Längs-Zeolith-Eisen-Eisen-Nanokomposit-abgeschiedener Kapazitäts-Biosensor für Interleukin-3 bei der Sepsis-Erkennung

Einführung

Sepsis ist eine tödliche Erkrankung, die auftritt, wenn der Körper stark auf eine Infektion reagiert [1]. Aufgrund eines Sepsis-Angriffs produziert der Körper ein höheres Maß an Signalbiomolekülen, die als „Zytokine“ bezeichnet werden und Immunzellen anziehen. Eine zunehmende Zahl dieser Zellen sezerniert mehr Zytokine und der Zytokinsturm rekrutiert mehr Immunzellen. Anstatt die Erstinfektion zu kontrollieren, greifen Immunfaktoren Körperorgane und -gewebe an. Darüber hinaus löst diese Infektion eine Kettenreaktion im ganzen Körper aus und führt zu Organversagen und Gewebeschäden [2]. Sepsis beginnt insbesondere in Lunge, Haut, Harnwegen und Magen-Darm-Trakt und breitet sich weit aus.

auf andere Organe, was zu Organschäden führt. Daher ist es notwendig, den Prozess früher zu stoppen, um Angriffe auf andere Organe zu verhindern. Die Sepsiserkennung in einem frühen Stadium mit einem geeigneten Biomarker hilft, Patienten schnell zu behandeln und Leben zu retten. Die Forscher fanden heraus, dass der Entzündungsfaktor Interleukin-3 (IL-3) ein unabhängiger Prädiktor für Sepsisangriff und Tod ist, der von B-Zellen des angeborenen Antwortaktivators (IRA) nach Aktivierung des Toll-like-Rezeptors produziert wird. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ein höherer IL-3-Spiegel mit einer höheren Sterblichkeitsrate bei Sepsispatienten verbunden ist und bestätigte, dass IL-3 eine wichtige Rolle bei der Immunregulation und höheren Reaktionen auf Kortikosteroide während der Sepsis spielt. Diese Forschung zielte auf die Quantifizierung des IL-3-Spiegels unter Verwendung eines mit einem Nanokomposit-modifizierten kapazitiven elektrochemischen Sensors aus Zeolith-Eisenoxid (Zeolith-Eisen) ab.

Der Nachweis von Biomolekülen mit Biosensoren hängt stark von der Immobilisierung des Ziel- oder Nachweismoleküls auf der Oberfläche der Wandlerelektrode ab [3]. Eine höhere Anzahl immobilisierter Fangsonden mit der richtigen Orientierung führt zu niedrigeren Zielnachweisgrenzen [4]. In den meisten Fällen wurde die Immobilisierung der Einfangsonden durch physikalische Adsorption, elektrostatische Wechselwirkung, kovalente Verknüpfung und Einschluss von Biomolekülen mit Polymeren durchgeführt [5, 6]. Es kann schwierig sein, Reproduzierbarkeit und Biokompatibilität von immobilisierten Biomolekülen durch die obigen Immobilisierungsverfahren zu erreichen. Insbesondere die Anheftung kleinerer Fängermoleküle wie RNA, DNA, Aptamere und Peptide an Sensoroberflächen ist kompliziert [7, 8]. Verschiedene Forscher haben unterschiedliche Techniken für eine effiziente Immobilisierung verwendet. In letzter Zeit sind Nanomaterialien sehr attraktiv für den Prozess der biomolekularen Immobilisierung auf Sensoroberflächen [9,10,11]. Goldnanopartikel wurden effizient auf verschiedenen Sensoroberflächen wie Polystyrol-ELISA-Substraten und Aluminiumelektroden immobilisiert und haben potenzielle Moleküle wie Antikörper, Proteine, DNA und Aptamere eingefangen. Neben Siliciumdioxid sind Aluminium und Graphen häufig verwendete Materialien zur Immobilisierung von Biomolekülen. Diese Nanomaterialien verbessern die Anzahl der Fängermoleküle und sorgen für die Biokompatibilität und Stabilität der Biomoleküle auf Sensoroberflächen, was zur Verbesserung der Nachweisstrategie beiträgt. In letzter Zeit haben anorganische Materialien wie Zeolith, Ton und Sol-Gel die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen, um diese Probleme zu lösen. Darüber hinaus wurde die Synthese von Nanomaterialien durch umweltfreundlichere Ansätze aufgrund der damit verbundenen großen Vorteile, wie z. Darüber hinaus können maßgeschneiderte Ansätze verwendet werden, um gewünschte Größen und Formen von Nanomaterialien zu erreichen. Die aktuelle Studie folgte diesem Ansatz und produzierte ein Zeolith-Nanomaterial, das mit isoliertem Eisen kombiniert wurde, um ein Nanokomposit zu bilden.

Zeolith ist ein kristallines mikroporöses Alumosilikat bestehend aus TO₄ Tetraeder und O-Atome [16]. Es ist ein vielversprechendes Material für die biomolekulare Immobilisierung aufgrund seiner größeren Oberfläche, Fähigkeit zum Ionenaustausch, kontrollierbarer Hydrophobie/Hydrophilie und hoher mechanischer und thermischer Leitfähigkeit. Daher wurden verschiedene Studien auf dem Gebiet der Biosensoren mit Zeolithmaterial für den biomolekularen Immobilisierungsprozess erstellt und erreichten niedrigere Nachweisgrenzen, um Biosensoren wie Glukosesensoren und Harnstoffsensoren zu entwickeln [17,18,19]. In ähnlicher Weise verbessern Eisennanomaterialien die Wirkung von Kationenaustauscheigenschaften und reagieren schnell auf Stromänderungen bei Wechselwirkungen mit Biomolekülen. Das in dieser Studie verwendete Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit mit einer einzigartigen Zusammensetzung verbessert die hohe Leistung des Sensors und bietet aufgrund der verbesserten Leitfähigkeit eine weitere verbesserte Empfindlichkeit. Diese Studie konzentrierte sich auf Zeolith-Eisen-Nanomaterialien, die aus Kohlebergwerksflugasche extrahiert wurden, und nutzte sie als Substrate für Kapazitätselektroden, um die Einfangsonde, die ein Anti-IL-3-Antikörper war, zu immobilisieren. Im Vergleich zu früheren durch Nanomaterialien vermittelten Nachweisen verschiedener Interleukine [20,21,22] bietet das aktuelle Sensorsystem in mehrfacher Hinsicht Verbesserungen. Zum Beispiel erfordert seine höhere Eignung für elektrochemische Sensoren weniger experimentelle Schritte und es zeigt eine Eignung für die chemische Oberflächenfunktionalisierung und eine hohe Antifouling-Fähigkeit.

Ein kapazitiver Biosensor ist ein elektrochemischer Sensor, der durch die Registrierung der Anziehung zwischen der Sonde und dem Ziel erzeugt wird, die auf der Elektrodenoberfläche interagieren. Ein kapazitiver Biosensor hilft, Änderungen in der dielektrischen Schicht an der Elektrodengrenzfläche zu messen, wenn ein Zielbiomolekül mit der immobilisierten Sonde auf der Sensoroberfläche bindet [23]. Die Kapazität zwischen Elektrode und Elektrolyt wird durch C . beschrieben = (2nε ₀ εA )/d , wobei ε :Dielektrizitätskonstante, A :Oberfläche der Platte, ε ₀ :Permittivität des freien Raums, n :Anzahl der sich wiederholenden Finger und d :Isolierschichtdicke [24, 25]. Ein nicht-faradischer kapazitiver Biosensor hilft, eine durch Metallisierung verursachte Proteindenaturierung zu vermeiden und verbessert die Interaktion von Target- und Sondenbindung [26, 27]. In verschiedenen Studien wurden kapazitive Biosensoren verwendet, um verschiedene Zielmoleküle zu identifizieren, darunter Nukleotide, Schwermetalle, Proteine ​​und organische Moleküle [23, 28, 29, 30, 31]. In dieser Forschung wurde ein Experiment mit einem nicht-faradischen Kapazitätsbiosensor an einer mit Zeolith-Eisen modifizierten Elektrodenoberfläche durchgeführt. Zeolith-Eisen wurde über (3-Aminopropyl)-trimethoxysilan als Amin-Linker an die Kapazitätselektrode gebunden, und dann wurde Anti-IL-3 an die Oberfläche durch die Anziehung zwischen der Aminoberfläche und der Carboxylgruppe (COOH) des Antikörper. Eine anti-IL-3-Antikörper-modifizierte Elektrode wurde verwendet, um IL-3 zu quantifizieren und eine Sepsis-Attacke zu diagnostizieren.

Materialien und Methoden

Geräte und Reagenzien

Flugasche wurde aus einem thermischen Kraftwerk in Indien bezogen. Natriumhydroxid und Schwefelsäure wurden von Sigma Aldrich (Missouri, USA) bezogen. (3-Aminopropyl)-trimethoxysilan (APTMS) wurde von Merck (NJ, USA) erhalten. Whatman-Filterpapier wurde von Thermo Fisher Scientific (Massachusetts, USA) erhalten. IL-3- und Anti-IL-3-Antikörper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Texas, USA) erhalten. Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FESEM; Hitachi, S-4300 SE, Japan) und Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie (FETEM; JEM-2100F, JEOL, Japan) wurden verwendet, um das Zeolith-Eisen-Nanomaterial mit den zuvor beschriebenen Methoden zu analysieren [ 32].

Synthese von Zeolith-Eisen-Nanomaterial

Zeolith-Eisen-Nanomaterialien wurden unter Verwendung von Eisen, Siliciumdioxid und Aluminiumoxid, das aus Flugasche extrahiert wurde, synthetisiert. Die folgenden drei Hauptschritte waren an diesem Verfahren beteiligt:​​(1) Abtrennung von Eisenpartikeln; (2) Extraktion von Natriumaluminosilikat; und (3) Herstellung von Zeolith-Eisen-Nanopartikeln durch die Sol-Gel-Synthesemethode.

Trennung von Eisen von Flugasche

Ein 25 g-Aliquot Flugasche wurde mit 500 µl destilliertem Wasser vermischt und 30 Minuten lang mit einem Magnetrührer gerührt. Die am Magnetrührer haftenden Eisenpartikel wurden abgetrennt, und dann wurde 1 g der abgetrennten Partikel mit 25 %iger Schwefelsäure vermischt und 1 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden die eisenhaltige Lösung und die Eisenpartikel durch Whatman-Filterpapier getrennt und als Basis für Eisenoxid verwendet, um das Zeolith-Eisen-Nanomaterial zu synthetisieren.

Extraktion von Natriumaluminiumsilikat aus Flugasche

Das alkalische Extraktionsverfahren wurde verwendet, um Natriumaluminosilikat aus Flugasche durch das alkalische Extraktionsverfahren zu extrahieren [33]. Zuerst wurden 25 g eisengetrennte Flugasche mit 500 µL 2 M Natriumhydroxid vermischt und 6 h unter Rühren auf 100 °C erhitzt. Nach dem Abkühlen der Lösung wurde Natriumaluminosilikat (die Lösung in der Mischung) durch Whatman-Filterpapier abgetrennt. Die filtrierte Lösung wurde als Base verwendet, um einen Zeolithen zu synthetisieren.

Zeolith-Eisen-Nanomaterial, synthetisiert nach der Sol-Gel-Methode

Das extrahierte Eisen und Natriumaluminosilikat wurden als Base verwendet, um Zeolith-Eisen-Nanomaterialien nach der Sol-Gel-Methode zu synthetisieren. Im ersten Schritt wurde ein Becher mit 200 ml Natriumaluminosilikat bei pH 12 unter Rühren auf die Heizplatte gestellt. Dann wurde die Lösung mit Eisenlösung bei pH 1 durch tropfenweise Zugabe von Eisenlösung titriert, bis sie pH 7 erreichte. Bei pH 7 bildete sich ein weißes Gel, und dieses Gel wurde über Nacht kontinuierlich gerührt, um gleichmäßig verteilte Zeolith-Eisen-Nanopartikel zu erhalten . Am nächsten Tag wurde das Gel durch Zentrifugation (10.000 × g für 10 Minuten) und dann mit 25 % Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen. Das Endprodukt wurde 1 h bei 100 °C getrocknet, um ein Pulver aus Zeolith-Eisen-Nanomaterialien zu erhalten. Die Oberfläche des Zeolith-Eisen-Nanomaterials wurde durch FETEM und FESEM charakterisiert. Es wurde auch eine energiedispersive Röntgenanalyse (EDX) durchgeführt, um die Elemente im Zeolith-Eisen zu identifizieren.

Amin-Modifikation von Zeolith-Eisen und Funktionalisierung der Kapazitätselektrodenoberfläche

Die Oberfläche des Zeolith-Eisens wurde mit dem Silan-Haftvermittler APTMS mit Amin beschichtet. Dazu wurde 1 g Zeolith-Eisen mit 1 % KOH für 10 Minuten gemischt und anschließend das überschüssige KOH mit destilliertem Wasser entfernt. Danach wurde das KOH-behandelte Zeolith-Eisen mit 1% APTMS vermischt und die Mischung über Nacht auf einen beheizten Rührer gegeben. Am nächsten Tag wurde das Nanomaterial mit Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation (10.000 × g für 10 Minuten). Dieses APTMS-Zeolith-Eisen wurde an der Kapazitätselektrodenoberfläche angebracht, um IL-3 zu identifizieren. Für diese Immobilisierung wurde APTMS-Zeolith-Eisen auf die hydroxylierte Elektrode getropft und 3 h bei RT gehalten. Die Bindung zwischen dem Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit, APTMS und der Sensoroberfläche war auf die Silankopplung mit den erzeugten Oxidgruppen zurückzuführen. Im Allgemeinen erfolgt die Silankopplung mit mehreren Armen, die den Oxidgruppen zur Verfügung stehen, was zu Verbindungen zwischen dem Zeolith-Eisenoxid-Nanokomposit, APTMS und der Sensoroberfläche führt. Durch diese Mehrfachverknüpfungen wird eine räumliche Anordnung auf der Erfassungsfläche gebildet. Nach dem Waschen der Oberfläche mit Ethanol gefolgt von Wasser wurde ein Anti-IL-3-Antikörper-Immobilisierungsprozess durchgeführt, um mit IL-3 zu interagieren.

Bestimmung von IL-3 auf der Anti-IL-3-modifizierten Kapazitätselektrodenoberfläche

Die oben beschriebene Oberfläche wurde durch Aminbindung gebildet, die eine Reaktion mit verfügbaren COOH-Gruppen ermöglicht, wenn der Antikörper anlagert. IL-3 wurde auf einer anti-IL-3-immobilisierten Kapazitätselektrodenoberfläche identifiziert. Dazu wurde IL-3 mit 100 pg/ml in PBS-Puffer verdünnt und auf eine Antikörper-modifizierte Elektrodenoberfläche getropft. Nach der Antikörperimmobilisierung wurde die verbleibende ungebundene Oberfläche durch PEG-COOH (1 mg/ml) blockiert. Eine ähnliche Reaktion zu Antikörper-APTMS tritt auf, wenn PEG-COOH angelagert wird. Der Kapazitätswert wurde vor und nach der Interaktion mit IL-3 aufgezeichnet. Für die Bindung von IL-3 mit seinem Antikörper wurden Wertunterschiede berücksichtigt. Darüber hinaus wurde IL-3 zur Berechnung der Nachweisgrenze von 3 bis 50 pg/ml titriert und unabhängig auf die Antikörper-modifizierten Oberflächen getropft. Das andere experimentelle Verfahren wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Der Unterschied im Kapazitätswert für jede IL-3-Konzentration wurde berechnet und aufgetragen, um den Nachweis von IL-3 durch den R ² . zu berechnen Wert. Wenn IL-3 an die Antikörper-immobilisierte Oberfläche gebunden wird, kommt es zu einer echten Interaktion.

Biofouling und selektive Bestimmung von IL-3 auf der Zeolith-Eisen-modifizierten Kapazitätselektrodenoberfläche

Ein Biofouling-Experiment wurde unter drei verschiedenen Biomolekülbedingungen durchgeführt, einschließlich der Anwesenheit eines nichtimmunen Antikörpers oder eines Kontrollproteins und der Abwesenheit von IL-3-Antikörper. Im ersten Fall wurde anstelle des IL-3-Antikörpers ein nichtimmuner Antikörper verwendet; im zweiten Experiment wurde anstelle von IL-3 ein Kontrollprotein verwendet; und das letzte Experiment wurde ohne IL-3-Antikörper durchgeführt. Die Kapazitätswerte wurden für die spezifische Interaktion von IL-3-Antikörper mit IL-3 verglichen. Ein selektives Experiment wurde durchgeführt, indem IL-3 in einer 1:100-Verdünnung von Humanserum gespickt und tropfenweise auf eine anti-IL-3-modifizierte Elektrodenoberfläche gegeben wurde. Die Kapazitätsänderungen wurden für jede IL-3-Konzentration aufgezeichnet, um die selektive Identifizierung von IL-3 zu identifizieren. Die Reproduzierbarkeit wurde durch dreimaliges Wiederholen der Experimente (in dreifacher Ausführung) mit ähnlichen Vorrichtungen, die aus derselben Chargenfertigung hergestellt wurden, bestätigt. Die Lebensdauerlagerung und Stabilität der Sonden-immobilisierten Oberfläche wurden ebenfalls bestimmt.

Ergebnisse und Diskussion

Sepsis ist der Zustand, bei dem viele Chemikalien im Immunsystem freigesetzt werden und eine weit verbreitete Entzündung mit letztendlicher Schädigung der Organe auslöst. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung der IL-3-Identifizierung auf einer anti-IL-3-modifizierten Kapazitätselektrodenoberfläche zur Bestimmung des mit Sepsis verbundenen Zustands. APTMS-modifiziertes Zeolith-Eisen wurde verwendet, um den Einfang-Antikörper an die Sensorelektrodenoberfläche zu binden. APTMS auf der Oberfläche des Zeolith-Eisen wurde auf der Elektrodenoberfläche durch die Wechselwirkung zwischen Amin auf dem Nanomaterial und OH-Gruppen auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Abbildung 1b bestätigt die Unversehrtheit der Oberflächenelektrode des Kapazitätssensors, aufgenommen unter einem Hochleistungsmikroskop. Der Antikörper wurde über COOH und das Amin des Zeolith-Eisens an die Oberfläche gebunden. Zeolith-Eisen trägt dazu bei, eine höhere Anzahl von APTMS an der Sensorelektrode anzubringen, wodurch mehr Antikörper auf der Oberfläche der Kapazitätselektrode eingefangen werden. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass die Immobilisierung der Einfangsonde auf der Sensoroberfläche eine entscheidende Rolle bei der Senkung der Nachweisgrenze des Zielmoleküls spielt. In dieser Forschung wurde das Zeolith-Eisen-Nanomaterial verwendet, um Anti-IL-3-Antikörper an die Sensorelektrodenoberfläche zu binden. Eine höhere Immobilisierung von Anti-IL-3-Antikörpern mit der richtigen Orientierung hilft, die niedrigeren Nachweisgrenzen von IL-3 zu erreichen.

a Schematische Darstellung der IL-3-Identifizierung auf einer anti-IL-3-modifizierten kapazitiven Sensoroberfläche. APTMS-modifiziertes Zeolith-Eisen wurde verwendet, um den Einfang-Antikörper zu binden und interagierte dann mit IL-3. Als Blockierungsmittel wurde PEG-COOH verwendet. b Morphologische Analyse der kapazitiven Sensoroberfläche durch Hochleistungsmikroskopie. c Morphologische Analyse von Zeolith-Eisen durch FESEM. Nanomaterialien wurden mit einer gleichmäßigen Verteilung und in der Längsdimension gebildet. d EDX-Analyse. Es wurde die Anwesenheit der Hauptelemente Si, Al, Fe und O gefunden. Der Figureneinschub wurde durch FESEM mit geringer Vergrößerung erhalten

Morphologische Analyse von Zeolith-Eisen-Nanomaterial durch FESEM und FETEM

Abbildung 1c, d (Einschub) zeigt das morphologische Bild des Zeolith-Eisen-Nanomaterials, das von FESEM bei verschiedenen Vergrößerungen und der EDX-Elementaranalyse erhalten wurde. Das erhaltene Zeolith-Eisen-Nanomaterial war glatt und gleichmäßig verteilt mit einer dicht gestapelten Längsnanostruktur. Die Größe dieser Nanostruktur betrug ~ 30 nm, und das erhaltene Bild zeigt, dass das Nanokomposit mit einheitlichen Formen angeordnet und im richtigen Abstand gut verteilt war. Das FETEM-Bild zeigte auch eine ähnliche Form wie die FESEM für die gebildeten Zeolith-Eisen-Nanokomposite (Abb. 2a, b). Das EDX-Ergebnis bestätigte das Vorhandensein von Fe, Al, Si und O im synthetisierten Zeolith-Eisen-Nanokomposit (Abb. 2c, d). Es wurde gefunden, dass die hauptsächlichen elementaren Atomprozentsätze von Si, Al, Fe und O 3,46, 0,78, 2,13 bzw. 24,39 % betrugen. Dieses FESEM- und EDX-Ergebnis bestätigt die Bildung von Zeolith-Eisen-Nanomaterialien.

FETEM-Aufnahmen von Zeolith-Eisen am a 50 nm-Skala und b 200 nm-Skala. Das Nanomaterial wurde mit einer gleichmäßigen Verteilung gebildet. c EDX-Analyse bestätigt das Vorhandensein der Hauptelemente Si, Al, Fe, C und O

Vorbereitung der Sensorelektrode für die IL-3-Bestimmung

Die Immobilisierung von Anti-IL-3-Antikörpern auf dem Kapazitätsbiosensor wurde durch Ändern des Kapazitätsniveaus nach jeder biomolekularen Immobilisierung bestätigt. Abbildung 3a zeigt die Kapazitätsänderungen während des Prozesses der Antikörperanlagerung an die Zeolith-Eisen-modifizierte Oberfläche. Wie in Abb. 3a gezeigt, weist die mit KOH verbundene Kapazitätselektrodenoberfläche einen Kapazitätswert von 1,74   ×  10 ⁰⁹ . auf nF, und nach tropfenweiser Zugabe von APTMS-Zeolith-Eisen wurde sie auf 2,02 × 10 ⁰⁹ . erhöht nF. Diese Kapazitätserhöhung bestätigte die Anhaftung der Nanomaterialien an der Messelektrode. Darüber hinaus stieg der Kapazitätswert nach Zugabe von Anti-IL-3-Antikörper drastisch auf 3,42 × 10 ⁰⁹ nF. Diese höhere Zunahme wurde aufgrund der höheren Menge an Antikörper-Immobilisierung auf dem APTMS-modifizierten Zeolith-Eisen festgestellt. Darüber hinaus zeigten die Nanomaterialien eine geeignete Anordnung mit einer höheren Anzahl von APTMS auf der Sensorelektrodenoberfläche, was letztendlich mehr Antikörper anzog. Schließlich wurde PEG-COOH zu Blockierungszwecken hinzugefügt, und es wurde festgestellt, dass die Kapazität auf 3,64 × 10 ⁰⁹ . ansteigt nF. Der Sensor arbeitet basierend auf Änderungen der Oberflächenladung und letztendlich Änderungen der Kapazität. Die Oberflächenladungsänderungen variieren mit molekularen Anlagerungen/Wechselwirkungen. Jedes Molekül trägt unterschiedliche Ladungen und beeinflusst die Kapazität des Sensors. Daher wurde der Unterschied in der Kapazität für die Messungen berücksichtigt. Aufgrund der höheren Besetzung von IL-3-Antikörpern auf der Sensorelektrodenoberfläche wurden höhere Kapazitätsänderungen festgestellt (Abb. 3b). PEG-COOH hilft, die unspezifische Bindung von IL-3 an der Sensorelektrodenoberfläche zu reduzieren und verhindert falsch positive Ergebnisse. Verschiedene Studien haben bewiesen, dass PEG-basierte Polymere auf Sensoroberflächen die Biokompatibilität verbessern, das Signal-Rausch-Verhältnis reduzieren und eine richtige Orientierung immobilisierter Biomoleküle auf Sensoroberflächen ermöglichen, was zu einer niedrigeren Nachweisgrenze des Sensors führt [34,35, 36,37]. Da die APTMS-Oberfläche andere Biomoleküle elektrostatisch anzieht, wurde PEG-COOH verwendet, um die überschüssige APTMS-Oberfläche auf dem Zeolith-Eisen-Nanomaterial zu bedecken, wodurch Biofouling reduziert wird. Diese Anti-IL-3-modifizierte Oberfläche wurde verwendet, um IL-3 zu identifizieren.

a Prozess der Antikörperanlagerung an die Zeolith-Eisen-modifizierte Oberfläche. die Kapazitätswerte stiegen nach jeder molekularen Immobilisierung an. b Kapazitätsunterschied. Die Immobilisierung von Anti-IL-3-Antikörpern zeigte eine höhere Änderung des Kapazitätswerts. Die Werte wurden unter Verwendung von drei Ablesungen als Triplikate gemittelt. [Zeolith-IO – Zeolith-Eisenoxid]

Bestimmung und Quantifizierung von IL-3 auf der Anti-IL-3-Antikörperoberfläche

IL-3 wurde auf einer Anti-IL-3-modifizierten Kapazitätselektroden-Sensoroberfläche quantifiziert. Anfänglich wurde eine höhere Konzentration von IL-3 (100 pg/ml) auf der antikörpermodifizierten Oberfläche getestet und der Kapazitätswert von 3,74 × 10 ¹⁰ . erhöht nF bis 13 × 10 ¹⁰ nF. Dieser Anstieg bestätigt die Wechselwirkung von IL-3 mit Anti-IL-3-Antikörper (Fig. 4a). Ein ähnliches Experiment wurde mit IL-3-Konzentrationen von 3 bis 50 pg/ml durchgeführt. Wie in Abb. 4b gezeigt, stiegen die Kapazitätswerte auf 4,56  × 10 ¹⁰ . nF, 5,84 × 10 ¹⁰ nF, 6,64 × 10 ¹⁰ nF, 8,39 × 10 ¹⁰ nF und 12 × 10 ¹⁰ nF. Es wurde festgestellt, dass mit steigenden Konzentrationen von Il-3 die Kapazitätswerte allmählich anstiegen (Abb. 5a). Die Differenz der Kapazitätswerte wurde berechnet und in einem Excel-Blatt aufgetragen, und der Nachweis von IL-3 wurde als 3 pg/ml mit einem R2-Wert von 0,9673 berechnet (Abb. 5b). Bei der Interaktion mit Anti-IL-3 wurde eine lineare dosisabhängige Reaktion mit unterschiedlichen Konzentrationen von IL-3 (3–100 pg/ml) festgestellt. Bei einer Titration mit weiteren Konzentrationen waren die Proben jedoch gesättigt.

Bestimmung von IL-3 auf der anti-IL-3-modifizierten Oberfläche. a Identifizierung von 100 pg/ml IL-3. Nach tropfenweiser Zugabe von IL-3 wurden deutliche Kapazitätsänderungen festgestellt. Der Figureneinschub zeigt den Schaltplan. b Titration verschiedener IL-3-Konzentrationen auf Anti-IL-3-Antikörper. Bei allen Konzentrationen von IL-3 wurden Kapazitätsänderungen festgestellt

a Kapazitätswert für jede IL-3-Konzentration. Eine Erhöhung der IL-3-Konzentration führte zu einer allmählichen Erhöhung des Kapazitätswerts. b Unterschied im Kapazitätswert für jede IL-3-Konzentration. Die Werte wurden in einer Excel-Tabelle aufgetragen und die Nachweisgrenze von IL-3 wurde zu 3 pg/ml berechnet. Die Werte wurden unter Verwendung von drei Messwerten als Triplikate gemittelt

Biofouling/Nonfouling auf der APTES-Zeolith-Eisen-modifizierten Kapazitätselektrode

Biofouling ist das größte Problem bei jeder Art von Biosensor, das zu einer falsch positiven Identifizierung des Ziels auf der Sensoroberfläche führt. Blockierungsmittel wie BSA, Ethanolamin und PEG-basierte Polymere sind übliche Moleküle, die das Biofouling auf Sensoroberflächen reduzieren. Hier wurde PEG-COOH als Blockierungsmittel verwendet und die Biofouling-Wirkung wurde in drei verschiedenen Kontrollexperimenten bestätigt, nämlich ohne IL-3-Antikörper, mit einem nichtimmunen Antikörper und mit einem Kontrollprotein (IL-8). Wie in Abb. 6a gezeigt, konnten alle drei Kontrollexperimente den Kapazitätswert nicht erhöhen, was auf die spezifische Identifizierung von IL-3 ohne jegliches Biofouling hinweist.

a Spezifischer Nachweis von IL-3. Kontrollmoleküle zeigten keinen Anstieg des Kapazitätswerts, was auf den spezifischen Nachweis von IL-3 hinweist. b Spiking von IL-3 in Humanserum. Spikes in Humanserum erhöhten die Kapazität mit steigenden IL-3-Konzentrationen. Dieses Ergebnis bestätigt den selektiven Nachweis von IL-3. Die Werte wurden unter Verwendung von drei Messwerten als Triplikate gemittelt

Spiking von IL-3 in Humanserum und Stabilität

Humanserum wurde mit verschiedenen Konzentrationen von IL-3 versetzt und demselben experimentellen Verfahren unterzogen, um IL-3 in realen Situationen zu identifizieren. Wie in Abb. 6b gezeigt, erzeugte gespicktes IL-3 in Humanserum deutlich erhöhte Kapazitätswerte mit erhöhten Konzentrationen von IL-3. Dieses Ergebnis bestätigt die selektive IL-3-Identifizierung durch die anti-IL-3-modifizierte Kapazitätselektrode.

Unter Berücksichtigung der Reproduzierbarkeit verhält sich die Sensorfläche gut mit minimalen Fehlerwerten. Die Betriebslebensdauer des hergestellten auf der Sensoroberfläche befestigten Nanomaterials kann bei ordnungsgemäßer Lagerung in einem Exsikkator um drei Monate verlängert werden. Nach dem Anbringen der Sonde war die Oberfläche jedoch 2 Wochen lang stabil und verlor tendenziell 19 % der Stabilität, und der Stabilitätsverlust wurde ab der 3. Woche steil. Um die hohe Leistungsfähigkeit des aktuellen Sensors zu beweisen, wurde eine Vergleichsstudie mit den derzeit verfügbaren Sensoren durchgeführt, und die Ergebnisse zeigen, dass er vergleichbar ist und sich in mehreren Fällen besser verhält (Tabelle 1).

Schlussfolgerung

Eine Sepsis ist lebensbedrohlich, beinhaltet eine überwältigende Immunreaktion, ist äußerst gefährlich und betrifft den ganzen Körper. Diese Studie demonstrierte die Identifizierung eines Sepsis-Biomarkers (IL-3) auf einer Kapazitätselektrode. Zeolith-Eisen-Nanomaterial wurde aus einer durch Kohlefliege modifizierten Kapazitätselektrode extrahiert, um den Stromfluss beim Binden von Biomolekülen an die Sensorelektrode zu erhöhen. Eine Aminmodifikation wurde durchgeführt, um Anti-IL-3-Antikörper an das Zeolith-Eisen zu binden. Der IL-3-Nachweis wurde an einer Antikörper-modifizierten Elektrode durchgeführt und erreichte die Nachweisgrenze von IL-3 auf 3 pg/ml. Weitere Kontrollexperimente zeigten keine Erhöhung des Kapazitätswerts, was den spezifischen Nachweis von IL-3 bestätigte, und selektive Experimente mit gespiktem IL-3 in Humanserum zeigten einen deutlichen Kapazitätsanstieg. Diese experimentelle Methode quantifiziert den IL-3-Spiegel und hilft bei der Diagnose von Sepsis-Attacken.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

IL-3:

Interleukin-3

pg:

Picogramm

ml:

Milliliter

µL:

Mikroliter

M:

Molaren

FESEM:

Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskop

FETEM:

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop

EDX:

Energiedispersive Röntgenstrahlung

IRA:

Aktivator der angeborenen Reaktion

COOH:

Carbonsäure

DNA:

Desoxyribose-Nukleinsäure

RNA:

Ribose-Nukleinsäure

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

APTMS:

(3-Aminopropyl)-trimethoxysilan

KOH:

Kaliumhydroxid

PEG:

Polyethylenglykol