GAL-GNR-siBRAF-Nanosystem: Gezieltes BRAF-Gen-Silencing und photothermische Therapie gegen Leberzellkarzinom

Zusammenfassung

Leberkrebs gehört weltweit zu den häufigsten malignen Tumoren. RAF-Kinase-Inhibitoren sind wirksam bei der Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC); daher stellt die Hemmung des BRAF/MEK/ERK-Signalwegs eine neue therapeutische Strategie dar. Allerdings bleiben zielgerichtete, tumorspezifische Verabreichungssysteme ein bedeutendes Hindernis für klinische Anwendungen. Galactose (GAL) kann den Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR) ansprechen, der auf Leberkrebszellen stark exprimiert wird. In dieser Studie entwickelten wir ein neuartiges multifunktionales Nanomaterial GAL-GNR-siBRAF, das aus drei Komponenten besteht: GAL als leberkrebszielende Moietät, Goldnanostäbe (GNR) mit photothermischer Fähigkeit unter Nahinfrarotlicht und siRNA zur spezifischen Stilllegung von BRAF (siBRAF). Der Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF zeigte hohe siRNA-Ladekapazität und schützte siRNA vor Degradierung im Serum. Im Vergleich zu nackten Goldnanostäben wies GAL-GNR-siBRAF geringere Bio-Toxizität und höhere Gen-Silencing-Effizienz auf. Die Behandlung mit GAL-GNR-siBRAF regulierte die BRAF-Expression signifikant herunter und hemmte Proliferation, Migration und Invasion von Leberkrebszellen. Zudem führte die Kombination aus photothermischem Effekt und BRAF-Knockdown durch GAL-GNR-siBRAF effektiv zum Tod von Tumorzellen. Unsere Studie entwickelte somit ein neues zielgerichtetes multifunktionales Nanomaterial für die Leberkrebsbehandlung, das neue Ansätze für klinische Therapien liefert.

Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) stellt ein globales Gesundheitsproblem dar [1]. Es ist der sechsthäufigste Krebs weltweit und die dritthäufigste krebsbedingte Todesursache [2, 3]. Die meisten HCC-Fälle treten in Ostasien und sub-saharischem Afrika auf, doch die Inzidenz steigt auch in entwickelten Ländern wie Frankreich, Großbritannien, Japan und den USA [4]. Die Standardtherapie für frühes HCC ist die chirurgische Resektion; die 5-Jahres-Überlebensrate liegt dann bei 89–93 % [5]. Leider werden nur 20–30 % der HCC-Patienten im Frühstadium diagnostiziert; über 70 % befinden sich bereits im fortgeschrittenen Stadium und sind nicht operabel. Weitere Optionen umfassen Lebertransplantation, transarterielle Chemoembolisation (TACE) und systemische Chemotherapie [6]. Transplantationen sind durch Organmangel limitiert, unvollständige TACE-Embolisation kann zum Therapieversagen führen, systemische Chemotherapie hat erhebliche Nebenwirkungen und die Gesamtprognose ist schlecht. Daher besteht hoher Bedarf an neuen HCC-Behandlungsmethoden [7].

Der RAS/RAF-Signalweg spielt eine wesentliche Rolle bei der Leberkrebsentstehung; BRAF ist eines der wichtigsten Krebs-assoziierten Gene in diesem Weg. Genetische Veränderungen in diesen Genen führen oft zu zwei kaskadierenden Störungen. Eine abnorme Aktivierung des RAS/RAF-Wegs korreliert mit schlechter Prognose bei Krebspatienten [8]. BRAF ist das am häufigsten mutierte Gen der RAF-Familie, und die gezielte Ansprache des RAS/RAF-Wegs ist eine neuartige therapeutische Strategie für HCC [8–10]. Seit der RAF-Kinase-Inhibitor Sorafenib bei HCC wirksam ist, sind BRAF-Mutationen zum bevorzugten Target für die HCC-Therapie geworden [8]. Insbesondere für fortgeschrittenes HCC sind BRAF-Mutationen ein wünschenswertes Target, da die klinische Entwicklung von Sorafenib in Asien, Europa und den USA bei HCC Anwendung fand [11]. Im Vergleich zu Placebo verlängerte Sorafenib das Gesamtüberleben und das mediane Überleben von Patienten mit fortgeschrittenem HCC [12–14]. Allerdings besitzt Sorafenib eine schlechte Tumor-Targeting-Fähigkeit, was zu Nebenwirkungen wie Bluthochdruck, Haarausfall und Übelkeit führt [15]. Medikamente, die Leberkrebs mit hoher Spezifität ansprechen und RAF blockieren, müssen weiter erforscht werden.

Der Asialoglykoprotein-Rezeptor (ASGPR), auch Leber-Galactose-Rezeptor genannt, ist ein C-Typ-Lektin, das auf der sinusalen Oberfläche von Hepatozyten exprimiert wird [16]. ASGPR gilt als essenzielles Target für lebergerichtete Nanostrukturen, da er eine wichtige Rolle bei Bindung, Internalisierung und Elimination von Substanzen mit terminalen Galactose-Resten spielt [17]. Mehrere Monosaccharide (Galactose, Mannose, Laktose, N-Acetylgalactosamin, Sialinsäure) interagieren in unterschiedlichem Maße mit ASGPR; Galactose zeigte die höchste Affinität [18]. Da ASGPR stark auf der Oberfläche von Leberparenchymzellen exponiert ist [19], besitzt der Rezeptor eine starke Affinität für Galactose und galaktosylierte Prodrugs oder Verabreichungssysteme, die die Leber ansprechen. Galactose-Nanopartikel [20], Galactose-Mizellen [21] und Galactose-Liposome [22] wurden als leberspezifische Drug-Delivery-Systeme identifiziert, die gezielt hepatozelluläre Karzinoidzellen ansprechen.

Goldnanostäbe (GNR) sind stäbchenförmige Goldnanopartikel mit signifikanten Vorteilen als Nanocarrier [23]. GNR weisen ausgezeichnete Biokompatibilität auf und eignen sich für die stabile siRNA-Delivery [24]; ihre große spezifische Oberfläche ermöglicht flexible Modifikation mit tumorzielenden Adaptern [25]; die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR) zeigt hohe photothermische Umwandlungseffizienz unter Nahinfrarot-Bestrahlung und macht sie zu exzellenten photothermischen Anti-Tumor-Materialien [26]. Die maximale photothermische Effizienz lässt sich durch Anpassung des Aspektverhältnisses der GNR erreichen. Die In-vitro- und In-vivo-Toxizität von Goldnanopartikeln hängt von Größe, Oberflächenladung und Beschichtung ab [27]. Allerdings ist Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ein essenzielles Aktivmittel bei der GNR-Synthese, das deutliche Zytotoxizität aufweist und biologische Anwendungen limitiert [28].

RNA-Interferenz (RNAi) hat sich als vielversprechender Ansatz zur Krebsbehandlung etabliert, da sie Target-Gene durch small interfering RNA (siRNA) effektiv ausschaltet oder stilllegt [29]. Kürzlich gelangten siRNA-Moleküle in die Phase menschlicher Studien und gelten als vielversprechend für die Behandlung multipler mutierter Gen-Krebsarten und Tumoren [30]. Dennoch stehen der siRNA-Anwendung enorme Herausforderungen gegenüber: Serum-Instabilität (Abbau durch Nukleasen in der extrazellulären Umgebung) und Off-Target-Effekte [31]. Zudem sind siRNAs negativ geladen, was ihre Bindung an negativ geladene Zellmembranen verhindert [32]. Daher ist eine direkte Delivery von siRNA in Zellen unwahrscheinlich. Die Stabilität von siRNA kann durch chemische Modifikation oder Einbau in schützende Carrier-Materialien verbessert werden [33].

In dieser Studie konstruierten wir neu einen multifunktionalen Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF. Das System nutzt Goldnanostäbe mit optischer Wärmeerzeugung als Kern und extern modifiziertes GAL (D-Galactose) mit spezifischem Targeting von Lebertumoren. Dieses System reduzierte die biologische Toxizität von CTAB auf der GNR-Oberfläche, zeigte hohe siRNA-Ladekapazität und kann das BRAF-Gen in Leberkrebs effektiv stilllegen. Die Applikation von GAL-GNR-siBRAF dämpfte Proliferation, Invasion und Migration von Leberkrebszellen signifikant. Zudem induzierte GAL-GNR-siBRAF simultan BRAF-Gen-Silencing und photothermische Effekte, die synergistisch die Tumorzell-Abtötung verstärkten – ein neuer Denkansatz für die klinische Leberkrebsbehandlung.

Materialien und Methoden

Zelllinie

Die murine hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie Hepa1-6 wurde vom Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, bezogen. Zellen wurden in DMEM-Medium (Life Technologies, Carlsbad, CA) mit 10 % FBS bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.

Synthese von BRAF-siRNA

Die Sequenz der siRNA gegen das BRAF-Gen lautet 5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′ und wurde von Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, USA) synthetisiert. Kommerziell erhältliches siGL2 (gegen Luciferase-Gen) diente als negatives Kontroll-siRNA.

Synthese von CTAB-GNR

Wasserlösliche Goldnanostäbe wurden über einen seed-versmittelten Wachstumspfad hergestellt [34]. Die Seed-Lösung: 1 mL CTAB (0,2 M) (Sinopharm) wurde vorsichtig mit 1 mL HAuCl₄ (0,5 mM) (Sinopharm) gemischt. Bei 28 °C gerührt, gründlich vermischt und 0,12 mL kalte NaBH₄-Lösung (0,01 M) (Sinopharm) zugegeben, bis die Seed-Lösung braun wurde und stabil blieb. Die Wachstumslösung: 50 mL CTAB (0,2 M) und 50 mL HAuCl₄ (1 mM), 2,5 mL AgNO₃ (4 mM) (Sinopharm) wurden bei 28 °C leicht gemischt. Nach gründlichem Mischen wurden 670 µL Ascorbinsäure (0,079 M) zugegeben, woraufhin die Farbe von dunkelgelb zu farblos wechselte. 120 µL der Seed-Lösung wurden unter sanfter Agitation bei 28 °C zugegeben; die Farbe wechselte allmählich von lila zu lila-schwarz. Nach 24 h Rühren bei konstanter Temperatur wurde die Lösung bei 12.000 rpm für 10 min zentrifugiert, um überschüssiges CTAB zu entfernen, und vakuum-gefriertrocknet zu GNR-Pulver für spätere Verwendung.

Synthese von MUA-PEI und GAL-PEI-MUA

Mercaptoundecansäure (MUA; 654 mg) wurde in 30 mL Chloroform (CHCl₃) gelöst und dann mit 100 mmol 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-hydrochlorid (EDC) und 100 mmol N-Hydroxysuccinimid (NHS) 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 100 mmol Polyethylenimin (PEI) zugegeben. Nach 24 h Reaktion bei Raumtemperatur wurde mit gleichem Volumen deionisiertem Wasser der wasserlösliche PEI-MUA extrahiert. Derselbe Weg wurde für die Aktivierung von D-Galactose in wässriger Lösung genutzt. Dann wurde ein Überschuss an aktiviertem D-Galactose (500 mmol) zur wasserlöslichen PEI-MUA-Lösung gegeben und die Reaktion 24 h bei Raumtemperatur fortgesetzt, um den wasserlöslichen GAL-PEI-MUA-Komplex zu erhalten.

Synthese von GAL-PEI-MUA-GNR (GAL-GNR) und PEI-MUA-GNR (PEI-GNR)

Gefriertrocknetes CTAB-GNR-Pulver (10 mg) wurde in 10 mL wasserlöslichem PEI-MUA oder GAL-PEI-MUA-Komplex suspendiert. CTAB wurde durch Au-S-Bindung ersetzt, während 24 h bei Raumtemperatur gerührt wurde. Die Lösung wurde bei 12.000 rpm für 15 min zentrifugiert, um überschüssigen Überstand zu entfernen, und der Niederschlag dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. PEI-GNR- oder GAL-GNR-Pulver wurde durch Gefriertrocknung hergestellt, gewogen und in ribonuklease-freiem Wasser gelöst; der Plasmonenresonanzeffekt wurde mit einem Multifunktions-Enzymanalysator (Spectra Max M5e, MD, USA) beobachtet.

Transmissionselektronenmikroskopie

GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension auf ein Kupfergitter aufgebracht. Nach 30 min Lufttrocknung wurde das Kupfergitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (LIBRA 120, Carl Zeiss, Deutschland) abgebildet.

Ultraviolett-Visible Analyse

GNR, PEI-GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert. Der Oberflächenplasmonenresonanzeffekt der Nanomaterialien im Wellenlängenbereich 600–900 nm wurde mit einem Multifunktions-Mikroplattenleser (SpectraMax M5e, MD, USA) untersucht.

Zeta-Potenzial und hydrodynamischer Durchmesser

GNR, PEI-GNR oder GAL-GNR wurde in destilliertem Wasser suspendiert; Zeta-Potenzial und hydrodynamischer Durchmesser wurden mit einem Zetasizer Nano ZS gemessen.

Kernspinresonanz-Analyse

Das gefriertrocknete GAL-GNR-Pulver wurde in Schwerwasser (99 %, Sigma) gelöst, um eine homogene Suspension herzustellen, die in ein NMR-Probenröhrchen überführt wurde. Die Zusammensetzung von GAL-GNR wurde durch Kernspinresonanz (NMR) (Bruker, 600 MHz, Deutschland) bestimmt.

Gel-Shift-Assay

GAL-GNR und siBRAF wurden nach Massenverhältnis (0:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1) gemischt. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde DNA-Ladepuffer zugegeben. Alle Proben wurden auf ein 2 % Agarosegel mit 0,01 % Goldview (Bioshop, USA) aufgebracht und 30 min bei 90 V elektrophoresiert. Der Grad der siBRAF-Ummantelung wurde am Gel-Imaging-System visualisiert.

Stabilität von siRNA im Serum

Das Gemisch GAL-GNR-siBRAF (6:1) wurde in frischem Mäusserum bei 37 °C für 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h inkubiert. Die Gruppe nacktes siBRAF plus frisches Mäusserum wurde unter gleichen Bedingungen behandelt. Ein gleiches Volumen 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS) wurde zur GAL-GNR-siBRAF-Lösung gegeben. Nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde DNA-Ladepuffer zugegeben, und alle Proben wurden auf ein 2 % Agarosegel (0,02 % Goldview) aufgebracht und 30 min bei 90 V elektrophoresiert. Die Streifenhelligkeit von siBRAF wurde am Gel-Imaging-System visualisiert.

Kompetitive Inhibitionsassay von GAL-GNR-siBRAF

2 × 10⁵ Hepa1-6-Zellen wurden über Nacht in 12-Well-Platten kultiviert. Dann wurden die Zellen 12 h mit Lactobionsäure vorbehandelt und anschließend 30 min mit GAL-GNR-siBRAF (Cy3-markiert) transfiziert. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität wurde per Fluoreszenzmikroskop bestimmt (Skalenbalken = 200 µm).

Leberkrebs-zielgerichtete Delivery-Fähigkeit von GAL-GNR-siBRAF

1 µg Cy3-markiertes siBRAF wurde mit PEI-GNR (30 µg/mL) oder GAL-GNR (30 µg/mL) 20 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann dem Medium von Hepa1-6-Zellen zugegeben. Nach 30 min Inkubation wurden die Zellen dreimal mit 50 % FBS gewaschen und die Fluoreszenzintensität in den Zellen per Fluoreszenzmikroskop gemessen.

Photothermische Effekte

20, 40, 60, 80 und 100 µg GAL-GNR sowie 100 µg GNR-Gefriertrocknungspulver wurden jeweils in 1 mL destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung kam in eine 24-Well-Platte und wurde 15 min kontinuierlich mit einer 803 nm Nahinfrarot-Laserquelle (2 W/cm²) bestrahlt. Die Temperatur jeder Gruppe wurde mit einem Infrarotthermometer alle 0,5 min für die ersten 5 min, danach jede Minute aufgezeichnet.

MTT-Assay

200 µL Zellen (3,5 × 10⁴/mL) wurden 24 h in 96-Well-Platten kultiviert und dann mit verschiedenen Konzentrationen von GNR oder GAL-GNR (0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 µg/mL) inkubiert. Nach 24 oder 48 h wurden 20 µL MTT zugegeben und 4 h weiterinkubiert. Die lila Kristalle wurden in 150 µL DMSO gelöst, gefolgt von spektrophotometrischer Analyse bei 490 nm (Referenz 650 nm) im Mikroplattenleser (SpectraMax M5e, MD, USA).

Calcein-AM und PI-Färbung

Hepa1-6-Zellen (1,5 × 10⁵) wurden über Nacht in einer 12-Well-Platte gehalten und mit PBS, Laser, GAL-GNR-siBRAF (30 µg/mL:1 µg), GAL-GNR-siGL2 (30 µg/mL:1 µg) + Laser oder GAL-GNR-siBRAF (30 µg/mL:1 µg) + Laser 4 h behandelt, dann 15 min mit Nahinfrarotlicht (808 nm, 2 W/cm²) bestrahlt. Die Zytotoxizität von GAL-GNR wurde durch Calcein-AM (lebende Zellen) und PI (tote Zellen) Färbung detektiert. Grünfluoreszenz von Calcein-AM und Rotfluoreszenz von PI wurden per Fluoreszenzmikroskopie fotografiert.

Echtzeit-quantitative PCR

Gesamte zelluläre RNA wurde mit Trizol (Trizol Reagenz, Invitrogen) extrahiert und als Template für cDNA-Synthese verwendet. qPCR wurde mit genspezifischen Forward- und Reverse-Primer (0,5 µL × 10 µM each) im Stratagene Mx3000P qRT-PCR-System (Agilent Technologies, Lexington, MA, USA) durchgeführt. SYBR Green PCR MasterMix (Life Technologies) wurde gemäß Herstellerprotokoll verwendet. Das Housekeeping-Gen β-Actin diente als interne Referenz. Primer-Sequenzen: β-Actin: 5′AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′ (forward), 5′ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′ (reverse); BRAF: 5′-CAATTGGCTGGGACACGGACAT-3′ (forward), 5′-TTGACAACGGAAACCCTGGAAAAG-3′ (reverse). Der Genexpressionsunterschied wurde mit der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet und dargestellt.

Western Blot

Gesamtprotein von Hepa1-6-Zellen wurde mit RIPA-Puffer (Cell Signaling, Pickering, Ontario, Kanada) gewonnen und über Bicinchonsäure (BCA) quantifiziert. Protein wurde in 12 % SDS-PAGE getrennt und auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) transferiert. Das Housekeeping-Gen β-Actin diente als interne Referenz zum Nachweis der BRAF-Proteinexpression. Das Proteinband und die interne Referenz des Target-Proteins wurden durch ECL-Chemilumineszenz detektiert.

Scratch-Test

Transfizierte Hepa1-6-Zellen (1,7 × 10⁵/mL) wurden über Nacht in 12-Well-Platten ausgesät. Vollständig adhärente Zellen wurden mit einer 10-µL-Pipettenspitze gekratzt. Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und das Medium durch solches mit 2 % FBS ersetzt. Die durchschnittliche Wundlinie wurde nach 0, 24 und 48 h unter dem Mikroskop beobachtet. Jeder Scratch-Test wurde in Triplicate durchgeführt.

Transwell-Assay für Migration und Invasion

8-µm-Transwell-Kammern (Corning Life Science) dienten zur Beurteilung von Zellmigration und -invasion. Hepa1-6-Zellen in 200 µL serumfreiem Medium (Dichte 1,7 × 10⁵ Zellen/mL/Well) wurden in die oberen Kammern gegeben, 500 µL Medium mit 12 % FBS in die untere Kammer. Nach 24–48 h Inkubation wurden Zellen mit 4 % Paraformaldehyd 30 min fixiert, dann mit 1 % Kristallviolett 30 min gefärbt. Schließlich wurden Zellen unter einem Inversmikroskop fotografiert und gezählt. Für den Invasionsassay erforderte das Zellinvasionsexperiment ECM-Gel-Beschichtung; die übrigen Schritte waren identisch.

Statistik

Alle Experimente wurden in Triplicate durchgeführt. Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt; Student'scher t-Test (zweiseitig) zum Vergleich zweier Gruppen, einseitige ANOVA für Mehrfachvergleiche. Statistische Signifikanz bei p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Ergebnisse

Synthese und Charakterisierung des Nanocarriers GAL-GNR-siBRAF

Wir entwarfen einen neuartigen Nanocarrier GAL-GNR, der siRNA in Leberzellen deliverieren und gleichzeitig den photothermischen Effekt der Goldnanostäbe beibehalten kann. Das Syntheseverfahren von GAL-GNR ist in Schema 1 dargestellt. Dieses leberzielende System enthält drei funktionale Komponenten. Erstens bildet ein GNR-Gerüst den Grundbaustein, ca. 30 nm lang und 10 nm im Durchmesser, wie im TEM-Bild gezeigt (Abb. 1a); chemisch konjugiertes GNR (GAL-GNR) zeigte keine signifikanten Dimensionsänderungen und behielt gute Dispergierbarkeit (Abb. 1b). Die Teilchengrößenanalyse ergab einen durchschnittlichen GNR-Durchmesser von 30,23 nm (konsistent mit Elektronenmikroskopie), während GAL-GNR (50 nm) und PEI-GNR (42,35 nm) größer waren, da die Konjugation von GAL und PEI die Hydratation zwischen den Teilchen erhöhte (Abb. 1c). Zweitens wurde das biologisch toxische CTAB auf der GNR-Oberfläche durch positiv geladenes MUA-PEI ersetzt, das negativ geladenes siRNA laden kann. Die Zeta-Potenzial-Messung zeigte, dass die Oberflächenladung von GNR von 35,6 auf 42,7 mV (PEI) bzw. 41,8 mV (GAL-PEI) anstieg, was die starke siRNA-Bindekapazität von GAL-GNR belegt (Abb. 1d). Drittens nutzten wir GAL als Leitmolekül zur Konjugation der GNR-Nanocarrier für spezifisches Homing zum hepatozellulären Karzinom. UV-Vis-Absorptionsspektroskopie detektierte vorläufig die Struktur modifizierter GNR. Die initiale Absorptionswellenlänge von unmodifiziertem GNR lag bei 763 nm; eine Verschiebung von 7 nm wurde nach MUA-PEI-Modifikation beobachtet, und eine weitere Verschiebung von 8 nm nach erfolgreicher GAL-Modifikation (Abb. 1e). Zur Bestätigung von GAL im Nanosystem wurde NMR zur Analyse der chemischen Gruppen eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass das H-Signal von Galactose nur im GAL-GNR-Spektrum des ¹H-NMR-Spektrums bei δ: 3,60, 3,65, 3,70, 3,78, 3,90, 4,53 auftauchte. NMR-Spektren bestätigten die chemische Struktur von GAL und dessen erfolgreiche Konjugation an die GNR-Oberfläche (Abb. 1f).

siRNA-Einkapselungsfähigkeit und Stabilität von GAL-GNR

Das GAL-GNR-Nanogerüst wurde durch positiv geladenes PEI modifiziert, das sich über elektrostatische Wechselwirkung mit negativ geladenem siRNA verbinden kann. Wir nutzten einen Gel-Shift-Assay zur Bewertung der siRNA-Bindekapazität von GAL-GNR. Freies siRNA wandert im Gel, während gebundenes siRNA verlangsamt oder ganz gestoppt wird; zudem bindet gebundenes siRNA nicht mehr effektiv an Bromid, sodass die Fluoreszenzintensität abnimmt. Der Gel-Elektrophorese-Befund zeigte, dass das optimale Verhältnis zur Sättigung von GAL-GNR mit siBRAF 6:1 (w/w) beträgt (Abb. 2a).

Nacktes siRNA ist sehr abbaubar, besonders in vivo. Eine wichtige Funktion des Delivery-Systems ist der Schutz von siRNA vor Degradation. Daher testeten wir den protektiven Effekt des Nanocarriers GAL-GNR auf siRNA in frischem Serum. Im Vergleich zu nacktem siRNA blieb das gebundene siRNA länger im Serum erhalten. Wie Abb. 2b zeigt, war nacktes siRNA bis zu 12 h im Serum nachweisbar, während gebundenes siRNA nach 48 h noch reichlich vorhanden war. Dies demonstriert, dass GAL-GNR siRNA effektiv vor Serumdegradation schützt und eine gezielte In-vivo-Delivery gewährleistet.

Zytotoxizität der Nanomaterialien

Geringe biologische Toxizität ist eine weitere wichtige Eigenschaft für den Einsatz in der Krebstherapie. Zur Bewertung der Biokompatibilität des neuen GAL-GNR-Nanostrukturen testeten wir die Zytotoxizität. Wie Abb. 3 zeigt, wurden tote Hepa1-6-Zellen in der Gruppe mit unmodifiziertem GNR bereits bei niedriger Konzentration (30 µg/mL) beobachtet. Nach Inkubation mit 75 µg/mL GNR für 24 h betrug die Zelltodesrate 56,09 %, nach 48 h stieg sie auf 75,5 %. Im Gegensatz dazu reduzierte die GAL-Modifikation die Zytotoxizität signifikant. Nach 48 h Inkubation mit GAL-GNR waren selbst bei hoher Konzentration (105 µg/mL) über 80 % der Zellen noch lebensfähig. Diese Daten legen nahe, dass der Nanocarrier GAL-GNR im Vergleich zu GNR eine hohe Biokompatibilität aufweist und die Anwendungssicherheit gewährleistet.

Leberkrebszell-zielgerichtete siRNA-Delivery und BRAF-Gen-Silencing In Vitro

Die Fähigkeit, siRNA in Krebszellen zu deliverieren, ist eine der wichtigsten Funktionen von Nanomaterialien. Um das Potenzial von GAL-GNR in der siRNA-Delivery zu untersuchen, detektierten wir die Gen-Silencing-Effizienz mit siBRAF, geladen auf GAL-GNR, in Hepa1-6-Zellen. Im Vergleich zur Blankogruppe zeigte die BRAF-Expression in GAL-GNR-siGL2 (negatives Kontroll)-transfizierten Zellen keine Veränderung, während Zellen, die mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert wurden, einen signifikanten Abfall aufwiesen (Abb. 4a). Der Silencing-Effekt war dosisabhängig und korrelierte mit der Erhöhung der GAL-GNR-Konzentration. Die qPCR-Ergebnisse demonstrierten, dass die ideale Transfektionskonzentration von GAL-GNR-siBRAF 30 µg/mL betrug, und die Silencing-Effizienz 90,29 % erreichte – vergleichbar mit der Lipofectamine-2000-Gruppe (positives Kontroll). Der Western-Blot-Befund war konsistent mit qPCR; die BRAF-Proteinexpression war nach 48 h Transfektion herunterreguliert (Abb. 4b).

Lactobionsäure ähnelt GAL strukturell und kann kompetitiv an den auf Hepatozellulärkarzinom-Zellmembranen exprimierten ASGPR binden [35]. Zur Bestätigung der spezifischen Targeting-Effizienz von GAL-GNR wurden Hepa1-6-Zellen mit Lactobionsäure vorinkubiert und dann mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert. Unbehandelte Zellen dienten als Blankokontrolle, klassisches Transfektionsreagenz Lipofectamine 2000 als positives Kontroll. Wie Abb. 4c zeigt, war die Rotfluoreszenzintensität von GAL-GNR-transfizierten Zellen vergleichbar mit der positiven Kontrollgruppe, während die Fluoreszenz von PEI-GNR-transfizierten Zellen signifikant reduziert war. Andererseits zeigten Zellen, die nur mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert wurden, stärkere Rotfluoreszenz von Cy3 als Hepa1-6-Zellen, die mit Lactobionsäure vorbehandelt waren (Abb. 4c), und das qPCR-Ergebnis war konsistent mit den Fluoreszenzresultaten (Abb. 4d). Diese Ergebnisse belegen weiter, dass GAL die Endozytose von siRNA durch Hepa1-6-Zellen effektiv fördert und als Targeting-Moietät für HCC anwendbar ist.

Auswirkungen von GAL-GNR-siBRAF auf Proliferation, Migration und Invasion von Hepa1-6-Zellen

BRAF spielt eine wichtige Rolle im MAPK-Weg, der Zellproliferation, Migration und Invasion reguliert [36]. Um den Einfluss von GAL-GNR-siBRAF auf hepatozelluläre Karzinomzellen zu beurteilen, analysierten wir zunächst die Zellproliferation per MTT-Assay. Wie Abb. 5a zeigt, war die Proliferation von GAL-GNR-siBRAF-transfizierten Hepa1-6-Zellen im Vergleich zu GAL-GNR-siGL2 (negatives Kontroll) oder PBS-behandelten Zellen signifikant verringert. Anschließend untersuchten wir den Effekt auf Zellmigration durch Scratch- und Transwell-Assays. Im Vergleich zu negativen Kontrollzellen war die Migrationsfähigkeit von Hepa1-6-Zellen, die mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert wurden, deutlich reduziert (Abb. 5b–d).

Zur weiteren Untersuchung des Invasionspotenzials wurden Transwell-Assays durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Hepa1-6-Zellen, die mit GAL-GNR-siBRAF transfiziert wurden, die Invasion von Hepa1-6 signifikant verringerten im Vergleich zu GAL-GNR-siGL2 oder PBS (Abb. 5e, f). Die obigen Ergebnisse implizieren, dass der Knockdown des BRAF-Gens mittels GAL-GNR-siBRAF-Komplexen die Migration und Invasion von hepatozellulären Karzinomzellen effektiv reduzieren kann.

Kombinationsbehandlung mit photothermischem Effekt und Gen-Silencing von GAL-GNR-siBRAF

Unsere früheren Studien zeigten, dass Goldnanomaterialien unter Nahinfrarotbestrahlung thermische Energie erzeugen [37]; dieses Phänomen wird als photothermischer Effekt aufgrund der LSPR-Eigenschaften der GNR bezeichnet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass mit steigender GAL-GNR-Konzentration die Wärmeerzeugungsfähigkeit zunahm. Bei 100 µg/mL GAL-GNR stieg die Temperatur schnell von 24 auf über 60 °C. Zudem gab es keinen signifikanten Unterschied in der Wärmeerzeugung zwischen GNR und GAL-GNR (Abb. 6a).

Das neuartige Nanosystem GAL-GNR-siBRAF besitzt drei individuelle Eigenschaften: spezifisches Leberkrebs-Targeting, siRNA-basiertes BRAF-Gen-Silencing und GNR-basierte photothermische Effekte. Daher untersuchten wir den synergistischen therapeutischen Effekt von GAL-GNR-siBRAF in der Anti-Tumor-Behandlung. Hepa1-6-Zellen ohne GAL-GNR behielten hohe Vitalität auch unter Nahinfrarotbestrahlung, was darauf hindeutet, dass der Laser allein keine signifikante Wirkung auf Tumorzellen hat. Wurde die Laserbestrahlung auf Basis der GAL-GNR-siGL2-Behandlung durchgeführt, zeigte der photothermische Effekt starke Abtötungsfähigkeit auf Hepa1-6-Zellen. Zwar induzierte BRAF-Gen-Silencing allein Zelltod, doch der Effekt war nicht eindeutig. Die Behandlung mit GAL-GNR-siGL2 plus Laserbestrahlung führte zu deutlich stärkerer Zellabtötung als BRAF-Gen-Silencing allein (Abb. 6b). Diese Daten deuten darauf hin, dass BRAF-Gen-Silencing und photothermischer Effekt synergistisch das Potenzial zur Tumorzellabtötung steigern können.

Diskussion

Schwierigkeiten bei der tumorzielgerichteten Delivery sind Haupthindernisse in der klinischen Tumorbehandlung. Diese Studie demonstrierte erstmals die Entwicklung eines neuartigen multifunktionalen Nanocarriers GAL-GNR-siBRAF mit zahlreichen Vorteilen. Der modifizierte GAL-GNR besitzt nicht nur gute Biokompatibilität, sondern behält auch das LSPR-Phänomen des GNR-Gerüsts und die exzellente photothermische Umwandlungsfähigkeit bei. GNR, modifiziert mit GAL, können hepatozelluläre Karzinomzellen über ASGPR ansprechen, was großes Potenzial für die zielgerichtete molekulare Therapie von HCC bietet. Weitere Studien zeigten, dass BRAF-Gen-Silencing die Proliferation, Migration und Invasion von Hepatomzellen hemmt. Bemerkenswert ist, dass GAL-GNR-siBRAF in der Kombination aus photothermischem Effekt und BRAF-Gen-Silencing eine stärkere Zellabtötungsfähigkeit zeigt.

RNA-Interferenz (RNAi) hat aufgrund ihrer entscheidenden Rolle in Genexpression und -regulation viel Aufmerksamkeit erregt. Der Einsatz von siRNA zum Knockdown sequenzspezifischer Gene in Krebszellen für Gentherapie ist eine effektive und spezifische gezielte Gentherapie und wurde zu einem neuen therapeutischen Werkzeug für viele Krankheiten einschließlich Krebs [29, 31]. Allerdings limitieren geringe Stabilität im Serum und schlechte Zellaufnahme die klinische Anwendung von siRNA [38]. Zudem besitzt siRNA negative Ladung, die die Bindung an negativ geladene Zellmembranen verhindert, sodass eine direkte Delivery in Zellen unwahrscheinlich ist [32, 39]. Hinzu kommen Probleme wie geringe Transfektionseffizienz und schlechte Zellinternalisierung in der siRNA-Therapie [40]. Diese Barrieren behindern die Delivery von siRNA an Targetzellen. Um die siRNA-Stabilität zu erhöhen und die Gen-Silencing-Effizienz zu stärken, synthetisierten wir einen neuartigen Nanocarrier GAL-GNR-siBRAF mit drei Komponenten (Schema 1). Dieser Nanocarrier besitzt geringe Molekülgröße (ca. 30 nm Länge, 10 nm Durchmesser) und gute Dispergierbarkeit (Abb. 1). Zudem kann GAL-GNR-siBRAF große Mengen siRNA bei niedriger Konzentration effektiv laden (Abb. 2a) und schützt siRNA vor RNase-Degradation im Serum; die siRNA war mindestens zwei Tage bei 37 °C in Gegenwart von frischem Mäusserum stabil (Abb. 2b).

Gute Biokompatibilität ist essenziell für Nanomaterialien in der Biotherapie. CTAB ist ein essenzielles Reagenz bei der GNR-Synthese, weist jedoch deutliche Zytotoxizität auf, die biologische Anwendungen limitiert [41]. Um die Zytotoxizität zu reduzieren, modifizierten wir GNR extern mit positiv geladenem PEI und Targeting-Adapter GAL (D-Galactose). Unsere Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zu unfunktionalisiertem GNR das GAL-modifizierte GNR eine bessere Biokompatibilität aufweist. Die Zellvitalität blieb über 80 % selbst bei sehr hohen Konzentrationen (105 µg/mL) von GAL-GNR für 48 h (Abb. 3). Zudem erleichtern die kleine Molekülgröße und die zylindrische Form des Nanostabs die Penetration durch die Zellmembran in die Zelle [37, 38, 42]. Dies ist besonders in der gezielten Krebstherapie evident. Nanokonstrukte, modifiziert mit Galactose-Targeting-Moietäten, resultierten in hoher Anreicherung von GAL-GNR-siBRAF in Tumorzellen, was effektive Herunterregulierung der BRAF-Genexpression induzierte (Abb. 4). Laut kompetitiven Inhibitionsversuchen gelangten GAL-GNR hauptsächlich über ASGPR-Oberflächenrezeptoren von Hepa1-6-Zellen in die Zellen (Abb. 4c).

Es wurde berichtet, dass HCC mit hoher Expression von BRAF und RAF1 zu schneller Proliferation und Wachstum neigt [41, 43, 44]. B-Raf und Raf1 wirken hauptsächlich downstream des ERK/MAPK-Wegs und regulieren nukleäre Faktoren durch Kaskadenverstärkung. Die Aktivierung dieses Wegs beschleunigt die Proliferation und Differenzierung von HCC-Zellen abnormal [41, 44, 45]. Das RAF-Gen kann auch die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) fördern, die die Adhäsion von Tumorzellen verändern, extrazelluläre Matrix (ECM) und Basalmembran abbauen und Invasion und Metastasierung von Tumoren fördern [44, 45]. BRAF-Kinase reguliert den RAS-RAF-MEK-ERK-Weg, der Tumorzellproliferation, Invasion, Metastasierung fördert und Zelltod durch Apoptose ermöglicht [5, 46, 47]. In früheren Arbeiten fanden wir, dass BRAF-Gen in Hepa1-6-Zellen hoch exprimiert war (Daten nicht gezeigt). Wir vermuteten, dass der Knockdown von BRAF-Expression in Hepa1-6 den RAS-RAF-MEK-ERK-Weg blockiert und biologische Veränderungen bewirkt. Zur Verifikation transfizierten wir hepatozelluläre Karzinomzellen mit GAL-GNR-siBRAF und fanden, dass es Zellproliferation, Migration und Invasion signifikant hemmt (Abb. 5), was eine neue Strategie für die klinische HCC-Behandlung bietet.

Ein weiterer wichtiger Vorteil von GNR ist der lokale Oberflächenplasmonenresonanz (LSPR), der absorbierte Lichtenergie unter Nahinfrarotbestrahlung in Wärmeenergie umwandelt und dadurch Zellen abtötet und zerstört [42]. Wir untersuchten die Licht-Wärme-Umwandlungsfähigkeit von GAL-GNR; die Ergebnisse zeigten, dass modifiziertes GAL-GNR unter Nahinfrarotbestrahlung effektiv Wärmeenergie induzieren kann (Abb. 6a). Anschließend untersuchten wir die synergistischen Effekte von GAL-GNR-siBRAF. Während BRAF-Gen-Silencing begrenzte Zytotoxizität zeigte, hatte die Behandlung GAL-GNR-siGL2 + Laser eine viel stärkere Abtötungsfähigkeit auf Tumorzellen. Gleichzeitig konnte die Kombination aus photothermischer Hyperthermie und BRAF-Gen-Silencing mehr als 85 % Zelltod verursachen (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass die Synergie von GAL-GNR-siBRAF und photothermischen Effekten eine ideale Strategie zur Hemmung von Leberkrebs sein könnte.

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigte, dass GAL-GNR-siBRAF das Hindernis der siRNA-Degradation überwindet und die Stabilität von siRNA im Serum in vitro effektiv erhöht. Zudem kann GAL-GNR-siBRAF siRNA gezielt an hepatozelluläre Karzinomzellen deliverieren, die BRAF-Expression herunterregulieren und Zellproliferation, Invasion und Migration signifikant hemmen. Noch wichtiger: GAL-GNR-siBRAF als neuartiger multifunktionaler Nanocarrier kann die Fähigkeit zur Tumorzellabtötung bei Kombination mit Nahinfrarotlicht 크게 steigern. Zusammenfassend besitzt GAL-GNR-siBRAF großes Potenzial in der Behandlung von hepatozellulärem Karzinom und liefert neue Ideen für die klinische Anwendung bei Leberkrebs.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle in dieser Studie generierten Daten und verwendeten Materialien sind im Manuskript und den zugehörigen Zusatzdateien enthalten.

Abkürzungen

GAL:

D-Galactose

GNR:

Goldnanostäbe

siBRAF:

Small interfering RNA spezifisch für BRAF

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

ASGPR:

Asialoglykoprotein-Rezeptor

TACE:

Transarterielle Chemoembolisation

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

CTAB:

Cetyltrimethylammoniumbromid

MUA:

Mercaptoundecansäure

EDC:

1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-hydrochlorid

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PEI:

Polyethylenimin

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

NMR:

Kernspinresonanz

FBS:

Fetales Kälberserum

DMSO:

Dimethylsulfoxid

BCA:

Bicinchonsäure

PVDF:

Polyvinylidenfluorid