Ein tragbares Gerät auf Basis von plasmonischer Thermosensorik für die Detektion und Quantifizierung von Lateral-Flow-Assays

Einführung

Früherkennung und schnelle Diagnose sind wichtig für die Früherkennung und Behandlung von Krankheiten. Die meisten medizinischen Tests sind zeitaufwendig und erfordern eine komplizierte Vorbereitung von klinischen Proben, großen Instrumenten und gut ausgebildetem Laborpersonal [1]. Diese Anforderungen haben die medizinische Behandlung in Gebieten mit begrenzten Ressourcen stark behindert. Point-of-Care-Tests (POCT) verwenden einfache Geräte und minimieren die Zeit, die erforderlich ist, um klinisch relevante Ergebnisse zu erhalten, sodass Ärzte und Patienten schnell Entscheidungen treffen können. POCT hat einige offensichtliche Vorteile, wie kurze Detektionszeit, schnelle Probenverarbeitung, einfache Instrumentierung und geringe Betriebsanforderungen [2, 3]. Somit kann das Aufkommen von POCT helfen, Krankheiten, insbesondere in Gebieten mit begrenzten Ressourcen, frühzeitig und schnell zu diagnostizieren und so die medizinischen Bedingungen zu verbessern. Eine geringe analytische Empfindlichkeit, komplizierte Betriebsverfahren und hohe Ausrüstungskosten erschweren jedoch normalerweise die Anwendung dieser Technik. Daher sind dringend weitere Arbeiten erforderlich, um POCT-Anwendungen mit den meisten idealen Eigenschaften zu finden und gleichzeitig die Nachteile zu minimieren.

Um einige dieser Probleme zu lösen, ist der Lateral Flow Assay (LFA) ein sehr guter Kandidat als Testwerkzeug im POCT. LFA ist ein papierbasierter Point-of-Care-Biosensor, der zur Identifizierung von Zielanalyten in einer bestimmten Probe verwendet wird [4, 5]. Die LFA wird in einem papierbasierten Streifen durchgeführt (Schema 1b), der aus einem Probenpad, einem Konjugatpad, einem Absorptionspad und einer Nitrozellulosemembran besteht, auf der der Nachweis erfolgt. Zu den Vorteilen der LFA zählen die Schnelligkeit und der einstufige Assay, die Kosteneffizienz, die einfache Bedienung, das kleine Probenvolumen und die lange Haltbarkeit unter verschiedenen Umgebungsbedingungen [6, 7]. Herkömmliche LFA liefert „Ja oder Nein“-Ergebnisse durch die Untersuchung von Farbänderungen auf der Testlinie mit bloßem Auge, die beliebteste Nachweismethode für diese Art von Assays. Daher leidet diese Art von Ansatz tendenziell unter einem Mangel an Genauigkeit und subjektiver Beurteilung [8]. Da es jedoch leicht ist, LFA in elektronische Geräte zu integrieren, besteht ein möglicher Nachweisansatz darin, Streifenlesegeräte zu entwickeln, um genaue quantitative Ergebnisse zu erhalten. Ladungsgekoppelte Bauelemente (CCD) oder komplementäre Metall-Oxid-Halbleiter-(CMOS)-Sensoren werden normalerweise verwendet, um Bilder in Streifenlesegeräten zu erfassen. Bildverarbeitungssoftware wird häufig verwendet, um quantitative Ergebnisse zu erzielen. In diesen optischen Lesegeräten werden die durch Reflexion, Transmission oder Streuung des Lichts von einer externen Quelle erhaltenen optischen Informationen aufgezeichnet, um eine Quantifizierung zu ermöglichen [9,10,11,12]. Bei kolorimetrischen Lesegeräten wird die Farbintensität wie Grauwert oder RGB-Koordinaten von den Test- und Kontrolllinien erfasst, um die LFA-Streifen zu analysieren [13,14,15,16,17]. Ein Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass der Farbstoff im Laufe der Zeit durch Lichtschäden, mechanische Mittel oder andere Abbauprozesse seine Farbe verlieren kann, was zu einer schlechten Wiederholbarkeit und Genauigkeit führt. In den Systemen, die auf Fluoreszenz-Reader zurückgreifen [18, 19], werden die organischen Fluorophore einer bestimmten Anregungswellenlänge ausgesetzt, die die Emission des in den Streifen vorhandenen Fluorophors bei einer längeren Wellenlänge induziert. Dieses emittierte Licht wird dann gesammelt, um einen quantitativen Nachweis zu erhalten. Das nicht zu vernachlässigende Problem besteht darin, dass die üblicherweise in diesen Anwendungen verwendeten organischen Fluorophore unter Photobleaching und chemischer Degradation leiden, die im Laufe der Zeit eine Abschwächung des Signals verursachen und eine spezielle Handhabung und spezielle Lagerung erfordern [7].

Konzept der plasmonischen thermischen Sensorik. a Das Modell des tragbaren Geräts und die Hauptkomponenten (oben) mit zwei verschiedenen Erfassungsmodi (unten). b LFA unter Temperatursensoreinstellung

In letzter Zeit wird die thermische Erfassung schrittweise auf die LFA-Erkennung angewendet. Die thermische Erfassung besteht in der Verwendung eines Wärmewandlers, bei dem die erzeugte Wärme in Gegenwart des Analyten erhöht wird, was es ermöglicht, dieses thermische Signal durch den Wandler zu erfassen. Poloet al. [20] untersuchten das Konzept der durch plasmonische Erhitzung angetriebenen Sensorik durch den Nachweis des Krebsbiomarkers karzinoembryonales Antigen (CEA) unter Verwendung einer Nahinfrarot(NIR)-Lichtquelle, um die Wärmeerzeugung unter Ausnutzung der plasmonischen Eigenschaften anisotroper Goldnanopartikel zu induzieren. Qinet al. [21] schlugen eine Methode vor, die thermischen Kontrast zur Quantifizierung von LFA unter Verwendung eines grünen Lasers als Lichtquelle verwendet, was eine 32-fache Verbesserung der analytischen Empfindlichkeit zeigte. Im Jahr 2016 wurde von Wang ein ähnliches Thermokontrastlesegerät [22] entwickelt, das die analytische Sensitivität bei der LFA-Quantifizierung um das 8-fache verbessert. Die Lichtquelle, die verwendet wird, um die Wärmeerzeugung durch den Wandler zu induzieren, kann auf bestimmte Wellenlängen abgestimmt werden, um zu verhindern, dass sie durch das Vorhandensein anderer Moleküle beeinflusst wird, die bei diesen Wellenlängen nicht absorbieren, wodurch die Detektionsspezifität gewährleistet wird. Die Verwendung von Lichtquellen, die sich im NIR-Bereich des elektromagnetischen Spektrums befinden, ermöglicht es, die Absorption des Lichts durch die Mehrheit der Moleküle biologischen Ursprungs, insbesondere Blut, zu verhindern [23]. Diese Vorteile zeigen, dass die plasmonische Thermosensorik mit NIR-Lichtquelle eine vielversprechende LFA-Nachweismethode ist. In früheren Forschungen wurde jedoch kein POCT-Gerät entwickelt, das LFA-Streifen zusammen mit einer NIR-Lichtquelle verwendet.

Hier haben wir ein tragbares Gerät entwickelt, das auf plasmonischer Thermosensorik basiert (Schema 1a), das die analytische Sensitivität bei LFA ohne zusätzliche Modifikation der Streifen verbessert. Das Signal wurde verstärkt, indem die Plasmonenresonanz bei NIR-Laserbestrahlung voll ins Spiel gebracht wurde. Die Laserwellenlänge des Prototyps liegt innerhalb des Peaks der lokalisierten Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) der Nanopartikel (die in unserer Umgebung als Licht-zu-Wärme-Wandler fungieren), wodurch Wärme in der Testlinie erzeugt wird. Dann wird die Wärmeentwicklung von einem im Gerät befindlichen Wärmesensor erfasst, der die entweder durch Infrarotemission (Strahlung) oder durch Wärmeleitung erzeugte Wärme misst. Die erzeugte Wärmemenge ist proportional zur Anzahl der Nanopartikel in der Testlinie und der Bestrahlungsleistung [24]. Es ist keine zusätzliche Operation erforderlich.

Die Wärmeübertragung hat drei Hauptformen:Leitung, Konvektion und Strahlung. Um die Detektionsleistung verschiedener Wärmeübertragungsformen zu untersuchen, testeten wir den Leitungsmodus (Kontakt) und den Strahlungsmodus (berührungslos) mit zwei Arten von Sensoren (Schema 1a und Zusatzdatei 1:Abbildung S1). Der gesamte Prototyp ist kompakt und verwendet eingebettete Systemtechnologie und oberflächenmontierte Komponenten. Um die Betriebsbedingungen zu optimieren, wurden die Hauptfaktoren untersucht, die die Detektionsfähigkeit beeinflussen. Um die Detektionsfähigkeit des tragbaren Geräts zu verifizieren, wurden die direkt mit Nanopartikeln auf der Membran beladenen LFA-Streifen quantifiziert und mit konventioneller visueller Detektion verglichen. Da unsere Detektionsmethode temperaturabhängig ist, wurde auch der Einfluss der Umgebungstemperatur auf die thermische Signaldetektion untersucht und eine Kalibrierungskurve für den Leitungsmodus erstellt. Schließlich wurden humane Choriongonadotropin (HCG)-Biomarker als Modell quantifiziert, um die Erkennungsfähigkeiten der thermischen Sensorik zu verifizieren.

Materialien und Methoden

Materialien und Reagenzien

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde von Lonza ® bezogen. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und heterobifunktionelles Polyethylenglycol (HS-PEG-COOH, MW =5000 µg/mol (5 µgDa)) wurden von SIGMA® bezogen. Tween 20, Triton X100, Rinderserumalbumin (BSA), Trehalose, Polyvinylpyrrolidon (PVP), N -Hydroxysulfosuccinimid (S-NHS), Natriumhydroxid, Natriumchlorid, Gold(III)-chloridhydrat und HCG-Hormon wurden von Aladdin® bezogen. Saccharose, Natriumtetraborat-Decahydrat, Borsäure, Kaliumiodid und Natriumthiosulfat-Pentahydrat wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. Natriumborhydrid wurde von Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. Anti-αHCG, Anti-βHCG und Anti -Maus-Sekundärantikörper, Nitrozellulosemembran (NC-a110), Probenpad (Glasfaser BX108), Konjugationspad (Glasfaser BX101) und Polyvinylchlorid (PVC)-Oberflächen wurden von JieyYiBiotech TM bezogen. 4-Morpholinethansulfonsäure (MES) wurde von Shanghai Majorbio bezogen. Reines Ethanol wurde von Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd. gekauft.

Synthese von Nanopartikeln (Gold-Nanoprismen, AuNPrs)

Die in dieser Studie verwendeten Nanopartikel wurden unter Verwendung einer Variation unseres zuvor berichteten Protokolls [25] erhalten, die später verbessert wurde [26]. Kurz gesagt, ein Volumen von 220 mL von 0,5 mM Na₂ S₂ O₃ wurde mit 20 µl 0,1 µM KI ergänzt. Dann wurden 110 ml der oben genannten Lösung nach und nach zu einer Lösung gegeben, die 2 mM HAuCl₄ . enthielt über 30 s und inkubiert bei Raumtemperatur bis zu einer Gesamtzeit von 4 min, Moment, in dem die Lösung mit 110 ml des restlichen Na₂ . ergänzt wurde S₂ O₃ +KI-Lösung im Verlauf von 30 s und inkubiert für weitere 4 min. Zum Schluss 100 ml Na₂ S₂ O₃ ohne KI wurde der resultierenden Lösung zugesetzt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die endgültigen prismenförmigen Nanopartikel zu erhalten. Alle zuvor beschriebenen Inkubationsschritte wurden ohne Schütteln durchgeführt. Nach der Synthese wurden die Nanopartikel mit PEG stabilisiert (PEGylierung). Die den Nanopartikeln zugesetzte PEG-Menge wurde in einem Verhältnis von 1:2 (NPs zu PEG) des Gesamtgewichts des in der Synthese verwendeten Goldes hergestellt. PEG wurde in 1 ml Milli-Q-Wasser verdünnt und ein bestimmtes Volumen an NaBH₄ wurde dann zugegeben, um ein Molverhältnis von 1:1 von PEG zu NaBH₄ . zu erreichen . Das gesamte Volumen der PEG zu NaBH₄ Die Lösung wurde vollständig zu den AuNPrs gegeben und mit 2 M NaOH unter mildem Mischen auf pH 12 eingestellt. Schließlich wurde die Lösung 60 min lang bei 60 °C beschallt und dann 15 min lang bei 4400 G bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die AuNPrs von überschüssigem PEG und nicht umgesetzten Materialien zu trennen. Die Pellets wurden in Milli-Q-Wasser resuspendiert und dreimal 9 min lang bei 4400 G bei Raumtemperatur zentrifugiert. Diese endgültigen Proben wurden auf ein Viertel ihres ursprünglichen Volumens verdünnt, um sie mehrere Wochen bei Raumtemperatur dekantieren zu lassen. Nach dieser Zeit konnte die obere Schicht der Lösung (die einen Hauptanteil an kleineren, leichteren nanometrischen Goldnebenprodukten enthält) von den AuNPrs entfernt werden, die am Boden sedimentieren. Die Konzentration der Nanopartikel wurde durch Messung ihrer Absorption (OD) bei 400   nm durch UV-Vis-Spektroskopie und Anwendung eines Umrechnungsfaktors (ε) von 11,3 ml  mg ⁻¹ . erhalten cm ⁻¹ . Dieser Wert wurde experimentell erhalten, indem die durch ICP erhaltene Goldkonzentration mit der OD bei 400 nm durch UV-Vis der Endprodukte der Synthese korreliert wurde.

Konjugation von Nanopartikeln mit Anti-HCG-Antikörper

Kurz gesagt wurden 3 ml einer Lösung, die 0,5 mg/ml PEGylierte Nanopartikel enthielt, dreimal mit 0,1 &mgr;M MES-Puffer pH 5,5 durch Zentrifugation für 9 &mgr;m bei 6000 Upm in einer Mini-Spin-Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur gewaschen. Die letzten gewaschenen Nanopartikel wurden in 1 µl Endvolumen des gleichen Puffers (0,1 µM MES-Puffer pH 5,5) resuspendiert und 4 µmg EDC und S-NHS wurden zu der Lösung gegeben. Die Proben wurden dann 20 min unter mildem Mischen inkubiert, 9 min bei 6000 min-1 zentrifugiert und mit MES-Puffer gewaschen. Dann wurden 20 µl Antikörper-Stammlösung (200 µg) zu der Probe gegeben und 3 Stunden bei 37 °C inkubiert, gefolgt von einer zweiten Inkubation über Nacht bei 4 °C (kein Schütteln). Am nächsten Tag wurden die konjugierten Nanopartikel zentrifugiert (9 min bei 6000 Upm) und zweimal mit Boratpuffer 5 mM pH 9 gewaschen, dann wurden 25 mg BSA zu der Lösung gegeben. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln wurde die Probe mit Boratpuffer, ergänzt mit Tween 20 (5 mM pH 9) gewaschen (9 min bei 6000 U/min) und schließlich bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung nicht länger als 4 . gelagert –5 Tage.

Nach der Präparation der Nanopartikel erfolgte die Konfektionierung der Teststreifen (beschrieben in ESI).

Laden von Nanopartikeln auf die Membran der Streifen

Um die Nanopartikel auf die Membran der Streifen zu laden, wurde die Konzentration des ursprünglichen Vorrats an PEGylierten Nanopartikeln (ohne Antikörper) erfasst und eine Reihe von Verdünnungen in Milli-Q-Wasser durchgeführt, was zu einem Konzentrationsbereich von 0 . führte (reines Milli-Q-Wasser ohne Nanopartikel) bis zu 10 OD/mL für die maximale Konzentration, was nach dem zuvor durch ICP-AES charakterisierten Umrechnungsfaktor 0,9 µmg/mL entspricht. Der Einfachheit und Extrapolation halber wurden die OD-Werte gegenüber der Gewichtskonzentration bevorzugt. So wurden 2 µl von jeder der oben genannten Verdünnungen mit einer Mikropipette direkt auf die Nitrozellulosemembran der Streifen gegeben und bei Raumtemperatur über ~ 2 Stunden trocknen gelassen. Die getrockneten Streifen wurden vor den Bestrahlungstests bei Raumtemperatur gelagert.

Zum Nachweis des HCG-Antigens in den Streifen wurde eine Reihe von Verdünnungen des Analyten (HCG) in PBS durchgeführt. Jeder Streifen wurde durch Laden von 5 µl AuNPr, konjugiert mit Anti-HCG-Antikörper, in das Konjugatkissen und 50 µl der erforderlichen Verdünnung, die HCG enthielt, durchgeführt. Die Streifen wurden auf ähnliche Weise wie beim vorherigen Test getrocknet.

Entwicklung des tragbaren Geräts

Das tragbare Gerät (Abb. 1a und Zusatzdatei 1:Abb. S1) wurde mit eingebetteter Systemtechnologie und oberflächenmontierten Komponenten aufgebaut, da sie klein und kostengünstig sind. Der Aufbau des Prototyps ist in Abb. 1b dargestellt. Das Motherboard (Zusatzdatei 1:Abbildung S1) ist das Kernmodul des Gerätes, dessen Funktion es ist, die Daten zu verarbeiten und die restlichen Komponenten zu steuern. Dieses Modul besteht hauptsächlich aus der MCU STM32F407, die über einen großen Speicher und einen stromsparenden Betrieb verfügt. Auf dem Motherboard wurde eine Spannungswandlerschaltung entwickelt, um die richtige Spannungsversorgung für jedes Modul im Gerät bereitzustellen.

Details des tragbaren Geräts. a Tragbares Gerät auf Plasmon-Thermosensor-Basis. b Hardware-Zusammensetzungsdiagramm ① Hauptplatine, ② Laser- und Sensormodul und ③ Benutzeroberfläche. c Kartusche für Streifen

Für die Verbindung mit anderen Modulen wurden auf dem Mainboard fünf Schnittstellen aufgebracht. Der Temperatursensor wurde über eine IIC-Schnittstelle mit dem Motherboard verbunden, um die vom Sensor übertragenen Temperatursignale zu empfangen. Für eine genaue Temperaturmessung haben wir uns für Temperatursensoren mit digitalem Ausgang entschieden. Der Sensor für den Leitungsmodus war ein Halbleitersensor (ADT7420, Analog Devices) mit einer 16-Bit-Temperaturauflösung (0,0078 °C) und einem geringen Stromverbrauch (700 μW). Im Strahlungsmodus haben wir ein Infrarot-Thermometer (MLX90614, Melexis) mit einer Temperaturauflösung von 17 Bit und einer Leistungsaufnahme von 3,9 mW verwendet. Die Schnittstelle zwischen dem Lasersteuermodul und dem Motherboard bestand aus einem Relaissteuerkreis, um eine genaue Verwaltung der Laserdiode zu gewährleisten und gleichzeitig das Motherboard vor hohen Strömen zu schützen. Das Lasermodul bestand aus drei Komponenten:(1) der Lasersteuerungskomponente (Zusatzdatei 1:Abbildung S1), (2) einer Laserdiode (Thorlabs, M9-A64-0200), die eine Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 1064 nm . lieferte und eine optische maximale Ausgangsleistung von 200 µmW, und (3) eine asphärische Linse (Thorlabs, 354330-C), die in dem Lasermodul angebracht ist, um das von der Laserdiode emittierte Licht in einen Bereich von 1 mm × 2,5 mm zu konvergieren. Diese Komponenten ermöglichten es, die Testlinie auf dem Streifen genau zu beleuchten. Ein LCD-Touchscreen (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 Pixel) wurde verwendet, um eine grafische Benutzeroberfläche bereitzustellen. Interface 4 des Boards wurde für Programmdownload und Debug belassen. Im Gerät wurde eine USB-Schnittstelle eingebaut, die als Ladeanschluss für den Akku und als Kommunikationsanschluss zwischen dem Gerät und einem optionalen externen Computer diente. Der Prototyp wurde von einem 10.000 mAh Lithium-Akku mit Strom versorgt. Die Programme in der MCU wurden mit der IAR-Software (Version 7.50.2.10505) kompiliert. Die grafische Benutzeroberfläche wurde mit der USART-HMI-Software entwickelt.

Design des Prototypgehäuses und der Teststreifenkassette

Um sicherzustellen, dass das Gerät benutzerfreundlich und tragbar ist, wurden eine 3D-gedruckte Hülle und eine Patrone entwickelt, die die Entstörungsfähigkeit und Stabilität des Geräts verbessern. Als Material für Gehäuse und Patrone wurde weißes Harz verwendet. Für die Konstruktion wurde die Software Solidworks 2018 verwendet.

Entsprechend der Form der Innenteile wurden für das Gerät ein quaderförmiges Gehäuse (Zusatzfeile 1:Bild S2a) und eine rechteckige Bodenplatte (Zusatzfeile 1:Bild S2b) konstruiert. Das quaderförmige Gehäuse bot eine feste Montageposition für den LCD-Bildschirm und das Laserdioden-Steuermodul. Zum Einlegen der Teststreifenkartusche diente ein rechteckiger Schlitz an der Seite des Gehäuses. Die Bodenplatte wurde mit einem Akku und einem Motherboard-Montagesockel versehen, wodurch die Komponenten ohne Verschieben auf der Bodenplatte befestigt werden konnten. Alle Detektionsteile wurden in der Bodenplatte befestigt. In der Bodenplatte wurde ein Tragrahmen sowohl für den Sensor als auch für die Streifenkartusche eingelassen, um sie in engen Kontakt zu bringen. Für die Laserdiode und das Objektiv wurde eine Feinabstimmungsfahrbahn bereitgestellt, mit der der Abstand fixiert und eingestellt werden kann. Die Größe des gesamten Gehäuses betrug 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Zum Schutz der Teststreifen wurde eine spezielle Kartusche (Abb. 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm) entwickelt. Die Kartusche hatte drei Fenster, eines für das Laden der Probe und zwei weitere für die Visualisierung der Testlinie bzw. der Kontrolllinie. Das Fenster der Testlinie wurde etwas kleiner als die Breite des Teststreifens gestaltet, um sicherzustellen, dass der Laser den Teststreifen nicht durchdringen und die Erkennung des Sensors beeinträchtigen kann. Auf der Rückseite der Kartusche wurde eine Sicherungskerbe angebracht, die es dem leitfähigen Sensor ermöglicht, die Rückseite der Streifen in der Position der Testlinie vollständig zu berühren und gleichzeitig sicherzustellen, dass der Strahlungssensor die Temperatur richtig erkennen kann.

Algorithmus für die thermische Erfassung und Parameterberechnung

Da der Laser die Nanopartikel beleuchtete, wurde in der Testlinie Wärme erzeugt, die nachweisbare Temperaturänderungen verursachte. Diese Wärmeentwicklung (Q , W/m ³ ) hängt von der Konzentration der Nanopartikel ab (C , OD/mL), der Beleuchtungsbereich (A , m ² ) und die Laserintensität (I , W/m ² ) [22], nach folgender Formel:

Das thermische Signal (Temperatur) wurde gesammelt, als der Laser die Streifen beleuchtete. Da die Beleuchtungsfläche und die Laserintensität konstant gehalten wurden, ändert sich das thermische Signal mit der Menge an Nanopartikeln, die sich an der Testlinie binden. Zur Quantifizierung der Wärmeentwicklung wurden zwei Methoden verglichen. Der erste verwendete die Temperaturänderungen (Zusatzdatei 1:Abbildung S3), um das thermische Signal zu quantifizieren. Die Temperaturschwankung (∆T ) wurde für die Bestimmung berechnet:

wo T _Ende ist die am Ende der Bestrahlung erreichte (maximale) Endtemperatur und T ₀ ist die anfängliche Umgebungstemperatur, die der Sensor vor Beginn der Bestrahlung registriert. Eine andere Methode nutzte die quantitative Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC, Additional file 1:Figure S3). Dieses Verfahren teilt die Kurve gemäß einer Abtastfrequenz von 10 Hz in Trapeze auf, gefolgt von der Berechnung der Addition aller Trapeze. Das thermische Signal wurde durch Division der Fläche durch die Detektionszeit (t _det ):

Bei Anwendung beider Methoden im Nachweis ergab die AUC-Analyse eine bessere Wiederholbarkeit der Quantifizierung (Zusatzdatei 1:Abbildung S4). Daher wurde die AUC-Analyse für ihre Verwendung bei der endgültigen Wärmequantifizierung ausgewählt.

Um die Leistung der verschiedenen Nachweismethoden zu bewerten, haben wir die LOD der Quantifizierung bewertet. In jedem Experiment haben wir eine Konzentration für vier Proben gemessen (vier Streifen, n =4). Unter Berücksichtigung der Standardabweichung (σ₀ ) der leeren Gruppe und die Empfindlichkeit (S ), die die Steigung der Standardkurve im linearen Bereich ist, haben wir die LOD wie folgt bewertet:

Testverfahren

Das gesamte Testverfahren umfasste drei Hauptschritte:(1) Datensammlung, (2) Detektion und Ergebniserfassung und (3) Ergebnisanzeige und -speicherung. Zuerst wurde der Teststreifen in die Kartusche geladen und in das Gerät eingeführt. Die Messung erfolgte einfach durch Antippen der Erkennungstaste und Eingabe der Patientendaten (optional kann stattdessen ein anonymer Code eingegeben werden). Die Informationen wurden an die Mikrocontrollereinheit (MCU) übertragen und gespeichert. Dann aktivierte die MCU den Temperatursensor und die Laserdiode, um mit dem Test zu beginnen. In der Zwischenzeit wurden die von der MCU empfangenen Temperaturdaten zur Echtzeitanzeige und -darstellung an das LCD gesendet. Nach der Erkennung berechnete die MCU den AUC-Wert und stellte das Ergebnis auf dem Bildschirm dar.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung der Nanopartikel

UV-Vis-Spektren von konjugierten Nanoprims sind in Fig. 2a gezeigt, was darauf hinweist, dass der maximale Peak bei 1130 nm liegt. Die Extinktion des AuNPr bei der Laserwellenlänge (1064 nm) beträgt 92 % der maximalen Extinktion bei 1130 nm. SEM- und TEM-Bilder (Abb. 2b, c) wurden aufgenommen, um die Morphologie der Nanopartikel zu visualisieren, die einen Großteil der dreieckigen Formen bestätigen.

Charakterisierung der Gold-Nanoprims. a UV-Vis-Spektren der Nanopartikel. Repräsentative Bilder der unkonjugierten Nanopartikel visualisiert durch b SEM und c TEM

Optimierung der Messbedingungen im Gerät

Bei der thermischen Sensorik sind die Detektionszeit und der Abstand von der Laserdiode zur Testlinie die Hauptfaktoren, die das Signalverhalten beeinflussen [27, 28]. Die beiden Faktoren wurden untersucht, um die Messbedingungen zu optimieren. Zur Optimierung der Bestrahlungszeit haben wir die Streifen 10 min bestrahlt und die Temperaturänderungen von beiden Sensoren jeweils aufgezeichnet. Wie aus Fig. 3a ersichtlich ist, stieg die Temperatur innerhalb von 10 min weiter an, aber der Temperaturanstieg begann nach 120 s ein Plateau zu erreichen. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Untersuchungen überein, in denen ein ähnlicher Trend bei den thermischen Signaländerungen mit der Zeit beobachtet wurde [28]. Unter Berücksichtigung der Anforderungen an POCT und Stromverbrauch wurde die Erkennungszeit des Geräts auf 120 s eingestellt.

Optimierung der thermischen Sensorik. a Temperaturänderungen in 10 min Bestrahlung. b Thermisches Signal bei unterschiedlichen Bestrahlungsabständen

Anschließend wurde die Abstandsoptimierung durchgeführt. Abbildung 3b zeigt, dass das thermische Signal mit zunehmendem Abstand zwischen der Laserdiode und der Testlinie abnimmt. Der Grund dafür kann sein, dass die die Testlinie erreichende Laserleistung mit zunehmender Entfernung der effektiv bestrahlten Fläche abgeschwächt wurde. Um die maximale Signalantwort zu erhalten, wurde der Abstand auf 7 mm eingestellt.

Der Einfluss der Umgebungstemperatur auf die Wärmemessung

Da die thermische Erfassung eng mit der Temperatur verbunden ist, musste untersucht werden, wie die Umgebungstemperatur die thermische Erfassung beeinflusst. Die Umgebungstemperatur wurde im Bereich von 27,5 bis 40 °C unter Verwendung eines Inkubators eingestellt. An jedem Temperaturpunkt wurden insgesamt 4 Proben im Abstand von 2,5°C gemessen. Die Kurven der Umgebungstemperatur gegenüber dem thermischen Signal wurden für die Leer- bzw. 1 OD/ml-Streifen mit beiden thermischen Erfassungsmethoden gemessen. Die Parameter der Umgebungstemperatur der Anpassungskurve sind in Tabelle 1 dargestellt. Abbildung 4a zeigt, dass die Kurvensteigungen im Leitungsmodus im Allgemeinen für verschiedene Konzentrationen konsistent waren, was darauf hindeutet, dass Änderungen der Umgebungstemperatur die gleichen Auswirkungen auf verschiedene Konzentrationen hatten. Als Ergebnis kann die Umgebungseffektkurve verwendet werden, um quantitative Ergebnisse zu kalibrieren. Im Strahlungsmodus waren die Steigungen der Kurven (Abb. 4b) entsprechend den beiden Konzentrationen miteinander konsistent, aber beide Kurven zeigten einen Abwärtstrend. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Leitungsmodus zuverlässiger ist, wenn Proben unter Bedingungen mit hoher Temperaturvariabilität gemessen werden.

Einfluss der Umgebungstemperatur. a Das thermische Signal ändert sich mit der Umgebungstemperatur im Leitungsmodus. b Das thermische Signal ändert sich mit der Umgebungstemperatur im Strahlungsmodus

Quantifizierung der Nanopartikel

Thermal Sensing Detection

Um die Standard-Quantifizierungskurven zu erhalten, wurden die beiden thermischen Sensing-Methoden (Zusatzdatei 1:Abbildung S5) verwendet, um Teststreifen mit Nanopartikeln im Bereich von 0 bis 10 OD/mL zu erkennen. Diese Streifen (Zusatzdatei 1:Abbildung S6a) mit unterschiedlichen Konzentrationen an Nanopartikeln wurden mit dem erwähnten tragbaren Gerät nachgewiesen (siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“). Die Einstellung beider Sensoren im Gerät ist in Zusatzdatei 1 dargestellt:Bild S5a und S5b. Vier Proben wurden für jede Konzentration bei einer Umgebungstemperatur von 27,5 °C getestet. Das Gerät wendete die AUC-Methode an, um das thermische Signal an der Testleitung zu berechnen. Daher war die Quantifizierung des thermischen Signals proportional zur Menge an Nanopartikeln auf der Testlinie. Die Quantifizierungskurven (Abb. 5a) wurden durch lineare Regression der aus dem thermischen Signal erhaltenen Daten gegen die Konzentration der Nanopartikel erstellt und werden durch die Formeln in Tabelle 2 dargestellt.

Quantifizierung von Nanopartikeln. a Standardquantifizierungskurven in drei Methoden. b Quantitative Ergebnisse in niedriger Konzentration mit linearen Kurven

Tabelle 2 zeigt, dass die Empfindlichkeit des Strahlungsmodus 15-fach höher war als die des Leitungsmodus. Die LOD der Leitungs- und Bestrahlungsmodi betrug 0,053 OD/ml bzw. 0,023 OD/ml. Bei der thermischen Erfassung verbesserte der Strahlungsmodus die Nachweisgrenze (LOD) um das Zweifache im Vergleich zum Leitungsmodus. Die Stabilität von LFA-Streifen wurde ebenfalls getestet, wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S7 dargestellt. Der konduktive thermische Erfassungsmodus erfordert die Übertragung von Wärme zwischen zwei Feststoffen. Wenn die Temperatur der Testleitung schnell ansteigt, dauert es eine gewisse Zeit (Relaxationszeit), bis der Sensor dieselbe Temperatur wie die Testleitung erreicht. Als Ergebnis war die Temperatur des Sensors am Ende der Detektion niedriger als die tatsächliche Temperatur in der Testleitung. Andererseits erforderte der Strahlungsmodus keine Übertragung der Wärme auf den Sensor, da der Sensor die von der Testleitung eingestrahlte IR-Welle direkt erfasste, um seine aktuelle Temperatur zu erhalten. Bei der Leitungsdetektion wurde ein Teil der Wärme aufgrund des Vorhandenseins guter Wärmeleiter, die als Kühlkörper wirkten, abgeführt, während bei der Strahlungsdetektion nur Luft und das Band selbst in die Wärmeableitung eingriffen. Diese Gründe können erklären, dass die Empfindlichkeit der Leitungsmethode geringer ist als die der Strahlungsmethode.

Beim Testen von Streifen mit einer Konzentration von 10 OD/ml stellten wir fest, dass im Strahlungssensor (berührungslos) ein Brandfleck vorhanden war. One possible reason for this phenomenon is that in the non-contact measurement, the low thermal conductivity of the air allows the heat to be retained in the test line and dissipate less efficiently, increasing the effective local temperature and eventually causing the combustion of the membrane.

In the contact mode of detection, however, the sensor with a large thermal conductivity acted as medium and heatsink. In this way, heat was conducted to the sensor so that no combustion occurred in the test line.

Comparison Between Thermal Sensing and Visual Detection

Due to its popularity for portable devices and wide use, we compared the thermal sensing with visual detection for its detection ability. For visual detection, the pictures of the strip were taken by a conventional microscope digital camera. The test strips were mounted in the cartridge to ensure the positional consistency of the image analysis in a similar fashion than with the thermal sensing. Software Image J was used to analyze the grey value in the test line for different concentrations of nanoparticles. A standard curve (Fig. 5a) of the visual detection method was plotted based on the results of this analysis. The linear range between the grey value and the concentration of nanoparticles was 0.2–10 OD/mL (R ² was 0.770 for the range of 0–0.2 OD/mL, so they were thus discarded from further analysis). The detection limit was 0.268 OD/mL. The results indicated that thermal sensing could reduce LOD by 5- to 12-fold compared to visual detection. In Qin’s research, they found that the LOD for visual analysis was 100-fold higher than thermal contrast [21]. Since they employed a high laser power and an infrared camera, they gained greater difference in LOD. One reasonable explanation for the LOD improvement is that thermal sensing is able to measure the nanoparticles on top and beneath the membrane surface. Another advantage of thermal sensing is that it has a higher stability than visual detection. Thermal sensing generates heat by the nanoparticles on the entire test line. Visual detection relies only on the color reaction of the nanoparticles on the surface of the test line. Even if the analyte concentrations of two test strips are the same, the distribution of the nanoparticles on the T-line in the tangent plane is different; thus, the visual inspection will result in a difference in the detection results while the thermal sensing is more stable and reproducible. On the contrary, the sensitivity of the visual detection was 2-fold higher than thermal sensing. Visual detection is a direct method for quantifying nanoparticles, while thermal sensing is an indirect measurement of the concentration of the nanoparticles by measuring the temperature changes, which may partially explain the lack of sensitivity. Figure 5b demonstrates that the linear range of detection for thermal sensing can be as low as 0 OD/mL, with the R ² of 0.972 (conduction) and 0.987 (radiation), suggesting that thermal sensing has a better potential for its applications in early detection in POCT than color quantification, since the target analytes are in lower concentrations.

Quantitative Detection of HCG

Finally, the biomarker HCG was quantified using our system in order to validate the thermal sensing. Both conduction and radiation modes were applied to quantify the HCG. The optical power was turned down to 150 mW, preventing the strips from burning. Strips (Additional file 1:Figure S6b) with four different concentrations were tested. Figure 6a and b show that the thermal signals were linear to the concentration of HCG from 35 to 700 mUI/mL. When the concentration was extended to the range of 35–7000 mUI/mL, the linearity was between the logarithm of the concentration and the thermal signal as in Fig. 6c, d. In conduction mode, the LOD was 64.2 mIU/mL which is in a similar range than the visual detection. However, the ideal LOD of the radiation mode was 2.8 mIU/mL. The data matched with the quantification of nanoparticles. Compared with other devices that applied photothermal effect (LOD =5.5 mIU/mL) [27], our device in radiation mode reduced the LOD by nearly 2-fold. Those results proved that thermal sensing is an effective way in LFA detection and quantification.

The standard curves of HCG. a A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal in radiation mode. b A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal conduction mode. c The quantification results of HCG in radiation mode. d The quantification results of HCG in conduction mode

Schlussfolgerungen

A plasmonic thermal sensing method for LFA detection was established. A portable device based on this method was developed by applying different temperature sensors (conduction and radiation modes). The study of the influence of the ambient temperature demonstrated that it has a negative impact on the thermal sensing and conduction mode was less affected than radiation mode. In radiation mode, the impact was more significant at high concentrations. Both modes were also tested to compare the quantification ability. When compared with the traditional visual detection, the thermal sensing methods showed a 5- to 12-fold improvement in LOD for nanoparticle quantification. The radiation mode showed a better performance than conduction mode in both sensitivity and LOD. In the validation of thermal sensing, LFA strips for the detection of HCG were tested and the results demonstrated that the radiation mode was much more sensitive than the conduction mode. In this way, we proved that thermal sensing is a feasible and effective way for early detection in LFA platforms.

In conclusion, plasmonic thermal sensing can truly improve the analytical sensitivity and shows a promising future in LFA detection for early diagnostic applications. The portable device described herein provided two sensing approaches to satisfy different requirements.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Abkürzungen

AUC:

Area under the curve

AuNPrs:

Gold nanoprisms

BSA:

Rinderserumalbumin

CCD:

Ladungsgekoppeltes Gerät

CMOS:

Complementary metal oxide semiconductor

HCG:

Human chorionic gonadotropin

LFA:

Lateral flow assay

LOD:

Nachweisgrenze

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

MCU:

Microcontroller unit

MES:

4-Morpholineethanesulfonic acid

NIR:

Nahes Infrarot

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

POCT:

Point-of-Care-Tests

PVC:

Polyvinyl chloride

PVP:

Poly-vinyl-pyrrolidone

S-NHS:

N -Hydroxysulfosuccinimide