Zielgerichtete Abgabe von Artemisinin über Fe(II)-Tanninsäure-beschichtetes MOF verstärkt Ferroptose in triple-negativem Brustkrebs

Zusammenfassung

Die Unterdrückung der Tumorentwicklung durch Induktion von Ferroptose könnte ein potenzielles Heilmittel für triple-negativen Brustkrebs bieten, der empfindlich auf intrazelluläres oxidatives Ungleichgewicht reagiert. Kürzlich wurden Artemisinin (ART) und seine Derivate als potenzielle Antikrebsmittel zur Behandlung hochaggressiver Krebserkrankungen durch Induktion von Ferroptose über eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke untersucht. Aufgrund seiner schlechten Wasserlöslichkeit und begrenzten intrazellulären Eisengehalt ist es jedoch herausfordernd für die weitere Anwendung in der Antitumortherapie. Hier entwickelten wir einen eisenliefernden Nanoträger für ART basierend auf Tanninsäure (TA) und Eisen(II)-Ion (Fe(II)), beschichtet auf dem zeolithischen Imidazolat-Framework-8 (ZIF) mit eingeschlossenem ART (TA-Fe/ART@ZIF) durch koordinationsgetriebene Selbstassemblierung. Freisetzungsexperimente zeigten, dass ART bei pH 7,4 kaum freigesetzt wurde, während 59% ART bei pH 5,0 nach 10 h freigesetzt wurden, was die hervorragende pH-getriggerte Freisetzung demonstriert. Gleichzeitig zeigten ein hoher intrazellulärer ROS- und MDA-Spiegel, begleitet von abnehmendem GSH und GPX4, dass das neu entwickelte Nano-Wirkstoffsystem die Ferroptose markant verstärkte. Im Vergleich zur Monotherapie zeigten In-vitro- und In-vivo-Tumorsuppressionsexperimente eine höhere Effizienz der Tumorsuppression von TA-Fe/ART@ZIF. Diese Arbeit bietet einen neuartigen Ansatz zur Verstärkung der Potenz ferroptotischer Nanomedizin und neue Richtungen für TNBC-Therapie.

Einleitung

Ferroptose, ein neu entdeckter Subtyp des Zelltods, könnte zur Anreicherung eisenabhängiger Lipidhydroperoxide (LPO) führen, was zur Schädigung der Zellstruktur und -integrität führt [1,2,3]. Aufkommende Beweise deuteten darauf hin, dass die Aktivierung von Ferroptose durch mehrere kleine Moleküle ein effektiver Ansatz für Tumorsuppression in verschiedenen experimentellen Krebsmodellen ist und hohe Erwartungen an das Potenzial von Ferroptose als neuartige Antikrebs-Therapie geweckt hat [4,5,6]. Triple-negativer Brustkrebs (TNBC) ist der aggressivste Subtyp von Brustkrebs – ohne zielgerichtete Therapien und oft assoziiert mit Tumorrückfall, Fernmetastasen und Therapieresistenz [7]. Frühere Studien wiesen darauf hin, dass der xCT Cystin/Glutamat-Antiporter in zahlreichen TNBC-Zellen hoch exprimiert ist und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glutathion (GSH)-Spiegel und des Redox-Gleichgewichts spielt [8]. Die Reduzierung des intrazellulären GSH-Gehalts kann TNBC-Zellen für Ferroptose sensibilisieren, wodurch Tumorzellen abgetötet werden [8]. Bemerkenswert ist, dass Ferroptose auch die Resistenz von TNBC gegen routinemäßige programmierte Apoptose umgehen kann [9]. Daher könnten Strategien oder Medikamente, die auf Induktion von Ferroptose basieren, therapeutisches Potenzial für die klinische Behandlung von refraktärem TNBC haben.

Artemisinin (ART), ein Sesquiterpenlacton, das eine Peroxidgruppe enthält, wurde aus der traditionellen chinesischen Pflanze Artemisia annua isoliert und hat eine wünschenswerte Antitumoraktivität in mehreren Krebszelllinien gezeigt [10, 11]. Zunehmende Beweise zeigten, dass Krebszellen signifikant mehr intrazellulären Eisenpool als normale Zellen enthalten, während eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke ART ermöglicht, selektiv Zelltod in mehreren Krebszelllinien zu verursachen [12, 13]. Die eisenionenabhängige Antitumoraktivität hat zunehmende Aufmerksamkeit auf ART-regulierte Ferroptose gelenkt [13]. Mechanistisch kann ART den lysosomalen Abbau von Ferritin in einer autophagy-unabhängigen Weise induzieren, was die zellulären Spiegel von Eisen(II)-Ionen erhöht und Zellen für Ferroptose sensibilisiert [11].

Ob ART jedoch Ferroptose in TNBC induziert, bleibt unklar. Zusätzlich begrenzen eine Reihe von Faktoren wie schlechte Wasserlöslichkeit und unzureichende Verfügbarkeit intrazellulärer Eisen(II)-Ionen die weitere Anwendung von ART in der Antitumortherapie [13]. ART-Nanokomplexe werden erwartet, erfolgreich als prospektives Nano-Wirkstofffreisetzungssystem für ART-basierte Antitumor-Medikamente eingesetzt zu werden [14,15,16]. In den letzten Jahren ziehen Metall-organische Frameworks (MOFs), eine Klasse poröser polymerer Materialien, Aufmerksamkeit auf sich aufgrund von Demonstrationen ihrer großen Porengrößen, hohen scheinbaren Oberflächenbereiche und selektiven Aufnahme kleiner Moleküle [17,18,19]. Als Repräsentant von MOF-Typ-Materialien wird das zeolithische Imidazolat-Framework (ZIF-8) breit in der Entwicklung von Nanomedizin mit Eigenschaften wie pH-Responsivität, hoher Wirkstoffbeladung und guter Biokompatibilität verwendet [20,21,22,23]. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, eine anpassbare Oberfläche auf MOF zu integrieren, die Kontrolle der Oberflächeneigenschaften und ihre Ausstattung mit Multifunktionalitäten [24, 25]. Die supramolekulare Assemblierung einer Metall-Phenol-Koordinationsbeschichtung auf der MOF-Oberfläche hat kürzlich Interesse geweckt aufgrund wünschenswerter Eigenschaften wie stimuliresponsiver Disassembly, kolloidaler Stabilität und Biokompatibilität [26, 27]. Die Metall-Phenol-Koordinationsmaterialien auf dem MOF könnten ein ideales Vehikel für die Abgabe des hydrophoben ART sein.

Inspiriert davon entwickelten wir ein Eisen(II)-Tanninsäure-Koordinations-beschichtetes ZIF-8-Nanosystem, das ART einkapselt (TA-Fe/ART@ZIF), zur Regulation von Ferroptose in TNBC-Zellen, was in Abb. 1 demonstriert wird. ZIF-8 wurde als Nanoträger ausgewählt, um ART einzukapseln, aufgrund seiner guten Biokompatibilität und pH-responsiven Freisetzung. Die Eisen(II)-TA-Koordinationsbeschichtung wurde auf die Oberfläche von ART@ZIF immobilisiert zum Zweck der Dispersionsstabilität und Lieferung von Eisen(II)-Ionen (Fe(II)). Nach der Internalisierung des hergestellten Nanosystems in Zellen würde der saure Abbau der Vehikel die Freisetzung von ART und Anreicherung von Fe(II) erleichtern. Die Hochregulierung der Fe(II)-Spiegel in Zellen würde ART in Radikale durch Spaltung der eisenvermittelten Endoperoxidbrücke zerlegen, was die Effekte von Ferroptose markant verstärkt. Schlussfolgernd könnte die Entdeckung der TA-Fe/ART@ZIF-vermittelten Ferroptose neue Perspektiven für die Entwicklung neuartiger Behandlungen gegen TNBC bieten.

Material und Methoden

Reagenzien

Artemisinin (99%), 2-Methylimidazol (98%), Zinknitrat (ZnNO₃; 98%), TA (98%), Eisensulfat (FeSO₄; 98%) und anhydres Methanol wurden von Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bereitgestellt.

Herstellung von TA-Fe/ART@ZIF Nanopartikeln

Zur Herstellung von ART@ZIF-Nanopartikeln wurden 200 mg ART in 1 ml anhydrem Methanol gelöst, und 2 g 2-Methylimidazol (das Lösungsmittel war 8 ml absolutes Methanol) wurden langsam zur erhaltenen ART-Lösung hinzugefügt. Unter magnetischem Rühren wurden 0,2 g Zinknitrat (das Lösungsmittel war 1 ml absolutes Methanol) langsam hinzugefügt. Schließlich wurde das Volumen der Lösung auf 15 ml eingestellt und 10 min gerührt, um eine hellweiße Lösung zu erhalten. Nach Zentrifugation bei 10.000 rpm wurde die Probe dreimal mit Methanol gewaschen. Der Überstand diente zur Messung des ART-Gehalts, während der Niederschlag gefriertrocknete, um den Feststoff für weitere Verwendung zu erhalten.

Zur Herstellung von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln wurde TA-Lösung (40 mg/ml in deionisiertem Wasser, 2 ml) langsam zur ART@ZIF-Lösung (10 mg/ml, 4 ml) hinzugefügt. Nach 20 min Rühren wurde 5 mg/ml FeSO₄ langsam zur obigen Lösung hinzugefügt. Nach wiederholtem Rühren für 30 min wurde eine dunkelviolette Lösung erhalten. Schließlich wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 10.000 rpm gesammelt. Der Niederschlag wurde dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriertrocknet, um TA-Fe/ART@ZIF für weitere Verwendung zu erhalten.

Charakterisierung

TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japan) wurde verwendet, um die morphologische und elementare Zusammensetzung jedes Teils des Nanopartikels zu bestimmen. Dynamische Lichtstreuung und Zeta-Potenzial (DLS; Zetasizer Nano System Malvern Instruments, Malvern, UK) wurden verwendet, um die Partikelgröße und elektrische Stabilität der Nanopartikel zu bewerten. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Deutschland) und Thermogravimetrische Analyse wurden verwendet, um die Zusammensetzung der Bestandteile der Nanopartikel zu analysieren. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) Messungen wurden mit einem PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics) durchgeführt. Die elementare Zusammensetzung des TA-Fe/ART@ZIF-Materials wurde mit EDX (Carl Zeiss Modell: Neon-40) durchgeführt.

Messung der Einkapselungseffizienz und Beladungskapazität

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) wurde verwendet, um die Menge an ART im Überstand zu messen. Die Wirkstoffbeladung und Einkapselungsrate von ART können wie folgt berechnet werden:

Wirkstoffbeladung (%) = (Tatsächliche Menge des in NPs eingeschlossenen Wirkstoffs / Menge der NPs) × 100%
Einkapselungseffizienz % = (Tatsächliche Menge des in NPs eingeschlossenen Wirkstoffs / Initialmenge des verwendeten Wirkstoffs) × 100%

In-vitro-Freisetzung und pH-Response von TA-Fe/ART@ZIF Nanopartikeln

Die behandelte Dialysemembran, umwickelt mit 2 mg Nanopartikeln, wurde in 50 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit pH 7,4 und 5,0 jeweils platziert und kontinuierlich bei 37 °C geschüttelt. Die Lösung außerhalb der Dialysemembran wurde zu 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h und 10 h nach Experimentbeginn entnommen. Die ART-Gehalte in der Pufferlösung wurden mit HPLC gemessen.

Zellkultur

MDA-MB-231 und L929 Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) erworben. Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO₂ Feuchtigkeit in RPMI-1640 Medium (Solarbio, Peking, China) kultiviert, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (Cyclone, Utah, USA), 100 µg/ml Natrium-Pyruvat, Penicillin und Streptomycin (Solarbio Peking, China).

Zellulärer Toxizitätstest In Vitro

Die Zelllebensfähigkeit wurde mittels 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay gemäß Literaturverfahren [28, 29] bestimmt.

MDA-MB-231 Zellen und L929 Zellen wurden in standardmäßigen Zellmedien in 96-Well-Platten (5.000 Zellen pro Well) kultiviert und in 5% CO₂ bei 37 °C für 24 h inkubiert. Die Flüssigkeit im Well wurde verworfen, und 100 µl pro Well des serumsfreien Mediums mit PBS und verschiedenen Konzentrationen von ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, Deferoxamin (DFO, MedChemExpress, Shanghai, China), N-Benzylcarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) Fluormethylketon (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China) und Ferrostatin-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China) wurden zu den 96-Well-Platten hinzugefügt. Nach 48 h wurden 10 µl MTT (5 mg/ml) hinzugefügt und weitere 4 h inkubiert. Schließlich wurde ein automatischer Enzymmarker (BioTek Instruments Inc., USA) verwendet, um die Absorption in jedem Well zu messen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit ausgedrückt.

Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM) Färbung Assay

MDA-MB-231 Zellen wurden in 24-Well-Platten (2 × 10⁴ Zellen pro Well) kultiviert und 24 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln für 24 h behandelt. Nach Entfernen des Mediums wurden die Zellen mit Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) im Dunkeln bei 4 °C für 20 min gefärbt und unter einem Fluoreszenz-Invertmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) beobachtet.

Durchflusszytometrie für Apoptose

MDA-MB-231 Zellen wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Well unter gleichen Bedingungen platziert. Nach Behandlung mit PBS, ART, TA-Fe/ZIF und TA-Fe/ART@ZIF für 24 h. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und von der 6-Well-Platte gesammelt. Nach Propidiumiodid- und Annexin-V-Doppelfärbung (Annexin V-FITC Kit; Beckman Coulter, Marseille, Frankreich) wurde Durchflusszytometrie zum Nachweis verwendet.

In-vitro Reactive Oxygen Species (ROS) Bestimmungsassay

Der ROS-Gehalt in Zellen wurde mit einer ROS-Fluoreszenzsonde (Dichloro-Dihydro-Fluorescein-Diacetat (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) durchgeführt. MDA-MB-231 Zellen wurden in 6-Well-Platten (2,5 × 10⁵ Zellen pro Well) kultiviert und in 5% CO₂ bei 37 °C für 24 h inkubiert. Die Flüssigkeit aus den Wells wurde verworfen, und Zellen wurden wie folgt behandelt: Blankokontrollgruppe (serumfreies Medium), Positivkontrollgruppe und Experimentelle Gruppe (verschiedene Konzentrationen von Nanopartikeln). Nach Inkubation für 8 h bei 37 °C wurde 0,1% DCFH-DA zu jedem Well hinzugefügt und die Zellen 30 min inkubiert. Zellen, die nicht auf DCFH-DA reagierten, wurden mit PBS entfernt und unter einem Fluoreszenz-Invertmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) beobachtet.

Malondialdehyd (MDA) und GSH Gehaltsbestimmung

Der MDA Assay Kit (TBA-Methode; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) und GSH Assay Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) wurden verwendet, um die intrazellulären MDA- und GSH-Spiegel zu messen. Nach Behandlung mit PBS, ART, TA-Fe/ZIF und TA-Fe/ART@ZIF wurden MDA-MB-231 Zellen gesammelt und gezählt. Der intrazelluläre Gehalt an MDA und GSH wurde gemäß den Anweisungen in den Kits bestimmt.

Western Blot Analyse

Die MDA-MB-231 Zellen, die mit verschiedenen Nanopartikeln behandelt wurden, wurden mit RIPA-Lysepuffer lysiert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proteine verschiedener Proben mit 10% SDS-PAGE-Gel getrennt und auf Nitrocellulosemembran transferiert. Die mit Probenproteinen beladene Nitrocellulosemembran wurde mit 0,5% BSA-Proteinslösung für 1 h blockiert, und die Nitrocellulosemembran und die Primärantikörper wurden 24 h bei 4 °C inkubiert. Wir spülten die Primärantikörper von der Nitrocellulosemembran mit TBST und fuhren fort, sie mit den entsprechenden Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 2 h zu inkubieren. Nach Abwaschen der Sekundärantikörper auf der Zellulosemembran wurde die Nitrocellulosemembran mit einer Chemilumineszenzlösung verwendet und unter dem Gel-Imaging-System beobachtet.

In-vivo Antitumor-Experiment

Alle Tierexperimente wurden vom Ethikkomitee der Weifang Medical University genehmigt. Gesunde weibliche Nacktmäuse (Alter: 4 Wochen; Gewicht: 13–17 g; Vital River, Peking, China) wurden mit 5 × 10⁶ MDA-MB-231 Zellen in 150 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung verabreicht. Als das Tumorvolumen auf 70–120 mm³ anstieg, wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe von Mäusen wurde separat mit PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg) und TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg) behandelt. Jede Maus wurde alle drei Tage durch intraperitoneale Injektion behandelt. Nach 14 Tagen wurden alle Mäuse getötet. Die Tumorgewebe und wichtigen Organe wurden für Hämatoxylin-Eosin-Färbung gesammelt.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Alle Daten wurden statistisch mit der SPSS Version 22.0 Software (IBM Corp., Armonk, USA) analysiert. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. P-Werte < 0,05 bezeichneten statistische Signifikanz.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung von TA-Fe/ART@ZIF Nanopartikeln

Zuerst wurden die ART@ZIF-Nanopartikel bei Raumtemperatur aus Methanol, Zinkacetat, 2-Methylimidazol und ART gemäß Literaturverfahren [30] synthetisiert. Stabile Metall-Polyphenol-Supramolekularfilme wurden dann schnell um die ART@ZIF-Templates durch Wirbeln von TA und Eisenionen gebildet. Im Vergleich zu den berichteten magnetischen Nanopartikeln [31,32,33] wurde TA-Fe/ART@ZIF über die Selbstassemblierungsmethode hergestellt, die TA-Fe-Membran auf der Oberfläche des MOF formatiert, ohne harte chemische oder hydrothermale Reaktionen einzubeziehen. Noch wichtiger: Der TA-Fe/ART@ZIF-Nanoträger kann durch niedrigen pH ausgelöst werden, um ART und Fe(II) freizusetzen, was weiter durch das Endoperoxid von ART katalysiert wird, um C-zentrierte freie Radikale zu erzeugen, was die Ferroptose markant verstärkt. Die Einkapselungseffizienz, gemessen durch HPLC mit dem Überstand der ersten Zentrifugation, betrug 66,7%. Der Überstand wurde aus den TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln gewonnen, und die berechnete Wirkstoffbeladung von ART betrug 11,4%. Laut FTIR-Spektroskopie (Abb. 2a) wurden charakteristische Absorptionspeaks von ART, nämlich die Carbonylbindung bei 1.738 cm⁻¹ und die Peroxid-Brücke bei 724 cm⁻¹ [34], in TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln beobachtet, was anzeigt, dass ART erfolgreich in den Nanopartikeln eingeschlossen war. Als nächstes zeigten die Ergebnisse der thermogravimetrischen Analyse, dass ART vollständig verschwand, als die Temperatur auf etwa 400 °C erhöht wurde (Abb. 2b). Im Vergleich zu den TA-Fe/ZIF-Nanopartikeln stellte sich heraus, dass ART 7,1% des Gesamtgewichts der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel ausmacht, was im Wesentlichen mit den HPLC-Analyseergebnissen konsistent ist.

Die TEM-Ergebnisse zeigten, dass ZIF-8 und ART@ZIF eine ähnliche gleichmäßige hexagonale Konfiguration aufwiesen, und die Partikelgrößenverteilung wurde auf etwa 100 nm bestimmt (Abb. 3a, b). TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel wiesen eine sphärische Konfiguration auf, und die Partikelgrößenverteilung betrug 150 nm. Im Vergleich zum vollständigen ART@ZIF zeigte TA-Fe/ART@ZIF, beschichtet mit Fe(II) und TA, eine offensichtliche konventionelle Kern-Schale-Struktur, und die Größe der TA-Fe-Membran betrug etwa 30 nm (Abb. 3a). Zudem führten wir eine Flächen-Elementar-Mapping-Analyse der gebildeten Nanopartikel durch. Das Flächen-Elementar-Mapping bestätigte, dass der Peripherie der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel von Fe-Element umkreist war, was anzeigt, dass Fe(II) und TA erfolgreich beschichtet waren (Abb. 3b). XPS-Messungen wurden durchgeführt, um die oberflächenelementare Zusammensetzung und Wechselwirkung in TA-Fe/ART@ZIF-Komposit zu untersuchen. Das Weitwinkel-XPS-Spektrum von TA-Fe/ART@ZIF ist in Zusatzdatei 1: Abb. 1s dargestellt. Die Hauptpeaks, die bei etwa 285, 408, 531, 737 und 1036 eV auftreten, waren auf C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p und Zn 2p bezogen, was die Bildung von TA-Fe/ART@ZIF-Nanokomposit demonstriert. Darüber hinaus sind EDS-Mapping-Bilder von TA-Fe/ART@ZIF in Zusatzdatei 1: Abb. 2s gezeigt. Es ist klar zu erkennen, dass die Peaks, die Elementen wie Kohlenstoff (C), Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Eisen (Fe) und Zink (Zn) entsprechen, in guter Übereinstimmung mit dem XPS-Spektrum stehen. Durch Erhöhung der Menge an Fe(II) fanden wir, dass der hydrodynamische Durchmesser der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel zunahm (Zusatzdatei 1: Abb. 3s). Um die Beschichtung weiter zu bestätigen, maßen wir das Zeta-Potenzial verschiedener Nanopartikel. Die Bildung der TA-Fe(II)-Schicht auf ART@ZIF-Partikeln verschob das Oberflächen-Zeta-Potenzial von +21 mV auf −19,5 mV aufgrund der sauren Natur von TA (Zusatzdatei 1: Abb. 4s). Wie frühere Literatur berichtete [30], verleihen die reichlichen Polyphenolgruppen in der TA-Struktur nicht nur dem Substrat Beschichtungsfähigkeit, sondern sind auch in der Lage, mit Übergangsmetallionen (Fe, Zn) zu koordinieren, um Metall-Phenol-Komplexe zu bilden. Wenn Zn²⁺ und Hmim gemischt werden, um eine Lösung zu bilden, würden sich viele Zn²⁺-Ionen an der Oberfläche von ART@ZIF-Partikeln koordinieren; somit beträgt das Zeta-Potenzial von ART@ZIF +21 mV. Die Phenolgruppen von TA (pKa 8,5) wurden negativ deprotoniert und konnten daher mit dem positiv geladenen Zn²⁺ interagieren, was das TA-Fe-Filwachstum auf der ART@ZIF-Oberfläche förderte. Da die Wirkstoffabgabe Träger begünstigt, ist die Stabilität ein wichtiger Faktor für ihre medizinische Anwendung. Die Stabilität der Nanopartikel wurde durch Dispergieren in PBS für eine Woche demonstriert. Wie in Zusatzdatei 1: Abb. 5s gezeigt, präsentierte die Partikelgröße wünschenswerte Größe und Stabilität im Zeitverlauf der Studie.

Freisetzung und Zytotoxizität von TA-Fe/ART@ZIF In Vitro

Als nächstes untersuchten wir, ob TA-Fe/ART@ZIF pH-responsives Zersetzungsverhalten hatte, indem wir die Freisetzung von ART aus Nanopartikeln unter neutralen und sauren Bedingungen untersuchten. Wie in Abb. 4a gezeigt, können die Nanopartikel in sauren Bedingungen innerhalb von 1 h etwa 58% von ART schnell freisetzen. Unter neutralen Bedingungen können die Nanopartikel jedoch nur langsam eine winzige Menge ART freisetzen. Zusätzlich wurde während der Behandlung der externen Lösung der Dialysemembran mit Natriumhydroxid die Lösung der pH = 5,0-Gruppe mit Natriumhydroxid reagiert, um einen beträchtlichen weißen Niederschlag zu produzieren. Dieses Phänomen wurde jedoch in der pH = 7,4-Gruppe nicht beobachtet.

Nach unserer Hypothese ist der weiße Niederschlag ein Zinkhydroxid-Niederschlag, der durch die Dissoziation von Zinkionen und Alkali aus den Nanopartikeln unter sauren Bedingungen gebildet wird. Insgesamt zeigt dieser Beweis erfolgreich, dass unsere Nanopartikel die Fähigkeit haben, sich unter sauren Bedingungen zu dissoziieren.

Im Design des TA-Fe/ART@ZIF-Nanosystems werden die TA-Fe(II)- und ZIF-Strukturen abgebaut, um das eingeschlossene ART und Fe(II) unter den sauren Bedingungen der Tumormikroumgebung freizusetzen. Die Hochregulierung der Fe(II)-Spiegel in Zellen würde ART in Radikale durch Spaltung der eisenvermittelten Endoperoxidbrücke zerlegen, was die Effekte von Ferroptose markant verstärkt. Entsprechend wurden MTT-Assays durchgeführt, um die Zytotoxizität des Nanosystems an MDA-MB-231 Zellen und L929 Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu ART zeigten TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel eine größere Zytotoxizität gegenüber MDA-MB-231 Zellen (Abb. 4b) und geringe Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen (Abb. 4c). TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel inhibierten die Aktivität von MDA-MB-231 Zellen um 53,9%, während ART bei gleicher Konzentration nur 24,1% der gesamten Zellen inhibierte. Die experimentellen Ergebnisse der Calcein-AM-Färbung bestätigten, dass die Anzahl der lebensfähigen MDA-MB-231 Zellen mit zunehmender Konzentration von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln allmählich abnahm (Abb. 4d).

TA-Fe/ART@ZIF Verstärkte ROS-Generierung in MDA-MB-231 Zellen

ART ist bekannt, seine Antikrebsaktivität über Generierung von ROS auszuüben, die durch eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke produziert werden [35, 36]. Daher haben wir die Effizienz von TA-Fe/ART@ZIF zur Induktion von ROS-Generierung mit der 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (DCHF-DA) Sonde [37] untersucht. Wie in Abb. 5 gezeigt, wurde ein leicht stärkeres Fluoreszenzsignal in Zellen beobachtet, die mit ART und TA-Fe/ZIF behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Gruppen, was anzeigt, dass ART und Fe(II)-Ionen ROS-Generierung induzieren konnten. Im Gegensatz dazu wurde in Zellen, die TA-Fe/ART@ZIF-Nanowirkstoff ausgesetzt waren, ein starkes Fluoreszenzsignal als Beweis für gewünschte ROS-Ausbeute gefunden, die durch Spaltung des Fe(II)-vermittelten Endoperoxids von ART generiert wird. Das hergestellte Nanosystem in Zellen würde degradiert werden und Fe(II)-Anreicherung bewirken, was die ROS-Generierung bemerkenswert verstärkt. Die Antikrebswirkung von ART und seinen Derivaten wurde ihrer Fähigkeit zugeschrieben, Apoptose durch verschiedene zelluläre Prozesse zu induzieren, die von DNA-Schadensantwort, lysosomalem katabolischem Prozess Makroautophagie und oxidativem Stress reichen [13, 35, 38]. Es wurde auch berichtet, dass die eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke in ART das intrazelluläre oxidative Gleichgewicht zu Ferroptose in vielen Krebszelltypen beeinflussen könnte [11]. Diese Induktion von Ferroptose basierend auf oxidativem Ungleichgewicht kann durch Zugabe von Fe(II) weiter verstärkt werden. Während Fe(II) ART aktiviert, kann es auch mit intrazellulärem Wasserstoffperoxid reagieren, um Hydroxylfreiradikale durch die Fenton-Reaktion zu generieren, was den Apoptose-induzierenden Effekt von ART in Tumorzellen verstärkt.

TA-Fe/ART@ZIF Induzierte Apoptose und Ferroptose in MDA-MB-231 Zellen

Gleichzeitig untersuchten wir Zelltod und Rolle von Fe(II), indem wir Eisen-Chelator Deferoxamin, Apoptose-Inhibitor Z-VAD-FMK und Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1 verwendeten, um diese Zellen zu retten. Wie vorhergesagt, konnte Deferoxamin, ein Scavenger von Fe(II), den Zelltod offensichtlich blockieren, was die wichtige Rolle von Fe(II) suggeriert. Zudem wurde die Überlebensrate von MDA-MB-231 Zellen signifikant durch Apoptose- und Ferroptose-Inhibitor von 31,4% auf 56,3% und 76,0% verbessert (Abb. 6a), was die Bedeutung von Apoptose und Ferroptose in TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel-vermittelten Zelltod hervorhebt. Zusätzlich verwendeten wir Annexin V-FITC-basierten Assay durch Durchflusszytometrie, um den Grad der Apoptose quantitativ zu bestimmen. Die Ergebnisse besagen, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel Apoptose in 21,8% der MDA-MB-231 Zellen induzieren können (Zusatzdatei 1: Abb. 6s). Dieser Prozentsatz war höher als der für ART aufgezeichnete, was impliziert, dass Apoptose an der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel-vermittelten beteiligt ist, aber nicht die Hauptursache ist.

Ein gemeinsames Merkmal von Ferroptose ist endogene Lipidperoxidation [39]. MDA, ein Produkt der Lipidperoxidation [40], wurde untersucht, um den Grad der Ferroptose zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel etwa 2,5-mal höhere MDA-Spiegel als die Kontrollgruppe hatten (Abb. 6b). Dies wurde aufgrund der Anwesenheit von Nanoträger-angereichertem Fe(II) und der entsprechenden Erhöhung der Lipidradikal-Spiegel vermutet. Als eine der wichtigsten antioxidativen Komponenten in Zellen wird intrazelluläres GSH begleitet von Ferroptose verringert [41]. In Anbetracht der wichtigen Rolle von GSH in Ferroptose bewerteten wir den intrazellulären GSH-Spiegel nach Behandlung mit TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln. GSH war im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Zellen signifikant verringert (Abb. 6c). Dies lieferte starke Evidenz für die Erschöpfung von GSH und oxidatives Ungleichgewicht, zentriert auf der Fe(II)-vermittelten Aktivierung von ART durch TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel. Als nächstes wurde Western Blotting durchgeführt, um den Einfluss von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln auf GPX4-Aktivität [42] zu verstehen. Wir beobachteten, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel eine signifikant stärkere Inhibition der GPX4-Aktivität als ART verursachten (Abb. 6d). Diese Daten stimmten auch gut mit dem höchsten Ausmaß der GSH-Erschöpfung überein.

In-vivo Antitumor-Experiment

Wir bewerteten die antitumorale Wirksamkeit unserer Nanopartikel an MDA-MB-231 Zellen in vivo durch Hemmung subkutaner Xenograft-Tumoren in tumor-tragenden Nacktmäusen. Während der 14-tägigen Behandlung konnten TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel im Vergleich zu anderen Gruppen das Wachstum von MDA-MB-231 Xenograft-Tumoren signifikant inhibieren als Ergebnis reichlicher ROS-Generierung durch Fe(II)-ART-Reaktion (Abb. 7a). Zusätzlich gab es keine signifikante Diversität des Körpergewichts in allen Experimentgruppen (Abb. 7b), was manifestiert, dass TA-Fe/ART@ZIF vernachlässigbare Nebenwirkungen hatte. Um den therapeutischen Effekt weiter zu untersuchen, wurden der Tumor und andere normale Gewebe nach 14-tägiger Behandlung mit H&E-Färbung untersucht. Wie in Abb. 8 gezeigt, verursachte TA-Fe/ART@ZIF den größten Bereich von Zelltod im Tumorgewebe, während es keine offensichtliche Schädigung und Apoptose in den normalen Geweben gab. Insgesamt demonstrierten diese Ergebnisse, dass die TA-Fe/ART@ZIF-vermittelte Therapie nicht nur zu Antikrebswirksamkeit führte, sondern auch ein niedriges Maß an akuter systemischer Toxizität in der SFT-MB-vermittelten Therapie aufwies.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend bietet Ferroptose ein potenzielles Heilmittel für TNBC-Behandlungen, da sie exklusive Vorteile hat, um unvermeidbare Barrieren der derzeit vorherrschenden Therapie zu überwinden. Hier entwarfen wir einen eisenliefernden Nanoträger für ART basierend auf TA-Fe(II) beschichtet auf den ZIF-Nanopartikeln mit eingeschlossenem ART durch koordinationsgetriebene Selbstassemblierung für verstärkte Ferroptose. Der Nanoträger konnte sich in der schwach sauren Mikroumgebung auflösen, um ART und Fe(II) freizusetzen, was weiterhin einen hohen intrazellulären ROS- und MDA-Spiegel verursachte, begleitet von abnehmendem GSH und GPX4, was zu potenter Tumorbeschränkung und Antikrebswirksamkeit in vitro und in vivo führte. Diese Arbeit bietet einen neuartigen Ansatz zur Verstärkung der Potenz ferroptotischer Nanomedizin und neue Richtungen für TNBC-Therapie. Biokompatibilität und umfassende Mechanismen der TA-Fe/ART@ZIF-induzierten Ferroptose sollten für weitere Untersuchungen sichergestellt werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind vollständig ohne Einschränkung verfügbar.

Abkürzungen

MOF:

Metall-organische Frameworks

TNBC:

Triple-negativer Brustkrebs

ART:

Artemisinin

TA:

Tanninsäure

ZIF:

Zeolithisches Imidazolat-Framework-8

TA-Fe/ART@ZIF:

Tanninsäure und Eisenion beschichtet auf zeolithischem Imidazolat-Framework-8 mit eingeschlossenem Artemisinin

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

LPO:

Lipidhydroperoxide

GSH:

Glutathion

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid

DFO:

Deferoxamin

Fer-1:

Ferrostatin-1

Z-VAD-FMK:

N-Benzylcarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) Fluormethylketon

Calcein-AM:

Calcein-Acetoxymethyl

DCFH-DA:

Dichloro-Dihydro-Fluorescein-Diacetat

MDA:

Malondialdehyd

BSA:

Rinderserumalbumin

TBST:

Tris-gepufferte Salzlösung Tween

SDS-PAGE:

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

GPX4:

Glutathionperoxidase 4