Zinndisulfid-Nanoflocken-basierter elektrochemischer Biosensor für schnellen, empfindlichen Nachweis von Cortisol im Speichel

Zusammenfassung

Cortisol, das quintessentielle Stresshormon, wird von der hypothalamisch-hypophysär-nebennierenrinden (HPA) Achse sezerniert und dient als kritischer Biomarker für psychologischen und physiologischen Stress. Länger andauernde Cortisol-Überexpression kann zu schweren Erkrankungen wie Cushing- und Addison-Krankheit führen, was den Bedarf an schneller Point-of-Care (POC) Detektion unterstreicht. Hier berichten wir über einen nicht-invasiven elektrochemischen Assay für Cortisol im Speichel basierend auf einem Mehrschichtfilm aus Zinndisulfid (SnS₂) Nanoflocken, einem Cortisol-spezifischen Antikörper (C-M_ab) und bovinem Serumalbumin (BSA), immobilisiert auf einer glasigen Kohlenstoffelektrode (GCE). Der BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE Sensor wurde durch elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) und Zyklovoltammetrie (CV) charakterisiert. Differentielle Pulsvoltammetrie (DPV) zeigte eine lineare Antwort auf Cortisolkonzentrationen von 100 pM bis 100 µM, mit einer Nachweisgrenze (LOD) von 100 pM und einer Sensitivität von 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0,9979). Speichelproben, die mit dem Sensor gemessen wurden, stimmten mit ELISA-Ergebnissen innerhalb einer 5%-Marge überein, was seine klinische Relevanz und Spezifität demonstriert. Das Gerät bietet eine schnelle, kosteneffektive Alternative zu konventionellen Immunoassays für die Überwachung stressbezogener Biomarker.

Einleitung

Cortisol ist ein Steroidhormon, das von der HPA-Achse freigesetzt wird und der am weitesten verbreitete Biomarker für die Bewertung psychologischen Stresses ist. Sein zirkadianer Rhythmus erreicht morgens früh seinen Höhepunkt und nimmt nachts ab, und eine Dysregulation kann Zustände von Cushing-Syndrom bis Addison-Krankheit auslösen. Genaues, Echtzeit-Monitoring von Cortisol ist daher essenziell für die Diagnose und das Management verschiedener stressbedingter Störungen, einschließlich PTBS, Depression und Autismus-Spektrumsstörung.

Aktuelle Labormethoden – Chromatographie, Radioimmunoassay, ELISA, SPR und QCM – sind laborgebunden, zeitaufwendig und teuer, was ihren Einsatz in POC-Einstellungen limitiert. Elektrochemische Immunosensoren, die auf spezifischen Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen basieren, bieten eine vielversprechende Lösung mit einfacher Instrumentierung, schnellen Auslesungen, niedrigen Kosten und hoher Sensitivität. Die Messung von Cortisol im Speichel ist besonders attraktiv, da sie nicht-invasiv ist und minimale Probenvorbereitung erfordert.

Während zahlreiche Metallsulfid-Nanomaterialien für Biosensing erforscht wurden, wurde Zinndisulfid (SnS₂) selten als Protein-Immobilisierungsmatrix verwendet. SnS₂ ist ein n-Typ-Halbleiter mit einer Bandlücke von 2,18–2,44 eV, hoher Ladungsträgermobilität und hervorragender chemischer Stabilität, was es zu einer idealen Plattform für elektrochemische Transduktion macht. In dieser Arbeit nutzen wir 2-D SnS₂-Nanoflocken, um einen hochsensitiven Cortisol-Sensor zu konstruieren, der über den physiologischen Konzentrationsbereich arbeitet.

Materialien und Methoden

Materialien

Hydrocortison, Anti-Rabbit-Cortisol-Antikörper (C-M_ab), Kaliumhexacyanoferrat (II/III), β-Östradiol, Testosteron, Progesteron, Corticosteron und bovines Serumalbumin (BSA) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Zinn(IV)-chlorid-pentahydrat und Thioacetamid wurden von Showa (Japan) bzw. Alfa Aesar (UK) geliefert. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) und mikropoliertes Aluminiumoxid wurden von Sigma-Aldrich und Buehler (UK) bezogen. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Ein kommerzielles Cortisol-ELISA-Kit (Kat. # SA E-6000) wurde von LDN (Deutschland) gekauft.

Synthese von Zinndisulfid

SnCl₄·5H₂O und C₂H₅NS wurden in 70 ml deionisiertem Wasser gelöst und auf pH 7,4 eingestellt. Die Lösung wurde in einen hydrothermalen Autoklaven überführt und innerhalb von 1 h auf 200 °C erhitzt, dann für 11 h gehalten. Das resultierende SnS₂-Pulver wurde mit Wasser und Ethanol bei 6000 rpm für 15 min gewaschen und an der Luft bei 80 °C getrocknet, wodurch gleichmäßige Nanoflocken entstanden.

Materialcharakterisierung

Röntgenbeugung (XRD) bestätigte die hexagonale SnS₂-Phase (JCPDS 89-2358). Rasterelektronenmikroskopie mit Feldemission (FE-SEM) zeigte flockenartige Morphologie mit lateralen Dimensionen ~300 nm. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und Selected-Area-Elektronenbeugung (SAED) bestätigten einkristalline Struktur mit Gitterabständen von 0,167 nm und 0,316 nm; die Nanoflocken waren weniger als 10 nm dick.

Herstellung von BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE Biosensoren

Glas-Kohlenstoff-Elektroden (GCE) wurden mit Aluminiumoxid-Schlamm poliert und mit einer 5 M SnS₂-Dispersion tropfenbeschichtet. Die Elektroden wurden dann sequentiell mit 1 mg ml⁻¹ C-M_ab und 1% BSA-Lösungen in PBS inkubiert. Die fertigen Sensoren wurden bei Nichtgebrauch bei 4 °C gelagert. Das Detektionskonzept und der Aufbau sind in Abb. 1 illustriert.

Elektrochemische Analyse

Elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) und Zyklovoltammetrie (CV) wurden eingesetzt, um das elektroaktive Verhalten des Sensors zu bewerten. Alle Messungen verwendeten eine Drei-Elektroden-Zelle: den BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE als Arbeitselektrode, einen Pt-Draht als Gegenelektrode und eine gesättigte Kalomelelektrode als Referenz, in 10 mM PBS (pH 7,4) mit 5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. CV- und Differentielle-Pulsvoltammetrie (DPV)-Scans wurden von -0,4 V bis 1,0 V bei 10 mV s⁻¹ durchgeführt.

Speichelprobenentnahme und elektrochemisches Sensing

Zwei gesunde Freiwillige lieferten 2 ml Speichelproben mittags. Proben wurden bei -20 °C eingefroren, aufgetaut, zentrifugiert (3500 rpm, 15 min), und der Überstand wurde für die Analyse verwendet. Die Cortisol-Messungen des Sensors wurden mit Ergebnissen des ELISA-Kits verglichen.

Interferenzstudie

Potenzielle Interferenten – β-Östradiol, Testosteron, Progesteron, Corticosteron (je 100 nM) – wurden getestet, indem der Sensor 10 min inkubiert und die CV-Antwort gemessen wurde. Der Einfluss auf die Cortisol-Detektion lag unter 5%.

Nachweis von Speichel-Cortisol durch ELISA

ELISA folgte dem Herstellerprotokoll. Eine Standardkurve wurde mit sechs Cortisol-Konzentrationen (0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0, 30 ng ml⁻¹) erstellt. Absorption wurde bei 450 nm gelesen und die resultierende Kurve zur Quantifizierung unbekannter Proben verwendet.

Ergebnisse und Diskussion

Materialanalyse von SnS₂

Das XRD-Muster (Abb. 2a) stimmt mit der hexagonalen SnS₂-Phase (JCPDS 89-2358) überein. FE-SEM-Bilder (Abb. 2b,c) zeigen gleichmäßige, 300-nm flockenartige Partikel. TEM (Abb. 2d-f) bestätigt einkristalline Flocken mit Schichtabständen von 0,167 nm und 0,316 nm und einer Gesamtdicke unter 10 nm.

Elektrochemische Antworten der Elektrode

Die Zugabe von SnS₂ zur GCE steigerte den Oxidationsstrom signifikant (Abb. 3a,b). Die nachfolgende Antikörper- und BSA-Modifikation erhöhte den Ladungstransferwiderstand, wie in EIS-Daten reflektiert (Abb. 3b). CV des BSA/C-M_ab/SnS₂/GCE bei Scanraten 10–100 mV s⁻¹ zeigte einen linearen Anstieg des Spitzenstroms (Abb. 3c,d), was einen oberflächenkontrollierten, reversiblen Redoxprozess bestätigt.

Sowohl CV als auch DPV demonstrierten eine monotone Abnahme des Spitzenstroms mit steigender Cortisol-Konzentration. DPV ergab eine lineare Beziehung: y = -0,0103 x + 0,0443 (R² = 0,9979), mit einer LOD von 100 pM und einer Sensitivität von 0,0103 mA M⁻¹ cm⁻². Der dynamische Bereich des Sensors (100 pM–100 µM) deckt das gesamte physiologische Spektrum von Speichel-Cortisol ab.

Lagerstabilitätsstudie

CV wurde an Sensoren durchgeführt, die 1 Tag bis 1 Woche unter zwei Bedingungen gelagert wurden: vakuumgetrocknet und 4 °C. Die 4 °C-Lagerung bewahrte 91% des Redox-Spitzenstroms nach 7 Tagen, im Vergleich zu 82% unter Vakuum, was eine bessere Stabilität der Antikörperaktivität bei niedrigerer Temperatur anzeigt.

Interferenzstudie

Inkubation mit 100 nM β-Östradiol, Testosteron, Progesteron und Corticosteron erzeugte <5% Änderung im Cortisol-Signal (Abb. 5a), was die hohe Assay-Spezifität bestätigt.

Nachweis von Speichel-Cortisol mit ELISA und elektrochemischen Methoden

Speichelproben von zwei Freiwilligen ergaben Cortisol-Konzentrationen von 1,105 × 10⁻⁸ M und 3,998 × 10⁻⁹ M durch ELISA, und 1,046 × 10⁻⁸ M und 3,911 × 10⁻⁹ M durch den elektrochemischen Sensor – nur eine 2-5% Diskrepanz – was die Genauigkeit des Sensors bestätigt.

Vergleich mit anderen Studien

Tabelle 2 und 3 (nicht gezeigt) vergleichen unseren Sensor mit nicht-gold-basierten Cortisol-Sensoren. Vorteile der vorliegenden Arbeit umfassen: (1) signifikant niedrigere Materialkosten; (2) ein schnelles, unkompliziertes Fertigungsprotokoll; und (3) eine LOD vergleichbar mit oder besser als existierende Geräte.

Schlussfolgerungen

Wir haben einen auf Zinndisulfid-Nanoflocken basierenden elektrochemischen Biosensor demonstriert, der eine 100 pM LOD und einen 100 pM–100 µM Detektionsbereich für Cortisol im Speichel liefert, passend zur ELISA-Genauigkeit. Der Sensor zeigt <5% Interferenz von strukturell ähnlichen Steroiden und behält >90% Aktivität nach 7 Tagen bei 4 °C. Seine niedrigen Kosten, einfache Montage und schnelle Auslesung machen ihn zu einem überzeugenden Kandidaten für POC-Stressmonitoring.