Gezielte Curcumin-Nanopartikel aktiviert durch niedrigintensiven fokussierten Ultraschall für pH-responsive Theranostik bei Eierstockkrebs

Zusammenfassung

Es wurde eine einfache und vielseitige Nanoplattform entwickelt, die pH-sensible Ferritin-Nanokäfige nutzt, die mit dem Antikrebsmedikament Curcumin (Cur) und flüssigem Fluorkohlenwasserstoff Perfluorohexan (PFH) im Kern beladen sind und außen an der Schale mit dem tumorzielenden Molekül Folsäure (FA) konjugiert sind (bezeichnet als FA-FCP). Die synthetisierten FA-FCP weisen einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 47 nm auf, stabile und günstige physikochemische Eigenschaften in verschiedenen Medien sowie hohe Biokompatibilität und Biosicherheit in vivo und in vitro. Unter Bedingungen von niedrigintensivem fokussiertem Ultraschall (LIFU) und bei pH = 5,0 setzte FA-FCP innerhalb von 24 h eine große Menge an Medikamenten frei (53,2 %). Nach 4 min LIFU-Behandlung (7 W) zeigte FA-FCP bei pH = 5,0 kontrastverstärkte Ultraschallbildgebungsfähigkeiten. Durch FA-Rezeptor-vermittelte Endozytose konnten FA-FCP effizient in Zellen eindringen und sich in Lysosomen verlagern. 18 h nach Injektion von FA-FCP wurde der Tumor durch LIFU stimuliert, was ein kontrastverstärktes Ultraschallbild ergab. In vivo- und in vitro-Experimente zeigten, dass die kombinierte Anwendung von FA-FCP und LIFU signifikante Tumorbhandlungswirkungen hatte. Es wird geschlossen, dass FA-FCP in Kombination mit externem LIFU und der endogenen sauren Umgebung leistungsstarke theranostische Funktionen bietet und eine neuartige, nicht-invasive und integrierte Tumor-Theranostik-Option darstellt.

Einleitung

Eierstockkrebs ist eine hochmetastatische und letale Erkrankung mit hoher Sterblichkeitsrate. Da frühe klinische Symptome unauffällig sind, sind Tumorzellen bei Diagnose bereits hochmetastatisch. Standardbehandlungen sind zytoreduktive Chirurgie und Chemotherapie, doch die 5-Jahres-Überlebensrate bei fortgeschrittenem Stadium ist sehr niedrig. Daher ist die Entwicklung neuer Strategien für Behandlung und Diagnose dringend erforderlich. Nanoplattformen, die gezielte Therapie und bildgebende Diagnostik kombinieren, bieten eine alternative Behandlungsstrategie.

In den letzten Jahren wurden akustisch-responsive Nanoplattformen (ARN) breit in der Tumorforschung eingesetzt. ARNs werden meist als Mikrobläschen (MBs) oder Nanopartikel (NPs) gestaltet. Im Vergleich zu MBs bieten NPs kleinere Partikelgröße, höhere Permeabilität, längere pharmakokinetische Zyklen, bessere Stabilität und einfachere Oberflächenmodifikation. Phasentransformierbare Fluorkohlenwasserstoffe wie Perfluorpentan (PFP), Perfluorohexan (PFH) und Perfluoroctylbromid (PFOB) werden häufig für akustische Responsivität genutzt. Sie können unter fokussiertem Ultraschall durch akustische Tröpfchenverdampfung (ADV) Blasen bilden oder platzen, was kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung ermöglicht. PFH mit Siedepunkt 56 °C gilt als ideales Phasentransformationsmaterial. Da PFH hydrophob ist, ist die Einkapselung in Nanopartikel zur Wasserlöslichkeit sinnvoll. Verschiedene Träger wie Liposomen, PLGA, mesoporöse Organika und Polymere wurden berichtet. Diese Träger können auch Antikrebsmedikamente laden, was chemotherapeutische Funktionen und akustisch gesteuerte Freisetzung ermöglicht. Trotz guter theranostischer Fähigkeiten bleibt die Biokompatibilität der Nanoträger ein klinisches Hindernis.

Eisenfreie Ferritin-Nanokäfige werden zunehmend als Drug-Delivery-Vehikel genutzt, da sie endogene Proteine sind und erhebliche pH-Sensitivität aufweisen. Sie können in sauren Umgebungen disassemblieren und in alkalischen wieder zusammenbauen, was hohe Biokompatibilität und kontrollierte Beladung/Freisetzung bietet.

In dieser Studie wurde Ferritin als Träger für PFH und Curcumin genutzt und das tumorspezifische Zielmolekül FA an der Proteinoberfläche modifiziert, um die multifunktionelle Nanoplattform FA-FCP zu erhalten. Curcumin, ein natürliches Polyphenol aus Kurkuma, hat günstige antikrebswirksame Effekte, aber schlechte Wasserlöslichkeit. FA-FCP verbessert die Wasserlöslichkeit von PFH und Cur, zeigt hohe physiologische Stabilität in verschiedenen Medien und gute Biokompatibilität in vivo und in vitro. Unter LIFU und pH = 5,0 setzt FA-FCP in 24 h viel Medikament frei (53,2 %). Nach 4 min LIFU (7 W) bei pH = 5,0 liefert FA-FCP kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung. Durch FA-Rezeptor-vermittelte Endozytose gelangen FA-FCP effizient in Zellen und in Lysosomen. 18 h nach Injektion zeigte der Tumor unter LIFU kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung. In vivo- und in vitro-Experimente belegen signifikante Tumorbhandlungswirkungen. Die Vorteile nicht-invasiver, ligand/rezeptor-vermittelter Targeting, LIFU-getriggerter Phasentransformation und präziser Freisetzung machen FA-FCP zu einer vielversprechenden theranostischen Nanoplattform.

Materialien und Methoden

Materialien

Ferritin (FRT), Folsäure (FA), Perfluorohexan (PFH) von Sigma (St. Louis, MO, USA). Curcumin (Cur) von Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA und NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH von Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). EDC und NHS von Thermo Fisher Scientific. CCK-8 von Dojindo Laboratories. DMEM, PBS, Penicillin-Streptomycin, Trypsin-EDTA, FBS von Gibco.

Herstellung von FA-FCP

Zunächst wurden 10 mg FRT in 10 ml Wasser gelöst. 10 mg Cur in 0,3 ml DMSO gelöst. Beide Lösungen und 1 ml PFH wurden bei pH 5,0 unter 30-minütiger Eisbad-Ultrasonikation gemischt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 7,4 eingestellt, um Cur und PFH beladenes FRT (FCP) zu erhalten. Dann wurde FA kovalent an FCP über Carbodiimid-Chemie gekoppelt: 5 mg NH₂-PEG₂₀₀₀-FA wurden zur FCP-Lösung mit EDC (5 mg/ml) und NHS (20 mg/ml) gegeben. Nach 3 h Reaktion bei Raumtemperatur wurde durch Dialyse (MWCO 12 kDa) 24 gereinigt, was FA-konjugiertes FCP (FA-FCP) ergab. Die Cur-Beladung wurde per UV-Vis bei 426 nm bestimmt.

Charakterisierung

Partikelgröße und Zeta-Potenzial per Zeta Sizer (Malvern NanoZS). Morphologie per TEM (Hitachi) und AFM (Agilent 5500LS). Zelluläre Aufnahme per Konfokalmikroskopie (Olympus LEXT OLS4100) und Durchflusszytometrie (BD). Absorptionsspektren per UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu UV1800).

Zellkultur und Tiermodell

Menschliche Eierstockkrebszelllinie SK-OV-3 vom Shanghai Institute of Cell Biology. Kultur in DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin, 5 % CO₂, 37 °C. Weibliche BALB/c-Nacktmäuse (ca. 5 Wochen) von Vital River Laboratory Animal Technology. SK-OV-3-Tumormodell: 1×10⁶ Zellen subkutan in rechten Rückenbereich. Alle Verfahren entsprachen den Richtlinien der Sichuan Academy of Medical Sciences und wurden vom Ethikkomitee genehmigt.

pH/LIFU-getriggerte Cur-Freisetzung

FA-FCP-Lösung in Dialysetaschen (MW 5000) in PBS pH 5,0 und 7,4 dialysiert. Nach 3 h Bestrahlung mit/ohne LIFU (7 W, 5 min, 50 % Tastverhältnis). Zu definierten Zeitpunkten 1 ml Dialysat entnommen, durch gleiches Volumen ersetzt und Cur-Konzentration per UV-Vis gemessen.

ADV-Eigenschaften und US-Bildgebungsfunktion

FA-FCP bei pH 5,0 und 7,4 in Agarosegel-Modell mit LIFU (5, 6, 7 W; 3, 4, 5 min) bestrahlt. US-Bilder mit Esaote Mylab 90 (5–12 MHz, MI 0,06) aufgenommen. US-Intensität im ROI per ImageJ analysiert.

Targeting-Fähigkeit von FA-FCP

FITC-Markierung der Nanopartikel. 1 mg FITC in 1 ml DMSO, mit FCP und FA-FCP 30 min gemischt, über Nacht gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Zellen 24 h kultiviert, dann FITC-markierte Nanopartikel 3 h inkubiert. Nach PBS-Waschen Färbung mit DAPI (5 min), LysoTracker Red (10 min), Fixierung mit 4 % Paraformaldehyd (15 min). Konfokalmikroskopische Beobachtung. Fluoreszenzsignale per Durchflusszytometrie quantifiziert.

Blutzirkulation und Tumorakkumulation

Freies Cur und FA-FCP (gleiche Cur-Konzentration) i.v. in normale Mäuse. Blutentnahme zu verschiedenen Zeitpunkten, Lyse, Cur-Konzentration per UV-Vis, ausgedrückt als %ID/g. Tumorakkumulation bei tumortragenden Mäusen: Nach 0, 1, 6, 12, 18, 24 h i.v. Injektion Tumorgewebe entnommen, gewogen, mit Königswasser verdaut, Cur per UV-Vis bestimmt (%ID/g).

In vitro- und in vivo-Antikrebswirksamkeit

In vitro: Zellen mit PBS, Cur, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU (Cur-Dosis 5 mg/kg) 3 h inkubiert, dann LIFU (5 min, 7 W). Weitere 21 h Inkubation, Zellviabilität per CCK-8. In vivo: Tumortragende Mäuse in 5 Gruppen (n=6): Kochsalzlösung, freies Cur, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU. LIFU 18 h nach i.v. Injektion alle 2 Tage, insgesamt 3 Mal ab Tag 1. Tumorvolumen und Körpergewicht alle 3 Tage über 24 Tage. Tumorvolumen = Länge×Breite²/2. Relatives Tumorvolumen V/V₀.

Biosicherheitsbewertung

In vitro: SK-OV-3 Zellen mit verschiedenen FA-FRT-PFH Konzentrationen (0–500 μg/ml) 24 h, dann CCK-8. In vivo: Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) gesunder Mäuse 25 Tage nach i.v. Injektion von FA-FCP, H&E-Färbung, Lichtmikroskopie.

Statistische Analyse

Daten als Mittelwert ± Standardabweichung. SPSS 22.0, Student's t-Test, p < 0,05 signifikant.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von FA-FCP

Schema 1 illustriert Synthese und Anwendung. FA-FCP wurde durch einfache, biokompatible Selbstassemblierung hergestellt. TEM/AFM zeigen kugelförmige Struktur (Abb. 1a, Inset). DLS: ca. 47 nm mittlerer Durchmesser, -37 mV Zeta-Potenzial in Wasser (Abb. 1a,b). Nach 4 Wochen in Wasser, PBS, Kochsalzlösung, FBS Größestabilität (Abb. 1c), was auf PEG-Beschichtung und FRT-Natur zurückgeführt wird. UV-Vis-NIR zeigt Cur-Absorptionspeak. Cur-Beladung: 125,8 ± 2,1 %.

Abbildung 2 zeigt Cur-Freisetzungsprofile unter verschiedenen pH-Bedingungen mit/ohne LIFU. Ohne LIFU: Freisetzung bei pH 5,0 ca. 30 % über 24 h, signifikant höher als bei pH 7,4 (5,3 %). Mit LIFU (7 W, 4 min) scharfer Anstieg bei beiden pH-Werten, aber bei pH 5,0 (50 %) deutlich höher. Dies macht FA-FCP für Tumor-Mikroumgebung nützlich. Ursachen: (1) FRT disassembliert unter Säure und öffnet den Nanokäfig; (2) LIFU induziert瞬时 Phasenübergang, der Cur-Entweichen aus poröser Schale ermöglicht.

In vitro ADV-Effekt von FA-FCP

FA-FCP bei pH 7,4 und 5,0 mit LIFU (5–7 W, 3–5 min) bestrahlt, US-Bilder und Grauwertanalyse (Abb. 3). Bei pH 7,4 zeit-/leistungsabhängiger ADV-Effekt, Peak bei 7 W, 5 min. Bei pH 5,0 Peak bei 7 W, 4 min. Unter 5 W/3 min unzureichende Blasen; über 7 W/4 min kollabieren Blasen. Optimale Bedingung: 7 W, 4 min bei pH 5,0.

Targeting-Fähigkeit von FA-FCP

FITC-Markierung (Abb. 4, Suppl. Fig. S2). FCP-Aufnahme 19,5 % (mögliche Ferritin-Rezeptoren). FA-FCP: 44,3 % Aufnahme. Mit freier FA-Vorbehandlung: 13,8 % (Kompetition). FA-Konjugation erhöht Aufnahme signifikant über FA-Rezeptor-vermittelte Endozytose.

Organell-Lokalisation (Abb. 4c): FA-FCP und LysoTracker Red zeigen nach Merge intensives Gelb im Zytoplasma, was Lysosomen-Lokalisation (pH ≈ 5,0) bestätigt, was intrazelluläre Freisetzung begünstigt.

Blutzirkulation und Tumorakkumulation

Abbildung 5a: FA-FCP Halbwertszeit ca. 7,31 h (8-fach vs. freies Cur), bedingt durch PEG-Beschichtung und FRT-Einkapselung. Verlängerte Halbwertszeit verbessert systemische Retention und Tumorakkumulation.

Abbildung 5b: FA-FCP zeigt maximale Tumorakkumulation nach 18 h, freies Cur nach ca. 1 h. FA-FCP hat signifikant höhere Tumorakkumulation, vermutlich durch EPR-Effekt und FA-Rezeptor-vermitteltes aktives Targeting.

In vivo US-Bildgebung

Tumoren von Nacktmäusen in 4 Gruppen (Kontrolle+LIFU, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU, FA-FCP ohne LIFU) 18 h nach Injektion mit/ohne LIFU (7 W, 4 min) untersucht (Abb. 6). Kontrolle: kein US-Signal. FA-FCP+LIFU: signifikant stärkeres US-Signal im Tumor vs. FCP+LIFU und FA-FCP ohne LIFU. FA-FCP+LIFU verbessert US-Kontrast.

In vitro- und in vivo-Antikrebs-Therapie

In vitro Zytotoxizität per CCK-8 (Abb. 7a): Alle Gruppen zeigen Cur-Konzentrationsabhängigkeit. Ohne LIFU: FA-FCP höherer Inhibitionsgrad als freies Cur (Targeting-Effekt). FA-FCP+LIFU signifikant höher als FP+LIFU, FCP+LIFU, FA-FCP ohne LIFU. Ursachen: LIFU und saure Lysosomenumgebung induzieren Freisetzung und Kavitation, plus FA-Targeting.

In vivo (Abb. 7b-d): Relatives Tumorvolumen in FA-FCP+LIFU Gruppe nach 24 Tagen signifikant reduziert vs. alle anderen Gruppen. Tumorgewicht in FA-FCP und FCP+LIFU Gruppen signifikant niedriger als Kontrolle/Cur, in FA-FCP+LIFU noch stärker inhibiert. Kein signifikanter Körpergewichtsverlust. Hervorragende Anti-Tumor-Wirkung durch Targeting-Akkumulation und akustisch/pH-responsive Freisetzung. Verlängerte Halbwertszeit verzögert Clearance am Tumorort.

In vitro- und in vivo-Biokompatibilität

Abbildung 8a,b: Zellviabilität von FA-FP (0–500 μg/ml) und LIFU (0–8 W) alle > 90 %, keine signifikante Zytotoxizität. Abb. 8c: H&E-Färbung Hauptorgane (Kontrolle vs. FA-FCP+LIFU, 24 Tage post-Injektion) zeigt keine histologischen Veränderungen. Hohe Biokompatibilität in vitro und in vivo bestätigt.

Schlussfolgerung

Es wurde eine multifunktionelle FA-FCP mit Antikrebsmedikament Cur und Tumorzielmolekül FA unter Nutzung von Ferritin-Nanokäfigen hergestellt, die kontrastverstärkte US-Bildgebung und präzises Targeting in Chemotherapie ermöglicht. FA-FCP zeigt hohe in vitro/in vivo Biokompatibilität, exzellentes Tumor-Targeting, akustisch/pH-getriggerte Cur-Freisetzung und akustisch-responsive Phasentransition durch LIFU für US-Bildgebung. Mit diesen Eigenschaften kann FA-FCP als signifikanter Tumoreinhibitor ohne systemische Toxizität dienen. Solch eine neuartige, biokompatible theranostische Nanoplattform wird erwartet, US-Bildgebung mit verbesserter therapeutischer Wirksamkeit zu integrieren und ein vielversprechendes Paradigma für Krebsbehandlung zu bieten.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen basieren auf den im Papier präsentierten Daten (Haupttext und Abbildungen).

Abkürzungen

US:

Ultraschall

FA:

Folsäure

FRT:

Ferritin

PFH:

Perfluorohexan

LIFU:

Niedrigintensiver fokussierter Ultraschall

ADV:

Akustische Tröpfchenverdampfung

FITC:

Fluorescein-Isothiocyanat

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

FBS:

Fetales Rinderserum

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

Cur:

Curcumin