Gezieltes Gen-Silencing BRAF synergierter photothermischer Effekt hemmt das Wachstum von Hepatomzellen mit dem neuen GAL-GNR-siBRAF-Nanosystem

Einführung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist ein großes globales Gesundheitsproblem [1]. Es ist die sechsthäufigste Krebserkrankung der Welt und die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache [2, 3]. Die meisten HCC-Fälle treten in Ostasien und Afrika südlich der Sahara auf. In einigen Industrieländern, darunter Frankreich, Großbritannien, Japan und den USA, ist die Inzidenz jedoch gestiegen [4]. Die Standardtherapie des frühen HCC ist die chirurgische Resektion des Tumors. Nach der Operation kann die 5-Jahres-Überlebensrate zwischen 89 und 93 % liegen [5]. Leider wird nur ein kleiner Prozentsatz der HCC-Patienten (ca. 20–30 %) in einem frühen Stadium diagnostiziert; die meisten HCC-Patienten (> 70 %) werden in einem fortgeschrittenen Stadium gefunden und können nicht chirurgisch reseziert werden. Andere Behandlungsoptionen sind Lebertransplantation, arterielle Transkatheter-Chemoembolisation (TACE) und systemische Chemotherapie [6]. Allerdings ist die Lebertransplantation durch das Angebot begrenzt, und eine unvollständige TACE-Embolisation kann zu einem Therapieversagen mit erheblichen Nebenwirkungen der systemischen Chemotherapie und einer schlechten Gesamtprognose führen. Daher sind neue Behandlungsmethoden für das hepatozelluläre Karzinom klinisch sehr anspruchsvoll [7].

Der RAS/RAF-Signalweg spielt eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von Leberkrebs und BRAF ist eines der wesentlichen krebsassoziierten Gene in diesem Signalweg. Genetische Veränderungen in diesen Genen führen oft zu zwei kaskadierten Störungen. Eine abnormale Aktivierung des RAS/RAF-Signalwegs ist bei Krebspatienten mit einer schlechten Prognose verbunden [8]. BRAF ist das am häufigsten mutierte Gen in der RAF-Familie, und die Ausrichtung auf den RAS/RAF-Signalweg ist eine neue therapeutische Strategie zur Behandlung von HCC [8,9,10]. Da sich der RAF-Kinase-Inhibitor Sorafenib bei der Behandlung des HCC bewährt hat, sind BRAF-Mutationen das bevorzugte Ziel der HCC-Therapie [8]. Insbesondere BRAF-Mutationen sind zu einem wünschenswerten Ziel für die Behandlung des fortgeschrittenen HCC geworden, da die klinische Entwicklung des RAF-Kinase-Inhibitors Sorafenib in der HCC-Behandlung in Asien, Europa und den USA gefunden wurde [11]. Im Vergleich zu Placebo verlängerte Sorafenib das Gesamtüberleben und verlängerte das mediane Gesamtüberleben von Patienten mit fortgeschrittenem HCC [12,13,14]. Sorafenib hat jedoch eine schlechte Tumor-Targeting-Fähigkeit, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Bluthochdruck, Haarausfall und Übelkeit führen kann [15]. Medikamente, die mit hoher Spezifität auf Leberkrebs abzielen und RAF blockieren, müssen noch weiter erforscht werden.

Der Asialoglycoprotein-Rezeptor (ASGPR), auch bekannt als Leber-Galactose-Rezeptor, ist ein C-Typ-Lectin, das auf der sinusförmigen Oberfläche von Hepatozyten exprimiert wird [16]. ASGPR gilt als wesentliches Ziel für Leber-Nanostrukturen, da es eine wichtige Rolle bei der Bindung, Internalisierung und Elimination von Substanzen mit terminalen Galaktoseresten spielt [17]. Es wurde berichtet, dass mehrere Monosaccharide (Galactose, Mannose, Lactose, N-Acetylgalactosamin und Sialinsäure) in unterschiedlichem Maße mit ASGPR interagieren, und Galactose zeigte eine höhere Affinität für ASGPR [18]. Da ASGPR der Oberfläche von Leberparenchymzellen stark ausgesetzt ist [19], hat der Rezeptor eine starke Affinität für Galaktose und galactosylierte Prodrugs oder Abgabesysteme, die auf die Leber abzielen. Galactose-Nanopartikel [20], Galactose-Micellen [21] und Galactose-Liposomen [22] wurden als hepatische Targeting-Wirkstoffsysteme identifiziert, die spezifisch auf hepatozelluläre Karzinoidzellen abzielen.

Gold Nanorods (GNR) sind stäbchenförmige Goldnanopartikel, die als Nanocarrier erhebliche Vorteile haben [23]. Gold-Nanostäbchen (GNR) weisen eine ausgezeichnete Biokompatibilität auf und können zur stabilen Abgabe von siRNA verwendet werden [24]; sie haben eine große spezifische Oberfläche, die eine flexible Modifikation spezifischer Tumor-Targeting-Adapter ermöglicht [25]; Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) hat eine hohe photothermische Umwandlungseffizienz unter Nahinfrarotlichtbestrahlung und hat sich zu einem ausgezeichneten photothermischen Antitumormaterial entwickelt [26]. Die maximale photothermische Effizienz kann durch Anpassung des Aspektverhältnisses der Gold-Nanostäbe (GNR) erreicht werden. Die In-vitro- und In-vivo-Toxizität von Goldnanopartikeln hängt von ihrer Größe, Oberflächenladung und Oberflächenbeschichtung ab [27]. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ist jedoch ein wesentlicher Wirkstoff bei der Synthese von Goldnanostäbchen, der eine offensichtliche Zytotoxizität aufweist und biologische Anwendungen einschränkt [28].

Die RNA-Interferenz (RNAi) hat sich zu einem vielversprechenden Ansatz in der Krebsbehandlung entwickelt, da sie Zielgene durch kleine interferierende RNA (siRNA) effektiv ausschaltet oder zum Schweigen bringt [29]. Vor kurzem sind siRNA-Moleküle in die Humanstudienphase eingetreten und gelten als vielversprechende Möglichkeiten zur Behandlung von Krebs und Tumoren mit mehreren mutierten Genen [30]. Die Anwendung von siRNA steht jedoch noch vor enormen Herausforderungen wie Seruminstabilität (Abbau durch Nukleasen in der extrazellulären Umgebung) und Off-Target-Effekten [31]. Darüber hinaus sind siRNAs negativ geladen, was sie daran hindert, an negativ geladene Zellmembranen zu binden [32]. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es unwahrscheinlich, dass siRNA selbst direkt an Zellen abgegeben wird. Die Stabilität von siRNA kann durch chemische Modifikation von siRNA oder durch Einbringen von siRNA-Loadern in schützende Trägermaterialien verbessert werden [33].

In dieser Studie haben wir einen multifunktionalen Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF neu konstruiert. Das System verwendet Gold-Nanostäbe mit optischer Wärmeerzeugung als innerer Kern und extern modifizierte GAL (d-Galactose) mit spezifischem Targeting von Lebertumoren. Dieses System reduzierte die biologische Toxizität von CTAB auf der Oberfläche von Gold-Nanostäbchen und zeigte eine hohe siRNA-Ladekapazität und kann verwendet werden, um das BRAF-Gen bei Leberkrebs effektiv zum Schweigen zu bringen. Die Anwendung von GAL-GNR-siBRAF schwächte die Proliferation, Invasion und Migration von Leberkrebszellen signifikant ab. Darüber hinaus induzierte GAL-GNR-siBRAF gleichzeitig das Gen-Silencing von BRAF und photothermische Effekte, die eine synergistische Wirksamkeit bei der Abtötungsfähigkeit von Tumorzellen erreichten und eine neue Denkweise für die Entwicklung der klinischen Behandlung von Leberkrebs eröffneten.

Material und Methoden

Zelllinie

Die hepatozelluläre Karzinomzelllinie Hepa1-6 der Maus wurde von der Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, erworben. Die Zellen wurden in DMEM-Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) mit 10 % FBS bei 37 °C mit 5 % CO₂ . kultiviert .

Synthese von BRAF-siRNA

Die Sequenz für siRNA, die auf das BRAF-Gen zielt, ist 5'-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3' und wurde von Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA) synthetisiert. Das kommerziell erhältliche zielgerichtete Luciferase-Gen siGL2 wurde als negative Kontroll-siRNA verwendet.

Synthese von CTAB-GNR

Wasserlösliche Goldnanostäbchen wurden unter Verwendung eines keimvermittelten Wachstumspfads synthetisiert [34]. Die Impflösung wurde wie folgt hergestellt:1 µl Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (0,2 µM) (Sinopharm) wurde vorsichtig mit 1 µl HAuCl<. vermischt sub>4 (0,5 µM) (Sinopharm). Rühre die Lösung bei 28 °C, mischte gründlich und fügte 0,12 mL kaltes NaBH₄ . hinzu (0,01 &mgr;M) (Sinopharm), bis die erhaltene Impflösung braun wurde und in Reserve blieb. Die Wachstumslösung wurde dann wie folgt synthetisiert:50 µl CTAB (0,2 µM) und 50 µl HAuCl₄ (1 mM), 2,5 ml AgNO₃ (4 µM) (Sinopharm) wurden bei 28 °C leicht gemischt. Nach gründlichem, mildem Mischen wurden 670 µl Ascorbinsäure (0,079 µM) zugegeben, wenn die Farbe der Lösung von dunkelgelb nach farblos wechselte. Einhundertzwanzig Mikroliter der Impflösung wurden unter leichtem Rühren bei 28ºC zugegeben, und die Farbe wurde allmählich von Purpur zu Purpurschwarz transparent. Nach 24 Stunden Rühren bei konstanter Temperatur wurde die Lösung bei 12.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, um zusätzliches CTAB zu entfernen, und zur späteren Verwendung zu GNR-Pulver vakuumgefriergetrocknet.

Synthese von MUA-PEI und GAL-PEI-MUA

Mercaptoundecansäure (MUA; 654 mg) wurde in 30 ml Chloroform (CHCl₃ .) gelöst ) und anschließend mit 100 mmol 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) und 100 µmol N-Hydroxysuccinimid (NHS) für 15 µm bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurden 100 µmol Polyethylenimin (PEI) zu der obigen Lösung gegeben. Nach 24 h Reaktion bei Raumtemperatur wurde ein gleiches Volumen entionisiertes Wasser verwendet, um das wasserlösliche PEI-MUA zu extrahieren. Das gleiche Verfahren wurde verwendet, um die Aktivierung von d-Galactose in wässriger Lösung zu vervollständigen. Dann wurde ein Überschuss an aktivierter d-Galactose (500 µMol) zu der obigen wasserlöslichen PEI-MUA-Lösung gegeben und die Reaktion wurde ausreichend bei Raumtemperatur für 24 Stunden durchgeführt, um ein wasserlösliches GAL-PEI-MUA zu erhalten komplex.

Synthese von GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) und PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Gefriergetrocknetes CTAB-GNR-Pulver (10 mg) wurde in 10 ml wasserlöslicher PEI-MUA- oder GAL-PEI-MUA-Komplexe suspendiert. CTAB wurde durch eine Au-S-Bindung ersetzt, wenn es 24 h bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Lösung wurde 15 min bei 12.000 U/min zentrifugiert, um überschüssigen Überstand zu entfernen, und der Niederschlag wurde dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. PEI-GNR- oder GAL-GNR-Pulver wurden durch Gefriertrocknen hergestellt, gewogen und in Wasser ohne Ribozym gelöst, und dann wurde der Plasmaresonanzeffekt mit einem multifunktionalen Enzymanalysator (Spectra Max M5e, MD, USA) beobachtet.

Transmissionselektronenmikroskopie

Das GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Resuspension wurde auf ein Kupfergitter gelegt. Nachdem die Proben auf dem Kupfernetz 30 min lang gründlich an der Luft getrocknet worden waren, wurde das Kupfernetz unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (LIBRA 120, Carl Zeiss, Deutschland) abgebildet

Ultraviolett-sichtbare Analyse

Der GNR, PEI-GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert. Der Oberflächenplasmonenresonanzeffekt von Nanomaterialien im Wellenlängenbereich von 600 bis 900 nm wurde mit einem multifunktionalen Mikroplattenlesegerät (SpectraMax M5e, MD, USA) untersucht.

Zetapotential- und hydrodynamische Durchmesseranalyse

Der GNR, PEI-GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert, und dann wurden das Zetapotential und der hydrodynamische Durchmesser des Nanomaterials auf einem Zetasizer Nano ZS gemessen.

Kernmagnetische Resonanzanalyse

Das lyophilisierte GAL-GNR-Pulver wurde in schwerem Wasser (99%, Sigma) gelöst, um eine homogene Suspension herzustellen, und die Suspension wurde dann in ein NMR-Probenröhrchen überführt. Die Zusammensetzung von GAL-GNR wurde durch Kernspinresonanz (NMR) (Bruker, 600 MHz, Deutschland) bestimmt.

Gel-Shift-Assay

GAL-GNR und siBRAF wurden entsprechend dem Massenverhältnis (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1) gemischt. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde der DNA-Ladepuffer in die Mischung gegeben. Alle Proben wurden zu 2% Agarosegel mit 0,01% Goldview (Bioshop, USA) gegeben und dann 30 min bei 90 °V elektrophoretisch aufgetrennt. Der Grad der siBRAF-Verpackung wurde auf dem Gel-Bildgebungssystem visualisiert.

Stabilität von siRNA im Serum

Die Mischung aus GAL-GNR-siBRAF (6:1) wurde in frischem Mausserum bei 37 °C 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h bzw. 48 h inkubiert. Die Gruppe mit nacktem siBRAF plus frischem Mausserum wurde unter den gleichen Bedingungen behandelt. Ein gleiches Volumen von 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde zu der GAL-GNR-siBRAF-Lösung gegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde DNA-Ladepuffer zugegeben und alle Proben wurden auf ein 2% Agarosegel (das 0,02% Goldview (Bioshop, USA) enthielt) geladen und bei 90 V für 30 Minuten elektrophoretisch aufgetrennt. Die Streifenhelligkeit des siBRAF wurde auf einem Gel-Imaging-System visualisiert.

Test zur kompetitiven Hemmung von GAL-GNR-siBRAF

2 × 10 ⁵ Hepa1-6-Zellen wurden über Nacht in Mikrotiterplatten mit 12 Vertiefungen kultiviert. Dann wurden die Zellen 12 h mit Lactobionsäure vorbehandelt und dann 30 min mit GAL-GNR-siBRAF (Cy3-markiert) transfiziert. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Skalenbalken =200 μm) bestimmt.

Gezielte Abgabefähigkeit von GAL-GNR-siBRAF auf Leberkrebs

Ein Mikrogramm cy3-markiertes siBRAF wurde mit PEI-GNR (30 µg/ml), GAL-GNR (30 µg/ml) für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann dem Medium von Hepa1-6-Zellen zugesetzt. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Zellen dreimal mit 50% FBS gewaschen und die Fluoreszenzintensität in den Zellen wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop gemessen.

Photothermische Effekte

Zwanzig, 40, 60, 80 und 100 µg GAL-GNR und 100 µg GNR lyophilisiertes Pulver wurden gründlich in 1 µl destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde in eine 24-Well-Platte gegeben und kontinuierlich mit einer 803 nm Nahinfrarot-Laserquelle (2 W/cm ² .) bestrahlt ) für 15 min. Die Temperatur jeder Gruppe wurde in den ersten 5 Minuten alle 0,5 min mit einem Infrarot-Thermometer aufgezeichnet, und dann wurde die Temperatur alle 1 min markiert.

MTT-Assay

Zweihundert Mikroliter Zellen (3,5 × 10 ⁴ /ml) wurde in 96-Well-Mikrotiterplatten für 24 h kultiviert und dann mit unterschiedlichen Konzentrationen von GNR oder GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 μg/ml) kultiviert. Nach 24 oder 48 h Inkubation wurden 20 μl MTT zum Kultursystem gegeben und weitere 4 h inkubiert. Die violetten Kristalle wurden in 150 µl DMSO gelöst, gefolgt von einer spektrophotometrischen Analyse bei 490 nm unter Verwendung einer Referenz von 650 nm in einem Mikroplattenlesegerät (SpectraMax M5e, MD, USA).

Calcein-AM- und PI-Färbungstest

Hepa1-6-Zellen (1,5 × 10 ⁵ ) wurden über Nacht in einer 12-Well-Platte aufbewahrt und mit PBS, Laser, GAL-GNR-siBRAF (30 µg/mL:1 µg), GAL-GNR-siGL2 (30 µg/mL:1 µg) + Laser oder GAL . behandelt -GNR-siBRAF (30 μg/mL:1 μg) + Laser für 4 h und dann mit Nahinfrarotlicht (808 nm, 2 W/cm ² . bestrahlt ) für 15 min. Die Zytotoxizität von GAL-GNR wurde durch Färbeexperimente mit Calcein-AM (lebende Zellen) und PI (tote Zellen) nachgewiesen. Die grüne Fluoreszenz von Calcein-AM und die rote Fluoreszenz von PI wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop fotografiert.

Quantitative Echtzeit-PCR

Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung von Trizol (Trizol-Reagenz, Invitrogen) extrahiert und als Matrize für die cDNA-Synthese verwendet. Die Q-PCR wurde mit genspezifischen Vorwärts- und Rückwärtsprimern (jeweils 0,5 µl × 10 µM) im Stratagene Mx3000P qRT-PCR-System (Agilent Technologies, Lexington, MA, USA) durchgeführt. SYBR green PCR MasterMix (Life Technologies) wurde nach dem Schema des Herstellers verwendet. Als interne Referenz wurde das Housekeeping-Gen β-Aktin verwendet. Die Primersequenzen waren β-Actin:5'AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3' (vorwärts) und 5'ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3' (rückwärts); BRAF:5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (vorwärts) und 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (rückwärts). Die Differenz der Genexpression wurde mit 2 ^−∆∆Ct . berechnet und angezeigt Methode.

Western Blot

Das Gesamtprotein von Hepa1-6-Zellen wurde durch RIPA-Puffer (Cell signaling, Pickering, Ontario, Kanada) erhalten und durch Bicinchoninsäure (BCA) quantifiziert. Protein wurde in 12% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) übertragen. Das Housekeeping-Gen β-Aktin wurde als interne Referenz zum Nachweis der BRAF-Proteinexpression verwendet. Die Proteinbande und die interne Referenz des Zielproteins wurden durch ECL-Chemilumineszenz nachgewiesen.

Kratztest

Das transfizierte Hepa1-6(1.7 × 10 ⁵ /ml) Zellen wurden über Nacht in 12-Well-Platten ausgesät. Zellen, die vollständig an der Platte hafteten, wurden mit einer 10-μl-Pipettenspitze angekratzt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und durch Medium ersetzt, das 2% FBS enthielt. Der Durchschnitt der Wundlinie wurde nach 0, 24 und 48 h unter einem Mikroskop beobachtet. Jeder Kratztest wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.

Transwell-Assay für Migration und Invasion

Acht Mikrometer große Transwellkammern (Corning Life Science) wurden verwendet, um die Zellmigration und -invasion zu beurteilen. Hepa1-6, suspendiert in 200 μL serumfreiem Medium, wurde mit einer Dichte von 1,7 × 10 ⁵ . in die oberen Kammern gegeben ml Zellen/Vertiefung, und dann wurden 500 µl Medium mit 12 % FBS in die untere Kammer gegeben. Nach 24–48 h Inkubation wurden die Zellen 30 min mit einer 4%igen Paraformaldehydlösung fixiert und dann 30 min mit einer 1%igen Kristallviolettlösung gefärbt. Schließlich wurden die Zellen fotografiert und unter einem inversen Mikroskop gezählt. Für den Zellinvasionsassay erfordern Zellinvasionsexperimente eine ECM-Gelbeschichtung und die verbleibenden Schritte sind konsistent.

Statistik

Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD und Student's t . ausgedrückt Test (zweiseitig), um den Unterschied zwischen den beiden Methoden zu bestimmen. Zum Vergleich mehrerer Gruppen wurde ein Einweg-ANOVA-Test verwendet. Die Daten wurden bei p . als statistisch signifikant angesehen <0,05 (*p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001).

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung des Nanoträgers GAL-GNR-siBRAF

Wir haben einen neuartigen Nanocarrier GAL-GNR entwickelt, der in der Lage ist, kleine interferierende RNA (siRNA) an die Leberzellen zu liefern und gleichzeitig den photothermischen Effekt der Goldnanostäbchen aufrechtzuerhalten. Das Syntheseverfahren von GAL-GNR ist in Schema 1 gezeigt. Dieses auf die Leber ausgerichtete System enthält drei funktionelle Komponenten. Erstens ist der grundlegende Teil von GAL-GNR ein GNR-Skelett mit einer Länge von etwa 30 nm und einem Durchmesser von 10 nm, wie im TEM-Bild (Abb. 1a) gezeigt und chemisch konjugiertes GNR (GAL-GNR) zeigte keine signifikanten Dimensionsänderung und besaß noch eine gute Dispergierbarkeit (Abb. 1b). Die Daten der Partikelgröße zeigten, dass die durchschnittliche Größe des GNR 30,23 nm betrug, was mit den Ergebnissen der Elektronenmikroskopie übereinstimmte, und die Größe von GAL-GNR (50 nm) und PEI-GNR (42,35 nm) war größer als GNR, da die Konjugation von GAL und PEI erhöhte die Hydratation zwischen den Partikeln (Abb. 1c). Zweitens wurde biologisch toxisches CTAB auf der Oberfläche von GNR durch positiv geladenes MUA-PEI ersetzt, das mit negativ geladener siRNA beladen werden kann. Die Messung des Zetapotentials zeigte, dass die Oberflächenladung von GNR von 35,6 auf 42,7 mV bzw. 41,8 mV anstieg, wenn die GNR mit PEI bzw. GAL-PEI modifiziert wurden, was darauf hindeutet, dass GAL-GNR eine starke Fähigkeit besitzt, siRNA zu binden (Abb. 1d). Drittens haben wir GAL als Leitmolekül verwendet, um GNR-Nanocarrier zu konjugieren, die für das spezifische Homing von Leberzellkarzinomen verwendet werden können. Die UV-Vis-Absorptionsspektroskopie wurde verwendet, um die Struktur des modifizierten GNR vorläufig zu erkennen. Die anfängliche Wellenlänge des Absorptionsspektrums von unmodifiziertem GNR betrug 763  nm; eine Wellenlängenverschiebung von 7 nm wurde anfänglich mit der MUA-PEI-Modifikation beobachtet, und eine weitere Verschiebung von 8 nm wurde am Ende der Synthese beobachtet, als die Modifizierung von GNR mit GAL erfolgreich war (Abb. 1e). Um die GAL im Nanosystem zu bestätigen, wurde ein NMR-Bild verwendet, um die chemischen Gruppen zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass das H-Signal von Galactose nur im GAL-GNR-Spektrum im NMR-Wasserstoffspektrum gefunden wurde, das war:3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53. NMR-Spektren bestätigten die chemische Struktur von GAL, in der GAL erfolgreich an die GNR-Oberfläche konjugiert wurde (Abb. 1f).

GAL-GNR-Syntheseverfahren. a Der Syntheseprozess von MUA-PEI. b Aktivierung von d-Galactose und chemische Reaktion mit MUA-PEI. c Das synthetische Endprodukt von GAL-GNR

Charakterisierung von GNR und GAL-GNR. a TEM-Aufnahme des GNR (Skala =0,5 µm/50 µm). b TEM-Aufnahme von GAL-GNR (Skala =0.5 μm /50 nm). c Partikelgrößenanalyse verschiedener modifizierter GNR. d Zetapotentialanalyse verschiedener modifizierter GNR (GAL-GNR). e Normalisierte UV-Vis-Absorptionsspektren von verschiedenen modifizierten GNR und Wasser. f NMR-Absorptionsspektren von GAL-GNR

siRNA-Verkapselungsfähigkeit und Stabilität von GAL-GNR

Das GAL-GNR-Nanoskelett wurde durch positiv geladenes PEI modifiziert, das durch elektrostatische Wechselwirkung mit negativ geladener siRNA kombiniert werden kann. Wir verwendeten einen Gel-Shift-Assay, um die siRNA-Bindungsfähigkeit von GAL-GNR zu bewerten. Die freie siRNA kann sich entlang des Geldurchgangs bewegen, während die gebundene siRNA verlangsamt oder vollständig gestoppt wird. Außerdem wird die gebundene siRNA nicht mehr effektiv an Bromid binden und die Fluoreszenzintensität nimmt dementsprechend ab. Das Ergebnis der Gelelektrophorese zeigte, dass das optimale Verhältnis zur Sättigung von GAL-GNR mit siBRAF 6:1 (w/w) beträgt (Abb. 2a).

Gel-Shift-Assays. a siRNA-Ladekapazität von GAL-GNR. Ein Mikrogramm siRNA wurde in gleichen Volumina mit unterschiedlichen Massenverhältnissen von GAL-GNR gemischt. Nach 30 min Inkubation wurde ein Gelmigrationsassay verwendet, um die siRNA-Beladungskapazität von GAL-GNR zu bestimmen. b Stabilität von siRNA in Mausserum. Ein Mikrogramm BARF-siRNA wurde mit dem GAL-GNR im Massenverhältnis 1:6 beimpft und anschließend zu frischem Mausserum gegeben. Nach einer Reaktion von 0, 3, 6, 12, 24 und 48 h bei 37 °C wurde siRNA aus GAL-GNR-siBARF mit 2% SDS extrahiert und mit Ethidiumbromid visualisiert

Nackte siRNA ist sehr gut abbaubar, insbesondere in vivo. Eine wichtige Funktion des Abgabesystems besteht darin, siRNA vor Abbau zu schützen. Daher haben wir die protektive Wirkung von Nanocarrier GAL-GNR auf siRNA in frischem Serum konsequent getestet. Im Vergleich zur nackten siRNA wurde die gebundene siRNA länger im Serum gelagert. Wie in Abb. 2b gezeigt, konnte nackte siRNA bis zu 12 Stunden im Serum existieren, während die gebundene siRNA nach 48 Stunden noch reichlich vorhanden war. Das Ergebnis zeigte, dass GAL-GNR den Abbau von siRNA im Serum effektiv verhindern kann, wodurch eine gezielte Abgabe in vivo gewährleistet wird.

Zytotoxizität von Nanomaterialien

Eine weitere wichtige Eigenschaft von Nanomaterialien ist die geringe biologische Toxizität, die ihren Einsatz in der Krebsbehandlung ermöglicht. Um die Biokompatibilität dieser neuen GAL-GNR-Nanostruktur zu bewerten, haben wir ihre Zytotoxizität getestet. Wie in 3 gezeigt, wurden tote Zellen von Hepa1-6 in der unmodifizierten GNR-behandelten Gruppe anfänglich bei einer niedrigen Konzentration von 30 &mgr;g/ml beobachtet. Nach Inkubation mit 75 µg/ml GNR für 24 Stunden betrug die Zelltodrate bis zu 56,09 % und die Mortalität stieg nach 48 Stunden Inkubation auf 75,5%. Im Gegenteil, die GAL-Modifikation reduzierte die Zytotoxizität signifikant. Nach 48-stündiger Inkubation von GAL-GNR waren selbst bei hoher Konzentration (105 µg/ml) noch mehr als 80 % der Zellen am Leben. Diese Daten legen nahe, dass der Nanocarrier GAL-GNR im Vergleich zu GNR eine hohe Biokompatibilität aufweist, was die Anwendungssicherheit gewährleistet.

Toxizität von GAL-GNR. Hepa1-6-Zellen wurden mit GNR (CTAB-GNR) oder GAL-GNR für 24 oder 48 h in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT-Test gemessen (n =5)

Gezielte Abgabe von siRNA auf Hepatomzellen und Gen-Silencing von BRAF in vitro

Die Fähigkeit, siRNA in Krebszellen zu transportieren, ist eine der wichtigsten Funktionen von Nanomaterialien. Um das Potenzial von GAL-GNR bei der siRNA-Lieferung zu untersuchen, haben wir die Wirksamkeit von Gen-Silencing unter Verwendung von siBRAF, das mit GAL-GNR beladen ist, in Hepa1-6-Zellen nachgewiesen. Verglichen mit der leeren Gruppe weist die Expression von BRAF in mit GAL-GNR-siGL2 (Negativkontrolle) transfizierten Zellen keine Veränderung auf, während die mit GAL-GNR-siBRAF transfizierten Zellen eine signifikante Abnahme aufwiesen (Fig. 4a). Darüber hinaus war der Silencing-Effekt dosisabhängig, was mit der Erhöhung der GAL-GNR-Konzentration korreliert. Die qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die ideale transfizierte Konzentration von GAL-GNR-siBRAF 30 µg/ml betrug und die Silencing-Effizienz bis zu 90,29% erreichen kann, was der Gruppe von Lipofectamin 2000 (Positivkontrolle) ähnlich war. Das Ergebnis des Western-Blots stimmte mit der qPCR überein, und die Proteinexpression von BRAF war nach 48-stündiger Transfektion herunterreguliert (Abb. 4b).

Gezielte Abgabe von siRNA auf Hepatomzellen und Gen-Silencing von BRAF in vitro. a Die mRNA der BRAF-Expression nach GAL-GNR-siBRAF-Transfektion. Hepa1-6-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von GA-GNR transfiziert, die die gleiche Menge BRAF-siRNA (1 µg) für 24 Stunden trugen. Die Expression von BRAF-mRNA wurde durch qPCR bestimmt. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung von drei Experimenten dar (***p <0,001). b Die Proteinexpression von BRAF in Hepa1-6 nach GAL-GNR-siBRAF-Transfektion. Hepa1-6-Zellen wurden mit GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 oder PBS für 48 h transfiziert, die Spiegel von BRAF und β-Aktin wurden durch Western-Blot bestimmt. c und d Leberkrebs-gezielte Abgabefähigkeit von GAL-GNR-siBRAF. Ein Mikrogramm cy3-markiertes siBRAF wurde mit lip2000, PEI-GNR (30 µg/ml), GAL-GNR (30 µg/ml) für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann dem Medium von Hepa1-6-Zellen zugesetzt. Für den kompetitiven Hemmtest wurden Hepa1-6-Zellen über Nacht mit Lactobionsäure vorbehandelt. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität wurde unter dem Fluoreszenzmikroskop (Skalenbalken =200 µm) beobachtet und die mRNA-Expression von BRAF wurde durch q-PCR quantifiziert. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung von drei Experimenten dar (*p <0,05)

Lactobionsäure hat eine ähnliche Struktur wie GAL, die kompetitiv mit dem Asialoglycoprotein-Rezeptor (ASGPR) kombiniert werden kann, der auf der Oberfläche der hepatozellulären Karzinomzellmembran exprimiert wird [35]. Um die spezifische Targeting-Effizienz von GAL-GNR zu bestätigen, wurden Hepa1-6-Zellen mit Lactobionsäure vorinkubiert und dann mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert. Als Blindwertkontrolle wurden unbehandelte Zellen und als Positivkontrolle das klassische Transfektionsreagenz Lipofectamin 2000 verwendet. Wie in 4c gezeigt, war die rote Fluoreszenzintensität von GAL-GNR-transfizierten Zellen ähnlich der der positiven Kontrollgruppe, während die Fluoreszenzintensität von PEI-GNR-transfizierten Zellen signifikant reduziert ist. Andererseits wurde bei mit GAL-GNR-siBRAF allein transfizierten Zellen eine stärkere rote Fluoreszenz von Cy3 beobachtet als bei mit Lactobionsäure vorbehandelten Hepa1-6-Zellen (Fig. 4c), und das Ergebnis der qPCR stimmte mit dem der roten Fluoreszenz-Ergebnisse überein ( Abb. 4d). Diese Ergebnisse zeigten weiter, dass GAL die Endozytose von siRNA durch Hepa1-6-Zellen effektiv förderte und als zielgerichtete Gruppe von HCC verwendet werden kann.

Der Einfluss von GAL-GNR-siBRAF auf die Proliferation, Migration und Invasion von Hepa1-6-Zellen

BRAF spielt eine wichtige Rolle im MAPK-Signalweg, der für die Regulierung der Zellproliferation, -migration und -invasion verantwortlich ist [36]. Um den Einfluss von GAL-GNR-siBRAF auf hepatozelluläre Karzinomzellen zu beurteilen, analysierten wir zunächst die Zellproliferation durch MTT-Assays. Wie in Fig. 5a gezeigt, war die Proliferation von GAL-GNR-siBRAF-transfizierten hepa1-6-Zellen im Vergleich zu GAL-GNR-siGL2 (Negativkontrolle) oder PBS-behandelten Zellen signifikant verringert. Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von GAL-GNR-siBRAF auf die Zellmigration durch Scratch- und Transwell-Assays. Compared with negative control cells, the migration ability of Hepa1-6 cells that transfected with GAL-GNR-siBRAF was evidently reduced (Fig. 5b–d).

The impact of silencing BRAF gene on Hepa1-6 cells by GAL-GNR-siBRAF. a Proliferation of Hepa1-6 Cells. Hepa1-6 cells were transfected with GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2, or PBS, and the cell proliferation was measured by MTT assay (n =5). The error bar represents the standard deviation of three experiments (*p <0,05). b Scratch test of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above and then scraped with a 10 μL tip. The cell scratch images were taken at different time points (scale bar =200 μm). c und e Migration and invasion of Hepa1-6 cells. Hepa1-6 cells were transfected for 24 h as described above. Cell migration and invasion ability was determined by transwell assay, and imagines were taken at different time points (scale bar =200 μm). d und f Columnar statistical analysis of cell migration and invasive capacity (***p <0.001)

To further investigate the potential of GAL-GNR-siBRAF on the invasion, transwell assays were performed. The results showed that hepa1-6 cells transfected with GAL-GNR-siBRAF haven significantly decreased the invasion of Hepal-6, as compared with GAL-GNR-siGL2 or PBS (Fig. 5e and f). The above results implied that knockdown of BRAF gene using GAL-GNR-siBRAF complexes can effectively reduce migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.

Combination Treatment with Photothermal Effect and Gene Silencing of GAL-GNR-siBRAF

Our previous studies have demonstrated that gold nanomaterials can generate thermal energy under near infrared radiation [37]; this phenomenon is called photothermal effect due to LSPR properties of the GNR. Our results showed that, with the increase of GAL-GNR concentration, the heat production capacity of GAL-GNR was enhanced. When the concentration of GAL-GNR is 100 μg/mL, the temperature quickly rises from 24 to over 60 °C. In addition, there was no significant difference in heat production capacity between GNR and GAL-GNR (Fig. 6a).

Photothermal effect induced by GAL-GNR and combination treatment of photothermal effect and gene silencing on liver cancer cells. a 803 nm near-infrared laser source (2 W/cm ² ) was used to irradiate the solution of GNR, GAL-GNR, or distilled water (blank control) for 15 min. The temperature was detected by infrared thermometer at different time point. b Hepa1-6 cells were treated with PBS, laser, GAL-GNR-siBRAF, GAL-GNR-siGL2 + Laser, or GAL-GNR-siBRAF + Laser, respectively. Green fluorescence of calcein AM (live cells) and red fluorescence of PI (dead cells) were observed under fluorescence microscope

The novel nano-system GAL-GNR-siBRAF possesses three individual characteristics:specific targeting of liver cancer, siRNA-based gene silencing of BRAF, and GNR-offered photothermal effects. Thus, we further study the synergistic therapeutic effect of GAL-GNR-siBRAF in anti-tumor treatment. Hepa1-6 cells without GAL-GNR kept higher viability even under near infrared radiation, suggesting laser itself had no significant effect on tumor cells. Once the laser irradiation was carried out on the basis of GAL-GNR-siGL2 treatment, the photothermal effect showed powerful killing ability on Hepa1-6 cells. Although BRAF gene silencing alone induced cell death, the effect was not conclusive. The treatment of cells with the nano-material GAL-GNR-siGL2 plus laser irradiation resulted in much stronger cell-killing ability than BRAF gene silencing individual (Fig. 6b). These data indicates that the BRAF gene silencing and photothermal effect can synergistically increase the potential of killing tumor cells.

Discussion

Difficulties in tumor-targeted delivery are major obstacles in the clinical treatment of tumors. This study demonstrated for the first time that we have developed a novel multifunctional nanocarrier GAL-GNR-siBRAF, and it was provided with many advantages. The modified GAL-GNR not only possessed good biocompatibility but also maintained the LSPR phenomena of GNR skeleton and still has excellent photothermal conversion ability. GNR modified with GAL can home hepatocellular carcinoma cells through ASGPR, which has great potential in targeted molecular therapy of hepatocellular carcinoma. Further studies showed that BRAF gene silencing inhibited the proliferation, migration, and invasion of hepatoma cells. It is worth noting that GAL-GNR-siBRAF shows a stronger cell killing ability in the combination of photothermal effect and gene silencing of BRAF.

RNA interference (RNAi) has attracted much attention due to its crucial role in gene expression and regulation. Using siRNA to knock down sequence-specific genes in cancer cells for gene therapy is an effective and specific targeted gene therapy, and which has become a new therapeutic tool for many diseases including cancer [29, 31]. However, low stability in serum and poor cell uptake limit siRNA in clinical application [38]. On the other hand, siRNA possess negative charge that prevents it from binding negatively charged cell membranes, and siRNA itself is unlikely to be delivered directly into cells [32, 39]. In addition, there are problems associated with low transfection efficiency and poor cell internalization in siRNA therapy [40]. These barriers impede the delivery of siRNA to target cells. To enhance siRNA stability and to strengthen gene silencing efficacy, we synthesized a novel nanocarrier, GAL-GNR-siBRAF, which includes three components (Scheme 1). This nanocarrier has low molecular size (about 30-nm longitude and 10-nm diameter) and good dispersibility (Fig. 1). Additionally, GAL-GNR-siBRAF could effectively load large amount of siRNA at low concentration (Fig. 2a) and protect siRNA degradation from RNase in serum; the siRNA was evidenced by stability for at least two days at 37 °C in the presence of fresh murine serum (Fig. 2b).

Good biocompatibility is essential for nanomaterials used in the field of biotherapy. CTAB is an essential active reagent in the synthesis of gold nanorods although it has apparent cytotoxicity that limits its biological application [41]. In order to reduce the cytotoxicity of the material, we manipulated the GNR by external modification of positive charge PEI and targeting adaptor GAL (d-galactose). Our results showed that, compared with unfunctionalized GNR, GAL-modified GNR has a better biocompatibility. The cell viabilities maintained over 80% even at very high concentrations (105 μg/mL) of GAL-GNR for 48 h (Fig. 3). In addition, the small molecular size and cylindrical shape of the nanorod facilitate its penetration through the cell membrane into the cell [37, 38, 42]. This phenomenon is particularly evident in targeted therapy of cancer cells. Nano-construct modified with the galactose-targeting moieties resulted in high accumulation of GAL-GNR-siBRAF in tumor cells, inducing effective downregulation of BRAF gene expression (Fig. 4). Moreover, according to the competitive inhibition experiments, we found that GAL-GNR entered cells mainly through ASGPR surface receptors of Hepa1-6 cells (Fig. 4c).

It was reported that HCC with high expression of BRAF and RAF1 tends to have rapid proliferation and growth [41, 43, 44]. B-Raf and Raf1 mainly act on the downstream of ERK/MAPK pathway, regulating nuclear factors through cascade amplification. Activation of this pathway accelerates the proliferation and differentiation of HCC cells abnormally [41, 44, 45]. RAF gene can also promote the expression of matrix metalloproteinases (MMPs), which can change the adhesion of tumor cells, degrade extracellular matrix (ECM) and basement membrane, and promote the invasion and metastasis of tumors [44, 45]. BRAF kinase regulates the RAS-RAF-MEK-ERK pathway, which promotes tumor cell proliferation, invasion and metastasis, and allows cell death through apoptosis [5, 46, 47]. In previous work, we found that BRAF gene was highly expressed in Hepa1-6 cells (data were not shown). It is speculated that the knock down of BRAF expression in Hepa1-6 will block the RAS-RAF-MEK-ERK pathway and lead biological changes of Hepa1-6. To verify our hypothesis, we transfected hepatocellular carcinoma cells with GAL-GNR-siBRAF and found that it can restrain the cell proliferation, migration, and invasion significantly (Fig. 5), providing a new strategy for clinical treatment of hepatocellular carcinoma.

Another important advantage of GNR is that it possesses local surface plasmon resonance (LSPR), which can convert absorbed light energy into heat energy under near infrared light irradiation, thereby killing and destroying cells [42]. Then, we explored the light-to-heat conversion ability of GAL-GNR, and the results showed that the modified GAL-GNR can induce heat energy effectively under the irradiation of near infrared light (Fig. 6a). Next, we further investigated the synergistic effects of GAL-GNR-siBRAF. Whereas BRAF gene silencing showed limited cytotoxicity, the treatment of GAL-GNR-siGL2 + laser had a much stronger killing ability on tumor cells. At the same time, the combination of photothermal hyperthermia and BRAF gene silencing could cause more than 85% cell death (Fig. 6b) which indicates that the synergy of GAL-GNR-siBRAF and photothermal effects could be an ideal strategy to inhibit liver cancer.

Conclusion

This study showed that GAL-GNR-siBRAF overcome the obstacle of siRNA degradation, effectively increased the stability of siRNA in serum in vitro. In addition, GAL-GNR-siBRAF can target deliver siRNA to hepatocellular carcinoma cells and knockdown the expression of BRAF and inhibit the cell proliferation, invasion, and migration significantly. More importantly, GAL-GNR-siBRAF, as a new multifunctional nanocarrier, can greatly enhance the ability of killing tumor cells when combined with near-infrared light. In conclusion, GAL-GNR-siBRAF has great potential in treatment of hepatocellular carcinoma and provides new ideas for clinical application of liver cancer.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data generated and materials used in this study are included in the manuscript and corresponding additional files.

Abkürzungen

GAL:

d-galactose

GNR:

Golden nanorods

siBRAF:

Small interfering RNA specific for BRAF

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

ASGPR:

Asialoglycoprotein receptor

TACE:

Transcatheter arterial chemoembolization

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

CTAB:

cetyltrimethylammonium bromide

MUA:

Mercaptoundecanoic acid

EDC:

1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PEI:

Polyethylenimin

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

NMR:

Nuclear magnetic resonance

FBS:

Fötales Rinderserum

DMSO:

Dimethyl Sulfoxide

BCA:

Bicinchoninic acid

PVDF:

Polyvinylidenfluorid