Entwicklung der Hyperthermie-Dosis von NIR-bestrahlten Cs0.33WO3-Nanopartikeln für HepG2-Leberkrebszellen

Einführung

Im Jahr 2018 forderten schwere Krebserkrankungen weltweit etwa 10 Millionen Menschenleben und kamen schätzungsweise 18 Millionen neue Fälle hinzu [1]. Obwohl Chemotherapie, Bestrahlung, chirurgische Entfernung oder maßgeschneiderte Kombinationen dieser drei bisher für eine Verbesserung der 5-Jahres-Überlebensrate von etwas mehr als 40 % der behandelten Krebspatienten verantwortlich sind [2, 3], ist die toxische und schädliche Natur von Chemikalien und ionischen Bombardements verursachen unweigerlich zahlreiche Nebenwirkungen wie Haarausfall, Kardiotoxizität, Unfruchtbarkeit, Chromosomenanomalien und vieles mehr [4, 5]. Solche lebensbedrohlichen Folgen haben die Entwicklung einer patientenfreundlichen therapeutischen Medizin, einschließlich Verbindungen mit Nanopartikeln, dringend vorangetrieben.

Nanotechnologie auf der Grundlage eigentümlicher Materialsysteme, Strukturen, Form und atomarer Stöchiometrie auf einer Größenskala unter 100 nm liefert beispiellose chemische, physikalische und biochemische Eigenschaften, die durch Quantisierungsphänomene verbessert werden, und hat bereits präklinische und in vitro-Anwendungen in vielen Bereichen der Forschung gefunden biomedizinische Wissenschaft [6, 7]. Trotz der Nachteile der Chemotherapie verbessern NPs als Transportträger die Selektivität der Wirkstofffreisetzung im erkrankten Tumor, erleichtern die Wirkstoffaufnahme durch die Tumorzellen und reduzieren die kumulative Toxizität im gesunden Gewebe weitgehend [8, 9]. Auch die Bildqualität, die von einer Reihe von NP-basierten Bildgebungsmodalitäten erzeugt wird, wird durch höhere Empfindlichkeit, feinere räumliche Auflösung und bessere Tiefenpenetration erheblich verbessert, um die Bioverteilung aufzudecken, die Medikamentenaufnahme zu überwachen, den Tumor zu lokalisieren und die Wirksamkeit der Behandlung zu bewerten [10]. Zusätzlich zu der diagnostischen Funktion können die NPs, wenn sie mit inhärenten physikalischen Eigenschaften wie Radiofrequenz (RF)-Ablation oder photothermisch erzeugte Hyperthermie genutzt werden, mit verbesserter Effizienz weitere Schäden an der gewünschten Stelle verursachen [11,12,13], von denen die zweite ist im Allgemeinen der ortsspezifischen Dosierung vorzuziehen, da sie weniger Schmerzen, geringe Nebenwirkungen und ein stark reduziertes Risiko von Gewebeverbrennungen aufweist.

Zu den NP-Materialsystemen, die bei Bestrahlung mit Licht eine Hyperthermie induzieren können, gehören bisher Gold (Au), Cäsiumwolframat (CsWO₃ ), Eisenoxid, Kupfersulfid, Graphen und Kohlenstoffröhre und demonstrierten die Anwendbarkeit tödlicher Schäden an Krebszellen durch Erhöhung der extrazellulären oder intrazellulären Temperatur in situ [14,15,16,17,18]. Wie bei der NP-verstärkten HF-Ablation ist die Höhe der einfallenden Leistungsdichte photonischer Quellen ein kritischer Punkt für die klinische Sicherheit und den Patientenkomfort [11], und es zeigt sich, dass der maximale Expositionsgrenzwert für die menschliche Haut im Bereich von VIS und Die NIR-Wellenlänge zwischen 400 und 980 nm liegt zwischen 0,2 und 0,726 W/cm ² laut der Internationalen Kommission für den Schutz vor nichtionisierender Strahlung (ICNIRP) aus dem Jahr 2013 [19]. Nichtsdestotrotz lagen die meisten der optischen Leistungsdichten, die aus früheren In-vitro-Krebszellstudien berichtet wurden, weit über der Sicherheitsgrenze für Hautgewebe, was bei der Behandlung von inneren biologischen Geweben mit einer niedrigen Lichtschwelle für Lichtbestrahlung eine ernste Angelegenheit sein kann Verletzlichkeit. Beispielsweise reicht die optische NIR-Leistungsdichte von Gold(Au)-NPs, die eine wirksame Zerstörung von Krebszellen gezeigt haben, von 2 bis 80 W/cm ² wenn nicht länger als 10 min (min) bestrahlt [13, 14, 20, 21, 22]. Ebenso eine Reihe anderer Materialsysteme wie Graphenoxide [18], Eisen-Platin (FePt) [23] und NaYF₄ :Yb,Er-Nanokristalle [24] erforderten nicht weniger als 150 mW/cm ² für einen instrumentellen Einsatz.

Da es sich um ein relativ wenig erforschtes Material für In-vitro-Experimente handelt, berichteten einige Studien über die Vernichtung von Gebärmutterhalskrebszellen (Hela) durch NIR-bestrahltes CsWO₃ NPs mit mindestens 0,72 W/cm ² [15, 25, 26], das sich in der Nähe des von ICNRP festgelegten Expositionsgrenzwerts der NIR-Wellenlänge des Hautgewebes befindet und bei längerer Exposition schädliche Auswirkungen auf gesundes Gewebe haben kann [19]. Darüber hinaus lag die Temperatur der Kulturmedien, die durch die Kombination von Behandlungsdosis der NP-Konzentration, Dauer der Belichtung und optischer Intensität erzeugt wurde, in früheren Studien weit über 40 °C, was für gesunde menschliche Zellen nicht tolerierbar ist, und die Sterblichkeitsraten der Krebszellen wurden nicht im Detail beschrieben.

CsWO₃ NP ist im Bereich der NIR-Wellenlänge von 800 nm bis 2400 nm außergewöhnlich absorptiv [27] und eignet sich funktionell für biomedizinische Anwendungen. Trotz der nachgewiesenen herausragenden Wirksamkeit bei der Eliminierung von Krebszellen ist die Zytotoxizität noch weitgehend unbekannt und die Bereitstellung einer Dosierungsformel der NP-Konzentration mit niedriger Zytotoxizität, kurzer Bestrahlungsdauer und optischer Leistungsdichte innerhalb der Grenzen der sicheren Photoexposition für Hautgewebe ist fehlt noch.

Die vorliegende Forschungsstudie versucht, in vitro die Machbarkeit der Vernichtung von HepG2-Leberkrebszellen zu bewerten, die in einer Petrischale mit einem Durchmesser von 5,2 cm kultiviert wurden, unter Verwendung der nicht-zytotoxischen NP-Konzentration und der optischen Leistungsdichte innerhalb der Belichtungsgrenze des Hautgewebes unter Beibehaltung der Temperatur des Zellkulturmediums bei normaler menschlicher Körpertemperatur von 36,5 °C. Im Detail Cs_0.33 WO₃ NPs mit einer durchschnittlichen Strukturgröße von etwa 120 nm wurden mithilfe einer Abfolge von Redox-, thermischen Glüh- und Nassschleifprozessen synthetisiert und mit ihrer Oberflächenmorphologie, Kristallinität sowie optischen und zeitlich photothermischen Eigenschaften charakterisiert. Darüber hinaus wurden die photothermischen Auswirkungen variabler Dosisparameter, Bestrahlungsdauer, Konzentration der NPs und optische Leistungsdichte der NIR-Bestrahlung bei der zentralen Wellenlänge von 980 nm auf die Überlebensrate der HepG2-Krebszellen untersucht und als bewertet eine Kombination aus Sicherheitsbehandlungsdosis entwickeln.

Methoden

In dieser Forschung wurde die 102. Generation der HepG2-Leberkrebszelllinie, die aus einem menschlichen Primärtumor stammt, als experimentelles Modell kultiviert, um die Zytotoxizität zu bewerten, die durch das NIR-bestrahlte hausgemachte Cs_0.33 . verursacht wird WO₃ NPs und bewerten Sie die therapeutische Wirksamkeit verschiedener thermischer Dosen innerhalb der Sicherheitsgrenze für die Exposition von Hautgewebe und bei einer nicht-toxischen NP-Konzentration.

Synthese von Cs _0,33 WO ₃ NPs

Das linke Feld von Fig. 1 zeigt das schematische Flussdiagramm des Syntheseverfahrens für Cäsiumwolframoxid (Cs_0,33 WO₃ ) NP-Material. Kurz gesagt, die Vorläuferchemikalien ((NH₄ )₂ WO₄ ) (Alfa Aesar, 99,9 % Reinheit) und CsCl (Alfa Aesar, 99,9 % Reinheit) wurden getrennt in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und dann bei 25 °C unter konstantem Rühren mit 250 Umdrehungen pro Minute (U/min) unter Verwendung von a . zusammengemischt magnetisch betätigter Spinner für eine Stunde (Std.). Nachdem das Rühren beendet war, wurde die Temperatur des die Mischungslösung enthaltenden Bechers auf 180 °C eingestellt und gebrannt, bis der Wassergehalt der Lösung vollständig verdampft war. Das resultierende getrocknete weiße Pulver war der letzte Vorläufer von Cs_0.33 WO3-Material. Bei eingeschaltetem Kühler wurde das Vorläuferpulver enthaltende Quarzschiffchen in die Mitte eines Hochtemperatur-Ofenrohrs geladen und der Druck im Inneren des Ofenrohrs auf 0,08 Torr gebracht. Anschließend wird die Vorstufe auf eine Temperatur von 500 °C erhitzt, während gleichzeitig eine Einströmung einer Kombination von Gasen, H₂ ., eingeleitet wird und N₂ , in einem Verhältnis von 90 bis 10 Standardkubikzentimeter pro Minute (SCCM), um die Redoxreaktion zu erleichtern. Nach 1 h Einlass von H₂ Gas wird abgeschaltet, der Fluss von N₂ Gas wird auf 100 SCCM eingestellt und die Temperatur des Ofens wird für eine Stunde thermisches Glühen auf 800 °C erhöht. Nachdem die Prozesse abgeschlossen waren, wurden der Kühler und der temperaturgeregelte Ofen abgeschaltet, und das Quarzschiffchen wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und aus dem Ofenrohr entfernt. Das resultierende dunkelblaue Pulver, das aus dem Quarzschiffchen gewonnen wird, hat die Größe Cs_0,33 . im Mikrometerbereich (µ). WO₃ Pulver. Um die Merkmalsgröße der Pulvergranulate weiter zu verkleinern, 150 g einer Mischlösung bestehend aus 15 g des µ-Pulvers, 3,8 g eines Dispergiermittels auf Copolymerbasis zur Verhinderung der Aggregation der Partikel, 10 μl Antischaummittel und DI Wasser wurde hergestellt, in eine Probenschüssel gegossen, die 600 g Zirkonoxidkügelchen enthielt, und in die Kammer einer Nanogrinder-Ausrüstung (Justnanotech Co., Taiwan) montiert. Bei einer Geschwindigkeit und Temperatur von 2400 Umdrehungen pro Minute (RPM) und 15 °C werden die NPs durch Mahlen des µPulvers mit 0,1 mm ZrO₂ . hergestellt Perlen für 4 h und mit 0,05 mm ZrO₂ Perlen für weitere 4 h. Die Gesamtdauer jedes Mahlvorgangs darf 4 h nicht überschreiten, um eine übermäßige Flüssigkeitsviskosität sowie eine sprunghafte Änderung der physikalischen Größen des Materials zu vermeiden. Die endgültige Lösung nach dem Mahlprozess wurde für alle nachfolgenden Charakterisierungen und Experimente durch einen 0,22-μm-Porenfilter gesiebt. Die Fluoreszenzversion von Cs_0.33 WO₃ NPs (fNPs) wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls hergestellt. Eine Lösung aus 2 ml Fluorescein in einer Konzentration von 28 mg/ml und 2 ml Cs_0.33 WO₃ NP-Lösung mit 1,5 mg/ml wurde in einem Becherglas hergestellt und für 15 Minuten in die Schüssel eines Ultraschallschüttlers gegeben. Anschließend wurden die NP-Lösung und das Dispergiermittel im Verhältnis 1:1,25 gemischt und 15 min einem Ultraschall-Schütteln unterzogen. Die resultierende Lösung wurde dann mit D.I. Wasser und zentrifugiert bei 10.000 U/min für 15 Minuten. und vor jeder Verwendung zweimal wiederholt.

Schematische Darstellung experimenteller Verfahren zur Materialsynthese, zellulären Inkubation mit NPs und photothermischem Assay an den Krebszellen. BCL, TEn und PD sind die Abkürzung für bikonkave Linse, Thermal Enclosure bzw. Petrischale; der rote Pfeil zeigt den Ort für die Strahlprofilmessung an

Materialcharakterisierung

Danach die Charakterisierung von Cs_0.33 WO₃ NPs einschließlich statistischer Strukturgrößen, Kristallstruktur, Strukturmorphologie, Konturform, VIS-NIR-Photoabsorption wurden mit Zetapotentialanalyse (ZS90, Malvern, UK), XRD (D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Deutschland), SEM . durchgeführt (SU-5000, Hitachi, Japan) in Verbindung mit eingebauter energiedispersiver Spektrometrie (EDS), TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan), dynamische Lichtstreuung (DLS) (Delsa Nano C, Beckman Coulter, USA) , UV-VIS-NIR-Spektrometer (V-750, Jasco, Japan). Die XRD-Spektren wurden durch Abtasten der Röntgenstrahlen auf den Proben innerhalb einer Winkelspanne von 20° bis 80° mit einer Abtastrate von 4° pro Minute aufgenommen. Das Signal der rasterwinkelabhängigen Beugung der Probe wurde bestimmt und mit dem Standard-XRD-Spektrum von Cs_0.32 . verglichen WO₃ vom Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) Karte Nr. 83-1334. Um die zeitliche Abhängigkeit der photothermischen Eigenschaft des NP zu bestätigen, wurde eine einfache experimentelle Apparatur bestehend aus einem NIR-Laser mit einer Wellenlänge von 980 nm und einer Temperaturmesssonde aufgebaut, um den Temperaturzustand zu untersuchen, der durch die NIR-bestrahlte Lösung erzeugt wird. Die Prüfungslösungen umfassen die D.I. mit Wasser verdünnte NPs-Lösung und die Mischung aus NPs-Lösung in Zellkulturmedien. Der Durchmesser des optischen Strahls für Proben in den Petrischalen wurde erweitert, um die gesamte Oberfläche der Petrischale abzudecken, was 0,05 W/cm ² . erzeugt in der geschätzten optischen Leistungsdichte, ansonsten unverändert bei 2 W/cm ² . Ein auf dem rechten Feld von Fig. 1 gezeigter optischer Aufbau wird verwendet, um eine NIR-Bestrahlung durchzuführen. Das Herzstück des optischen Systems ist ein NIR-Laserstrahl, der auf eine bikonkave Linse gerichtet ist, die den Strahldurchmesser von 4 mm auf 5,2 cm erweitert, was dem Oberflächendurchmesser einer Petrischale entspricht, die auf einer auf 36,8 ° . eingestellten Heizplatte gestellt wird C, was eine physiologische Temperatur für das Zellwachstum ist; Außerdem ist die Petrischale von einem zylindrischen Kunststoffgehäuse umgeben, um die Temperatur der Umgebung und des Mediums auszugleichen. Zusätzliche Datei 1:Abb. S1 zeigt die Abbildung der optischen Intensität des NIR-Laserstrahls, gemessen am Austritt der Strahlapertur, die in Abb. 1 durch einen roten Pfeil neben dem Laserstrahl angezeigt wird. Das Strahlprofil zeigt eine 3D-Verteilung von optische Intensität und überprüft die Gleichmäßigkeit des Lichtfeldes über die gesamte Öffnung der Petrischale.

Zytotoxizität und photothermische Assays

Um die Zellkultivierungszyklen zu beginnen, 500 ml Mediumlösung bestehend aus 440 ml Ham's Nährmischung F-12 und Dulbecco's modifiziertem Eagle's Essential Medium (HDMEM), 50 ml fötalem Rinderserum (FBS), 5 ml L-Glutamin und 5 ml P/S (Penicillin-Streptomycin), das durch einen Maschenfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm sterilisiert wurde, wurden hergestellt. Die zellhaltigen Petrischalen, 10 cm bzw. 5,2 cm Durchmesser, entsprechend mit 8 ml und 2 ml des Mediums gefüllt, wurden zur Primär- und Subkultivierung verwendet und in einem mit 5 % CO_{2 und bei der Temperatur 37 ̊°C. Die Beobachtung des Zellwachstums und eine Erneuerung des Kulturmediums erfolgten alle zwei Tage.}

Um die Überlebensraten für die Fälle von Zellassays zu erhalten, die (1) Kontrolle ohne externen Input, (2) alleinige NIR-Bestrahlung, (3) Inkubation mit NPs und (4) Inkubation mit NPs neben einer NIR-Nachbestrahlung umfassen, Das Kulturmedium in der Kulturschale wurde abgesaugt, und 0,4 ml Trypsin werden in die Kulturschale gegeben und für etwa 10 Minuten in den Brutschrank gestellt. Sobald die Ablösung der Zellen von den Schalenwänden bestätigt wurde, wurden 10 μl des zellhaltigen Mediums aus der Kulturschale entnommen und zu 10 μl Trypanblau-Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, und die restlichen schwimmenden NPs wurden durch mehrere entfernt Waschzeiten mit Phosphatpufferlösung (PBS). Danach wurde die Zellzählung durchgeführt, indem eine Zählplatte mit 10 μl der gefärbten Zelllösung durch ein Injektionsloch gefüllt wurde, und die Zellen können in der Brennebene eines Stereomikroskops beobachtet und mit einem manuellen Zähler gezählt werden; jeder in allen Abbildungen dargestellte Datenpunkt zur Zellüberlebensrate war ein Durchschnitt von drei experimentellen Versuchen (N = 3) plus der Standardabweichung.

Zur Vorbereitung der Bewertung der Zytotoxizität des NP und seiner photothermischen Auswirkungen auf die zelluläre Überlebensrate wurde das Medium in der 5,2 cm-Schale entfernt und mit der richtigen Menge an NP-Lösung im neuen Medium aufgefüllt, um eine Reihe von Testkonzentrationen zu erhalten. 2 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1 mg/ml und 0,5 mg/ml und dann einen Tag vor dem Experiment inkubiert.

Vor dem photothermischen Assay wurde die Zytotoxizitätsbewertung durchgeführt, um die Reaktion der Zellen auf eine Reihe von NP-Konzentrationen zu untersuchen, und wurde wie folgt durchgeführt. Das die Zellen und NPs enthaltende Medium wurde aus dem Inkubator entnommen und abgesaugt. Ein Milliliter vorgewärmtes PBS wurde verwendet, um die Krebszellen zu waschen und restliches schwimmendes CsWO₃ . abzusaugen NPs, die keiner Endozytose unterzogen wurden, deren Vorgang mehrmals wiederholt wird, um sicherzustellen, dass keine potenzielle Zellsterblichkeit durch den NP-induzierten Temperaturanstieg im neuen Medium verursacht wird. Nach der photothermischen Behandlung wurde dann das Zählverfahren für die Zytotoxizität und den photothermischen Assay an den Zellen durchgeführt.

Ergebnisse

Die optische Extinktion und die photothermischen Eigenschaften von Cs_0,33 WO₃ Nanomaterialien hängen stark von der kristallinen Struktur, der Temperatur nach dem Tempern, der atomaren Stöchiometrie und den Partikelstrukturgrößen ab [28, 29].

Zur Charakterisierung der Oberflächenmorphologie des Cs_0.33 WO₃ µPulver wurden SEM-Bilder mit 10.000-facher Vergrößerung zur visuellen Bestätigung der ikonischen Struktur des säulenförmigen Sechsecks aufgenommen, die in Abb. 2a durch einen roten Pfeil gekennzeichnet ist. Darüber hinaus zeigen die TEM-Bilder die Konturform und die Merkmalsgrößen des µ-Pulvergranulats in Abb. 2b, wobei seine Merkmalsgröße etwa 1 μm oder weniger beträgt. Die stabförmige Geometrie der NPs und das DLS-Verteilungshistogramm der nanoskaligen Strukturgröße um 120 nm zentriert wurden ebenfalls verifiziert und sind in Abb. 2c und dem entsprechenden eingefügten TEM-Bild dargestellt. Auch die kristalline Charakterisierung des µ-Pulvers und der NPs mit XRD ist in Abb. 2d dargestellt. Wie aus dem XRD-Spektrum des µ-Pulvers auf dem oberen Feld ersichtlich ist, sind die ikonischen Kristallisationsebenen entlang (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220 ), (222), (204), (400) und (224) stimmen gut mit dem Standardspektrum von Cs_0.32 . überein WO₃ vom Joint Committee on Powder Diffraction Standards (JCPDS) Karte Nr. 83-1334. Wenn die Strukturgröße von µPulver auf 120 nm reduziert wird, werden die Intensitäten aller Beugungspeaks monoton reduziert und einige charakteristische Peaks, die auf eine starke NIR-Absorption hinweisen, wie die Ebenen (102) und (220), werden im Spektrum unsichtbar in den Schatten gestellt. Ebenso bestätigt die in Abb. 2e gezeigte Identifizierung der atomaren Bestandteile Cäsium (Cs), Wolfram (W) und Sauerstoff (O) nicht nur seine atomare Anwesenheit, sondern bestätigt auch das Verhältnis der Atomprozentsätze von Cs zu W, 0,315 , die der ursprünglich entworfenen Stöchiometrie sehr ähnlich ist.

Physikalische und materielle Charakterisierung. a SEM und b TEM-Bilder des µPulvers, c DLS-Verteilungshistogramm der NP-Merkmalsgröße, d XRD-Spektren von µPulver und 120 nm-NPs und e Dargestellt sind EDS-Spektren mit Prozentanteil der Atomzusammensetzung. Die Skalenbalken in a , b , c sind 1,5 μm, 200 nm bzw. 100 nm

Neben der Materialcharakterisierung wurden die optischen Absorptionsspektren der NPs und die photothermische Temperaturmodulation im Zeitverlauf gemessen und sind in Abb. 3 dargestellt. In (a, b) die Abhängigkeit der NIR-Absorption und die Profile des durch NIR . induzierten Temperaturanstiegs -bestrahlte NP-Lösung als Funktion der NP-Konzentration dargestellt, wobei die Temperaturkurve im Zeitverlauf von 1 mg/ml beispielsweise 40 °C überschreitet und mindestens 1 h konstant bleibt, was die photothermische Stabilität und Haltbarkeit der Materialien bestätigt. . Ebenso veranschaulicht das Temperaturprofil im Zeitverlauf in Abb. 3c 5 sich wiederholende Zyklen innerhalb von 190 Minuten, wodurch die photothermische Reaktionsfähigkeit des NP-Materials bestätigt wird. In Abb. 3d stabilisieren sich die zeitlichen Temperaturprofile des Kulturmediums und des NP-inkorporierten Kulturmediums, die aus dem Inkubator entnommen, auf die Heizplatte gestellt und einer NIR-Bestrahlung unterzogen wurden, im Verlauf von 10 Minuten bei etwa 37 °C, und die Temperatur der NIR-bestrahlten reinen NP-Lösung steigt von 24,6 °C auf 33,6 °C nach 10 min. Dabei wurde unter Berücksichtigung der photothermischen Funktionalität des NP die NIR-Bestrahlung für das folgende Experiment für 10 min, 30 min und 60 min durchgeführt, wodurch die Robustheit der NPs während der experimentellen Sitzung erhalten blieb und potenziell auf präklinische Studien anwendbar ist.

Optische und photothermische Eigenschaften. a Optische Absorptionsspektren und die Profile der Temperatur im Zeitverlauf einer NIR-bestrahlten NP-Lösung in b , c eine Küvette und in d eine Petrischale abgebildet. Ex symbolisiert die Profile von strahlaufgeweiteten Fällen; NP-Konzentration von 1,5 mg/ml und optische Leistungsdichte von 50 mW/cm ² wurden verwendet in (d ); die Dauer der NIR-Bestrahlung pro Zyklus in c beträgt 15 Minuten

Anschließend wurde die nicht-toxische Dosis experimenteller Parameter, einschließlich der Dauer der NIR-Bestrahlung und der NP-Konzentration, durch Bestrahlung der Zellen für 1 h und 2 h mit 50 mW/cm ² . bestimmt und durch direkte Wechselwirkung mit den NPs mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml und 2 mg/ml, die in Abb. 4a bzw. b dargestellt sind. Die Zellüberlebensrate bleibt im Verlauf von 2 h NIR-Bestrahlung deutlich über 95 %, was die Untoxizität der Zellen für eine langfristige Exposition gegenüber dem 980-nm-Photon sowie die nicht-toxische NP-Konzentration unter 1,5 mg . bestätigt /ml wurde bestimmt.

Zytotoxizitätstest experimenteller Parameter. Die Überlebensrate von HepG2-Zellen bei Dosierung mit a die Dauer der NIR-Bestrahlung, b 120-nm-NPs verschiedener Konzentration werden vorgestellt. Die Dauer der NP-Inkubation betrug einen Tag; die Standardabweichung von drei experimentellen Versuchen (N = 3) für jeden Datenpunkt wird angezeigt

Der Zweck der Dosierung der Krebszellen von 1,5 mg/ml oder weniger, die kaum eine schädliche Wirkung auf HepG2-Zellen hat, besteht darin, die Auswirkungen der photothermischen Dosis auf die Krebszellen zu untersuchen, ohne die inhärente Toxizität des NP zu implizieren. Um zu untersuchen, ob die NIR-bestrahlten NPs eine praktikable Lösung zur Eliminierung von Krebszellen sein können, wurden die Zellen einen Tag lang mit NPs bei 1,5 mg/ml inkubiert und anschließend 1 h lang der NIR-Strahlung ausgesetzt. Wie aus den optischen Hellfeld-(BF)-Bildern der Abb. 5d–f ersichtlich ist, wird die Anzahl der Zellen deutlich reduziert, wenn die Belichtungszeit 1 h (e) oder 2 h (f) beträgt. Quantitativ sinkt die Überlebensrate mit zunehmender Bestrahlungsdauer von 10 min monoton von 84,2 % auf 58,4 %. bis 1 h, und eine lineare Trendlinie passt gut zu den gestreuten Datenpunkten, die 20 % der Überlebensrate vorhersagt, wenn die Bestrahlung 2 h dauert. Darüber hinaus zeigt Abb. 5h, dass die Überlebensrate für eine Stunde Bestrahlung von 73 auf 58 % sinkt, wenn die optische Leistungsdichte von 12,5 auf 50 mW/cm ² . steigt , um die Funktionalität der NIR-bestrahlten NPs als photothermischer Auslöser bei der Zerstörung von Krebszellen zu ermitteln.

Photothermischer Test. Die Überlebensrate von HepG2-Zellen bei Dosierung mit einer NP-Konzentration von 1,5 mg/ml neben NIR-Bestrahlung. Die jeweiligen Skalenbalken auf der a –c oben und d –f Die unteren Reihen der optischen BF-Bilder sind 200 μm und 100 μm groß. Die Standardabweichung von drei experimentellen Versuchen (N = 3) für jeden Datenpunkt wird angezeigt

Darüber hinaus wurde die Ungewissheit darüber, ob eine solche photothermische Wirkung auf intrazellulärem oder extrazellulärem Weg auftrat, durch die Herstellung der fNPs, die Durchführung des gleichen Wasch- und Inkubationsverfahrens und die Beobachtung jeglicher intrazellulärer Anwesenheit der fNPs angegangen. Abbildung 6 veranschaulicht konfokale BF- (b, e) und Fluoreszenz- (a, d) Bilder und ihre überlagerten Zusammensetzungen (c, f) der Zellen, die mit und ohne fNPs inkubiert wurden. Offensichtlich zeigen die Zellen ohne Inkubation von fNPs als Kontrolle eine vernachlässigbare grüne Fluoreszenz, die hauptsächlich der zellulären Autofluoreszenz zugeschrieben wird, und steht in scharfem Kontrast zu dem Experiment, bei dem die Verteilung der grünen Fluoreszenz im gesamten Zytoplasma im Bild allgegenwärtig ist. Die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten in den Bildern der Kontroll- und Versuchsproben wurden ebenfalls quantifiziert und sind im Histogramm von Abb. 6g dargestellt, wo die Fluoreszenz von fNPs, die einer Endozytose unterzogen wurden, mindestens neunmal so stark ist wie die der Kontrolle.

Optische konfokale Bilder. Die a , d Fluoreszenz, b , e BF und c , f zusammengesetzte optische Bilder der mit und ohne fNPs inkubierten HepG2-Zellen als entsprechende Versuchs- und Kontrollgruppen sind in der a dargestellt –c oben und d –f untere Reihen neben g ein Histogramm der durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten. Maßstabsbalken repräsentieren 20 μm; die Laseranregungswellenlänge beträgt 488 nm

Diskussion

Das Konzept der therapeutischen Hyperthermie mit elektromagnetischen Wellen zur Heilung von Krebserkrankungen stammt bereits aus den frühen 1900er Jahren und war erfolgreich bei der Behandlung einiger Formen von Malignomen, wurde jedoch aufgrund der Nützlichkeit fiebererzeugender antibakterieller Mittel und des Fehlens präziser Zugänglichkeit zu lokalen Tumoren von Interesse in situ [30]. Erst in den 1980er Jahren wurde das Interesse durch mehrere In-vitro-Studien wiederbelebt, die viele Aspekte von Stoffwechselveränderungen, Veränderungen der Tumormikrozirkulation und Acidolyse nach Hyperthermiebehandlung mit tödlichen Auswirkungen auf die Krebszellen entdeckten [31]. Neben der direkten Zytotoxizität, bei der Krebszellen eine Nekrose mit abnehmender Apoptose eingehen, wenn die angewendete Temperatur> 42 °C beträgt, macht die verringerte Blutflussrate in Verbindung mit einer geringeren Kühlfähigkeit und einem niedrigen pH-Wert (< 6,8) die Krebszellen mechanistisch anfälliger für Erwärmung und folglich eine höhere Zelltötungsrate [32, 33]. Aufgrund des jahrhundertealten Nachteils der ungenauen unspezifischen Lokalisation zeigte die Hyperthermie jedoch klinisch nur eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit, wenn sie gleichzeitig mit Chemo- oder Strahlentherapien angewendet wurde [34, 35].

Die NP-basierten Materialien, die ein präzises Targeting und Monitoring ermöglichen und eine breite Palette physikalischer Eigenschaften wie Oberflächenladung, Fluoreszenz, photothermische Umwandlung aufweisen, passen gut in die Nische dieser Unpräzision bei Hyperthermieanwendungen. Trotz der nachgewiesenen Nützlichkeit vieler NIR-bestrahlter NP-Materialien in Krebszellstudien wird die Sicherheitsgrenze der Photobelichtung jedoch oft nicht gut untersucht, wie im Fall von CsWO₃ NPs. CsWO₃ NPs haben jedoch, wie in Abb. 4b gezeigt, mit 1,5 mg/ml eine relativ niedrige Zytotoxizität im Vergleich zu einer Handvoll gängiger NP-Materialien wie Ag, Au, Graphen, deren Schwellenwerte im Bereich von 1 μg/ml liegen [ 18, 36, 37], benötigt immer noch 0,7 W/cm ² zur effektiven Zerstörung von Hela-Zellen trotz starker NIR-Absorption im Wellenlängenbereich von 800 nm bis 2400 nm [15, 25, 26].

Diese Forschungsstudie beabsichtigt, einen effektiven, durch NIR-Strahlung ausgelösten Cs_0.33 . zu entwickeln WO₃ NP-basierte thermische Dosierungsformel für in vitro HepG2-Krebszellen als Funktion der NP-Konzentration, der Bestrahlungsdauer und der optischen Leistungsdichte innerhalb des NIR-Expositionsgrenzwerts für Hautgewebe.

Das Experiment beginnt mit der Synthese der NPs, wobei in Abb. 1 ein schrittweises Syntheseverfahren einschließlich Redoxreaktion, Glühprozess und Nassmahlverfahren skizziert ist. Die Redoxreaktion integriert große ternäre Elemente, in diesem Fall Cs, in Ringe mit oktaedrischer Struktur von WO₆ in einer geeigneten physikalischen Umgebung, was die Bildung einer besonderen Kristallstruktur und den Einbau von freien Elektronen in die metallische Molekülverbindung ermöglicht, was der intrinsische Grund für die starke photothermische Umwandlung bei der NIR-Absorption ist [26, 27]. Auch die anschließenden Temper- und Nassschleifprozesse trugen dazu bei, die Kristallbildung zu verfeinern und die Partikelstrukturgröße zu reduzieren, was die photothermische NIR-Umwandlung weiter verbessert. Anschließend wurde die synthetisierte NP-Lösung mit einer Reihe von physikalischen und Materialcharakterisierungen fortgeführt, die eine durchschnittliche Strukturgröße von 120 nm, eine kritische Optimierung der NIR-Absorption und die Authentisierung der atomaren Zusammensetzung verifizieren (Abb. 2). Darüber hinaus beträgt die entsprechende Messung des Zetapotentials für 0,5 mg/ml, 1 mg/ml und 1,5 mg/ml − 53,2 mV, − 54,3 mV, − 60,1 mV. Im Allgemeinen ist der Prozess der Endozytose der Haupteintrittspfad für die meisten NP-Typen, und die Aufnahmerate von sowohl kationischen als auch ionischen NPs für nicht-phagozytische Zellen ist höher als bei neutralen Einheiten, obwohl erstere eine bessere Leistung erbringen als spätere [38]. In vielen früheren Berichten wurde auch festgestellt, dass negativ geladene NP für nicht-phagozytische Zellen weniger toxisch sind [39, 40], was von Vorteil ist, wenn eine übermäßige intrazelluläre NP-Akkumulation für eine photothermische Dosis in Verbindung mit einer geringen Toxizität in Betracht gezogen wird.

Um einen Ton für den photothermischen Assay an den HepG2-Zellen festzulegen, die Bewertung der Robustheit der NPs als photothermische Heizung, ihrer Langzeitstabilität bei gesättigter Temperatur im Gleichgewicht mit der Umgebung über eine Stunde und der Wiederholbarkeit für 5 aufeinander folgende Zyklen within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

Schlussfolgerung

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm ² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data are fully available without any restriction.

Abkürzungen

NPs:

Nanopartikel

fNPs:

Fluorescence version of Cs_0.33 WO₃ Nanopartikel

NIR:

Nahinfrarot

UV–VIS–NIR:

Ultraviolet–visible–near-infrared

REDOX:

Oxidation-reduction

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

XRD:

Röntgenbeugung

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

EDS:

Energiedispersive Röntgenspektroskopie

RF:

Radiofrequency

ICNRP:

International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection

MIN:

Minutes

SCCM:

Standard cubic centimeter per minute

μ:

Micron

RPM:

Round per minute

JCPDS:

Joint Committee on Powder Diffraction Standards

DI:

Entionisiert

BF:

Hellfeld