Rollen von ROS und Zellzyklusarrest bei der Genotoxizität, die durch eine Gold-Nanostäbchen-Kern-/Silberschalen-Nanostruktur induziert wird

Einführung

Silbernanopartikel (AgNPs) mit einer Größe von 1 bis 100 nm können ein breites Spektrum antimikrobieller Eigenschaften aufweisen, indem sie Krankheitserreger durchdringen und die innere Sulfhydrylgruppe ihrer Stoffwechselenzyme inaktivieren [1]. Sie haben eine starke Bakteriostase und bakterizide Wirkung bei Escherichia Coli . gezeigt , Neisseria gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis , und werden häufig als medizinische Beschichtungen, Haushaltsprodukte [2] sowie Wundauflagen [3] verwendet. Überzeugende Beweise zeigen, dass Nanopartikel in der Lage sind, in den Zellkern einzudringen und den Synthese- und Transkriptionsprozess der DNA zu stören [4]. In unserer vorherigen Studie berichteten wir, dass eine einzelne intravenöse Dosis von 5 mg/kg AgNPs zu einem bemerkenswerten Chromosomenbruch in den Knochenmarkzellen von Sprague-Dawley-Ratten führen könnte [5]. Eine einzelne intraperitoneale Injektion von 10 mg/kg oder mehr AgNPs induzierte sowohl DNA- als auch Chromosomenschäden [6]. Blumeet al. [7] schlugen vor, dass AgNPs in Dosen von 50 und 100 μg ml ⁻¹ könnte innerhalb von fünf Minuten nach der Verabreichung DNA-Schäden auslösen, was die Genotoxizität von schnell freigesetztem Silber (Ag) unterstreicht. Angesichts des Risikos einer übermäßigen Exposition hat die Untersuchung der Nanogenotoxikologie oder der DNA-Schäden und des kanzerogenen Potenzials von technisch hergestellten Nanomaterialien viel Aufmerksamkeit erhalten [8].

Als Hauptmechanismen für AgNP-induzierte genetische Schäden werden die Überproduktion reaktiver oxidativer Spezies, Entzündungen und Zellzyklusstörungen angesehen [9, 10]. Wie in früheren Studien vorgeschlagen, könnten AgNPs entweder direkt über oxidative Schäden mit der DNA interagieren [11] und in die Interphase auf DNA-Ebene und Mitose auf chromosomaler Ebene eingreifen oder mit dem Nukleoprotein und dem mitotischen Spindelapparat interagieren, um die Kontrollpunkte des Zellzyklus zu stören [ 12]. Ob die durch AgNPs induzierte Genotoxizität jedoch teilweise auf die Nanopartikel zurückzuführen ist [13, 14] oder vollständig auf das freigesetzte Ag ⁺ Ionen ist noch unklar [15, 16].

Die Untersuchung der Genotoxizität von AgNPs ist aufgrund der instabilen und ununterbrochenen Freisetzung des Silbers in den Geweben schwierig, was zu Schwierigkeiten bei der Lokalisierung der AgNPs und der Unterscheidung zwischen Nanokern und Ag führt. Unsere Gruppe hat kürzlich eine Gold-Nanostab-Kern/Silberschale (Au@Ag NR)-Nanostruktur entwickelt, um die durch Nanopartikel induzierte Toxizität zu untersuchen [17]. Der Goldkern von Au@Ag NR ist dem Gewebe physiologisch angeboren und könnte als interner Standard verwendet werden, um die Freisetzung von Ag ⁺ . zu überwachen Ionen aus dem Stab durch Überwachung der Änderung des Ag/Au-Verhältnisses, gemessen mit induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) [18]. Mit dieser Methode können die verschiedenen Ursachen der Toxizitäten identifiziert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass das freigesetzte Ag ⁺ Ionen aus der Hülle von Au@Ag NR führten zu oxidativen Schäden der Nieren und führten schließlich zu morphologischen Veränderungen und einer Beeinträchtigung der Filtrationsfunktion des Glomerulus [19]. Jianget al. [20] schlugen vor, dass sowohl die partikelspezifische Aktivität als auch die intrazelluläre Freisetzung von Silberionen durch Au@Ag-NR zur toxischen Reaktion von Granulosazellen beitragen. Wir verwendeten Au@Ag NR auch als Modell, um das Genotoxizitätspotenzial von AgNPs in vivo zu untersuchen, und zeigten, dass die Klastogenität und nicht die Mutagenität die primäre Form der Genotoxizität ist, die sowohl durch die Ag-Hülle als auch durch das freigesetzte Ag ^{+ Ionen, während es keinen Unterschied in ihren Toxizitätsmustern gab [21].}

Die Leber ist eines der Hauptorgane, das für die Ansammlung von AgNPs anfällig ist, und gilt als Zielorgan/-gewebe für AgNPs-induzierte Genotoxizität. Unsere vorherige Studie zeigte, dass acht Wochen nach der intravenösen Verabreichung einer Dosis Au@Ag NR eine gewisse Menge Silber (8,26 ± 3,90 µg/g) und Gold (80,07 ±   64,72 µg/g) in der Leber von SD-Ratten verblieben [21 ]. In dieser Studie haben wir versucht, die Rolle von Zellzyklusarrest und reaktivem oxidativem Stress auf AgNP-induzierte Chromosomen- und DNA-Schäden unter Verwendung von Au@Ag NR in humanen Hepatom-abgeleiteten HepaRG-Zellen zu identifizieren. Genotoxizitätsassays, einschließlich Comet-Assay, γ-H2AX-Assay und Mikronukleus-Test, wurden parallel zum oxidativen Radikalfänger durchgeführt, um den Beitrag reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) zur DNA-/Chromosomenschädigung zu untersuchen, während die Zellapoptose, der Zellzyklus und verwandte Proteine wurden bestimmt, um die Mechanismen zu erforschen, durch die AgNPs die Synthese und Replikation von DNA unterbrechen. Darüber hinaus wurde die intrazelluläre Akkumulation und Verteilung von Au@Ag NR durch die Kombination von Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Rolle von Nanopartikeln und freigesetzten Ag-Ionen zu differenzieren.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Behandlung

In dieser Studie wurde die humane Hepatomzelllinie HepaRG (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Die Zellen wurden in RPMI 1640 mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Australia Origin, Gibco) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Lösung (Gibco) in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ . kultiviert bei 37 °C. Die Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen von Au@Ag NR für 24 h bzw. 72 h behandelt und die Konzentrationen wurden gemäß IC₅₀ . bestimmt geschätzt durch Zelllebensfähigkeitsassay. Um die Rolle von ROS bei der Genotoxizität zu untersuchen, 1 mM N -Acetyl-l-cystein (NAC, Sigma-Aldrich) wurde 1 h vor der Behandlung mit Au@Ag NR aufgetragen.

ATP-Zellwachstums-/Lebensfähigkeitsassay

Die Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 5 × 10 ³ . ausgesät /Gut. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden 24 h bzw. 48 h unterschiedlichen Konzentrationen von Au@Ag NR ausgesetzt. Es wurde ein breites Konzentrationsspektrum hergestellt, und es wurden vier Vertiefungen pro Behandlung in einer Behandlungsperiode durchgeführt. Die Zytotoxizität von Au@Ag NR wurde mit dem Adenosintriphosphat (ATP)-Assay (CellTiter-Glo® 2.0 Assay, Promega) untersucht, der die zelluläre Stoffwechselaktivität durch Quantifizierung der Menge an ATP, einem wichtigen Stoffwechselparameter in lebensfähigen Zellen, misst. Die Lumineszenzsignale, die die Menge an lebensfähigen Zellen widerspiegeln, wurden mit dem VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer) und IC₅₀ . nachgewiesen die Werte wurden als Konzentration von Au@Ag NR für die halbmaximale Lebensfähigkeit von Prism 7 (GraphPad Prism 7, CA, USA) geschätzt. Die Rentabilitätsquote wird mit der folgenden Gleichung berechnet:

wobei RLU die relative Lichteinheit ist, dargestellt als Mittelwert von vier Wells, RLU_Fahrzeug repräsentierte Zellen, die nicht mit Nanostäbchen behandelt wurden, und RLU_Probe repräsentierten Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Au@Ag NR behandelt wurden.

Konzentrationsbestimmung von Silber und Gold in Zellen

Die Zellproben wurden in Salpetersäure unter Verwendung des Mikrowellenaufschlusssystems aufgeschlossen. Nach dem Aufschluss wurden die Proben mit einer Mischung aus 1% Salpetersäure und Salzsäure präpariert. Die Mengen an Ag und Au in den Lösungen wurden durch ICP-MS (NexION300X, PerkinElmer) bestimmt. Die TEM-Analyse wurde verwendet, um das Vorhandensein von Au NR und Au@Ag NR in der Zelle zu bestimmen. Die Zellproben wurden in einer Mischung aus 2,5 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd für 2 h bei 4 °C fixiert. Die Zellpellets wurden fixiert und dreimal in Phosphatpuffer (pH 7,4) gespült und in 1 % Osmiumtetroxid 2 h bei 4 °C nachfixiert. Anschließend wurden die Proben dreimal in destilliertem Wasser gespült und nacheinander 15 min in unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen (50 %, 70 %, 90 % und 100 % Ethanol) dehydriert. Anschließend wurde Propylenoxid in Verdünnungen von 1:1 und 1:3 bei 20–26 °C für 2 h auf das Harz aufgetragen. Die Polymerisation wurde durch abgestuftes Erhitzen bei 35 °C für 16 h, 45 °C für 8 h, 55 °C für 14 h und 65 °C für 48 h durchgeführt. Ultradünne Schnitte wurden 25 Minuten lang mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und mit einem Transmissionselektronenmikroskop (H-7650, HITACHI, Japan) analysiert.

Herkömmlicher und modifizierter Kometentest

Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät /gut oder 3 × 10 ⁵ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. Wasserstoffperoxid (H₂ .) O₂ ) in einer Konzentration von 200 μmol wurde den Zellen als Positivkontrolle eine Stunde lang ausgesetzt. Für jede Probe wurden zwei Vertiefungen sowohl für die konventionelle Behandlung als auch für die Formamidopyrimidin-Glycosylase (Fpg)-Behandlung hergestellt. Ein konventioneller Comet-Assay wurde unter alkalischen Bedingungen (pH > 13) durchgeführt, wie zuvor beschrieben [21]. Für die Fpg-behandelten Wells wurde eine zusätzliche Fpg-Behandlung vor dem DNA-Abwicklungsverfahren angewendet, und die Objektträger wurden in einen Enzympuffer (0,1 M KCl, 0,5 mM EDTA, 40 mM HEPES, 0,2 mg.ml ^{-1 .) eingetaucht} BSA) dreimal für jeweils 5 Minuten. Das Fpg (New England Biolabs, Inc., UK) wurde 1:50.000 mit Enzympuffer verdünnt. 100 Milliliter-Aliquots des verdünnten Enzyms wurden zu jedem Gel auf den Objektträgern gegeben und in einer Feuchtigkeitskammer bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Die verbleibenden Schritte waren die gleichen wie bei der herkömmlichen Behandlung. Die Comet-Assays wurden dreifach durchgeführt. Mindestens 50 Zellen pro Probe wurden unabhängig voneinander mit dem Fluoreszenzmikroskop Nikon Eclipse 80i (Nikon, Tokio, Japan) bewertet, während Komet 6.0 (Andor Technology, Belfast, Großbritannien) verwendet wurde, um den mittleren Wert des prozentualen DNA-Anteils in Schwanz und Olivenschwanz zu analysieren Moment (OTM) jeder Probe.

Qualifizierung von γ-H2AX-Fokus durch Durchflusszytometrie und High-Content-Screening

Für die Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie wurden Zellen in 12-Well-Platten mit Dichten von 2 × 10 ⁵ . ausgesät /gut oder 3 × 10 ⁵ /Well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung, während für den High-Content-Screening-Assay die Zellen in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 6 × 10 ³ . ausgesät wurden /gut oder 1 × 10 ⁴ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. Als Positivkontrolle wurde eine Stunde lang 2 μM Methylmethansulfonat (MMS, Sigma-Aldrich) parallel zu den Zellen appliziert. Die Zellen wurden in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) gespült und mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit TBS wurden die Zellen mit 50 μL eiskaltem Methanol 30 Minuten lang bei – 20 °C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal in TBS gespült und das Blockierungsreagenz (TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 10 % Ziegenserum) wurde 1 h lang aufgetragen. Der primäre Antikörper (Maus-Anti-Phospho-H2AX Ser139, Millipore) wurde mit Blockierungsreagenz auf 1:200 verdünnt und mit den Zellen über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platte wurde dann erneut dreimal mit TBS gespült und der sekundäre Antikörper (Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus, Life Technologies), verdünnt mit dem Blockierungsreagenz im Verhältnis 1:20, wurde anschließend zugegeben. Die Proben wurden 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt und 2 μg ml ⁻¹ (20 μl/Well) DAPI (Invitrogen) wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Fluoreszenz wurde mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) oder High Content Analysis System (Operetta CLS, PerkinElmer) gemessen. Für den Durchflusszytometrie-Assay wurden Daten von mindestens 10.000 Zellen pro Gruppe analysiert und die Experimente wurden dreifach durchgeführt; Für die High-Content-Analyse wurden 20 Gesichtsfelder in jeder Vertiefung und mindestens fünf Vertiefungen in jeder Gruppe analysiert.

Zytokinese-Block-Mikronukleuszytom (CBMN-Zyt)

CBMN-cyt wurde gemäß dem von Fenech et al. [22]. Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät /gut oder 3 × 10 ⁵ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. 0,2 μg ml ⁻¹ Mitomycin C (MMC, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Japan) wurde den Zellen als Positivkontrolle 24 h lang ausgesetzt. 3 μg ml ⁻¹ Cytochalasin B wurde nach einer 24- oder 72-stündigen Behandlung angewendet, um den Zytokineseprozess zu blockieren, und die Zellen wurden nach 40 h geerntet. Die Proben wurden mit 5 % Giemsa nach Hypotonie mit vorgewärmtem 0,075 mol L ^–1 . gefärbt KCl und Fixierung mit einer 3:1-Mischung aus Methanol und Essigsäure. Dreifach-Wells pro Gruppe wurden hergestellt und mindestens 1000 zweikernige Zellen pro Well wurden untersucht.

Messung von MDA, Gesamt-GSH- und SOD-Gehalt

Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit Dichten von 5 × 10 ⁵ . kultiviert /gut oder 3 × 10 ⁵ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. Anschließend wurden die Zellen geerntet und dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gespült. Die Mengen an Malondialdehyd (MDA) in den Zellhomogenaten wurden unter Verwendung eines auf Thiobarbitursäure basierenden Verfahrens (Nanjing Jiancheng Bio-engineering Institute, Nanjing, China) bestimmt. Die Mengen an Gesamtglutathion (GSH) und Superoxiddismutase (SOD) wurden mit den Gesamtglutathion-Quantifizierungs- bzw. SOD-Assay-Kits (Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kumamoto, Japan) bestimmt. Die optischen Dichten (O.D) jeder Vertiefung wurden mit dem VICTOR Multilabel Plate Reader (2030-0050, PerkinElmer) gemessen.

Durchflusszytometrische Analyse des Zellzyklus

Die Zellen wurden in 6-Well-Platten bei Dichten von 1 × 10 ⁶ . kultiviert /gut oder 5 × 10 ⁵ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung und wurden anschließend mit 70 % Ethanol bei 4 °C über Nacht fixiert. Die Proben wurden dreimal mit PBS gespült und mit PI/Rnase-Färbepuffer (BD Biosciences) 15 min bei Raumtemperatur gefärbt. Zellpopulationen in der G0/G1-, S- und G2/M-Phase unter 20.000 Zellen wurden durch Verwendung von Regionen mit FL2-Fläche versus FL2-Breite bestimmt. Die Analyse erfolgte mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) und FlowJo (BD Bioscience), und die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Durchflusszytometrische Analyse der Zellapoptose

Die Zellen wurden in 6-Well-Platten bei Dichten von 1 × 10 ⁶ . kultiviert /gut oder 5 × 10 ⁵ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. Anschließend wurden sie zweimal mit PBS gespült und mit 500 μL 1 × -Bindungspuffer (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, BD Bioscience) verdünnt, um die Suspension auf etwa 1 × 10 ⁶ . einzustellen Zellen/ml, und anschließend wurde eine 100-μl-Verdünnung mit 5 μl FITC Annexin V und 5 μl PI gemischt. Die Proben wurden 15 min bei Raumtemperatur gefärbt und es wurden mindestens 10.000 Zellen analysiert, um die Zellpopulation unter früher und später Apoptose zu bestimmen, indem Regionen mit FL1H versus FL2H mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, BD Bioscience, NJ, USA) und FlowJo . verwendet wurden (BD Biowissenschaften). Die Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden in einem 75-cm- ² . kultiviert Kolben mit Dichten von 1 × 10 ⁷ /well und 6 × 10 ⁶ /well für eine 24- bzw. 72-stündige Behandlung. Die Zellen wurden mit RIPA-Lysepuffer, der einen Protease-Inhibitor (PMSF) enthielt, lysiert und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines BCA-Proteinquantifizierungskits (Beyotime Biotechnology, China) bestimmt. Die Konzentrationen der Proben wurden vor der Denaturierung mit RIPA-Lysepuffer durch Erhitzen auf 95 °C für 3 Minuten angepasst. Die Proteinproben wurden durch Elektrophorese auf 12% SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen (Millipore) übertragen. Die Membranen wurden mit 5% Magermilch für 30 Minuten blockiert und mit primärem p53 (SC-137174, Santa Cruz), p21 (SC-6246, Santa Cruz) und β-Aktin (sc-47778, Santa Cruz) und sekundären Antikörpern inkubiert Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L)-HRP(SE131, Solabio). Die Expressionsniveaus der Zielproteine ​​in den Proben wurden unter Verwendung einer verbesserten Chemilumineszenz (ECL)-Methode sichtbar gemacht und durch das ImageJ-System (National Institutes of Health) analysiert.

Statistische Analysen

Die Daten wurden als Mittelwert  ± SEM dargestellt. Die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen der Negativkontrolle und den behandelten Gruppen zu testen, gefolgt von dem Dunnett-Mehrfachvergleichstest mit SPSS (Version 22, IBM, Armonk, NY, USA) und die Daten wurden berücksichtigt statistisch signifikant bei P < 0,05. Die Abbildungen wurden mit GraphPad Prism 7 für Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) erstellt.

Ergebnisse

Charakterisierung von Au NR und Au@Ag NR

Goldnanostäbchen (Au NRs), Goldnanostäbchenkerne und Silberschalen-Nanostrukturen (Au@Ag NR) wurden wie zuvor beschrieben konstruiert, hergestellt und charakterisiert [21]. Kurz gesagt betragen die mittleren Durchmesser und Längen 15,0 ± 2,5 nm, 66,7 ±   2,5 nm für Au-NRs und 26,2 ± 3,0 nm, 72,7 ±   8,9 nm für Au@Ag-NRs. Die Dicke der Ag-Schale beträgt etwa 5 nm. Die Zeta-Potentiale von in Wasser dispergierten PDDAC-beschichteten Au-NRs und Au@Ag-NRs betrugen 37,7 ± 1,6 mV bzw. 52,5 ± 1,4 mV. Das Ag/Au-Gewichtsverhältnis des hergestellten Au@Ag-NR wurde auf 2,3 geschätzt. Die Charakterisierungsergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt.

Charakterisierung von Au NR und Au@Ag NR. a Strukturdiagramm von Au NR und Au@Ag NR; b UV-Vis-NIR-Extinktionsspektren von Au NR und Au@Ag NR dispergiert in Wasser; c repräsentative TEM-Bilder von Au-NR; d repräsentative TEM-Bilder von Au @Ag NR

Zelllebensfähigkeit

Die Zytotoxizität von Au@Ag NR gegenüber HepaRG-Zellen wurde durch einen ATP-Lebensfähigkeitstest (Tabelle 1) untersucht, und die Zellen wurden Au@Ag NR für 24 oder 48 h in Konzentrationen von 0,125 bis 160 μg mL ^{-1 . ausgesetzt} . Au@Ag NR induzierte signifikante zytotoxische Wirkungen sowohl zeit- als auch dosisabhängig nach einer Exposition von 24 und 48 Stunden, mit % Lebensfähigkeit IC₅₀ bei 20 µg ml ⁻¹ und 6 µg ml ⁻¹ , ausgestattet mit der Software GraphPad Prism 7.0 bzw. Unter Berücksichtigung der Gesamtzytotoxizität wurden die Behandlungszeiten auf 24 h und 72 h angepasst, während die angewendeten Konzentrationen mit 0,8 µg mL ⁻¹ . bestimmt wurden , 4 µg ml ⁻¹ und 20 µg ml ⁻¹ . Außerdem wurde Au-NR als inerte Kontrolle aufgenommen und der Au-Gehalt in der AuNR-Gruppe betrug 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR, das ist 16 µg mL ⁻¹ . Im Gegensatz dazu wurde in der Au@Ag NR + NAC-Gruppe eine 1 mM NAC-Vorbehandlung zur Kontrolle der oxidativen Stressreaktion eingesetzt (die Konzentration von Au@Ag NR beträgt 20 µg mL ⁻¹ ).

Zellverteilung von Au NR und Au@Ag NR

Die Verteilung des Au- und Ag-Gehalts in den HepaRG-Zellen wurde durch ICP-MS analysiert. Wie in den Tabellen 2 und 3 gezeigt, nahm der Ag-Gehalt dosisabhängig zu. Das Antioxidans N -Acetyl-l-cystein (NAC) als Radikalfänger kann die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln einschränken, da ein geringerer Ag-Gehalt beobachtet wurde, obwohl die gleiche Konzentration von Au@Ag NR (20 µg mL ⁻¹ .) ) wurde in dieser Gruppe angewendet. Der Rückgang des Ag/Au-Verhältnisses von 24 auf 72 Stunden deutet auf eine kontinuierliche Freisetzung von Ag ⁺ . hin aus der Schale von Au@Ag NR. Auch die zelluläre Aufnahme von Ag ist viel höher als die von Au (Tabelle 4). Darüber hinaus zeigten TEM-Daten, dass die meisten Au-NR und Au@Ag-NR als Agglomerate in den Zellen zurückgehalten wurden. Die Strukturen der Nanostäbchen waren deutlich im Inneren der Zellen zu erkennen, die Au NR oder Au@Ag NR ausgesetzt wurden, ohne in den Zellkern einzudringen (Abb. 2).

Au-NR- und Au@Ag-NR-Internalisierung:HepaRG durch TEM bei 80 kV nach 24 Stunden Exposition gegenüber 16 μg mL ⁻¹ Au NR und 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR. a Fahrzeug Kontrolle; b Au-NR; c Au@Ag NR

DNA-Schaden

Die durch Au@Ag NR ausgelöste DNA-Schädigung wurde sowohl mit dem Comet-Assay als auch mit dem γH2AX-Assay bewertet (Abb. 3). Im Comet-Assay wurde beobachtet, dass 0,8 bis 20 µg mL ⁻¹ Au@Ag NR könnte erhebliche DNA-Schäden verursachen. Nach einer 24- oder 72-stündigen Exposition gegenüber Au@Ag NR stiegen sowohl % der Schwanz-DNA als auch OTM der Zellen sowohl zeit- als auch konzentrationsabhängig an. Darüber hinaus wurde in den Zellen, die mit 20 µg ml ⁻¹ . behandelt wurden, DNA-Schäden im Zusammenhang mit der Induktion von oxidativem Stress beobachtet Au@Ag NR durch den Fgp-Enzym-modifizierten Comet-Assay (Abb. 3a, b). Zur Bewertung des Ausmaßes des Doppelstrangbruchs, der eine höhere Korrelation zur Krebsentstehung darstellt, wurden sowohl γ-H2AX-positive Zellen als auch mittlere Fluoreszenzintensitäten in γ-H2AX-positiven Zellen analysiert. Nach einer 24-stündigen Exposition gegenüber Au@Ag NR wurde kein Unterschied zwischen den Gruppen in γ-H2AX-positiven Zellen gefunden. Allerdings 4 μg ml ⁻¹ Die Au@Ag NR-Gruppe verursachte einen signifikanten Anstieg nach einer 72-stündigen Behandlung. Nach 72 h wurden in allen Au@Ag-NR-Gruppen im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikante Zunahmen der Fluoreszenzintensitäten beobachtet (Abb. 3c–e, P < 0.05).

Durch Au@Ag NR induzierte DNA-Schädigung. HepaGR-Zellen wurden Au@Ag NR in unterschiedlichen Konzentrationen ausgesetzt (0,8 bis 20 μg ml ⁻¹ ) für 24 Stunden bzw. 72 Stunden. a Durchschnittlicher % Schwanz-DNA nach 24-stündiger Exposition gegenüber Au@Ag NR; b gemittelter % Schwanz-DNA nach 72 h Exposition gegenüber Au@Ag NR; c Prozentsatz positiver Zellen mit -H2AX-Foci, geschätzt mittels Durchflusszytometrie; d mittlere Fluoreszenzintensitäten in Zellen mit γ-H2AX-Foci, geschätzt durch Immunfluoreszenzfärbung. ^* P <  0,05 gegenüber Fahrzeugkontrolle; ^a P < 0,05 gegenüber Au-NR. 2 μM ml ⁻¹ Als Positivkontrolle wurde MMS eingesetzt

Chromosomenschaden

Die Bildung von Mikronuklei ist ein wichtiger Biomarker zur Identifizierung von Chromosomenschäden, die eine schwerwiegendere Schädigung des Erbguts darstellen als DNA-Bruch. Das Verhältnis von zweikernigen Zellen, die Mikronukleus enthielten, wurde wie in Fig. 4c gezeigt bewertet. Au@Ag NR erhöhte die Mikronukleusbildung in einem konzentrationsabhängigen Muster. Nach einer 24-stündigen Exposition wurden die Mikronukleus-Verhältnisse in Zellen beobachtet, die mit 4 μg ml ^–1 . behandelt wurden Au@Ag NR und 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR betrugen 1,133 ± ±0,145% bzw. 1,567 ± ±0,318%, die beide signifikant höher waren als diejenigen in der Vehikel-Kontrollgruppe. Nach 72-stündiger Exposition war das Verhältnis von Mikronukleus in Zellen, die mit 4 μg ml ⁻¹ . behandelt wurden, Au@Ag NR betrug 1,767 ± 0,233%, was signifikant höher war als in der Vehikel-Kontrollgruppe; das Verhältnis von Mikronukleus in Zellen, die mit 20 μg ml ⁻¹ . behandelt wurden Au@Ag NR betrug 2,167 ± 0,252%, was signifikant höher war als die Werte, die in beiden Vehikelkontrollgruppen und 16 μg ml ⁻¹ . beobachtet wurden Au-NR-Gruppe (0,700   ±   0,153 %). Im Gegensatz dazu wurde kein Unterschied zwischen Zellen gefunden, die mit 20 μg ml ^–1 . behandelt wurden Au@Ag NR + NAC und Vehikelkontrolle, was auf eine Beteiligung von ROS am durch Au@Ag NR induzierten Chromosomenbruch hinweist.

Chromosomenschädigung durch Au@Ag NR. HepaGR-Zellen wurden Au@Ag NR in verschiedenen Konzentrationen von 0,8 μg ml ^–1 . ausgesetzt bis 20 μg ml ⁻¹ für 24 h und 72 h. a , b Repräsentative Bilder des Mikronukleus (roter Pfeil); c Mikronukleus-Häufigkeit (%). ^* P <  0,05 gegenüber Fahrzeugkontrolle; ^a P < 0,05 gegenüber Au-NR. 0,2 μg ml ⁻¹ Mitomycin C wurde als positive Kontrolle verwendet

Auswirkungen von Au@Ag NR auf die ROS-Formation

Um die Rolle der ROS-Bildung bei Au@Ag-NR-induzierten DNA- und Chromosomenschäden weiter zu untersuchen, wurden die MDA-, GSH- und SOD-Werte geschätzt. Eine signifikante Zunahme der MDA-Bildung (P < 0,05) wurde nach Exposition gegenüber 20 μg ml ⁻¹ . beobachtet Au@Ag NR für 24 und 72 h (Abb. 5a). Darüber hinaus zeigten die GSH- und SOD-Werte in Zellen, die Au@Ag-NR ausgesetzt waren, eine signifikante Verringerung (P < 0,05) zeit- und konzentrationsabhängig. Diese Ergebnisse deuten auf ein Ungleichgewicht zwischen Oxidation und Antioxidation hin, das durch die Exposition von Au@Ag NR entsteht (Abb. 5b, c).

Auswirkungen von Au@Ag NR auf die ROS-Bildung. HepaGR-Zellen wurden Au@Ag NR in verschiedenen Konzentrationen von 0,8 μg ml ^–1 . ausgesetzt bis 20 μg ml ⁻¹ für 24 h und 72 h. a MDA-Niveau; b GSH-Spiegel; c SOD-Level. ^* P <  0,05 gegenüber Fahrzeugkontrolle; ^a P < 0,05 gegenüber Au-NR

Auswirkungen von Au@Ag NR auf den Zellzyklus und die Apoptose

Nach einer 72-stündigen Exposition gegenüber Au@Ag NR wurde eine Zunahme der Zellzahlen in Phase G2/M in 4 μg ml ⁻¹ . beobachtet Au@Ag NR, 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR und Au@Ag NR + NAC Gruppe, mit Anteilen von 32,63 % ± 1,77 %, 32,267% ± 2,17 % bzw. 32,967 % ± 4,25 % (Abb. 6a, b), die deutlich größer waren als die in die Vehikel-Kontrollgruppe (22,37%   ±   0,92%). In der Zwischenzeit konnte eine durch Au@Ag NR induzierte Zellapoptose nach einer 72-stündigen Exposition beobachtet werden und die späte Apoptoserate von Zellen, die mit 20 μg mL ⁻¹ . behandelt wurden Au@Ag NR und 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR + NAC betrug 78,90 ± 1,19% bzw. 70,20 ± 4,50% (Abb. 6c, d). Au@Ag NR induzierte mehr späte Apoptose als frühe Apoptose, und die Behandlung von NAC könnte die Zellrate der durch Au@Ag NR ausgelösten späten Apoptose verringern.

Auswirkungen von Au@Ag NR auf den Zellzyklus und die Apoptose. Auswirkungen von Au@Ag NR auf den Zellzyklus (a , b ) und Apoptose (c , d ) nach 24 h bzw. 72 h Exposition; die repräsentativen Daten der Expressionsniveaus von p53 und p21 in HepaRG-Zellen verschiedener Gruppen (e , f Spur 1:Fahrzeugkontrolle; Spur 2:Au-NR; Spur 3:Au@Ag NR + NAC; Spur 4:Au@Ag NR 20 μg mL ⁻¹ ; Spur 5:Au@Ag NR 4 μg mL ⁻¹ ; Spur 6:Au@Ag NR 0,8 μg mL ⁻¹ ); das durchschnittliche relative Expressionsniveau von p53 und p21 zu β-Aktin in verschiedenen Gruppen wurde in (g , f ). ^* P <  0,05 gegenüber Fahrzeugkontrolle; ^a P < 0,05 gegenüber Au-NR

Die Expressionsniveaus von p21 und p53 wurden durch Western-Blots nachgewiesen und ein ähnliches Muster wurde beobachtet. Die Expressionsspiegel von p53 und p21 in Zellen, die mit 4 μg ml ^–1 . behandelt wurden und 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR wurden deutlich erhöht (P < 0,05) und waren bei Zellen, die mit 20 μg ml ⁻¹ . behandelt wurden, signifikant verringert Au@Ag NR und NAC (P < 0,05, verglichen mit 20 μg ml ⁻¹ Au@Ag NR-Gruppe, Abb. 6e–h). Es ist bekannt, dass das p53-Protein ein Kernmolekül ist, das die G2/M-Checkpoint-Aktivierung als Reaktion auf DNA-Schäden vermittelt, und p21 wird als ein p53-abhängiger Zellzyklus-Inhibitor erkannt. Somit könnte das Au@Ag NR die DNA-Replikation stören und die DNA-Reparatur durch den Zellzyklusarrest behindern.

Diskussion

Derzeit sind die Rollen der veröffentlichten Ag ⁺ und AgNPs bei der Generierung von Genotoxizität sind alles andere als klar. Frühere Studien unserer Gruppe [21] und anderer [13] haben gezeigt, dass Ag ⁺ die Hauptquelle für die Einführung von Toxizitäten ist, könnten Nanopartikel auch hochgiftig sein. AgNPs könnten beispielsweise zur Genotoxizität beitragen, indem sie die Bildung von Hydroxylradikalen induzieren [13]. Darüber hinaus wurden durch AgNP im Vergleich zu Ag ⁺ . schwerwiegendere Chromosomenschäden, oxidativer Stress und Apoptose eingeführt allein [23], was darauf hindeutet, dass verschiedene Wege beteiligt sein könnten. Wir verwendeten Au@Ag NR als Modellmaterial, um die Formen und Verteilungen von AgNPs in Zellen zu verstehen, und die Mengen an intrazellulärem Ag und Au wurden durch ICP-MS bestimmt. The Ag/Au weight ratio of prepared Au@Ag NR was estimated as 2.3. However, after a 24-h exposure, it sharply increased to 16.5 in the cells treated with Au@Ag NR, suggesting that large amount of Ag was released from the shell of Au@Ag NR within that period. When the exposure period of Au@Ag NR was extended to 72 h, the Au/Ag weight ratio was decreased to 1.7, indicating that the Ag ⁺ was released from the cell and the nanorod was the major form of Au@Ag NR in the cell at that stage. Therefore, it could be deduced that once the Au@Ag NR entered the cell, Ag ⁺ rapidly dissolved from its shell within 24 h and gradually released to the extracellular environment, while the Au@Ag NR itself retained in the cell for a longer period.

Oxidative stress is deemed as one of the most important toxicological mechanisms of nanoparticles [24]. N-acetylcysteine (NAC) is a thiol, a mucolytic agent and precursor of l-cysteine which reduced glutathione. NAC is also a source of sulfhydryl groups in cells and exerts the ROS scavenger activity by interacting with OH ^· und H₂ O₂ [25]. In this study, the GSH and SOD levels were significantly decreased after exposure to Au@Ag NR, while the MDA level increased in a concentration- and time-dependent manner, indicating that the Au@Ag NR introduced the oxidative stress in the cells.

The potentials of Ag and Au@Ag NR in interfering with the genetic materials were further investigated by a series of genotoxicity assays. It is noteworthy that co-culturing the NAC with Au@Ag NR could ameliorate the ROS formation, which in turn supports the participation of oxidative stress in the genotoxicity triggered by Au@Ag NR. In this study, comet and γ-H2AX assays were performed to confirm that Au@Ag NR could interact with DNA and induce certain DNA damage, and the repair endonuclease Fpg was included in the comet assay to identify the oxidative DNA damage [26]. The Fgp could recognize oxidized pyrimidines and remove oxidized purines, e.g., 8-hydroguanine, so as to create apurinic or apyrimidinic sites that could introduce gaps in the DNA strands. The oxidative stress-induced DNA breakage could be determined subsequently by another comet assay [27]. The further DNA breakage detected by the additional Fgp in the comet assay suggested that the Au@Ag NR could cause DNA damage. Mei et al. [28] observed that 5-nm-sized AgNPs induced oxidative lesion-specific DNA damage by employing the hOGG1, EndoIII and Fpg endonucleases in the comet assay. Liet al. [29] also suggested that both PVP- and silica-coated AgNPs (15–100 nm and 10–80 nm, respectively) could lead to a significant increase in DNA breakage in mice hepatocytes in the presence of hOGG1and EndoIII. The formation of γ-H2AX foci, which represents an early cellular response to genotoxic stress, is the most sensitive and specific biomarker for detecting DSBs [30]. As demonstrated in this study, γ-H2AX foci in cells exposed to Au@Ag NR were markedly increased after 24 h, and a further increase could be observed after 72 h. The reduction in the 20 µg mL ⁻¹ group might be due to the cytotoxicity to the HepaRG cells at higher concentration. Similar results were observed for AgNPs with different coatings [31, 32]. Further, our results suggest that Au@Ag NR could induce chromosome damage in HepaRG cells, as the micronucleus rates were significantly increased. This is consistent with previous studies, where AgNPs-induced increased micronucleus rate was reported in HaCaT and TK6 cells [33]. In contrast, the addition of oxidative radical scavenger NAC could inhibit the formation of micronucleus induced by Au@Ag NR. Taken together, these data suggest the participation of oxidative stress in AgNP-introduced clastogenicity risk in vitro.

Previous studies have investigated the cell cycle arrest and cytotoxicity induced by AgNPs [33,34,35]. With prolonging the exposure time, the impact of AgNPs on cell cycle and apoptosis might be enhanced and in turn aggravate the cytotoxicity and genotoxicity. Usually, the cell cycle checkpoints (e.g., G2/M) were initiated by cells when experiencing DNA damage, and this mechanism serves to prevent the cell from entering mitosis (M phase). The G2/M cell cycle arrest indicates that an increasing percentage of cells is hindered in G2 phase for DNA repairing. Cells experiencing successful DNA repairing would further proceed to mitosis; however, for those with fatal damages, irreversible G2/M cell cycle arrest and cells apoptosis would take place [36]. We observed that Au@Ag NR could arrest the majority of HepaRG cells in G2/M phase, induce late cell apoptosis and increase the expression levels of p53 and p21, which are important proteins associated with the regulation of cell cycles [37]. As p53 could also induce apoptosis, when the DNA cannot be repaired properly [38], the p21 might indirectly participate in cell apoptosis by cell cycle arrest in a p53-dependent pathway via down-regulating the nuclear protein ICBP90 for DNA replication and cell cycle regulation [39]. Furthermore, apoptosis and a G2/M arrest induced by activation of the p53/p21 system have been reported in HepG2 cells following the administration of garlic extracts [40]. Thus, it could be inferred that the oxidative stress-triggered DNA/chromosome damages might facilitate the expression of p53 and p21, which subsequently induces cell cycle arrest. Extending the exposure period of Au@Ag NRs to the DNA/chromosome during replication may further aggravate the genotoxicity or apoptosis.

Conclusion

Genotoxicity induced by AgNPs may be attributed to the oxidative stress induced by the nanoparticles as well as the released ions [41]. This study employed Au@Ag NR as a model to determine the distribution and release behavior of Ag after the nanoparticles enter into the cells. Considering the disparate forms of Au@Ag NR in the cell, after its exposure the Ag ⁺ was rapidly dissolved from the silver shell. Ag ⁺ and Au@Ag NR could introduce cytotoxicity and genotoxicity (clastogenicity) in the cells, and the Au@Ag NR retained in the nucleus may further release Ag ⁺ to aggravate the damage, which are mainly caused by cell cycle arrest and ROS formation (summarized in Fig. 7). Collectively, these data reveal the correlation between the intracellular accumulation, Ag ⁺ release as well as the potential genotoxicity of AgNPs.

Schematic diagram of the possible mechanism of genotoxicity introduced by AgNP in vitro

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

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