Hocheffiziente tumor-zielgerichtete Photo-Chemo-Theranostik-Nanopartikel: Artesunat-beladene, ICG-konjugierte Human-Serum-Albumin

Zusammenfassung

Wir berichten über eine tumorspezifische Theranostik-Plattform, die vier klinisch zugelassene Wirkstoffe – Artesunat (Arte), Human-Serum-Albumin (HSA), Folsäure (FA) und Indocyaningrün (ICG) – in ein einzelnes Nanopartikel (FA-IHA NPs) vereint. Diese Nanopartikel zeigen außergewöhnliche photo- und physikochemische Stabilität. ICG verleiht Nahinfrarot (NIR)-Fluoreszenz für Bildgebung und vermittelt photothermische (PTT) und photodynamische (PDT) Therapie unter einem einzelnen 808-nm-Laser. Gleichzeitig löst 808-nm-Bestrahlung kontrollierte Arte-Freisetzung aus, was die chemotherapeutische Wirksamkeit verstärkt. In-vitro- und In-vivo-Studien demonstrieren schnelle zelluläre Aufnahme und selektive Tumorakkumulation, verifiziert durch Konfokalmikroskopie und NIR-Bildgebung in HepG2-Xenotransplantat-Mäusen. Eine einzelne NIR-Bestrahlungssitzung (808 nm, 1 W/cm²) kombiniert mit FA-IHA NPs unterdrückt Tumorwachstum vollständig ohne Rezidiv. Diese Ergebnisse etablieren FA-IHA NPs als vielversprechende Plattform für die klinische Translation bildgeführter Photo-Chemo-Therapie.

Hintergrund

Bildgeführte Photo-Chemo-Therapie (IGPC) hat sich als überzeugende Strategie für personalisierte Onkologie etabliert, die präzise Tumolokalisation mit multimodaler Behandlung verbindet und Kollateralschäden minimiert (1–4). Eine erfolgreiche IGPC-Plattform muss: (i) multifunktional sein, Diagnostik und Therapie integrieren; (ii) biokompatibel, stabil und tumorselektiv (5–8). Fluoreszenzbildgebung wird aufgrund hoher Sensitivität und günstiger zeitlicher Auflösung häufig für Echtzeitführung eingesetzt (9–16).

Photothermische Therapie (PTT) und Photodynamische Therapie (PDT) können unter NIR-Bestrahlung vereint werden, um sowohl Wärme als auch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zur Ablation von Tumorzellen zu liefern (17–19). Monotherapie gelingt jedoch oft nicht, Restkrankheit zu eliminieren, was zu Rezidiven führt (17–19). Konventionelle Chemotherapie bietet systemische Zytotoxizität, leidet aber unter Unselektivität und assoziierten Toxizitäten (20–22). Daher verspricht IGPC, die lokalisierte Phototherapie mit gezielter Chemotherapie kombiniert, diese Limitationen zu überwinden.

Nanomedizin hat eine Vielzahl IGPC-Theranostika hervorgebracht, einschließlich Indocyaningrün (ICG), metallbasierter Nanopartikel, Kohlenstoffnanomaterialien und polymere Systeme (23–27). ICG, ein FDA-zugelassener NIR-Farbstoff, wird klinisch für Herzzeitvolumen, Leberfunktion und ophthalmologische Angiographie eingesetzt (28–29). Seine starke Absorption bei 800 nm ermöglicht effiziente PTT-PDT. Freies ICG ist jedoch instabil, wird schnell aus dem Kreislauf eliminiert, bleicht sich selbst und fehlt Tumorspezifität (31–32). Einkapselung in Träger wie Mizellen, Polymere oder Protein-Nanostrukturen verbesserte seine Leistung, doch der Bedarf an biokompatibleren, gezielten ICG-basierten Kompositen besteht fort (33–34).

Hier konstruierten wir ein tumorzielgerichtetes IGPC-Agent, indem wir FA und ICG kovalent an HSA-Nanopartikel koppelten und gleichzeitig Arte einkapselten – ein natürliches Antimalariamittel mit nachgewiesener Antikrebsaktivität gegen Leber-, Lungen- und Brustkrebs (35). Die resultierenden FA-IHA NPs nutzen FA-vermittelte Rezeptoraufnahme, HSA's exzellente Biokompatibilität und die doppelte therapeutische Kraft von ICG und Arte. Dieser multifunktionale Konstrukt bietet NIR-Bildgebung, PTT-PDT und kontrollierte Chemo-Freisetzung und positioniert sich als vielseitige Plattform für klinische Translation.

Methoden

Materialien

Reagenzien umfassten EDC, NHS und Arte (≥ 99 %) von Sigma-Aldrich; DAPI und CCK-8 von Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH und NH₂-PEG₂₀₀₀-FA von Xi'an Ruixi; DMEM und PBS von Gibco; ICG-NHS von Dojindo. Alle Chemikalien wurden unverändert verwendet.

Synthese und Charakterisierung von FA-IHA NPs

Arte wurde in DMSO gelöst, dann zu 15 ml Wasser gegeben. HSA (10 mg) wurde hinzugefügt und 3 h bei Raumtemperatur gerührt, gefolgt von Vernetzung mit 150 µl 0,5 % Glutaraldehyd. Das Gemisch wurde 24 h gegen destilliertes Wasser (MWCO 8–12 kDa) dialysiert, um Arte-beladenes HSA (Arte-HSA) zu erhalten. Aktivierung der HSA-Carboxylgruppen mit EDC/NHS folgte Konjugation mit NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 h, 4 °C) und anschließender Anlagerung von ICG-NHS (30 min, RT). Endgültige FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NPs) wurden durch 24-h-Dialyse in deionisiertem Wasser gereinigt. Arte- und ICG-Beladungseffizienzen wurden durch UV-Vis-Spektroskopie quantifiziert (Beladung % = W₁/W₂ × 100 %).

Morphologie wurde durch TEM (Hitachi) beurteilt. Hydrodynamische Größe und ζ-Potenzial durch DLS (Malvern Zetasizer). Absorptionsspektren wurden auf einem Shimadzu UV-Vis-Spektrophotometer aufgezeichnet. Photothermische Antworten wurden mit einem 808-nm-CW-Laser (1 W/cm²) gemessen, Temperatur überwacht mit Fluke-Thermoelement. Photostabilität und Fluoreszenz-Langlebigkeit wurden über 5 Zyklen bzw. 30 Tage evaluiert.

Thermisch und pH-getriggerte Arte-Freisetzung

FA-IHA NPs (50 µg/ml) wurden bei pH 6,5, pH 7,4 und pH 6,5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², 1 min Puls) über 36 h inkubiert. Arte-Freisetzung wurde durch UV-Vis bei 287 nm im Überstand quantifiziert.

Detektion von Singulett-Sauerstoff-Produktion

DPBF (15 µl) wurde mit 1 ml 10 µg/ml ICG oder FA-IHA NPs gemischt und bestrahlt (808 nm, 1 W/cm², 5 min). Absorptionsabfall bei 410 nm über die Zeit reflektierte Singulett-Sauerstoff-Generierung.

Zellkultur und zelluläre Aufnahme

HepG2-Zellen (ATCC) wurden in DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 °C, 5 % CO₂ kultiviert. Für Aufnahmestudien wurden Zellen mit freiem ICG, IHA NPs oder FA-IHA NPs (0,05 mg/ml ICG) 6 h inkubiert, gewaschen, fixiert, DAPI-gefärbt und per Konfokalmikroskopie abgebildet. Durchflusszytometrie quantifizierte Internalisierungsraten.

Generierung intrazellulärer ROS

HepG2-Zellen (2 × 10⁵ Zellen/ml) wurden mit PBS, Arte, FA-HA-NPs, freiem ICG, IHA-NPs oder FA-IHA NPs 12 h behandelt, dann bestrahlt (808 nm, 1 W/cm², 5 min). DCFH-DA (5 µg/ml) wurde 30 min zugegeben, gefolgt von Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie zur ROS-Bewertung.

In-vitro Tumor-Kombinationstherapie

HepG2-Zellen (2 × 10⁴ Zellen/Well) wurden mit freiem ICG, Arte, IHA NPs oder FA-IHA NPs (Arte 0–30 µg/ml) 6 h behandelt, dann bestrahlt (808 nm, 1 W/cm², 5 min) oder unbehandelt belassen. Zellviabilität wurde nach 24 h durch CCK-8 gemessen. Live/Dead-Färbung (Calcein-AM/PI) bestätigte Zytotoxizität per Konfokalbildgebung.

Tiermodell und In-vivo-Fluoreszenzbildgebung

Balb/c Nacktmäuse (n=5) wurden subkutan mit 1 × 10⁶ HepG2-Zellen injiziert. IVIS Spectrum Imaging (Caliper) verfolgte NIR-Fluoreszenz bei 10 min, 6 h, 12 h, 24 h und 48 h nach intravenöser Injektion von freiem ICG, IHA NPs oder FA-IHA NPs.

In-vivo Tumor-Kombinationstherapie

Mäuse wurden in sechs Gruppen randomisiert (n=5): PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA + NIR, FA-IHA + NIR (gleiche Arte-Dosis). NIR-Bestrahlung (808 nm, 1 W/cm², 5 min) wurde bei 24 h und 48 h appliziert. Tumorvolumen wurde alle 4 Tage aufgezeichnet und relativ zum Baseline ausgedrückt. Nach Behandlung wurden Hauptorgane für H&E-Histologie entnommen.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von FA-IHA NPs

Abbildung 1 zeigt schematisch das Design und den therapeutischen Workflow von FA-IHA NPs. Die Nanopartikel wurden via einfacher, biokompatibler Methode assembliert, integrierend ICG für NIR-Bildgebung und Phototherapie sowie Arte für chemotherapeutische Wirkung.

Transmissionselektronenmikroskopie offenbarte monodisperse, kugelförmige Partikel (~131,2 nm). Dynamische Lichtstreuung bestätigte einen hydrodynamischen Durchmesser von 131 ± 2,3 nm in Wasser, PBS und Zellmedium, mit stabilem ζ-Potenzial von –29,2 ± 1,13 mV. Größe blieb über 7 Tage unverändert, was robuste kolloidale Stabilität durch PEG- und HSA-Beschichtung anzeigt. UV-Vis-Spektren zeigten charakteristische Peaks von Arte und ICG, bestätigend erfolgreiche Beladung (Arte 98,6 ± 3,1 %, ICG 56,9 ± 2,4 %). Fluoreszenzspektren entsprachen freiem ICG, was erhaltene photophysikalische Eigenschaften bestätigt.

Photothermische Evaluation zeigte, dass FA-IHA NPs (gleicher ICG-Gehalt) die Temperatur innerhalb von 5 min unter 808 nm (1 W/cm²) um ~36 °C erhöhten, während freies ICG ähnlichen Anstieg zeigte und Wasser kaum anstieg (<4 °C). Photostabilitätstests ergaben, dass FA-IHA NPs Absorption über fünf Bestrahlungszyklen beibehielten, während freies ICG Intensität verlor, was den schützenden Effekt kovalenter Konjugation und HSA/PEG-Einkapselung unterstreicht. Fluoreszenz-Langlebigkeit über 30 Tage bei 4 °C zeigte 28 % Reduktion für FA-IHA NPs versus 88 % Abfall für freies ICG, was überlegene Photostabilität hervorhebt.

DPBF-Assays demonstrierten, dass FA-IHA NPs 58 % des Standard-Singulett-Sauerstoff-Ertrags innerhalb von 5 min NIR-Exposition produzierten, übertreffend freies ICG (35 %). Diese Verstärkung reflektiert den synergistischen Effekt dualer Phototherapie.

Unter sauren Bedingungen (pH 6,5) und NIR-Bestrahlung stieg Arte-Freisetzung aus FA-IHA NPs von 11,6 % (pH 7,4) auf 68,4 % (pH 6,5 + NIR). Die dualen Trigger – thermische Expansion von HSA und protonenvermittelte Oberflächenladungsänderung – ermöglichen kontrollierte Wirkstofffreisetzung (37–38).

Zellaufnahme und Detektion intrazellulärer ROS

Konfokalbildgebung zeigte ausgeprägte rote ICG-Fluoreszenz in HepG2-Zellen, behandelt mit FA-IHA NPs, übertreffend freies ICG und IHA NPs. Durchflusszytometrie quantifizierte 52,3 % Aufnahmerate für FA-IHA NPs, deutlich höher als IHA NPs (25,2 %) und freies ICG (3,9 %) – klare Indikation für FA-vermitteltes Rezeptortargeting (39–41).

ROS-Produktion, bewertet mit DCFH-DA, war in FA-IHA NPs-behandelten Zellen nach 5 min NIR-Bestrahlung signifikant höher als in allen anderen Gruppen, was verstärkte photodynamische Aktivität bestätigt (Abbildung 6a,b).

In-vitro Tumor-Kombinationstherapie

FA-IHA NPs erzielten den höchsten Temperaturanstieg (~31 °C) aller Behandlungen nach 5 min NIR-Exposition, korrelierend mit überlegener photothermischer Leistung (Abbildung 7a). Ohne Bestrahlung zeigten Arte, IHA NPs und FA-IHA NPs konzentrationsabhängige Zytotoxizität, während freies ICG inert blieb. Nach Bestrahlung fiel Zellviabilität in der FA-IHA NPs-Gruppe dramatisch, zuzuschreiben synergistischen Chemo-Photothermischen Effekten. Calcein-AM/PI-Färbung bestätigte nahezu vollständigen Zelltod bei FA-IHA NPs + NIR, während andere Gruppen lebende Zellen behielten (Abbildung 7d).

In-vivo Fluoreszenzbildgebung

IVIS-Bildgebung zeigte starke Ganzkörper-Fluoreszenz innerhalb 10 min post-Injektion aller Formulierungen. Tumor-Fluoreszenz erreichte Maximum bei 24 h, wobei FA-IHA NPs zu jedem Zeitpunkt das höchste Signal aufwiesen, was FA-getriebene Tumorakkumulation bestätigt (Abbildung 8b). Ex-vivo-Organanalyse bei 24 h zeigte vorwiegende Leberaufnahme in allen Gruppen, konsistent mit hepatischen Clearance-Pfaden (Abbildung 8c).

In-vivo Tumor-Kombinationstherapie

Thermische Bildgebung bei 24 h post-Injektion unter NIR-Bestrahlung zeigte größten Temperaturanstieg (~22,1 °C) für FA-IHA NPs, bestätigend potente photothermische Konversion (Abbildung 9a,b). Zwei Bestrahlungssitzungen (Tag 0 und Tag 2) führten zu vollständiger Tumorremission in der FA-IHA + NIR Gruppe, ohne Rezidiv über 90 Tage und 100 % Überlebensrate, während alle anderen Gruppen keine anhaltende Suppression erreichten (Abbildung 9c,d). Histologische Untersuchung zeigte keine signifikante Organpathologie in der FA-IHA + NIR Gruppe, was vernachlässigbare systemische Toxizität unterstreicht (Abbildung 10).

Schlussfolgerungen

Wir haben ein multifunktionales Theranostik-Nanopartikel entwickelt, das FA und ICG kovalent konjugiert und Arte in HSA einkapselt. FA-IHA NPs demonstrieren robuste kolloidale und photothermische Stabilität, bewahren NIR-Fluoreszenz und setzen Arte bei NIR-Bestrahlung frei. FA-vermitteltes Rezeptortargeting ergibt hohe zelluläre Aufnahme und Tumorakkumulation, was einen synergistischen photothermisch-photodynamisch-chemotherapeutischen Angriff ermöglicht, der Tumoren in vitro und in vivo ohne Rezidiv eliminiert. Diese Ergebnisse positionieren FA-IHA NPs als hochvielversprechende Plattform für klinische Translation bildgeführter, tumorzielgerichteter Photo-Chemo-Therapie.

Abkürzungen

Arte:

Artesunate (Artesunat)

FA:

Folic Acid (Folsäure)

HSA:

Human Serum Albumin (Human-Serum-Albumin)

ICG:

Indocyanine Green (Indocyaningrün)

NIR:

Near Infrared (Nahinfrarot)

PDT:

Photodynamic Therapy (Photodynamische Therapie)

PEG:

Polyethylene Glycol (Polyethylenglycol)

PTT:

Photothermal Therapy (Photothermische Therapie)