNS auf der TiO₂-Oberfläche. Abb. 3 zeigt die Immobilisierungsprozesse von Antikörper und GNS-Antikörper auf den amin-modifizierten IDE-TiO₂-Sensoroberflächen. Die TiO₂-modifizierte IDE-Sensoroberfläche zeigt einen Strompegel von 4,65E−12 (Abb. 3a). Nach Zugabe von APTES stieg der Strompegel auf 5,37E−11; dieser Anstieg zeigte an, dass die Oberfläche durch APTES in Amin modifiziert wurde. Bei Antikörperimmobilisierung änderte sich der Strompegel von 5,375E−11 auf 1,05E−9. Der Stromunterschied betrug 1,04E−9 (Abb. 3a). Diese Immobilisierung erfolgte durch chemische Interaktion der Aminogruppe aus APTES und der COOH-Gruppe im Antikörper [18]. Die Stromänderungen bestätigten die Bindung des Antikörpers auf der APTES-modifizierten Oberfläche. Anschließend wurde die verbleibende Oberfläche mit 1 M Ethanolamin bedeckt, um den Biofouling-Effekt durch unspezifische Bindung von Biomolekülen auf der Sensoroberfläche zu reduzieren. Ebenso wurde GNS-Antikörper auf TiO₂-IDE-Oberfläche immobilisiert; dabei stieg der Strompegel von 4,41E−12 auf 1,23E−9 (Abb. 3b). Es zeigte sich deutlich, dass bei Antikörperimmobilisierung auf GNS-Oberfläche eine höhere Antwort auf der amin-modifizierten Oberfläche erzielt wird. Dies könnte an der größeren Anzahl an Antikörpern liegen, die auf der Oberfläche eines einzelnen GNS binden, und der starken Bindung dieses Komplexes auf der amin-modifizierten Oberfläche. Diese Bindung erfolgt, da die aminterminale Gruppe im APTES die Citratgruppen auf GNS verdrängt und chemisch auf der APTES-modifizierten IDE-Oberfläche fixiert wird [34]. Bekanntlich hängt die Detektion von Biomolekülen auf Sensoroberflächen hauptsächlich von zwei Faktoren ab: Bindungsaffinität der interagierenden Moleküle und ordnungsgemäße Oberflächenimmobilisierung der Moleküle auf der Sensoroberfläche. Höhere biomolekulare Immobilisierung auf der Sensoroberfläche verbessert die Detektion eines Targets auf niedrigem Niveau drastisch. In dieser Arbeit wurde GNS verwendet, um Anti-SCC-Ag-Antikörper auf IDE-TiO₂-Oberfläche zu immobilisieren, um die Chance höherer Antikörperbindung zu erhöhen, was zu effizienter SCC-Ag-Detektion führt.

Immobilisierungsprozesse auf IDE-TiO₂-Oberflächen. a Mit Antikörper. b Mit GNS-Antikörper. Oberflächenmodifikationen begannen mit 3 % APTES, gefolgt von EDC- und NHS-Aktivierung zur Antikörperimmobilisierung; 1 M Ethanolamin blockierte ungebundene Antikörperbereiche. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für Messungen verwendet. Korrekte Stromänderungen nach jeder Immobilisierung bestätigten die Bindung von Antikörper und GNS-Antikörper auf den Sensoroberflächen

Vergleichende Detektion von SCC-Ag auf IDE-TiO₂-Oberfläche durch Antikörper oder GNS-Antikörper

Da GNS-Antikörper eine effiziente Immobilisierung auf IDE-TiO₂-Oberfläche zeigte, wurde dieselbe 1-nM-Konzentration von SCC-Ag auf sowohl Antikörper- als auch GNS-Antikörper-Oberflächen detektiert und die Stromänderungen verglichen. Abb. 4a zeigt die 1-nM-SCC-Ag-Detektion auf einer Antikörper-modifizierten Oberfläche. Vor der Detektion wurde die Antikörper-modifizierte Oberfläche mit dem Blockiermittel Ethanolamin bedeckt, um unspezifische Bindung von Biomolekülen zu vermeiden. Ethanolamin zeigte eine Stromänderung von 4,65E−12. Nach Zugabe von 1 nM SCC-Ag stieg der Strompegel auf 1,33E−09. Diese Stromänderungen zeigten deutlich die Bindung von SCC-Ag an seinen Antikörper. Im Fall der GNS-Antikörper-Oberfläche zeigte Ethanolamin einen Strompegel von 1,33E−11; nach Zugabe von 1 nM SCC-Ag stieg er auf 1,62E−09 (Abb. 4b). Die Stromänderungen mit GNS-Antikörper waren höher als mit reinem Antikörper bei gleicher SCC-Ag-Konzentration. Dies könnte an der höheren Anzahl an Antikörpern liegen, die über GNS auf der IDE-TiO₂-Oberfläche gebunden sind.

SCC-Ag-Detektion mit a Antikörper und b GNS-Antikörper. Getestet auf IDE-TiO₂-Oberflächen mit den obigen Schritten bis 1 M Ethanolamin-Blockierung. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für Messungen verwendet. Nach Interaktion von 1 nM SCC-Ag stiegen die Strompegel in beiden Fällen; gleichzeitig zeigte GNS-Antikörper eine höhere Stromänderung

Nachweisgrenze von SCC-Ag auf IDE-TiO₂-Oberfläche durch Antikörper oder GNS-Antikörper

Antikörper- oder GNS-Antikörper-modifizierte Oberflächen zeigen klare Detektion von SCC-Ag, und die Nachweisgrenze wurde auf beiden Oberflächen zum Vergleich geschätzt (Abb. 5a, b). Dazu wurden Konzentrationen von 10 fM bis 1 nM SCC-Ag verdünnt und einzeln auf diese Oberflächen aufgebracht, die Stromänderungen notiert. Abb. 5a zeigt die verschiedenen SCC-Ag-Konzentrationen auf der Antikörper-modifizierten Oberfläche. Nach Ethanolamin interagierte 10 fM SCC-Ag, und es wurde keine Stromänderung festgestellt. Bei Erhöhung auf 100 fM gab es eine geringe Stromänderung von 4,65E−12 auf 6,54E−11. Weitere Erhöhung auf 1 pM, 10 pM, 100 pM und 1 nM führte zu Strompegeln von 4,69E−10, 7,91E−10, 8,78E−10 und 1,33E−09. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass mit steigender Konzentration die Bindung zunimmt. Die Nachweisgrenze wurde basierend auf 3σ berechnet und lag bei 100 fM (Abb. 6a).

Dosisabhängige Interaktionen mit a Antikörper und b GNS-Antikörper auf IDE-TiO₂-Oberflächen. Die Oberfläche entspricht den obigen Schritten bis 1 M Ethanolamin-Blockierung. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für Messungen verwendet. SCC-Ag-Konzentrationen von 10 fM bis 10 nM interagierten auf beiden Oberflächen, die Stromänderungen wurden notiert. Waschen erfolgte mit fünf Reaktionsvolumina pro Schritt mittels 10 mM PBS (pH 7,4). Mit steigenden SCC-Ag-Konzentrationen stiegen die Strompegel in beiden Fällen allmählich. GNS-Antikörper zeigt Stromänderungen ab 10 fM, während bei reinem Antikörper Änderungen ab 100 fM festgestellt wurden. In beiden Fällen zeigte 1 nM SCC-Ag Sättigung. Bei weiterer Konzentrationserhöhung konnten keine signifikanten Stromänderungen beobachtet werden

Vergleich der Stromänderungen mit unterschiedlichen SCC-Ag-Konzentrationen auf Antikörper- und GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. a Lineare Regressionsgrafik für die Nachweisgrenze von SCC-Ag. Mit Antikörper (rote Linie) und mit GNS-Antikörper (blaue Linie) sind dargestellt. Die Nachweisgrenze betrug 10 fM mit GNS-Antikörper und 100 fM mit reinem Antikörper. b Stromänderungen bei SCC-Ag- und Antikörper-Interaktion. Bei allen Konzentrationen wurde ein höherer Stromänderungspegel auf GNS-Antikörper-Oberfläche gefunden. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für Messungen verwendet. Fehlerbalken geben gemittelte Werte aus Triplikaten (n = 3) mit Standardabweichungen im Bereich ± 0,1 bis 0,15 × 10⁻⁹ A an. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde als niedrigste Analytkonzentration (aus der Kalibriergeraden bei niedrigen Konzentrationen) gegenüber dem Hintergrundsignal (S/N = 3:1) definiert, d.h. LOD = Standardabweichung der Baseline + 3σ

Dieselben SCC-Ag-Konzentrationen interagierten unabhängig auf GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. Beim Aufbringen von 10 fM SCC-Ag auf die Oberfläche änderte sich der Strom eindeutig von 1,33E−11 auf 3,74E−11. Dies zeigt, dass selbst 10 fM SCC-Ag klar mit der GNS-Antikörper-immobilisierten Oberfläche interagieren kann, was mit reinem Antikörper nicht detektierbar war. Bei Erhöhung auf 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM und 1 nM stiegen die Strompegel weiter auf 4,69E−10, 9,23E−10, 1,41E−09, 1,48E−09 und 1,62E−09 (Abb. 5b). Die statistischen Berechnungen mit Standardabweichungen liegen im Bereich ± 0,1 bis 0,15 × 10⁻⁹ A. Im Vergleich der Sensierung auf den beiden Oberflächen zeigt die GNS-Antikörper-modifizierte Oberfläche höhere Stromänderungen bei allen getesteten SCC-Ag-Konzentrationen (Abb. 6b). Basierend auf 3σ wurde die Nachweisgrenze als 10 fM bestimmt (Abb. 6a), was eine 10-fach bessere (niedrigere) Detektion im Vergleich zur reinen Antikörper-modifizierten Oberfläche darstellt. Die statistischen Berechnungen mit Standardabweichungen liegen im Bereich ± 0,1 bis 0,15 × 10⁻⁹ A. Zuvor wurde SCC-Ag auf verschiedenen Nanomaterialien wie Strontium-Nanopartikeln und Graphen evaluiert; diese Oberflächen zeigten jedoch ~1000-fach geringere Sensitivität im Vergleich zur vorliegenden Studie [35].

Selektive Detektion von SCC-Ag auf Antikörper/GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen

Die selektive Detektion von SCC-Ag wurde mit zwei Kontrollproteinen verglichen: Serpin und Albumin, die im Blutstrom reichlich vorhanden sind. Serpin ist ein Protease-Inhibitor mit verschiedenen physiologischen Funktionen und biologischen Prozessen, während Albumin 45 mg mL⁻¹ ausmacht und 50–70 % des Blutserums beiträgt. Wie in der Abbildung gezeigt, wurde 1 nM dieser beiden Kontrollproteine und SCC-Ag einzeln auf Antikörper- oder GNS-Antikörper-Oberflächen aufgebracht (Abb. 7a); es war deutlich zu sehen, dass Stromänderungen nur bei SCC-Ag in beiden Fällen auftraten, was bedeutet, dass der Antikörper ausschließlich SCC-Ag erkennt. Es wurden keine signifikanten Stromänderungen bei der Interaktion der Kontrollproteine festgestellt. Dieses Experiment bestätigt, dass der vorliegende Versuchsaufbau SCC-Ag spezifisch detektieren/diagnostizieren kann. Weitere Stützen lieferten Kontrollexperimente durch Interaktionen von SCC-Ag mit GNS allein und SCC-Ag mit TiO₂-IDE-Oberfläche, die mit nicht-immunem Antikörper-markiertem GNS beschichtet war. Es wurden keine signifikanten Stromänderungen im Vergleich zur spezifischen Interaktion festgestellt (Abb. 7b).

a Selektive Detektion von SCC-Ag auf Antikörper- und GNS-Antikörper-modifizierten Oberflächen. Interaktionen mit C1-Serpin und C2-Albumin wurden durchgeführt. Die Oberfläche entspricht den obigen Schritten bis 1 M Ethanolamin-Blockierung. Werte wurden durch Triplikate gemittelt. In beiden Fällen erkannte der Antikörper nur SCC-Ag, was die spezifische Detektion belegt. b Kontrollmessungen. Spezifische Interaktionen werden mit unspezifischen verglichen. Klare Diskriminierungen waren sichtbar. Ein linearer Spannungssweep von 0 bis 2 V bei 0,01 V Schritting wurde für Messungen verwendet. Fehlerbalken geben gemittelte Werte aus Triplikaten (n = 3) mit Standardabweichungen im Bereich ± 0,1 bis 0,15 × 10⁻⁹ A an

Fazit

Kopf-Hals-Krebs ist ein häufiger Krebs, der Mund, Rachen und Speicheldrüsen betrifft. Die Diagnose mit einem geeigneten Biomarker ist zwingend, um Patienten die notwendige Behandlung zu geben und ihre Lebensqualität zu verbessern. SCC-Ag hat sich als einer der wichtigen Biomarker für Krebserkrankungen erwiesen; hier wurde SCC-Ag auf der titanoxid-beschichteten Interdigital-Elektroden-Sensoroberfläche (IDE-TiO₂) detektiert. Antikörper für SCC-Ag wurde auf IDE-TiO₂-Oberfläche immobilisiert und detektierte SCC-Ag. Die Nachweisgrenze betrug 100 fM, und eine weitere Verbesserung wurde durch Konjugation des Antikörpers mit Gold-Nanostern (GNS-Antikörper) erzielt. Die Nachweisgrenze wurde um das 10-fache verbessert (auf 10 fM), was möglicherweise auf die größere Anzahl an Antikörpern zurückzuführen ist, die über GNS auf der amin-modifizierten TiO₂-Oberfläche gebunden sind. Zudem wurden Kontrollexperimente mit zwei verschiedenen Proteinen durchgeführt, die nicht vom Anti-SCC-Ag erkannt wurden, was die selektive Detektion von SCC-Ag anzeigt. Die demonstrierte IDE-TiO₂-Sensoroberfläche hilft bei der Diagnose von Kopf-Hals-Krebs; eine Strategie kann für die Früherkennung verfolgt werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt vollständig verfügbar.

Abkürzungen

16-MDA:

16-Mercaptoundecansäure

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilan

GNS:

Gold-Nanostern

IDE:

Interdigital-Elektrode

PBS:

Phosphat-gepufferte Salzlösung

RT:

Raumtemperatur

SCC-Ag:

Plattenepithelkarzinom-Antigen

SiO₂:

Siliciumdioxid

TiO₂:

Titanoxid

UV:

Ultraviolett