Abstimmung der Oberflächenchemie von Polyetheretherketon durch Goldbeschichtung und Plasmabehandlung

Hintergrund

Eines der Probleme des menschlichen Alterns ist das Tragen von Gelenken, die mit einer starken Zunahme verschiedener Erkrankungen des Skelett- und Gelenksystems zusammenhängen, einschließlich Frakturen, Wirbeldegenerationen, Arthritis und Knochentumoren. Orthopädische Operationen mit künstlichen Implantaten sind derzeit die wichtigste Methode zur strukturellen und funktionellen Erneuerung von geschädigten Knochen und Gelenken. Üblicherweise für orthopädische Implantate verwendete Materialien sind insbesondere Metalle, Keramiken, Polymere und Verbundstoffe. Metallimplantate (z. B. Gold) werden in der klinischen Praxis häufig als dauerhafter Ersatz (z. B. Hüftersatz, künstliche Zähne) oder als Schläfenprothesen (z. B. Bandscheiben, Scharniere, Schrauben und Stäbe zur Fixation von Frakturen) verwendet. Metalle werden aufgrund ihrer mechanischen Festigkeit, Verschleißfestigkeit und Ungiftigkeit bevorzugt [1,2,3]. Andererseits sind ihre hohe mechanische Festigkeit und geringe Elastizität mit dem menschlichen Skelettgewebe unverträglich. Dies kann sich negativ auf ein Knochenimplantat auswirken, was zur Resorption von angrenzendem Knochengewebe und zur Freisetzung des Implantats führen kann. Polymere wie ultrahochmolekulares Polyethylen (UHMWPE), Polytetrafluorethylen (PTFE), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polylactid (PLA), Polyglycolid (PGA) und Polyhydroxybutyrat (PHB) werden in zahlreichen biomedizinischen Anwendungen eingesetzt. Als Knochen- oder Gelenkersatz wurden jedoch nur wenige Polymere eingesetzt, da sie tendenziell zu flexibel und zu schwach sind, um den Anforderungen an mechanische orthopädische Implantate gerecht zu werden [4, 5].

Polyetheretherketon (PEEK) ist ein semikristallines lineares polyzyklisches aromatisches thermoplastisches Polymer, das erstmals 1978 synthetisiert wurde [6]. PEEK wird häufig als Material für Zwischenwirbelspacer und Knochenschrauben verwendet [7, 8]. Aufgrund seiner besonderen chemischen Struktur weist PEEK eine hohe Beständigkeit gegenüber chemischen und physikalischen Veränderungen auf [6, 9, 10]; außerdem ist es verschleißfest und bei hohen Temperaturen stabil [6]. Darüber hinaus wurde die Biokompatibilität von PEEK sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen und verursacht keine toxischen oder mutagenen Wirkungen [11,12,13]. Sein großer Vorteil ist die Elastizität ähnlich der eines menschlichen Knochens, die eine ausgewogene Gewichtsverteilung zwischen Implantat und Knochen ermöglicht; daher gibt es nach der Implantation keinen Stress-Shielding-Effekt. PEEK weist jedoch hydrophobe und bioinerte Eigenschaften auf, die für die Proteinadsorption und Zelladhäsion nicht günstig sind [14, 15]. Um diese Eigenschaften zu verbessern, muss die PEEK-Oberfläche daher modifiziert werden.

Oberflächeneigenschaften von Materialien können durch verschiedene Techniken eingestellt werden [16]. Eine dieser Methoden ist die Modifizierung einer Biopolymeroberfläche durch Plasma, das ionisiertes Gas verwendet, das in einem geschlossenen Reaktorsystem erzeugt wird, das Gas unter niedrigem Druck und eine Vorrichtung zur elektromagnetischen Gasanregung enthält. Im Vergleich zu Nasstechniken ist die Plasmamodifikation einer Biopolymeroberfläche für die chemische Flexibilität vorteilhaft. Elektromagnetisch erzeugte reaktive Partikel interagieren mit der Biopolymeroberfläche in einem Reaktor und bewirken eine Veränderung ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften. Mechanische, elektrische und optische Eigenschaften der Materialmasse, die für ihre Anwendung relevant sind, bleiben unverändert [17], was für Design, Entwicklung und Herstellung biokompatibler Polymere von Vorteil ist. Ein weiteres Verfahren, das verwendet wird, um die Eigenschaften von Polymeroberflächen zu verbessern, ist Kathodenzerstäubung. Die Integration von Goldnanopartikeln in einen dünnen Film ist für verschiedene Anwendungen wichtig, beispielsweise für das Tissue Engineering und die biologische Sensorik [18]. Die Nanopartikelgröße beeinflusst das Verhalten und die Oberflächeneigenschaften der Materialoberfläche (z. B. Dichte, Gitterparameter, elektrische und optische Eigenschaften) [19]. Insbesondere Nanopartikel, die kleiner als 100 nm sind, verbessern oft die Zelladhäsion und -proliferation [20].

Das Ziel dieser Arbeit war die Bildung von Nanostrukturen auf PEEK sowohl durch Plasmabehandlung als auch durch Goldabscheidung, um die Zelladhäsion und -proliferation zu verbessern, insbesondere von embryonalen Fibroblasten der Maus (L929). Die Oberflächeneigenschaften (Polarität, Oberflächenchemie und Struktur) vor und nach der Behandlung wurden durch verschiedene Techniken (Gravmetrie, Goniometrie, Röntgenphotoelektronenspektroskopie und elektrokinetische Analyse) bewertet. Ferner wurde Rasterkraftmikroskopie verwendet, um die Oberflächenmorphologie und -rauheit von PEEK zu untersuchen. Die Ergebnisse werden im Kontext potenzieller biomedizinischer Anwendungen diskutiert, hauptsächlich für eine mögliche Verwendung bei der Konstruktion von Wirbelsäulenimplantaten und anderen Ersatzprodukten für die Orthopädie und Traumatologie.

Methoden

Materialien und Modifikationen

Eine PEEK-Folie (Dicke 50 μm, Dichte 1,26 g cm ⁻³ , geliefert von Goodfellow Ltd., UK) wurde für alle Experimente verwendet. Alle PEEK-Proben (rund, ø = 2 cm) wurden mit Plasma behandelt, gefolgt von einer Goldbeschichtung der Hälfte jeder Probe. PEEK-Proben wurden in direktem (Glühen, Diode) Ar ⁺ . behandelt Plasma mit Balzers SCD 050 (BalTec AG, Pfäffikon, CH) unter den in [18, 21] beschriebenen Bedingungen. Die Behandlungszeiten betrugen 60 und 240 s und die Entladungsleistung betrug 8,3 W. Die Goldbeschichtung von PEEK wurde mit einem Balzers SCD 050-Gerät von einem Goldtarget (Reinheit von 99,95 %, geliefert von Safina Ltd., CZ) durchgeführt. Die Abscheidungsbedingungen waren DC Ar ⁺ Plasma; Gasreinheit von 99,995%; Sputterzeiten von 30, 150 und 300 s, Strom von 40 mA (Entladeleistung 15 W); und Gesamtar ⁺ Druck. Der Elektrodenabstand, die Leistungsdichte und die durchschnittliche Abscheidungsrate wurden ähnlich wie in [18, 22] beschrieben eingestellt. Die vorbereiteten Proben wurden unter Laborbedingungen (24 °C, 40–60 % Luftfeuchtigkeit) gelagert [23].

Messtechniken

Gravimetrie

Die mittlere Dicke der Goldfilme wurde durch Gravimetrie unter Verwendung einer Mettler Toledo UMX2-Mikrowaage gemessen. Die Dicke wurde aus den Probengewichten vor und nach dem Sputtern unter Verwendung der Schüttdichte von Gold berechnet. Für die Messung wurden zehn Proben jeder Modifikationsart verwendet. Der Fehler der gravimetrischen Messung lag unter 15 %.

Kontaktwinkel

Die Benetzbarkeit der Proben wurde durch Messung ihrer Oberflächenwasserkontaktwinkel (WCA) bestimmt. Darüber hinaus wurde die Charakterisierung von Struktur- und Zusammensetzungsänderungen durch Plasmabehandlung und Goldabscheidung durch das Tropfenformanalysesystem DSA 100 (KRÜSS GmbH, DE) bei Raumtemperatur (24 °C, 40–60 % Luftfeuchtigkeit) bestimmt [23]. Wassertropfen von 2,0 ± 0,2 μL wurden mit einer Edelstahlnadel auf die getesteten Proben aufgebracht. Bilder der Tropfen wurden mit einer Verzögerung von 2 s aufgenommen. Anschließend wurden die Kontaktwinkel mit dem ADVANCE-System ausgewertet. Mindestens sieben Messungen verschiedener Positionen an mindestens drei Replikaten jeder Probe wurden durchgeführt und gemittelt, um den endgültigen WCA und seine Standardabweichung zu erhalten. Die Messung des WCA wurde an 14 Tagen "gealterten" Proben durchgeführt.

Röntgen-Photoelektronen-Spektroskopie

Die chemische Zusammensetzung der präparierten Proben wurde aus Röntgen-Photoelektronenspektren (XPS) bestimmt (drei Messungen) mit dem Omicron Nanotechnology ESCAProbeP-Spektrometer (geliefert von der Omicron Nanotechnology GmbH, DE) mit einem relativen Fehler von 10 %. Die Abmessungen der exponierten und analysierten Fläche betrugen 2 × 3 mm ² . . Die Messbedingungen wurden in [18, 21] beschrieben. Der charakteristische Kohlenstoff (1s ), Sauerstoff (1s ) und Gold (4f ) Peaks gesucht wurden. Die Messung wurde im Ultraleichtvakuum durchgeführt. Die Auswertung der aufgenommenen Spektren erfolgte mit dem CasaXPS-Code [24]. Die für die Messung verwendeten Proben wurden 14 Tage lang "gealtert". Vor der Messung wurden die Proben unter Standard-Laborbedingungen gelagert.

Zeta-Potenzial

Die elektrokinetische Analyse (elektrokinetisches Potential, Zetapotential) aller Proben wurde mit SurPASS Instrument (Anton Paar) bestimmt. Die Proben wurden in einer Zelle mit einstellbarem Spalt in Kontakt mit einem Elektrolyten (0,001 mol L ⁻¹ KCl) sowie in einer gepufferten Lösung (Phosphat-Buffered Saline (PBS)). Für jede Messung wurde ein Paar Polymerfolien mit derselben Deckschicht auf zwei Probenhaltern (mit einem Querschnitt von 20 × 10 mm ² und eine Lücke zwischen ihnen von 100 μm). Alle Proben wurden in zwei Wiederholungen hergestellt; alle wurden dreimal bei einem konstanten pH von 6,8 mit einem experimentellen Fehler von 5% gemessen. Zur Bestimmung des Zetapotentials wurde die Strömungsmethode verwendet und die Helmholtz-Smoluchowski-Gleichung zur Berechnung des Zetapotentials angewendet [25,26,27]. Gealterte Proben, die zur Messung des Zetapotentials verwendet wurden, wurden 14 Tage lang "gealtert".

Atomkraftmikroskopie

Die Oberflächenmorphologie der Proben wurde durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) unter Verwendung des VEECO CP II-Systems (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA) untersucht. Die Oberfläche wurde im „Tapping-Modus“ mit einer P-dotierten Silizium-Sonde RTESPA-CP mit einer Federkonstante von 20–80 N m ⁻¹ . gemessen (Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Durch wiederholte Messungen derselben Region (1 × 1 μm ² ) bestätigten wir, dass sich die Oberflächenmorphologie nach drei aufeinanderfolgenden Scans nicht änderte. Die für die Messung verwendeten Proben wurden 14 Tage lang gealtert.

Massenspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma

Induktiv gekoppeltes Plasma mit Massenspektroskopie-Detektor (ICP-MS) wurde verwendet, um die Menge der in PBS freigesetzten Au-Ionen zu bestimmen (pH = 7.4). Die Spurenelementanalyse von Au-Auslaugungen wurde unter Verwendung eines Agilent 8800 Triple-Quadrupol-Spektrometers (Agilent Technologies, Japan) in Verbindung mit einem Autosampler durchgeführt. Die Probenzerstäubung wurde mit einem MicroMist-Gerät durchgeführt, das mit einer peristaltischen Pumpe ausgestattet war. Die Messunsicherheit (dreimal jede Probe) betrug weniger als 3%. Die Auslaugungen für ICP-MS wurden durch statische Inkubation der Proben in PBS in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO₂ . hergestellt bei 37 °C für 6, 24 und 72 h. Die Laugen wurden mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:8 verdünnt und analysiert.

Zellkultur

Gemäß der internationalen Norm EN ISO 10993-5 wurden Zytokompatibilitätstests in vitro mit der Zelllinie L929 von Mausfibroblasten (Sigma, USA) durchgeführt. PEEK-Proben (rein, plasmabehandelt und goldbeschichtet) wurden in 70 % Ethanol in Szintillationszählerfläschchen für 20 Minuten sterilisiert, in 12-Well-Platten (Jet Biofil, Ø 2,14 cm) eingelegt, mit PBS gewaschen und auf die Wells montiert Boden mit Kunststoffhohlzylindern aus Poly(methylmethacrylat). L929-Zellen wurden auf die Proben in einer Dichte von 30.000 Zellen pro Vertiefung in 1 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (DMEM, Sigma, USA) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Invitrogen, USA) und 2 mM . ausgesät stabiles L-Glutamin (L-Alanyl-L-Glutamin, Sigma, USA). L929-Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . gehalten .

Fluoreszenzmikroskopie

Nach der gewünschten Inkubationszeit (6, 24 und 72 h) wurden die Zellen fixiert und ähnlich wie in [28, 29] beschrieben gefärbt. L929-Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 4% Formaldehyd (Thermo Scientific, USA) in PBS (37°C, 20 min) fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde F-Aktin des Zellzytoskeletts mit Phalloidin-Atto 565 (Sigma, USA) in PBS für 20 Minuten markiert. Dann wurden die Zellkerne mit DAPI (4′,6-Diaminido-2-phenylindol-dihydrochlorid, Sigma, USA) für 10 min gefärbt und die Zellen wurden mit PBS gespült, mit Eindeckmedium (Vector Laboratories, USA) bedeckt und zwischen einem mikroskopischen Objektträger und einem Deckglas montiert. Alle Proben („gealtert“ für 14 Tage) wurden in dreifacher Ausfertigung getestet.

Rasterelektronenmikroskopie

Die detaillierte Morphologie der untersuchten Zellen, die auf reinem PEEK, Plasma/Gold-Grenzfläche und einer Kontrolle (Glasdeckglas) wuchsen, wurde durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) TESCAN LYRA3 GMU (Tescan, CZ) im Sekundärelektronenmodus charakterisiert. Die für die SEM-Analyse vorgesehenen Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit Karnovsky-Lösung [30, 31] in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,2) fixiert und dehydratisiert (erhöhter Prozentsatz an Ethanol, gefolgt von zwei letzten Schritten einer 10-minütigen Inkubation in Hexamethyldisilazan und Trocknen im Ofen bei 40 °C für 2 h). Die dehydrierten Proben wurden mit einer 10-nm-Goldschicht überzogen.

Ergebnisse und Diskussion

Alle Messungen wurden an „gealterten“ Proben 14 Tage nach der Plasmabehandlung und dem Goldsputtern durchgeführt. Es ist bekannt, dass funktionelle Gruppen, die auf einer plasmabehandelten Polymeroberfläche gebildet werden, nicht stabil sind und sich mit der Zeit ändern [32]. Die Materialoberfläche neigt dazu, sich in den unbehandelten Zustand zurückzuversetzen [33]. Daher kommt es zu einer Umorientierung der durch die Plasmabehandlung erzeugten chemischen Gruppen in die Masse des Materials [34, 35].

Die PEEK-Ablation während der Plasmabehandlung mit anschließendem Au-Sputtern wurde gravimetrisch untersucht. Der Massenverlust eines Polymers, verursacht durch Ablation und Massenwachstum durch Sputtern, wurden nacheinander in Polymerdicke umgerechnet. Die nach der Plasmabehandlung (60 und 240 s, Leistung von 8,3 W) ermittelten Massenverluste sind in Tabelle 1 aufgeführt. Mit zunehmender Expositionszeit war ein ausgeprägter Ablationsverlust erkennbar, der sich jedoch nur verdoppelte. Der leichte Verlust wurde wahrscheinlich durch den aromatischen Charakter von PEEK verursacht, der zu einer erhöhten Spaltbeständigkeit führte als beispielsweise im Fall von aliphatischen Ketten von Polyolefinen (UHMWPE). Für das Goldsputtern wurden die Zeiträume von 30 und 300 s als repräsentative Beispiele für diskontinuierliche und kontinuierliche Schichten bestimmt [19, 36]. Verringerte Ablationsverluste haben zu einer verbesserten Verankerung von Gold auf der PEEK-Oberfläche geführt, wie es bei Proben mit 150- und 300-s-Goldbeschichtung offensichtlich ist.

Die Wasserkontaktwinkelwerte von Proben, die in Abhängigkeit von der Plasmabehandlung und der Goldzerstäubungszeit gemessen wurden, sind in Tabelle 2 gezeigt. Nach der Plasmabehandlung stieg der WCA von 79,5 ± ± 2,4 ° (unmodifiziertes reines PEEK) auf 94,0 ± ± 5,5° und auf 95,6 ± ± 2,1 ° (PEEK mit Plasma behandelt für 60 bzw. 240 s). Der Unterschied der WCA-Werte nach der Plasmabehandlung ist im Vergleich zu den Wertabweichungen vernachlässigbar. Der WCA nimmt mit der Au-Beschichtung ab und die Oberfläche wird hydrophiler als bei den plasmabehandelten Proben.

Die Elementkonzentration auf der Polymeroberfläche (die zugängliche Tiefe von sechs bis acht Atomschichten) wurde mit der XPS-Methode untersucht; die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die XPS-Daten wurden für reines PEEK, eine plasmabehandelte Probe und eine plasmabehandelte Probe mit anschließender Au-Beschichtung erhalten. Aus der XPS-Messung kann man erkennen, dass die Sauerstoffkonzentration bei längerer Behandlung zugenommen hat. Dies wurde wahrscheinlich durch die Umorientierung sauerstoffhaltiger Gruppen in das Polymervolumen verursacht [37,38,39]. Es wurde nachgewiesen, dass die Ausrichtung der Gruppen unmittelbar nach der Plasmabehandlung erfolgt; so kommt es beim "Alterungsprozess" der Probe zu Veränderungen in deren Oberfläche. Aus diesem Grund wurden die Proben 14 Tage nach der Plasmabehandlung gemessen, wenn sich der "Alterungszustand" einer Probe stabilisiert hat [40, 41]. Die Sauerstoffkonzentration stieg mit längerer Plasmabehandlung an. Die Polymeroberfläche wird durch stärkere Plasmaentladung unter Bildung von Radikalstellen auf der Oberfläche zerstört; je höher die Plasmaleistung, desto ausgeprägter die Polymermodifikation. Diese Stellen reagieren mit dem in der Luft vorhandenen Sauerstoff und erhöhen die Sauerstoffkonzentration auf der behandelten Oberfläche [42, 43]. Nach dem Goldsputtern nimmt die Sauerstoffkonzentration auf Kosten der Goldschicht ab. Die Konzentration des Goldes wurde mit kürzerer Sputterzeit erhöht, wenn die Oberfläche nicht so stark gestört war.

Abbildung 1 zeigt die mit AFM erhaltene PEEK-Oberflächenmorphologie. Die Plasmabehandlung verursachte bei beiden Expositionszeiten (60 und 240 s) nachweisbare Veränderungen auf der PEEK-Oberfläche, aber wie erwartet führte eine längere Plasmaexposition zu einer raueren Oberfläche, was zu einem Unterschied in der Metallisierung der Proben führte. Proben, die längere Zeit mit Plasma behandelt wurden, bildeten besser definierte Metallcluster. Dieser Effekt war besonders deutlich bei Proben mit dicken (gesputtert für 300 s) und auch sehr dünnen (gesputtert für 30 s) Goldschichten. Proben, die für einen kurzen Zeitraum (60 s) mit Plasma behandelt wurden, bildeten eine kleinere Anzahl größerer und unregelmäßiger Cluster. Bei Schichten, die nur 30 s lang gesputtert wurden, waren Metallcluster nur auf dem 240 s lang plasmabehandelten Substrat leicht erkennbar. Wie erwartet nehmen Clustergröße und Oberflächenrauhigkeit im Allgemeinen mit längerer Zeit des Goldsputterns zu. Dieses Verhalten korrespondiert gut mit der XPS-Messung. Proben, die 30 s lang mit Metall gesputtert wurden, hatten bereits den größten Teil ihrer Oberfläche mit Metall bedeckt, und weiteres Sputtern verursachte hauptsächlich vertikales Wachstum von Clustern; daher hatte es keinen so signifikanten Einfluss auf die Goldkonzentration und hinterließ immer noch eine teilweise unbedeckte Polymeroberfläche. Auch ein Unterschied in der Form der Cluster in Abhängigkeit von der Länge der Plasmabehandlung stimmte gut mit den XPS-Befunden überein. Unregelmäßige große Cluster auf Proben, die nur für kurze Zeit (60 s) mit Plasma behandelt wurden, bedeckten einen relativ großen Teil der PEEK-Oberfläche; daher wurde die mittels XPS bestimmte Goldkonzentration leicht erhöht. Morphologische Unterschiede zwischen reinen Materialien, die mit einer Metallschicht unterschiedlicher Dicke gesputtert wurden, können mit Daten verglichen werden, die für Poly-1-Milchsäure (PLLA) [44] und Polytetrafluorethylen (PTFE) [45] erhalten wurden. Unberührtes PTFE hat eine sehr raue Oberfläche; Daher beobachteten wir keine Bildung kleiner Metallcluster, sondern eine allgemeine Abnahme der Oberflächenrauheit. Dies wird durch das Phänomen verursacht, dass ein gesputtertes Metall bevorzugt „Täler“ auf der Polymeroberfläche füllt, um auf „Spitzen“ zu bleiben. Andererseits zeigt die PLLA-Oberfläche eine erhöhte Granulation und Bildung ähnlicher Strukturen wie Strukturen auf PEEK, jedoch mit geringerer Regelmäßigkeit. Diese Daten legen nahe, dass die Bildung einer regelmäßigen körnigen Struktur auf gesputterten Polymeren stark von der Regelmäßigkeit der Polymeroberfläche beeinflusst wird; Daher ermöglicht PEEK (Polymer mit der kleinsten Oberflächenrauheit unter PEEK, PLLA und PTFE) die Bildung der meisten regelmäßigen Metallcluster auf der Oberfläche.

AFM-Bilder von makellosem PEEK, mit Plasma behandeltem PEEK (pl) für 60 und 240 s und Gold (Au), das für 30, 150 und 300 s gesputtert wurde

Die elektrokinetische Analyse zeigte Veränderungen der Oberflächenchemie und -ladung von PEEK nach einzelnen Schritten der Oberflächenmodifikation. Im ersten Schritt führte die Plasmabehandlung zur Bildung neuer polarer Gruppen auf der PEEK-Oberfläche, was zu einer Erhöhung des Zetapotentials führte [19, 25, 26, 27]. In der zweiten Modifikation hatte die Ablagerung von Goldclustern auf der Probenoberfläche auch einen Einfluss auf die Oberflächenchemie und das Zetapotential (Abb. 2). Aufgrund der Anwesenheit eines Metalls auf der Polymeroberfläche spielt der Effekt einer Oberflächenladungsänderung eine wichtige Rolle – die Ansammlung von Elektronen [27, 46]. Wir beobachteten auch unterschiedliche Zetapotentiale für frische und „gealterte“ Proben. Für das in PBS gemessene Zetapotential, das durch Ionen unterschiedlicher Konzentration gegeben war, wurden dramatischere Veränderungen festgestellt. In KCl-Lösung beträgt die Konzentration von KCl 0,001 mol L ^–1 ; in PBS ist die Ionenkonzentration drei Ordnungen höher. Eine höhere Ionenkonzentration in PBS verursacht das Pressen einer elektrischen Doppelschicht und führt zu einem verringerten Zetapotential (in absoluten Werten) [27, 46]. Daher verursachte die viel höhere Ionenkonzentration eine Änderung der Oberflächenladung sogar von negativen zu positiven Werten. Somit waren die Veränderungen des PEEK-Zetapotentials, die in PBS-Lösung bestimmt wurden, dramatischer und Veränderungen der Oberflächenchemie und Ladung waren ausgeprägter. Daher ist klar, dass die Plasmabehandlung und die anschließende Au-Abscheidung zu dramatischen Veränderungen der Polymeroberflächenchemie und -ladung führen, die von der Länge der Plasmabehandlung sowie von der Au-Abscheidung abhängen. Diese Ergebnisse bestätigten andere durchgeführte Analysen.

Zeta-Potenzial von plasmabehandeltem PEEK (60 und 240 s) und Au-gesputterten (30, 150 und 300 s; aktuell 40 mA) PEEK-Proben in 1 mM KCl-Lösung (grüne Säulen .) —frische Proben; braune Säulen —gealterte Proben) und in PBS-Lösung (graue Säulen )

Um die Konzentration von Gold zu bestimmen, die während der Zellkultivierung in ein Kultivierungsmedium freigesetzt wurde, verwendeten wir ein einfaches wässriges PBS-System, um diese Bedingungen zu simulieren. Gold, das nach 6 (Zeit der Zelladhäsion) und 72 h (Zellproliferation) statischer Inkubation in PBS freigesetzt wurde, wurde durch ICP-MS gemessen und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. PBS hat den gleichen pH-Wert und die gleiche Osmolarität wie das Zellkulturmedium; daher wurde es für die ICP-MS-Messung verwendet. Einerseits ist PBS ein vereinfachtes System; andererseits gibt es keine die ICP-MS-Messung potenziell störenden Komponenten, wie dies bei einem kompletten Zellkulturmedium der Fall ist. Wir fanden heraus, dass die in PBS freigesetzte Au-Konzentration bei mit Au beschichteten PEEK-Proben 30 s lang höher war als bei 300 s. Dies könnte durch einen diskontinuierlichen Charakter der Goldschicht verursacht werden, der möglicherweise kleine Goldcluster bildet, die schneller aufgelöst werden [47]. Das Gold wurde in höherem Maße aus der Probe PEEK/60/300 als aus PEEK/240/300 freigesetzt, da die Oberfläche weniger abgetragen und das Gold anscheinend weniger verankert war.

Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Oberflächenmodifizierung von Polymeren die Endothelzelladhäsion fördern kann. Die PEEK-Oberfläche wurde durch Plasmabehandlung und Goldsputtern aktiviert. Die PEEK-Zytokompatibilität wurde anhand der Ergebnisse der Zelladhäsion (6 h) und Proliferation (24 und 72 h) bestimmt, wie in Abb. 3 dargestellt. Jeweils zwei Spalten (PEEK/Plasma (ab) und PEEK/(ab) /Au (cde)) repräsentieren zwei Hälften einer Probe. Die Unterschiede in der Anzahl der L929-Zellen, die auf reinem PEEK und Kontrollgewebekulturpolystyrol (TCPS) wachsen, liegen im Bereich des Messfehlers. Die Zelladhäsion wurde 6 h nach dem Aussäen der Zellen auf der Probenoberfläche überwacht. Es ist offensichtlich, dass die Zellzahl von reinem PEEK im Vergleich zu behandelten Proben erhöht war. Nach 24 h des Zellwachstums beobachteten wir nur einen sehr geringen Anstieg der Zellzahl, der durch eine Lag-Phase verursacht werden könnte, wenn sich die Zellen an die neue Umgebung anpassen [48]. Es ist offensichtlich, dass 72 h nach der Aussaat eine sehr geringe Anzahl von Zellen auf Proben wuchs, die für 30 s (60 und 240 s mit Plasma behandelt) im Vergleich zu anderen gemessenen Proben deponiert wurden. Diese Werte entsprechen den Ergebnissen aus ICP-MS-Messungen, bei denen Gold im höchsten Maße in PBS freigesetzt wurde. In diesem Fall hatte die auf PEEK (für 30 s) abgeschiedene Au-Schicht einen diskontinuierlichen Charakter [36]; somit konnten die Au-Cluster in das Zellkulturmedium freigesetzt werden. Durch diesen Prozess kann das Medium für kultivierte Zellen toxisch werden. Die größte Zellzahl, die auf einer Goldschicht wuchs (im Vergleich zu einer plasmabehandelten Probe) wurde bei der Probe PEEK/pl 60 s/150 s beobachtet, auf der die Goldschicht durchgehend war. Als nächstes, 72 h nach der Aussaat, war die am besten geeignete Umgebung für das L929-Zellwachstum auf den Proben, die 60 oder 240 s lang mit Plasma behandelt und anschließend 300 s lang mit Gold beschichtet wurden. Auch die Au-Schicht dieser Proben war durchgehend [36]. Nach den Daten der ICP-MS wurde nur eine sehr geringe Menge Au in das Zellkulturmedium freigesetzt. Dieses freigesetzte Gold war jedoch wahrscheinlich die Ursache für eine erhöhte Zellproliferation auf der plasmabehandelten Oberfläche.

Anzahl der L929-Zellen nach 6, 24 und 72 h Kultivierung auf TCPS, reinem PEEK und PEEK mit Goldgrenzflächen von plasmabehandelten (60 und 240 s) und Au-gesputterten (30, 150 und 300 s) Regionen

Um die Zellmorphologie und die interzellulären Verbindungen detaillierter zu bewerten, führten wir eine hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie von L929-Zellen durch, die auf den getesteten Substraten wachsen; die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt. Die Scans der SEM-Analyse wurden nach 72 Stunden Zellwachstum auf reinem PEEK und plasmabehandeltem und goldbeschichtetem PEEK und einem Deckglas aus Glas, das als Kontrolle diente (wird häufig verwendet) durchgeführt für die REM-Analyse [49] sowie für Immunfluoreszenzstudien [29]). Aus Abb. 4 ist ersichtlich, dass Zellen auf reinem PEEK wachsen, mit Plasma behandeltes PEEK für 60 s (zweite Hälfte ist 300 s Au) und 240 s (zweite Hälfte ist 150 und 300 s Au) und auf einem Deckglas hatte nach 72 h Kultivierung eine ähnliche Form. Die Zellen waren auf der plasmabehandelten Oberfläche vollständig ausgebreitet und oberhalb dieser Zellschicht ist die Bildung einer neuen Schicht proliferierender Zellen erkennbar. Die Zellen hatten eine kugelförmige Form auf der Oberfläche von PEEK/60 (zweite Hälfte ist 150 s Au) und PEEK/240/30 s Au-Proben, obwohl die Umgebung für die Zellproliferation nicht geeignet war. Die am stärksten abgerundeten Zellen wurden auf PEEK/240/300 s Au beobachtet, was vollständig mit den in Abb. 3 dargestellten Daten korreliert.

SEM-Bilder von L929-Zellen, die 72 h lang auf reinem PEEK, mit Plasma behandeltem PEEK (60 und 240 s) kultiviert wurden, und deren goldbeschichteten Teilen 30 und 300 s lang gesputtert wurden (mikroskopisches Deckglas diente als Kontrolle). Die Maßstabsleiste entspricht 10 μm

Schlussfolgerungen

Wir haben zwei verschiedene Arten von PEEK-Modifikationen verglichen, um ein Material mit verbesserter Zelladhäsion und -wachstum zu schaffen. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten variable Änderungen der Oberflächeneigenschaften nach einzelnen Modifikationsschritten. Beide verwendeten Modifikationswege führten zu Änderungen der Oberflächenchemie, Morphologie, Benetzbarkeit und Ladung. Die Plasmabehandlung über 240 s verursachte einen bis zu zweimal höheren Gewichtsverlust von PEEK als die Behandlung über 60 s. Die Benetzbarkeit der PEEK-Oberfläche wurde durch die Plasmabehandlung nicht signifikant verändert. Die XPS-Messung bestätigte die allgemeine Tatsache, dass mit zunehmender Zeit der Plasmabehandlung die Kohlenstoffkonzentration in der PEEK-Oberfläche abnahm, während die Sauerstoffkonzentration im Gegensatz dazu anstieg. Die Dicke eines abgeschiedenen Goldfilms war nach einer Plasmabehandlung für 60 s höher. Das Sputtern von Gold erhöhte die Oberflächenbenetzbarkeit von PEEK. Die Ergebnisse der XPS-Analyse zeigten für beide plasmabehandelten Proben die gleichen Trends (60 und 240 s), und die Kohlenstoff- und Sauerstoffkonzentrationen nahmen mit zunehmender Abscheidungszeit zugunsten der steigenden Goldkonzentration ab. AFM-Bilder bestätigten auch XPS-Messungen, insbesondere für Proben, die 60 s lang mit Plasma behandelt und 300 s lang goldbeschichtet wurden, auf denen unregelmäßige große Cluster einen relativ großen Teil der PEEK-Oberfläche bedeckten; daher wurde die Goldkonzentration leicht erhöht. Es wurde auch festgestellt, dass Proben mit einer dünnen und auch einer dickeren Goldschicht nicht für die Zellvermehrung geeignet sind.

Diese Forschung zeigt, dass die Plasmabehandlung die Zytokompatibilität von PEEK im Vergleich zu reinem PEEK verbessert. Außerdem ist die Plasmabehandlung eine bessere Methode zur Polymermodifikation für das Zellwachstum als das Sputtern von Gold, wenn Gold in das Zellkulturmedium freigesetzt wird.

Abkürzungen

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

CO₂ :

Kohlendioxid

DAPI:

4′,6-Diaminido-2-phenylindol-dihydrochlorid

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

FBS:

Fötales Rinderserum

ICP-MS:

Inductively coupled plasma mass spectrometry

KCl:

Potassium chloride

L929:

Mouse embryonic fibroblasts

PBS:

Phosphate-buffered saline

PEEK:

Polyetheretherketone

PGA:

Polyglycolide

PHB:

Polyhydroxybutyrate

PLA:

Poly(l-lactide)

PMMA:

Polymethylmethacrylate

PTFE:

Polytetrafluorethylene

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TCPS:

Tissue culture polystyrene

UHMWPE:

Ultra-high-molecular-weight polyethylene

WCA:

Water contact angle

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie