Schneller, sensitiver Fluoreszenz-Immunassay für CYFRA 21-1 mit Kohlenstoff-Quantenpunkt/Zinkoxid-Nanokomposit

Zusammenfassung

Die schnelle Detektion von Lungenkrebs in frühen Stadien mittels des Tumor-Markers Cytokeratin-19-Fragment (CYFRA 21-1) in menschlichem Serum spielt eine entscheidende Rolle für das Überleben der Patienten und eine rasche chirurgische Reaktion. Diese Studie zielte darauf ab, grün synthetisierte Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs), konjugiert mit Zinkoxid-Nanokomposit, als hochsensitive Fluoreszenz-Immunsensorlösung für die schnelle Bestimmung von CYFRA 21-1-Antigen in menschlichem Serum einzusetzen. Die Methode nutzte ein hydrothermales Verfahren zur Herstellung von CQDs aus Citrus lemon-Schale. Die gebildeten CQDs dienten als Reduktions- und Stabilisierungsmittel für Zinkacetat zur Synthese des CQDs/ZnO-Nanokomposits. Für ein Sandwich-Capping-Antikörper-Antigen-Antikörper-Immunsensorsystem wurde CYFRA 21-1-Antigen durch Immobilisierung eines nicht-konjugierten monoklonalen Antikörpers BM 19.21 auf der Oberfläche des CQDs/ZnO-Nanokomposits gebunden, während ein weiterer monoklonaler Antikörper KS 19.1 die Mikrotiterplattenoberfläche beschichtete. Das System weist ein einstellbares Fluoreszenzsignal bei Anregung λ_ex = 470 nm und Emission λ_em = 520 nm auf. Der vorgeschlagene Nanokomposit-Fluoreszenz-Immunsensor zeigte einen linearen Bereich von 0,01–100 ng mL⁻¹ mit einer Nachweisgrenze (LOD) von 0,008 ng mL⁻¹. Das System bietet einen vielversprechenden Ansatz für schnelle Lungenkrebsdiagnostik durch CYFRA 21-1-Nachweis in menschlichem Serum.

Einleitung

Lungenkrebs ist die häufigste und aggressivste Krebsart mit großen Herausforderungen in der medizinischen Behandlung. Tumorrezidiv und Metastasen gelten als Haupttodesursachen bei Lungenkrebspatienten [1]. Der Tumor-Marker Cytokeratin-19-Fragment (CYFRA 21-1) existiert in vielen normalen und malignen Epithelzellen [2]. Er kann mittels Sandwich-Immunradiometrieassay bestimmt werden. Frühere Studien zeigten, dass CYFRA 21-1 in malignen Lungenkrebsstadien in die Blutzirkulation freigesetzt und im Serum erhöht ist [3]. Daher kann frühe Detektion und daraus resultierende schnelle chirurgische Reaktion das Überleben verbessern [4].

Wenige Techniken wurden zuvor für CYFRA 21-1-Nachweis berichtet: Enzym-Immunassay [5], Elektrochemilumineszenz-Immunassay [6], Immunradiometrieassay [7]. Eine vorteilhafte Strategie zur Sensitivitätssteigerung im menschlichen Serum bleibt ein Anliegen.

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte und explosives Wachstum der Nanotechnologie in fast allen Lebensbereichen erzielt [8]: Drug-Delivery-Systeme [9], pharmazeutische Analytik [10], katalytische Reaktionen [11], medizinische Anwendungen [12], Krebstumor-Marker [13], Gewebebildgebung [14].

Heutzutage ziehen Fluoreszenz (FL)-basierte Sensortechniken viele Forscher an wegen einfachem Design und exzellenter Sensitivität. Verschiedene FL-Sensormaterialien wurden für biologisches Monitoring entwickelt. FL-Systeme für biologische Bestimmung sind hochlumineszent, wasserdispergierbar, chemisch stabil und ungiftig [15]. Es gibt verschiedene immunsensorbasierte Fluoreszenz-Sonden für Biomarker-Detektion. Der heterogene kompetitive Assay immobilisiert Capture-Moleküle auf der Oberfläche und inkubiert mit fluorophor-konjugierten Biomarkern. Der Wettbewerb zwischen freien und konjugierten Biomarkern um Bindung an Capture-Moleküle verringert Fluoreszenzintensität mit Biomarkerkonzentration [16]. Der heterogene Sandwich-Assay basiert auf Inkubation von Capture-Molekülen und Probenlösung zur Komplexbildung mit Biomarkern – Fluoreszenzintensität steigt mit Biomarkerkonzentration [17].

Im homogenen kompetitiven Assay konkurrieren zwei verschiedene Fluorophor-A-konjugierte Capture-Moleküle mit Fluorophor-B-konjugierten Biomarkern und der Probe – Fluoreszenz steigt mit Biomarkerkonzentration [18]. Diese Techniken zeigten jedoch Nachteile: lange Experimentierzeit, fehlende Multiplex-Detektion, Komplexität, teils falsche Ergebnisse. Nanotechnologie-Fortschritte ermöglichten neuartige Fluoreszenz-Immunsensorsonden mit einzigartigen optischen Eigenschaften [19]. Seit erster Nutzung von Quantenpunkten in Biomolekül-Detektion gewannen diese großes Interesse: ihre optischen Eigenschaften bieten hohe Flexibilität bei Wellenlängenwahl, exzellente Labels für Multiplex-Detektion, Biokompatibilität und Targeting-Kapazität [20].

Kohlenstoff-Quantenpunkte (CQDs) demonstrieren exzellente chemische, physikalische, optische, magnetische und elektrische Eigenschaften. CQDs können durch verschiedene Techniken synthetisiert werden: hydrothermal, elektrooxidativ, Laserablation, Mikrowelle [21,22,23,24]. Aufgrund geringer Toxizität gelten CQDs als mächtige Kandidaten für fluoreszierende Sonden. Zudem besitzen sie starke Manipulierbarkeit durch kontrollierbare chemische Reaktionen für diverse Anwendungen: biochemisch, photochemisch, Biosensing, Bioimaging, Drug Delivery [25,26,27] sowie Immunoassay-Detektion [28]. Frühere CQD-Synthese-Studien offenbarten Nachteile: teure Kohlenstoffquellen, toxische Chemikalien, nicht-selektive Prozesse [29]. Um dies zu begrenzen, nutzten Forscher Fruchtsäfte als neuartige, günstige Kohlenstoffquellen [30]. Da Fruchtsäfte keine optimale Ressourcennutzung bieten, wurden fluoreszierende CQDs kürzlich aus Fruchtschalen gewonnen [31]. Die Nutzung von Fruchtschalen bietet vielversprechende Route für umweltfreundliche, grüne CQD-Synthese.

Zinkoxid (ZnO) ist eines der wichtigsten, potenziell aktiven, stabilen und niedrig-toxischen Metalloxide, weit verbreitet in UV-Lasergeräten, Biomedizin, diversen Sensoren, Photokatalyse [32,33,34,35]. ZnO-Nanopartikel (ZnONPs) zeigen photolumineszente Eigenschaften im nahen UV- und Vis-Spektralbereich. Dies wird auf exzitonische Emission durch direkte Rekombination von Elektron-Loch-Paaren [36] oder grün-gelbe Emission bei 520 nm durch elektronischen Übergang vom Leitungsbandrand zu einem Fallenniveau zurückgeführt [37].

Generell sind Kohlenstoffpunkte amorphe oder nanokristalline quasi-sphärische Nanopartikel mit sp²- und sp³-Kohlenstoff, O/N-basierten Gruppen und post-modifizierten chemischen Gruppen. CQDs können mit höheren Wellenlängen anregen und die Effizienz kombinierter Oberflächen von Elektron-Loch-Paaren verändern sowie Quenching in Analysesystemen behandeln – was quantitative Biomolekül-Bestimmung erleichtert [38]. Sie können mit Metalloxiden wie TiO₂ und ZnO dekoriert werden zu optisch aktiven Nanokompositen für Biomarker-Detektion in menschlichem Serum. ZnO hat breite Bandlücke (3,37 eV), luminesziert in UV- und Blau-Bereich durch hohe Dichte von Defektniveaus in der Bandlücke [39]. Die Bildung von CQDs/ZnO-Nanokomposit erhöht Absorption im sichtbaren Licht durch Hybridisierung von ZnO mit CQDs; der Blaulicht-Shift der Lumineszenzabsorption auf 520 nm wird auf radiative Rekombination ionisierter O-Vakanzen zurückgeführt. Zusätzlich können bessere Elektron-Loch-Trennung und reduzierte interfaciale Elektronentransferzeit für höhere optische Leistung des hybridisierten CQDs mit ZnO-Nanopartikeln verantwortlich sein [40]. Der signifikante Anstieg von –OH*-Radikalen, generiert aus CQDs/ZnO-Nanokomposit an der Wasser-Grenzfläche, kann signifikante Erhöhung der Fluoreszenzsignale bewirken. Somit verbessert das kombinierte CQDs/ZnO-Nanokomposit die Modifikation optoelektronischer und photolumineszenter Eigenschaften der ZnO-Oberfläche und erzeugt starken Oberflächenfehler mit einstellbarer Photolumineszenz [41]. Zudem bieten CQDs, immobilisiert mit Bio-Erkennungsantikörpern zur Bildung von Antikörper-Antigen-Antikörper-FL-Sensorsystemen, eine lebensfähige Sonde mit hoher Spezifität und Sensitivität für Target-Analyte [42].

Die vorliegende Studie schlug ein neues, einfaches und ultrasensitives Immunoassay-Fluoreszenz-Sensorsystem basierend auf CQDs, dekoriert mit ZnO-Nanokomposit, zur Bestimmung des Tumor-Markers CYFRA 21-1 in menschlichem Serum vor. Citrus lemon-Schale diente als Kohlenstoffvorläufer für CQDs unter hydrothermalen Bedingungen. Zudem fungierte sie als Reduktions- und Stabilisierungsmittel für die Synthese des CQDs-konjugierten ZnO-Nanokomposits. Das hergestellte CQDs/ZnO-Nanokomposit wurde durch einen nicht-konjugierten monoklonalen BM 19.21-Antikörper (mAb) immobilisiert, und Mikrotiterwellen wurden mit einem weiteren monoklonalen KS 19.1-Antikörper beschichtet, um ein Sandwich-Capping-Immunsensorsystem zu bilden.

Methoden

Geräte

Spektrophotometrische Spektren von CQDs und CQDs/ZnO-Nanokomposit wurden mit Ultrospec 2100-Biochrom Spektrophotometer (Biochrom Ltd., Cambium, Cambridge, UK) aufgezeichnet. Oberflächenmorphologie und Partikelgrößenverteilung der grün synthetisierten CQDs und CQDs/Zn-Nanokomposits wurden mit Transmissionelektronenmikroskop (TEM) JEOL 1200EX (JEOL Ltd., Freising, Deutschland) und Rasterelektronenmikroskop (SEM) JSM-7610F (JEOL, USA) bewertet. Fluoreszenz- und Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR)-Spektren des Immunsensorsystems wurden mit Biotek Synergy H1 Multi-Mode-Reader (Biotek, Tokyo, Japan) und Perkin Elmer FT-IR-Spektrophotometer (PerkinElmer Ltd., Yokohama, Japan) geprüft. Raman-Spektren, Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Röntgenpulverdiffraktion (XRD) wurden mit Mikro-Raman-Spektrometer (CRAIC Technologies, CA, USA), Kratos Axis Ultra Röntgenspektroskopiesystem (Kratos Analytical Ltd., Manchester, UK) und Siemens D-5000 Diffraktometer (Siemens, Erfurt, Deutschland) gemessen.

Chemikalien und Reagenzien

SG-2000-10090 Gerät (Barsbüttel, Deutschland) lieferte das in allen Experimenten verwendete deionisierte Wasser. CYFRA 21-1-nicht-konjugierte monoklonale Antikörper (mAb) BM 19.21 und KS 19.1 für das Sandwich-Capping-Immunsensorsystem stammten von Abcam (Cambridge, UK). Citrus lemon-Früchte wurden von lokalen Märkten bezogen. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 wurde aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumhydroxid, Monokaliumphosphat, Dinatriumphosphat (BHD Ltd. Co., Poole, UK) hergestellt. Randox Laboratories (Nordirland-UK) stellte kommerzielle Normalseren bereit. Zufällige Blutproben wurden von gesunden Freiwilligen entnommen; vor Studienbeginn lag Einverständniserklärung vor. Sigma-Aldrich (Hamburg, Deutschland) lieferte reingradiges Carbodiimidhydrochlorid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Der Forschungsethikausschuss der King Saud University, KSA (KSU-REC-002-E, 2019) genehmigte die Studie.

Grüne hydrothermale Herstellung von Kohlenstoff-Quantenpunkten (CQDs)

Citrus lemon-Schale wurde zur CQD-Synthese unter hydrothermalen Bedingungen verwendet. Ca. 20 g Schale und 200 mL deionisiertes Wasser wurden in einen Rundkolben gegeben und bei 100 °C unter kontinuierlichem Magnetrühren 6 h refluxiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde der Extrakt bei 3500 rpm zentrifugiert, und 20 mL der oberen Extraktlösung wurden im Autoklaven unter hydrothermalen Bedingungen im Temperaturbereich 100–200 °C für 6–120 h erhitzt. Nach Abkühlung stellt der obere Überstand die CQDs dar (Schema 1).

Herstellung von Kohlenstoff-Quantenpunkt-Zinkoxid-Nanokomposit

Zur Herstellung des CQDs/ZnO-Nanokomposits wurde eine einfache chemische Reduktionsreaktion durchgeführt, wobei CQDs als Reduktions- und Stabilisierungsmittel dienten. 20 mL CQDs wurden zu 50 mL 5,0 × 10⁻² mol L⁻¹ Zinkacetat bei 60 °C unter kontinuierlichem Rühren 10 min gegeben. Bei Farbumschlag von gelblich zu cremefarben wurde die Mischung 30 min zur vollständigen Reduktion stehen gelassen und bei 4 °C gelagert. Zur Stabilitätsprüfung und Agglomerationskontrolle wurde UV-Vis-Spektrometrie zur Absorptionsaufzeichnung bei 390 nm über 20 Tage eingesetzt – hohe Stabilität, keine signifikante Absorptionsänderung.

Charakterisierung des CQDs/ZnO-Nanokomposits

Zur Bestätigung der Nanokompositbildung wurden verschiedene mikroskopische und spektroskopische Techniken eingesetzt. Uniformität und Oberflächenmorphologie von CQDs und CQDs/ZnO-Nanokomposit wurden mit Hochauflösungs-TEM (HRTEM) und SEM untersucht. Optische Spektren wurden mit UV-Vis, FT-IR, XPS und Raman-Spektroskopie analysiert. Kristallstruktur der CQDs wurde via XRD-Muster evaluiert.

Immobilisierungsprozess

Ein nicht-konjugierter monoklonaler BM 19.21-Antikörper wurde über eine einfache Peptidamidbindung zwischen Amin- und aktiven Carboxylgruppen auf der Oberfläche des synthetisierten CQDs/ZnO-Nanokomposits immobilisiert. Der Prozess: 5,0 mL jeweils equimolaren 3,0 × 10⁻³ mol L⁻¹ NHS und EDC zu 5,0 mL CQDs/ZnO-Nanokompositlösung unter Rühren 1 h. Ca. 5 mg nicht-konjugierter BM 19.21-Antikörper in 1,0 mL 0,01 mol L⁻¹ PBS (pH 7,4) gelöst und zugegeben. Nach Inkubation bei 37 °C für 12 h war der Antikörper immobilisiert (Schema 2). Spektrophotometrie bestätigte den Erfolg.

Allgemeines Prinzip der Immunoassay-Methode

Ein Sandwich-Capping-Antikörper-Antigen-Antikörper-System wurde mittels eines weiteren monoklonalen KS 19.1-Antikörpers erzielt, der die Mikrotiterwellenoberfläche beschichtete (Schema 3). Unter optimalen Immunoassay-Bedingungen wurde die CYFRA 21-1-Antigenkonzentration als Funktion der Fluoreszenzsignalintensitätszunahme bestimmt.

Immunosensing-Verfahren

Menschliche Serenproben stammten von zufälligen Freiwilligen. Vollständige Gerinnung vor Zentrifugation bei Raumtemperatur, Lagerung bei 4 °C. Spiking-Technik bereitete Standardproben mit CYFRA 21-1-Antigen im Konzentrationsbereich 0,01–500 ng mL⁻¹ vor. Ca. 50 μL gespikter Proben wurden in Mikrotiterwellen gegeben, mit 50 μL frisch verdünntem monoklonalem KS 19.1-Antikörper in PBS (pH 7,4) 30 min gemischt, dann 1 h bei 37 °C inkubiert (ungedeckt). Welleninhalt wurde ausgeschüttelt, Wellen 3× mit deionisiertem Wasser (300 μL/Well) gespült. Ca. 50 μL immobilisierter CQDs/ZnO-BM 19.21-Nanokompositlösung zugegeben, vorsichtig gemischt, 30 min bei 37 °C inkubiert. Proben wurden mittels Mikrotiterplatten-Reader fluoreszenzanalytisch untersucht (Intensitäten aufgezeichnet).

Ergebnisse und Diskussion

Morphologische Evaluation von CQDs und Nanokomposit

TEM charakterisierte Oberflächenmorphologie und CQD-Verteilung. Ca. 4 μL CQD-Suspension auf TEM-Kohlegitter gegeben. HRTEM-Bild (Abb. 1a) zeigte uniforme schwarze Punkte mit Gitterabstand (0,36 nm) – CQD-Bildung. Partikelgrößenverteilungsgraph (Abb. 1b): durchschnittliche Partikelgröße 1,5 ± 0,5 bis 5,0 ± 0,5 nm – Quantengröße bestätigt. Dynamische Lichtstreuung (DLS) ergab durchschnittliche Partikelgröße ~ 20 ± 0,2 nm. Unterschied zu HRTEM: HRTEM zeigt bei höherer Vergrößerung keine Kristallgitterstruktur aufgrund amorpher Natur [43]. Citrus lemon-Schale als natürlicher Kohlenstoffvorläufer liefert amorphe CQDs. Unterschiede in Partikelgrößenmessung auf Agglomeration, amorphe Natur, Messmechanismen und Hydrationsdynamik zurückzuführen.

CQDs/ZnO-Nanokomposit wurde per TEM und SEM untersucht. TEM-Bild (Abb. 2a): hexagonale Partikel an CQDs angeheftet – Nanokompositbildung. SEM: Probe mit Gold beschichtet (Elektronenabsorption/Charge-Vermeidung), Beschleunigungsspannung 15 kV, Vergrößerung × 30.000 (Abb. 2b).

UV-Vis- und Fluoreszenzspektren von CQDs: zwei signifikante Peaks bei 224 und 280 nm (π–π* und n–π* Übergang von C=C und C=O). Fluoreszenzspektrum: zwei Signale bei max. λ_ex = 360 nm, λ_em = 453 nm (Abb. 3a, b). UV-Vis-Spektrum von CQDs/ZnO-Nanokomposit: signifikante Absorptionspeak bei 370 nm mit Blau-Grün-Shift (Abb. 4a). Photolumineszenz (PL) von CQDs/ZnO-Nanokomposit: Größe und Oberflächenfehler beeinflussen Lumineszenz stark. Als Funktion der Anregungswellenlänge variierte PL-Emission von CQDs [38]. ZnO-Nanopartikel zeigten defekt-bezogene Emission im Blau-Grün-Bereich [41]. CQD-dekorierte ZnONPs ergaben exzellentes Nanokomposit für PL-Emission. Abb. 4b: PL-Spektrum mit Blaulicht-Shift, signifikantem Peak bei 520 nm nach Anregung 470 nm. Shift auf überlappende Energiebänder von CQDs und ZnONPs zurückzuführen – Defektemissionsniveau 2,1 eV.

Vergleichende FT-IR-Studie zur Bestätigung Nanokompositbildung und Immobilisierung mit BM 19.21-Antikörper. FT-IR von CQDs (Abb. 5a): Streckungsschwingungen bei 3462 cm⁻¹ (C–OH), 2932 cm⁻¹ (C–H); drei Absorptionsbänder bei 1749 cm⁻¹ (C=O), 1375 cm⁻¹ (C–N), 1246 cm⁻¹ (C–O–C). Neuer Peak bei 436 cm⁻¹ (Zn–O-Streckung) im Nanokomposit (Abb. 5b) – Reduktions-/Stabilisierungseigenschaften von CQDs durch –OH und COOH Gruppen (Elektronendonatoren, starke Affinität zur Nanokompositbildung). Immobilisiertes CQDs/ZnO-BM 19.21 (Abb. 5c): zwei neue Peaks bei 3254 cm⁻¹ (N–H-Streckung) und 1675 cm⁻¹ (C=O) – Peptidbindung bestätigt.

XPS-Spektren grüner CQDs (Abb. 6a): Funktionsgruppen bei 288 eV (C=O), 286 eV (COOH). Zwei signifikante Bindungsenergiepeaks bei 1044,4 eV (Zn 2p_1/2) und 1021,5 eV (Zn 2p_3/2) (Abb. 6b). Hochauflösendes XPS von CQDs/ZnO-Nanokomposit (Abb. 6c): Peaks bei 560 eV (O 1s), 385 eV (C 1s), 350 eV (Zn 3s), 246 eV (Zn 3p), 200 eV (Zn 3d) – ZnO auf CQD-Oberfläche bestätigt.

Vergleichende XRD-Muster (Abb. 7): CQDs zeigen breiten Peak bei 20° (2θ). CQDs/ZnO-Nanokomposit: scharfe Peaks bei 27°, 32°, 34°, 45°, 57°, 64°, 67°, 70°, 73°, 78°, 80° (2θ) für Zn (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112), (201), (004), (202) – ZnO-Verteilung auf CQDs bestätigt.

Raman-Spektren (Abb. 8): CQDs (Abb. 8a) – typische D- und G-Bänder bei 1300 und 1520 cm⁻¹ (sp³-Defekte, sp²-Ebenenschwingungen) [44]. I_D/I_G-Ratio = 1,02 ± 0,03. CQDs/ZnO-Nanokomposit (Abb. 8b): neue scharfe Peaks bei 440 und 520 cm⁻¹ (ZnO), typische CQD-Peaks bei 1364 und 1595 cm⁻¹. I_D/I_G = 1,2 ± 0,01 – Nanokompositbildung. Immobilisiertes CQDs/ZnO-BM 19.21 (Abb. 8c): zahlreiche Peaks als Bestätigung sekundärer/tertiärer Strukturen. Peaks 1007–1128 cm⁻¹ (sekundäre Antikörperstruktur), 550–682 cm⁻¹ (Disulfidkonformationen), 867–797 cm⁻¹ (Wasserstoffbrücken Tyrosinreste). Signifikanter Shift zu 1630 cm⁻¹ (tertiäre Struktur) [45]. I_D/I_G = 1,4 ± 0,04 – verbesserte kristalline Struktur durch Immobilisierung.

Optimierung der Fluoreszenz-Immunsensing-Bedingungen

Selektion und Optimierung durch Untersuchung verschiedener Parameter. Allgemein: Menge immobilisierten Nanokomposits, pH und Pufferkonzentration, Inkubationszeit zwischen Zielanalyt in Serumproben und Immunsensing-Reagenzien. Für optimale Menge immobilisierten CQDs/ZnO-BM 19.21-Nanokomposits: 10–100 μL getestet. Maximale Fluoreszenzintensität bei 50 μL (Abb. 9a). Vier PBS-Lösungen pH 7,2–7,5 getestet. Leichte Fluoreszenzänderung bei pH-Variation. pH 7,2 und 7,3: Signalabfall durch chemische Instabilität. pH 7,4 bis 7,5: Signalanstieg durch exzellente Interaktion monoklonaler Moleküle auf Nanokompositoberfläche (Abb. 9b). pH 7,4 optimal für Zielantigen-Aktivität (Zerfall bei pH > 7,5). Für weitere Studien pH 7,4 gewählt.

Einfluss PBS-Konzentration (0,01–0,05 mol L⁻¹) auf Fluoreszenzintensität: Maximum bei 0,01 mol L⁻¹. Höhere Konzentrationen: Aggregation immobilisierten Nanokomposits, Instabilität, Signalabfall (Abb. 9c). Immunreaktionszeit (10–60 min): Maximum Fluoreszenzintensität bei ≥ 30 min (Abb. 9d).

Analytische Quantifizierung

Unter optimierten Bedingungen: 12 Serenproben mit CYFRA 21-1 (0,01–500 ng mL¹). Kalibrationsgraph linear über 0,01–100 ng mL⁻¹, LOD 0,008 ng mL⁻¹. Gleichung: I_F = 7,933C + 181,24 (r² = 0,9992). Nach 6 Wiederholungen: %RSD = 1,3 %. Hohe Sensitivität der Immunosensing-Fluoreszenzmethode für CYFRA 21-1-Quantifizierung in Serenproben.

Systemtauglichkeit

Vergleichende Studie: vorgeschlagenes immobilisiertes CQDs/ZnO-BM 19.21-Immunsensing vs. vorherige Methoden. Vorteile: Einfachheit, umweltfreundlich, einfache Detektion in Serenproben. Hohe Sensitivität, breiter linearer Detektionsbereich 0,01–100 ng mL¹, niedrigere LOD 0,008 ng mL¹ (Tabelle 1).

Genauigkeit, Präzision und Selektivität

Genauigkeit: 12 Serenproben getestet, Vergleich mit vorher berichteter Technik [6] (Elektrochemilumineszenzassay mit Tris(2,2′-bipyridyl)ruthenium(II)-Komplex, Anregung durch Tripropylamin). Akzeptable Ergebnisse (Tabelle 2). Intra-Day und Inter-Day-Assay für Präzision: Serenprobe mit 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1. Mittlere relative Standardabweichungen: 1,1 % (Intra-Day), 1,3 % (Inter-Day) – hohe Präzision.

Selektivität: Störsubstanzen getestet – Aminosäuren (Cystein, Lysin, Serin, Tyrosin, Glycin), Kationen (K⁺, Na⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺), andere Biomarker (CA 15-3, CA 27-29, CA 19-9, CA 125). Optimum-Bedingungen, menschliches Serum mit 10 ng mL⁻¹ CYFRA 21-1 + 10 ng mL⁻¹ Koexistenzspezies. Relative Prozentfehler (Er%) ≤ ± 5 % für jede Störspezies (Tabelle 3). Toleranzwerte (F-F⁰/F⁰) < 5 %. Hohe Selektivität für CYFRA 21-1-Bestimmung in menschlichem Serum.

Analyse realer Proben

In echten menschlichen Proben: Detektion und Quantifizierung von CYFRA 21-1 (% Recovery). Wie im Immunosensing-Verfahren: Beziehung Fluoreszenzintensität vs. CYFRA 21-1-Konzentration. Zielantigen-Mengen (0,5, 1,0, 2,0 ng mL⁻¹) zugegeben, Signalintensitätsanstieg evaluiert. Nach 6 Bestimmungen: % Recovery 96,7 ± 0,7 bis 100,0 ± 1,3 %. %RSD 0,2–1,4 %. Vergleich mit vorheriger Methode [6]: % Recovery 96,1 ± 1,6 bis 100,0 ± 0,4 %, %RSD 0,3–1,7 %. Statistischer Vergleich (Student's t-Test, F-Test [46]): t-Test 0,354–2,181 (tabelliert 2,228)*, F-Test 1,16–4,0 (tabelliert 5,05)* bei P = 0,05. Gute Übereinstimmung zwischen vorgeschlagener und veröffentlichten Methoden. Alle detektierten CYFRA 21-1-Mengen im Normalbereich – kein Lungenkrebs in untersuchten Serenproben.

Fazit

Die Studie befasste sich mit grüner Synthese von CQDs konjugiert mit ZnO-Nanokomposit unter Verwendung von Citrus lemon als Vorläufer. CQDs/ZnO-Nanokomposit bildete neues Fluoreszenz-Immunsensorsystem durch Immobilisierung monoklonalen BM 19.21-Antikörpers via Peptidbindungen. Hochsensitives Fluoreszenzsystem bestimmte Lungenkrebs-Tumor-Marker (CYFRA 21-1) in menschlichem Serum. CYFRA 21-1-Antigen via Sandwich-Capping-Antikörper-Antigen-Antikörper-Reaktion mit monoklonalem KS 19.1-Antikörper auf Mikrotiterwellen. Einzigartige Eigenschaften und hohe Sensitivität ermöglichen Bestimmung des Ziel-Tumor-Markers mit hoher Stabilität und Reproduzierbarkeit. Vergleichende Studie bestätigte Tauglichkeit und hohe Sensitivität des Immunsensorsystems, Ergebnisse stimmten mit konventioneller Technik überein.