Fortschrittliche Detektion von miRNA-335-5p mit interdigitalen Elektroden zur Beurteilung der Schwere von Bauchaortenaneurysmen

Zusammenfassung

Ein Bauchaortenaneurysma (AAA) bezeichnet die Erweiterung der unteren Arterie der Bauchaorta, und ein Früherkennungsinstrument wird dringend für die Diagnose benötigt. In der vorliegenden Studie wurde eine interdigitale Elektroden (IDE)-Sensoberfläche verwendet, um miRNA-335-5p zu identifizieren, die die Bildung von AAAs widerspiegelt. Die Gleichmäßigkeit des Siliciumdioxid-Materials wurde durch 3D-Profilometrie beobachtet, und die chemisch modifizierte hochleitfähige Oberfläche verbesserte die Detektion im I-V-Modus. Die gezielte miRNA-335-5p wurde in dosisabhängiger Weise detektiert, und basierend auf linearer Regression und 3σ-Analysen wurde die Empfindlichkeit mit einer biotinylierten Sonde auf 1 fM bestimmt. Die hohe Spezifität wurde durch Diskriminierung der Zielsequenz von nicht-komplementären sowie einfach- und dreifach-mismatchten Sequenzen gezeigt. Diese Ergebnisse demonstrierten die hochleistungsfähige Detektion von miRNA-335-5p mit guter Reproduzierbarkeit zur Bestimmung der AAA-Schwere.

Einleitung

Bauchaortenaneurysmen (AAAs) sind lebensbedrohliche Erkrankungen, definiert als Bauchaorta mit einem Durchmesser > 3 cm oder größer als normal. Dieser Zustand tritt bei Atherosklerose oder Plaque-Ablagerung auf, die die Wände der Bauchaorta schwächt und zu einer nach außen gerichteten Ausbuchtung führt, ähnlich einem Ballon. Mit der Zeit weitet sich die Arterienwand, was mit der Alterung von Gartenschläuchen vergleichbar ist. Der Druck des durch die Aorta fließenden Blutes bewirkt, dass dieser geschwächte Bereich nach außen ausbeult, was als Aneurysma bezeichnet wird. AAA entsteht, wenn der geschwächte Teil der Aorta zu Komplikationen führt. AAA kann durch Ruptur kleiner Aneurysmen zum Tod führen. Derzeit werden körperliche Untersuchungen, computertomografische Angiogramme, Magnetresonanztomografie und Ultraschallsonografie zur Diagnose eingesetzt. Es gibt jedoch keine Detektionsmethoden für AAA, die häufig bei der Analyse anderer Gesundheitsprobleme zufällig identifiziert werden. Dies führt zu verzögerter Erkennung von AAA und letztlich zu unnötigen Gesundheitsproblemen. Um dieses Problem zu überwinden, müssen Forscher Früherkennungsmethoden entwickeln, und eine potenzielle Strategie ist die Entwicklung eines Sensorsystems.

Frühe, schnelle und empfindliche quantitative Detektion von Krankheiten ist ein wichtiges Ziel für klinische Diagnosen. Gegenwärtige Biosensing-Plattformen erfüllen mehrere Anforderungen, erfordern aber geeignete Laboreinstellungen und Schulungen. Daher sind die meisten Methoden nicht tragbar, was für ideale Point-of-Care-Detektion erforderlich ist. Zudem ist eine Analyse der Veränderungen von Biomarker-Levels zur Unterstützung von Ärzten bei Entscheidungsfindung in präziser und schneller Weise wünschenswert. Zirkulierende Biomarker, die in spezifischen Bereichen exprimiert werden, sollten weiter untersucht werden, um AAA zu diagnostizieren und den Behandlungsfortschritt zu verfolgen. Die Identifizierung dieser zirkulierenden Biomarker hilft bei der Diagnose der Krankheit und der Patientenüberwachung nach der Behandlung. Um diesen Bedürfnissen gerecht zu werden, schlägt diese Studie vor, Sensoren für geeignete AAA-Biomarker zu entwickeln. Der in dieser Studie vorgeschlagene Sensor (interdigitale Elektrode) hat das Potenzial für hochleistungsfähige Analysen mit einer breiten Palette von Biomarkern. Es handelt sich um ein Dielektrodensystem mit abwechselnden Lücken und Fingern, das unter dielektrischen Messungen arbeitet.

Biomarker können beliebige Biomoleküle sein, einschließlich DNA, RNA, Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und deren modifizierte Formen. Forscher haben vorgeschlagen, dass verschiedene Biomarker wie nicht-codierende RNAs im zellulären System exprimiert werden, aber nicht in Proteine translatiert werden. Nicht-codierende RNAs werden normalerweise nicht in Proteine translatiert und haben generell kurze Sequenzen. Verschiedene Klassen nicht-codierender RNAs wie microRNAs (miRNAs), ribosomale RNAs, Transfer-RNAs, kleine nucleolare RNAs, kleine Kern-RNAs, Telomerase-RNAs, snRNAs, Xist-RNAs, Vault-RNAs und 7SL-RNAs wurden berichtet. miRNAs funktionieren hauptsächlich in der transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulation der Genexpression und führen oft zu Gensilencing. Kürzlich beschrieben Forscher die Bedeutung von miRNAs für die Vorhersage von AAA und berichteten über eine verringerte Expression von miRNA-335-5p bei AAA-Patienten. Es wurde bewiesen, dass die Kombination klinischer Faktoren und der Expression von microRNAs die Krankheitsvorhersage drastisch verbesserte und eine erhöhte Genauigkeit zeigte. Forscher konzentrierten sich spezifisch auf miRNA-335-5p, das einen signifikant minimalen Bereich bei Personen mit schnell wachsendem AAA aufwies. Ein Rückgang der miRNA-335-5p-Levels erhöhte die Zuversicht bei der Detektion wachsender AAA. Mit anderen Worten: Der negative Output (höhere Levels) von miR-335-5p deutet auf die Schwere von AAA hin und minimiert aufwendige Screenings. Dies wurde von Wanhainen et al. demonstriert und zeigte, dass miRNAs nützliche Biomarker für das Screening von AAA und die Eliminierung des Risikos schnell wachsender AAA sind. Die aktuelle Studie demonstriert die Anwendung der miRNA-335-5p-Detektion durch einen interdigitale Elektroden (IDE) Sensor zur Bestimmung der AAA-Schwere bei betroffenen Personen.

Materialien und Methoden

Reagenzien und Biomoleküle

Streptavidin, 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und Phosphatpufferlösung (PBS) wurden von Sigma-Aldrich, USA, bezogen. Ethanolamin wurde von Fisher Scientific, UK, gekauft. Alle Oligos wurden kommerziell von Apical Scientific Sdn. Bhd., Malaysia, synthetisiert.

Musterdesign auf einer Chrommaske

Zunächst wurde das Muster des dielektrischen Sensors mit AutoCAD-Software entworfen. Die gewünschten Abmessungen waren: Länge 7500 µm, Breite 4100 µm, 20 Finger-Lücken-Paare, Lückengröße 85 µm, Elektrodengröße 100 µm, Elektrodendicke 40 nm, Fingerlänge 4000 µm. Das Muster wurde auf eine leere Fotomaske gedruckt und auf die Oberfläche des Chromglases geklebt. Dieses Chromglas wurde unter einem UV-Belichtungssystem für den Musterübertragungsprozess fixiert. Ein Siliciumdioxid-Substrat mit aufgedampfter Aluminiumdünnschicht wurde in entgegengesetzter Richtung gegen das Chromglas platziert und 10 Sekunden UV-Licht ausgesetzt. Das Muster wurde übertragen, gefolgt vom Entwicklungsprozess mit dem Resist-Entwickler.

Herstellung der interdigitalen Elektrode

Die Oberflächenelektrode wurde durch einen konventionellen mikroelektronischen Fertigungsprozess hergestellt: (i) Ein 4-Zoll-Wafer mit nativem Oxid wurde vorbereitet. (ii) Der Wafer wurde mit gepuffertem Oxidätzmittel (BOE) und Piranha-Lösung gereinigt, um natives Oxid und anorganische Verunreinigungen zu entfernen. (iii) Eine 2800-Å dicke Oxidschicht wurde durch eine Stunde nasse thermische Oxidation bei 1000 °C gewachsen. (iv) Der Wafer mit der Oxidschicht wurde für bessere Handhabung in vier Teile geteilt. (v) Die Metallschicht wurde mit Ti als Haftschicht für die leitende Schicht aufgedampft. Die Aluminiumschicht (40 nm) wurde 3 cm lang mit 0,5 mm Durchmesser durch ein thermisches Verdampfungs-basiertes physikalisches Abscheidungsverfahren hergestellt. (vi) Eine Schicht positiven Photoresists wurde auf den Substrat aufgesponnen. (vii) Der Wafer wurde 60 Sekunden bei 90 °C weichgebacken. (viii) Der Wafer wurde mit einer Chrommaske ausgerichtet und 10 Sekunden UV-Licht ausgesetzt. (ix) Der Wafer wurde 15 Sekunden in RD6-Entwicklerlösung gespült, um den unbelichteten Bereich zu entfernen, was zum interdigitalen Elektroden (IDE)-Muster mit Oxid führte. (x) Der Wafer wurde 120 Sekunden bei 90 °C hartgebacken. (xi) Der Wafer wurde mit Königswasser geätzt, um den exponierten Bereich beider Schichten zu entfernen. (xii) Das Oberflächenmuster wurde erzeugt, und der verbleibende Photoresist wurde mit Aceton abgewaschen. Dann wurde 3D-Nanoprofilometrie (Hawk 3D-Profilometrie, USA) durchgeführt, um das klare Bild der Lücken zwischen den Elektroden zu beobachten. Strommessungen (A) wurden mit Keithley 6487 bei einem linearen Sweep von 0 bis 2 V in 0,1 V Schritten (bei 20 s) durchgeführt.

Oberflächenchemische Funktionalisierung: Tetravalente Streptavidin-Biotin-Strategie

Für die oberflächenchemische Funktionalisierung wurde die Siliciumdioxid-Oberfläche zunächst gründlich mit 1 M Kaliumhydroxid (pH 9,0) gewaschen, um die Oberfläche zu aktivieren. Diese Oberfläche wurde weiter mit CDI (0,5 M) für 1 Stunde inkubiert, um mit 100 nM Streptavidin (für 1 Stunde) zu reagieren, verdünnt aus dem Originalbestand in 10 mM Phosphatpufferlösung (PBS; pH 7,4). Anschließend wurden die unreaktiven Bereiche mit 1 M Ethanolamin (für 1 Stunde) blockiert. Dann reagierte das tetravalente Streptavidin mit 1 µM biotinylierter Sonde miRNA-335-5p (für 10 Minuten) bei Raumtemperatur. Nach jedem Modifikationsschritt wurde die Oberfläche gründlich mit PBS gewaschen, sofern nicht anders angegeben.

Design der Sonde und Zielsequenzen aus miRNA-335-5p

Die voll-längige miRNA-335-5p (5'-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGUUUGUCAUAAACCGUUUUUCAUUAUUGCUCCUGACCUCCUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3') mit dem Zugangsnummer MIMAT0000765 wurde aus der Datenbank entnommen. Der gewünschte Bereich für diese Studie als Ziel ist 5'-UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU-3'. Um die Ziel-miRNA-335-5p-Region einzufangen, wurde die Sonde als 5'-ACAUUUUUCGUUAUUGCUCUUG-3' entworfen. Am 3'-Ende wurde Biotin markiert, um mit dem auf der Sensoberfläche immobilisierten Streptavidin zu interagieren. Die Sekundärstruktur der voll-längigen miRNA-335-5p wurde durch Online-mfold-Software vorhergesagt.

Sonden-Ziel-Interaktionen: miRNA-335-5p-Sequenzen

Nach Bindung der biotinylierten Sonde an die Streptavidin-Oberfläche interagierte die Ziel-miRNA-335-5p-Sequenz (für 10 Minuten) bei Umgebungstemperatur von niedrig-femtomolaren bis niedrig-nanomolaren Konzentrationen. Diese Konzentrationen reichten von 1 fM bis 1 nM mit 10-fachen seriellen Verdünnungen in PBS. Die Anlagerungen wurden unabhängig von niedrigeren zu höheren Konzentrationen getestet, und nach Duplexbildung wurde die Oberfläche mit 5-fachem Volumen PBS gewaschen, und Messungen wurden durchgeführt.

I-V-Messungen

Die elektrischen Charakterisierungen wurden durch I-V-Messungen mit einem Keithley 6487 Picoammeter mit Spannungs-/Stromversorgung durchgeführt. Die Messungen wurden an den oben genannten Volt auf der blanken Oberfläche gefolgt von jeder oberflächenchemischen Modifikation aufgezeichnet. Ebenso wurde für die interaktive Analyse zwischen Sonde und Ziel-miRNA-335-5p bei jeder Konzentration die Messung nach dem Waschschritt mit 10 Reaktionsvolumen durchgeführt. Alle Modifikationen, Interaktionen und Messungen wurden unter feuchten Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung des IDE-Sensors und Oberflächenanalyse

Die aktuelle Studie verwendete miRNA-335-5p als Werkzeug zur Elucidation der AAA-Schwere durch interaktive Analyse auf einem interdigitalen Elektroden (IDE) Sensor (Abb. 1). Für die interaktive Analyse mit der Sonde und dem Ziel, designed aus der vollen Länge von miRNA-335-5p, wurde eine IDE-Oberfläche entworfen und mit konventionellen photolithografischen Techniken hergestellt. Schrittweise Oberflächenmodifikationen wurden durchgeführt und mit einem Amperemeter gemessen (Abb. 2b, c). Die Maskenausrichtung für die IDE-Herstellung und die Gleichmäßigkeit wurden durch hochauflösende 3D-Nanoprofilometrie-Analyse bestätigt. Diese Beobachtung bestätigte, dass die Herstellung und der Abstand zwischen jedem Finger gut ausgerichtet waren (Abb. 2d). IDEs haben eine Elektrodengröße von ~100 µm mit einem Abstand von ~85 µm, und ein großes intercaliertes Netzwerk mit Millionen von Biomarkern in Reihe/Parallel wird gebildet. Um den Erfolg der hergestellten IDEs zu gewährleisten, verwendeten wir verschiedene blanke Geräte zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit unter dem dielektrischen System. Dieses System misst die molekularen Vibrationen zwischen den Dielektroden, verursacht durch den Dipolmoment (Abb. 2c). Dieser dielektrische IDE ist ein gut anerkanntes System, das weit verbreitet für verschiedene biomolekulare und chemische Analysen verwendet wird. In dieser Studie wurden alle oberflächenchemischen Modifikationen und interaktiven Analysen im I-V-Strommodus gemessen.

Hochdichte Oberflächenmolekülassemblierung: Streptavidin-Biotin-Strategie

Hochdichte molekulare Anlagerungen auf der Sensoberfläche oder Biochips haben sich als entscheidend erwiesen und hängen stark von der Oberflächenfunktionalisierung ab. Diese Studie zielte darauf ab, die geeignete Oberfläche für eine hohe Anzahl molekularer Unterbringungen zu bestimmen, was für Genexpression, Entdeckung und molekularer Analyse zwingend erforderlich ist. Für diese potenziellen Anwendungen erfordert die Erzeugung analytischer Systemoberflächen die richtige Kopplung von Molekülen, um sie in geeigneten Formaten zu immobilisieren. Diese Materialoberflächen wurden untersucht, um den oberflächeninteraktiven Mechanismus zu erforschen, da sie kostengünstig sind und variierte Packungsdichten, Morphologien und Dicken bieten. Dies wird die richtige Anlagerung von Molekülen erleichtern und den Verlust biomolekularer Aktivität verhindern. Darüber hinaus wird die richtige Orientierung der biomolekularen Immobilisierung mit geeigneter sekundärer Strukturbestätigung beibehalten.

Um hochdichte Moleküle auf der Oberfläche zu erreichen, wurde die Siliciumdioxid-Oberfläche zunächst gründlich mit alkalischer Lösung gewaschen und mit CDI modifiziert. Um hohe Mengen an biotinylierten Sonden auf der CDI-Oberfläche einzufangen, immobilisierten wir die Sonde mit Streptavidin. Streptavidin ist ein tetravalentes Protein mit vier Bindungsstellen für Biotin und gilt als Hochaffinitätsmolekül in den Biowissenschaften. Die IDE-Oberfläche hatte einen Strompegel von 2,08E-10 A, und nach CDI-Anlagerung stieg er auf 9,2E-06 A. Dies zeigt deutlich, dass die durch CDI modifizierte IDE-Oberfläche für unsere Analysen geeignet ist. Bei Zugabe von Streptavidin stieg der Strompegel weiter auf 2,36E-05 A. Mit dieser Strategie immobilisierten wir eine höhere Anzahl biotinylierter Sonden, designed aus der vollen Länge von miRNA-335-5p, auf der IDE-Oberfläche (Abb. 3a). Biotin-Interaktionen wurden nach dem Blockierschritt auf der IDE-Oberfläche durchgeführt, um die unreaktiven Bereiche zu maskieren. Bei jeder Oberflächenmodifikation wurden die Stromänderungen bestimmt (Abb. 3b). Wie in Abb. 3c gezeigt, betrugen die Stromänderungen nach Zugabe von Ethanolamin 2,53E-05 A, und bei Zugabe von 1 nM biotinylierter Erfassungsssequenz sank der Strompegel auf 1,29E-08 A. Diese Stromänderung bestätigte die Immobilisierung der Erfassungssonde auf der IDE-Sensoberfläche. Generell trägt ein einzelsträngiges Oligonukleotid eine stärker negative Ladung mit exponiertem 5-Carbonat-Phosphat-Rückgrat (Sonde), während die Nettoladung von Ethanolamin neutral ist, wie vom Lieferanten angegeben. Dieser große Ladungsunterschied führte zu einer offensichtlichen Variation im gemessenen Strom (Abb. 3c). Darüber hinaus kehrte dieser Parameter bei Duplexbildung mit dem Zielstrang wieder um. Dies ist auf die Verringerung der Exposition des Phosphat-Rückgrats und die zusätzlichen positiven Ladungen zurückzuführen, die von den Nukleobasen in der miRNA-Kette stammen (Abb. 4a).

Dosisabhängige interaktive Analyse auf der IDE

Nach Anlagerung der biotinylierten Sonde auf der Sensoberfläche wurde die Zielinteraktionsanalyse mit verschiedenen Dosen durchgeführt. Diese Validierung wurde vom niedrig-femtomolaren bis zum niedrig-nanomolaren Bereich durchgeführt. Um diesen Bereich zu gewährleisten, führten wir eine Voranalyse mit 1 nM Ziel-miRNA-335-5p-Sequenzen durch. Nach Zugabe von 1 nM Ziel-miRNA-335-5p-Sequenz auf der Erfassungssonden-modifizierten Oberfläche änderte sich der Strompegel von 1,29E-08 A auf 1,29E-07 A (Abb. 4a); dieses Ergebnis zeigte an, dass Hybridisierung zwischen Erfassungssonde und Zielsequenz stattfand. Nach dieser Bestimmung titrierten wir die Zielsequenz von 1 fM bis 1 nM, um die Nachweisgrenze zu bestimmen, die unabhängig auf den Erfassungssonden-modifizierten Oberflächen aufgebracht wurde. Die Stromänderungen wurden vor und nach der Immobilisierung detektiert. Die Stromdifferenzen für die 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM und 1 nM Hybridisierungen betrugen 2,87, 3,87, 5,04, 6,88, 8,59, 11,21 und 11,61E-08 A. Basierend auf den Ergebnissen wurden klare dosisabhängige Stromänderungen bei allen getesteten Konzentrationen der Zielsequenz detektiert (Abb. 4b).

Hohe analytische Leistung: Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit

Basierend auf den obigen Ergebnissen mit konzentrationsabhängigen Inkrementen wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Die Empfindlichkeit der Detektion wurde mit der 3σ-Berechnung geschätzt und lag bei 1 fM (Abb. 5a, b). Die Konzentration war unter 1 fM, zeigte das Hintergrundsignal und niedrigere Werte. Zudem wurde eine Spezifitätsanalyse durchgeführt, um die Zielsequenzen von nicht-komplementären und einfach- und dreifach-mismatchten Sequenzen zu diskriminieren. Es war offensichtlich, dass die designte Sonde eine stärkere Reaktion mit den perfekten miRNA-335-5p-komplementären Sequenzen zeigte als mit den anderen Sequenzen (Abb. 6a). Eine einfach-mismatchte Sequenz führte zu einer höheren Stromantwort als die nicht-komplementären und dreifach-mismatchten Sequenzen aufgrund der partiellen Duplexbildung durch die einfach-mismatchte Sequenz auf der Sondsequenz. Reproduzierbarkeitsanalysen wurden mit allen chemischen und biologischen Modifikationen auf der IDE-Oberfläche in Triplicate durchgeführt, und die Daten wurden gemittelt. Die gemittelten Daten zeigen, dass es keine signifikanten Änderungen gab, wenn verschiedene Experimente durchgeführt wurden (Abb. 6b). Zur Unterstützung der IDE-Leistung wurden die Eigenschaften aktuell verfügbarer Methoden verglichen (Tabelle 1).

Schlussfolgerungen

Die Entwicklung einer analytischen Methode mit biologischen Biomarkern hilft bei der Diagnose von AAA während körperlicher Untersuchungen. In der aktuellen Forschung wurde eine miRNA-335-5p-vermittelte Detektion zur Vorhersage der AAA-Schwere entwickelt, da miRNA-335-5p bei AAA exprimiert wird. Der Output der generierten IDE-Detektion zeigte niedrigere bis höhere Detektionspegel, um die Vorhersage der AAA-Schwere zu erleichtern. Die untere Detektionsgrenze betrug 1 fM mit hoher Spezifität und Reproduzierbarkeit für die hochleistungsfähige Analyse. Die in dieser Forschung verwendete tetravalente Streptavidin-Biotin-Methode ergab einen guten Output und kann für andere Biomarker-Analysen genutzt werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt vollständig verfügbar.

Abkürzungen

AAA:

Bauchaortenaneurysma

CDI:

1,1'-Carbonyldiimidazol

PBS:

Phosphatpufferlösung

IDE:

Interdigitale Elektrode

UV:

Ultraviolett