Co-Lieferung von Dacarbazin und All-Trans-Retinsäure (ATRA) unter Verwendung von Lipid-Nanoformulierungen für eine synergistische Antitumor-Wirksamkeit gegen malignes Melanom

Einführung

Das maligne Melanom gehört zu den aggressiven bösartigen Erkrankungen, die überwiegend in der menschlichen Haut vorkommen [1]. Melanome machen 4 % aller dermatologischen Krebsarten aus, sind jedoch für 80 % der Hautkrebssterblichkeit verantwortlich und werden in unterentwickelten und Entwicklungsländern zunehmend besorgniserregend [2, 3]. Melanome haben eine hohe Tendenz, in die verschiedenen Teile des Körpers zu metastasieren, einschließlich des Gehirns, des Herzens und der Lunge, was es zu einer der aggressiven Formen von Malignomen macht [4]. Bei frühzeitiger Diagnose ist die chirurgische Exzision eine der möglichen therapeutischen Optionen. Ein operativer Eingriff garantiert jedoch keine vollständige Genesung vom Melanom [5]. Außerdem wird die radiale Wachstumsphase dieser Malignität gegenüber den meisten anderen Behandlungsoptionen, einschließlich Chemotherapie und Strahlentherapie, resistent [6]. Genauer gesagt werden Peptidrezeptoren auf der Oberfläche von Melanomkrebs überexprimiert, was es zu einer attraktiven Aussicht macht. Es wurde gezeigt, dass der Subtyp-2-Somatostatin-Rezeptor (SSTR2) in den Melanomzellen stark exprimiert wird [7].

Dacarbazin (DBZ) oder Dimethyl-Triazeno-Imidazol-Carboxamid (DTIC), ein DNA-Alkylierungsmittel, ist das einzige und von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Chemotherapeutikum der ersten Wahl [8]. DBZ ist ein starkes Alkylierungsmittel, das die Krebszellen abtötet, indem es die Alkylgruppen an die DNA oder das Kernmaterial von Krebszellen anfügt [9]. Trotz seiner starken Wirkung leidet DBZ an einer schlechten Wasserlöslichkeit und einer kurzen Halbwertszeit (41 min) im Blutkreislauf, was seine therapeutische Wirkung bei der Behandlung von malignen Melanomen verringert [10]. Außerdem wurde eine enttäuschende Ansprechrate zwischen 10 und 25 % mit weniger als 5 % vollständiger Krebsheilung beobachtet, was auf die Einschränkung einer Therapie mit einem einzigen Wirkstoff hindeutet [11, 12]. Daher ist es dringend erforderlich, eine alternative Strategie zu entwickeln, um die Behandlungswirksamkeit von DBZ zu verbessern.

Die gleichzeitige Verabreichung mehrerer Therapeutika in einer einzigen Verabreichung erwies sich als wirksamer als die des einzelnen Therapeutikums [13]. Die gemeinsame Abgabe von Therapeutika in einem einzigen Trägersystem wird die synergistische Aktivität, ähnliche pharmakokinetische Eigenschaften und eine höhere Antikrebswirksamkeit verleihen [14]. All-trans-Retinsäure (ATRA) ist ein vielversprechendes Antikrebsmittel, das bei der Behandlung mehrerer Krebsarten eingesetzt wird [15]. Das ATRA zeigte seine therapeutische Wirksamkeit durch die Bindung an die Retinsäurerezeptoren im Kern von Krebszellen, was zur Hemmung des Wachstums, der Proliferation, der Differenzierung und schließlich des Zelltods führte [16]. Im Gegensatz zu anderen Chemotherapeutika führte ATRA zu keinen Nebenwirkungen wie Kardiotoxizität oder Knochenmarkshypoplasie. Es wurde berichtet, dass ATRA die Wirksamkeit gegen Krebs verstärkt, wenn es in Kombination mit einem geeigneten Chemotherapeutikum verwendet wird. Auch hier leidet lipophiles ATRA unter einer schlechten Wasserlöslichkeit und einer schnellen systemischen Clearance, was die Notwendigkeit eines stabilen Abgabesystems erfordert [17].

Es hat sich gezeigt, dass nanopartikuläre Abgabesysteme die therapeutische Wirksamkeit von verkapselten Therapeutika verbessern, indem sie diese in das Zieltumorgewebe freisetzen und den Off-Target-Effekt im systemischen Kreislauf vermeiden, indem sie einen verbesserten Permeations- und Retentionseffekt (EPR) einsetzen [18, 19]. Die festen Lipid-Nanopartikel (SLN) gelten aufgrund der herausragenden Eigenschaften wie verbesserte Stabilität, kontrollierte Wirkstofffreisetzung, hohe Beladungseffizienz und einfache Herstellung/Vergrößerung als Alternative zu vielen bestehenden Trägern, einschließlich Liposomen oder Mizellen [20] . Einer der wichtigen Aspekte von SLN als Wirkstoffträger ist das Sicherheitsprofil von Lipiden mit GRAS-Status, gut verträglichen und physiologischen Lipiden [21]. Der stabile Einbau von Medikamenten in den Lipidkern verbessert die Wasserlöslichkeit und verbessert das pharmakokinetische Profil und verlängert die physiologische Stabilität im systemischen Kreislauf [22].

In dieser Studie adressieren wir eine vielversprechende Strategie der gemeinsamen Abgabe von DBZ und ATRA unter Verwendung von Lipid-Nanoformulierungen für die Kombinationsbehandlung bei malignen Melanomen. Es wird erwartet, dass DBZ in den Lipidkern geladen wird, während ATRA ein Teil der Nanopartikelstruktur ist. Wir untersuchten die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die zelluläre Aufnahme und die In-vitro-Zytotoxizität von kombinierten Nanopartikeln. Darüber hinaus wurde die Antikrebswirkung durch Apoptose-Assay, Zellzyklusanalyse, Koloniebildung und Zellmigrationsanalyse weiter bewertet.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir erfolgreich mit Dacarbazin und all-trans-Retinsäure beladene Lipid-Nanoformulierungen formuliert. Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass RD-LNF die Proliferation von Melanomzellen hemmt, eine bemerkenswerte Apoptose induziert und das Fortschreiten des Zellzyklus und die Zellmigration hemmt. Futuristische Arbeiten werden sich auf die Untersuchung der Antikrebswirksamkeit in klinisch relevanten Tiermodellen und die Entwicklung einer gezielten Therapie für das maligne Melanom konzentrieren. Dies ist eine Vorstudie an den Melanomzellen und breit angelegte Studien in verschiedenen klinisch relevanten Tiermodellen sind der nächste Teil unserer Forschungsarbeit.

Materialien und Methoden

Herstellung von DBZ/ATRA-beladenen Lipid-Nanoformulierungen

Die arzneimittelbeladenen Lipid-Nanopartikel wurden durch das Beschallungsverfahren hergestellt. Kurz gesagt wurden 10 mg DBZ und 10 mg ATRA in 2 ml einer Chloroformlösung gelöst, die 50 mg Egg l-α-Phosphatidylcholin (PC) und 2 mg DSPE-Methyl(polyethylenglykol)-2000 (mPEG₂₀₀₀ ). Das organische Lösungsmittel wurde unter Verwendung von Argongas für 20 Minuten getrocknet. Das getrocknete Arzneimittel + Lipid-Gemisch wurde mit 80 mg Trimyristin (Tm) versetzt und 1 h bei 65 °C inkubiert. Zu dieser Ölmischung wurden 5 ml 4% Poloxamerlösung zugegeben und sofort bei 80 W für 6 min mit einer Sonde beschallt. Die resultierende Emulsion wurde 30 min auf Eis gekühlt. Die Nanopartikel wurden einer Amicon Ultra 0.5 Zentrifugalfiltereinheit (3 kDa Cutoff; Merck, Deutschland) bei 12000 × g . ausgesetzt für 20min. Die Menge an freiem DBZ und ATRA im Filtrat wurde durch das HPLC-Verfahren bewertet und die Beladungseffizienz und Beladungskapazität wurden berechnet. Für die Arzneimittelanalyse wurde ein Waters HPLC-System bestehend aus einer Waters 1525 Binärpumpe, Waters 2487 UV Detektor, Waters 2475 Fluoreszenzdetektor, 1500 Säulenheizer und einer Symmetry C18 Säule verwendet. Für ATRA bestand die mobile Phase aus Acetonitril und Trifluoressigsäure im Verhältnis 90/10 v/v bei einer Flussrate von 1 ml/min und wurde bei 348 nm nachgewiesen. Für DBZ wurden Acetonitril und 0,05 M Dinatriumhydrogenphosphat im 30/70 V/V-Verhältnis mit 0,5% TEA verwendet. Der pH-Wert der mobilen Phase wurde bei pH 3,7 gehalten und es wurde eine Flussrate von 1 ml/min verwendet.

Partikelgrößen- und Morphologieanalyse

Die Partikelgrößenverteilung der kombinierten Nanopartikel wurde von Malvern Zetasizer Nano ZS90 mit einem He-Ne-Laser (633 nm) bewertet. Alle Proben wurden mit destilliertem Wasser verdünnt und die Experimente wurden bei 24 °C in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Morphologie des Nanopartikels wurde durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM; JEOL JEM200CX bei 120 kV) bewertet. Die verdünnten Partikel wurden mit 2% Phosphorwolframsäure gefärbt, getrocknet und unter TEM untersucht.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung von wirkstoffbeladenen Nanoformulierungen

Die Freisetzung von verkapselten Arzneimitteln wurde durch das Dialyseverfahren bewertet. Zwei Milliliter arzneimittelbeladener Nanopartikel, die ein Äquivalent von 1 mg ATRA und 1 mg DBZ enthielten, wurden in einer Dialysemembran (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa) versiegelt. Das Dialyseröhrchen wurde in 25 ml Freisetzungspuffer gegeben und bei einer Rotation von 100 U/min bei 37 °C gehalten. In einem vorgegebenen Zeitintervall bis 72 h wurden 1 ml Proben entnommen und durch frischen Puffer gleicher Menge ersetzt. Die Menge an DBZ und ATRA wurde durch das HPLC-Verfahren wie oben beschrieben bewertet.

Zellkultur und zelluläre Aufnahmeanalyse

Melanomzellen der Maushaut (B16F10) wurden von China Infrastructure of Cell Line Resources (Beijing, China) gekauft. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10 % FBS und 1 % der Antibiotikamischung ergänzt war. Die Medien wurden regelmäßig alle 2 Tage gewechselt und nach 90 % Konfluenz kultiviert. Zur Analyse der zellulären Aufnahme wurden B16F10-Zellen in einer 6-Well-Platte für eine 24-stündige Inkubation ausgesät. Die Nanopartikel wurden mit Cumarin-6 als Fluoreszenz-Tracker beladen. Das alte Medium wurde entfernt und durch ein frisches Medium mit den Cumarin-6-Lipid-Nanopartikeln ersetzt und für 1–3 h in umgekehrter Reihenfolge inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit einem Zellschaber verschrottet. Die Zellen wurden 5 min bei 1200 Upm zentrifugiert und das Zellpellet in 1 ml kaltem PBS resuspendiert. Die Proben wurden mit dem AccuriTM C6 Durchflusszytometer (BD Co., USA) bewertet.

In-vitro-Zytotoxizitäts-Assay

Die zytotoxische Wirkung von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF auf B16F10-Zellen wurde durch MTT-Assay bewertet. Die Zellen (1 × 10 ⁴ ) wurden in jedes Well der 96-Well-Platte ausgesät und für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen an freiem ATRA und DBZ behandelt und ihre Antikrebswirkung auf die Melanomzellen getestet. Anschließend wurden die Zellen mit einer festen Konzentration von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF von 25 µg/ml bzw. 50 µg/ml behandelt. Die Zellen wurden 24 h inkubiert und dann wurde das Medium vorsichtig entfernt und zweimal mit PBS gewaschen. Am Ende wurden die Zellen mit 100 µl 5 mg/ml MTT-Lösung behandelt und 4 h inkubiert. Das Kulturmedium wurde vorsichtig entfernt und mit 100 µl Isopropanol versetzt und 15 min unter Schüttelbedingungen inkubiert. Die gelösten Formazankristalle wurden bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts untersucht. Unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet und Berechnungen wurden basierend auf der Zelllebensfähigkeit der Kontrollen durchgeführt.

Apoptose-Assay – Durchflusszytometer

Die Apoptosewirkung von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF in B16F10-Zellen wurde nach der Färbung mit PE-Annexin V und einem 7AAD-basierten Apoptose-Kit bewertet. Die Zellen wurden in einer 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung und für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit 25 &mgr;g/ml Äquivalenten freier ATRA-, DBZ-, D-LNF- und RD-LNF-Formulierungen behandelt und unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle betrachtet. Nach 24 Stunden Behandlungszeit wurden die Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers gefärbt. AccuriTM C6 Durchflusszytometer wurde für die PE- und 7AAD-Expression verwendet und im Durchflusszytometer wurden mindestens 10.000 Ereignisse erfasst. PE-positive und 7AAD-negative Zellen waren früh apoptotisch; PE-positive und 7AAD-positive Zellen waren spät apoptotisch.

Zellzyklusanalyse – Durchflusszytometer

Die Zellen wurden in einer 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung und für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit 25 &mgr;g/ml Äquivalenten freier ATRA-, DBZ-, D-LNF- und RD-LNF-Formulierungen behandelt und unbehandelte Zellen wurden als Kontrolle betrachtet. Nach 24 h wurden die behandelten Zellen gewaschen und durch Trypsinierung gesammelt und mit 70 % Ethanol für 2 h bei 4 °C fixiert. Die Zellen wurden dann mit Ribonuklease behandelt, um jegliche RNA-Kontaminationen loszuwerden. Nun wurden die Zellen mit Propidiumiodid (PI) für 30 min bei 37 °C im Brutschrank gefärbt. Die Fluoreszenz von PI-gefärbten Zellen wurde mit dem AccuriTM C6 Durchflusszytometer bestimmt. Die Zellzyklusphase wurde in subG1-, G1-, S- und G2/M-Phase unterteilt.

Kolonie-Bildungs-Assay

Die Zellen wurden in 12-Well-Platten mit einer Zelldichte von 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Vertiefung und für 24 h inkubiert. Die Zellen wurden mit 25 &mgr;g/ml Äquivalenten freier ATRA-, DBZ-, D-LNF- und RD-LNF-Formulierungen behandelt. Die behandelten Zellen wurden trypsiniert, gewaschen und unter Verwendung eines Zellzählers gezählt. Die Zellen wurden dann in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 1500 Zellen/Well ausgesät. Die Zellen wurden dann 12 Tage unter Umgebungsbedingungen von 37 °C inkubiert, bis die Kolonien sichtbar waren. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Methanol an Essigsäure an Wasser (1:1:8) für 10 Minuten fixiert, gefolgt von einer Färbung mit 0,1% Kristallviolett-Färbung für 45 Minuten. Die gefärbten Zellen wurden dann unter einem Lichtmikroskop beobachtet.

Zellmigrations-Assay

Für diesen Assay wurde eine 12-Well-Transwell-Kammer mit einer Porengröße von 8 &mgr;m verwendet. Um die Studie zu starten, 5 × 10 ⁴ Zellen/Vertiefung wurde in der oberen Kammer ausgesät. Das obere Medium ist frei von FBS, während das Medium der unteren Kammer aus 10 % FBS besteht. Nach 24 h wurde die zur unteren Membranoberfläche gewanderte Zellmenge fixiert und mit 0,5% Kristallviolett-Farbstoff gefärbt. Die Anzahl der Zellen wurde in fünf Feldern gezählt, die zufällig unter einem Lichtmikroskop ausgewählt wurden; die durchschnittliche Zellzahl wurde aufgezeichnet und analysiert.

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Zwei Gruppen wurden mit ungepaarten t . verglichen Tests, während der Vergleich von mehr als zwei Gruppen unter Verwendung einer Einweg-ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest der Türkei durchgeführt wurde. Die Statistik wurde mit der GraphPad Prism-Software und einem Unterschied von p . durchgeführt <0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von DBZ/ATRA-beladenen Lipid-Nanoformulierungen

Die Behandlung des Melanoms bleibt eine große Herausforderung, und Standardbehandlungsoptionen, einschließlich Chemotherapie oder Strahlentherapie oder chirurgische Resektion, werden nur bei soliden Bulktumoren mit schlechter Prognose wirksam sein. Die FDA hat Medikamente wie Paclitaxel oder seine Kombination zugelassen, konnte jedoch die Gesamtwirkung auf das Überleben der Patienten und die Krebsheilung nicht verbessern. Dacarbazin (DBZ) ist das von der FDA zugelassene Chemotherapeutikum der ersten Wahl; DBZ leidet jedoch unter schlechten physikalisch-chemischen Eigenschaften und führte zu einer enttäuschenden Ansprechrate zwischen 10 und 25 %. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine neuartige therapeutische Strategie der Kombination mit ATRA und DBZ in Lipid-Nanoformulierungen entwickelt (Abb. 1). Wir stellten die Hypothese auf, dass die Kombination von zwei therapeutischen Komponenten die Antitumor-Wirksamkeit bei malignen Melanomen verbessern wird. Es ist erwähnenswert, dass ATRA zwar die krebshemmenden Eigenschaften aufweist, jedoch keine negativen Auswirkungen in der systemischen Umgebung hatte [23]. Da das DBZ von Natur aus hydrophob ist, haben wir Lipid-Nanoformulierungen entwickelt, die die hydrophoben Wirkstoffe stabil in den Lipidkern einbringen können, und ATRA wird als struktureller Bestandteil der Nanopartikel geladen. Die Lipid-Nanopartikel, die die therapeutischen Komponenten tragen, werden dazu beitragen, den weit tiefen Tumor im Körper zu transportieren. Die Ladeeffizienz von DBZ und ATRA betrug 91,2 ± 1,25 % bzw. 95,8 ± 1,14 %. Die Beladungskapazität von DBZ und ATRA in RD-LNF betrug 7,07 ± 0,65% w/w bzw. 7,48 ± 1,05% w/w. Es wurde beobachtet, dass die Partikelgröße von D-LNF 121,5 ± 1,65 nm mit einem Polydispersitätsindex (PDI) von 0,134 und einem Zetapotential von –23,5 ± 0,85 mV betrug. Die Partikelgröße von RD-LNF betrug 138,2 ± 1,28 nm mit einem PDI von 0,159 und einem Zetapotential von – 25,4 ± 0,58 mV. Die Zunahme der Gesamtpartikelgröße wurde hauptsächlich der strukturellen Beladung von ATRA zugeschrieben; die endgültige Größe von RD-LNF betrug jedoch weniger als 150 nm, was eine bevorzugte Akkumulation der malignen Melanomtumore aufgrund des EPR-Effekts ermöglichte. Außerdem verhindert das Vorhandensein von hydrophilem PEG die Aggregation von Partikeln und verringert seine Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES) und verbessert dadurch seine systemische Leistung im Körper. Die Oberflächenladung von etwa – 25 mV verleiht eine ausgezeichnete Lagerstabilität. Die Partikelmorphologie wurde mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) untersucht (Abb. 2). Wie zu sehen ist, sind sowohl D-LNF als auch RD-LNF perfekt kugelförmig und gleichmäßig im Kupfergitter verteilt. Der Größenunterschied zwischen D-LNF und RD-LNF stimmte mit der DLS-Beobachtung überein. Das Fehlen von Partikelablagerungen, kleinen Partikeln und Aggregation zeigt den Erfolg des Formulierungsprozesses an.

Struktur von Dacarbazin (DBZ) und all-trans-Retinsäure (ATRA). Es wird eine schematische Darstellung von DBZ/ATRA-beladenen Lipid-Nanoformulierungen präsentiert. Die Lipid-Nanoformulierung wurde durch ein Ultraschallverfahren hergestellt. Sowohl DBZ als auch ATRA sind hydrophobe Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 300 g/mol. Es wird erwartet, dass sich die hydrophoben Moleküle im Kern der Nanopartikel konzentrieren, die durch ein Tensid stabilisiert werden

Morphologische Analyse von D-LNF und RD-LNF mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Ein repräsentatives Bild mit der genauen Morphologie wird präsentiert

Stabilitätsanalyse und In-vitro-Wirkstofffreisetzung aus D-LNF und RD-LNF

Der RD-LNF zeigte eine ausgezeichnete Stabilität sowohl bei pH 7,4 (PBS) als auch bei Serumbedingungen (10 % FBS) (Fig. 3a). Die Partikelgröße zeigte bei beiden Bedingungen während des Untersuchungszeitraums keinen signifikanten Anstieg, was auf die Stabilität der Nanopartikel hinweist. Die Fähigkeit zur rechtzeitigen Wirkstofffreisetzung entscheidet über die Wirksamkeit der wirkstoffbeladenen Nanopartikelsysteme. Wir haben die Freisetzungskinetik von DBZ und ATRA aus D-LNF und RD-LNF in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) durchgeführt. Wie in Abb. 3b gezeigt, wurde aus keinem der Zwei-Nanopartikel-Systeme keine Burst-Freisetzung oder phasenweise Freisetzung des Arzneimittels beobachtet, was auf die stabile Beladung im Kern der Nanopartikel und nicht in der Nanopartikel-Oberfläche hinweist. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Freisetzung von DBZ von D-LNF und RD-LNF beobachtet, was darauf hinweist, dass die Anwesenheit von ATRA das Freisetzungsmuster des Arzneimittels nicht verlangsamte oder veränderte. Eine leichte Verzögerung bei der Wirkstofffreisetzung von DBZ aus RD-LNF könnte der erhöhten Pfadlänge zugeschrieben werden, die dem ATRA in der Lipidstruktur zugeschrieben wird. Es ist interessant festzustellen, dass ATRA im Vergleich zu DBZ im RD-LNF-Trägersystem deutlich langsamer freigesetzt wird. Nach 24 h bis 72 h traten signifikante Unterschiede auf, die hauptsächlich auf die extrem hydrophobe Natur von ATRA und die strukturelle Komponente zurückzuführen sind. Insgesamt wird das Fehlen von Burst-Release und kontrollierter Freisetzung von therapeutischen Komponenten der Melanomkrebsbehandlung zugute kommen.

a Stabilitätsanalyse von RD-LNF unter pH 7,4 und Serum (10% FBS) Bedingungen. b In-vitro-Wirkstofffreisetzung von DBZ aus D-LNF; und in vitro-Wirkstofffreisetzung von DBZ und ATRA aus RD-LNF. Die Freisetzungsstudie wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) über einen 72-stündigen Studienzeitraum durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n =4)

In-vitro-Zelluläre Aufnahme

Eine höhere oder verstärkte zelluläre Aufnahme des Nanopartikels bestimmt die therapeutische Wirksamkeit in den Krebszellen. Wir haben die zelluläre Aufnahme von RD-LNF in B16F10-Krebszellen durchgeführt und Coumarin-6 wurde als fluoreszierender Tracker verwendet. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurde nach 1 h Inkubation der Nanopartikel eine bemerkenswerte Internalisierung von Nanopartikeln beobachtet, und die Aufnahme stieg bis 3 h konsequent an. Die bemerkenswerte Aufnahme von Lipid-Nanoformulierungen steht im Einklang mit der höheren zellulären Aufnahme des lipidbasierten Trägersystems. Es wurde spekuliert, dass der passive Diffusions- und Endozytose-basierte Mechanismus für die höhere zelluläre Aufnahme verantwortlich sein könnte. Die Nanopartikel erreichen nach der Endozytose das Lysosom, wo die verkapselten Wirkstoffe freigesetzt werden und ihre jeweiligen pharmakologischen Wirkungen entfalten.

In-vitro-Analyse der zellulären Aufnahme von B16F10-Melanomzellen. Die Krebszellen wurden mit RD-LNF behandelt und die Inkubationszeiten wurden von 1 h bis 3 h variiert und die zelluläre Aufnahme wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Der Coumarin-6 wurde als fluoreszierender Tracker verwendet

In-vitro-Zytotoxizitäts-Assay

Der MTT-Assay wurde an B16F10-Zellen nach der Behandlung mit den jeweiligen Formulierungen durchgeführt, um die Antikrebswirkung einzelner Therapeutika zu bewerten (Abb. 5a). Zunächst wurde die Zytotoxizität von individuellem freien DBZ und ATRA bewertet. DBZ zeigte eine konzentrationsabhängige zytotoxische Wirkung in den Melanom-Krebszellen, während ATRA eine signifikant höhere zytotoxische Wirkung in den B16F10-Zellen zeigte. Bei 100 µg/ml zeigte DBZ eine Zelllebensfähigkeit von ~ 45 % im Vergleich zu ~ 22 % Zelllebensfähigkeit für ATRA, was auf die ausgezeichnete therapeutische Wirksamkeit von ATRA hinweist. Um zu beweisen, dass die gemeinsame Abgabe von DBZ und ATRA möglicherweise das Fortschreiten der Krebserkrankung hemmen könnte, wurden DBZ+ATRA-beladene Lipid-Nanoformulierungen (RD-LNF) an Melanomzellen behandelt. DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen (D-LNF), die das Einzelwirkstoff enthalten, wurden als Referenzgruppe verwendet, um die synergistische Wirksamkeit von ATRA hervorzuheben (Abb. 5b). Wie erwartet, zeigte ATRA bei einer festen Konzentration von 25 μg/ml im Vergleich zu DBZ eine geringfügig geringere Zelllebensfähigkeit, während D-LNF auf Nanopartikelbasis die Antikrebswirkung von DBZ nicht verbesserte und bei weitem nicht wirksam blieb. Wie erwartet zeigte RD-LNF eine signifikant geringere Zelllebensfähigkeit und eine höhere Antikrebswirkung im Vergleich zu D-LNF, was auf eine offensichtliche synergistische therapeutische Wirkung von zwei Komponenten auf den Melanomkrebszelltod hindeutet. RD-LNF zeigte im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen eine signifikant höhere Antikrebswirkung. Es könnte erwartet werden, dass die langsame und anhaltende Freisetzung von DBZ zusammen mit der langsamen Freisetzung von ATRA aus dem Nanoträgersystem zu der synergistischen therapeutischen Wirkung beitragen könnte. In dieser Studie war Dacarbazin (DBZ) das wichtigste Chemotherapeutikum und ATRA wurde als struktureller Bestandteil von Lipid-Nanopartikeln verwendet, bildete daher keine separate Gruppe für R-LNF. Wir haben die Antikrebswirkung von bloßem ATRA und DBZ in den Krebszellen untersucht. Außerdem belegen viele veröffentlichte Berichte die krebsbekämpfende Wirkung von ATRA; Daher haben wir ATRA als strukturelle Komponente verwendet, die auch die Antikrebswirksamkeit von verkapselten Therapeutika auf synergistische Weise verbessern könnte.

a In-vitro-Zytotoxizitätstest von freiem DBZ und ATRA in einer konzentrationsabhängigen Weise. b In-vitro-Zytotoxizität von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF bei einer festen Konzentration von 25 µg/ml und 50 µg/ml

Kolonie-Bildungs-Assay

Der Koloniebildungstest wurde durchgeführt, um das Potential der Tumorentstehung von Melanomzellen zu bewerten. Wie gezeigt, spielen freies DBZ und ATRA eine begrenzte Rolle bei der Hemmung der Koloniebildung und in ähnlicher Weise war D-LNF bei der Kontrolle der Koloniebildung unwirksam (Fig. 6). Wie erwartet führte die Kombination von DBZ + ATRA zu einer signifikanten Verstärkung der Hemmung der Koloniebildung im Vergleich zu der von einzelnen freien Wirkstoffen oder einzelnen Wirkstoff-beladenen Nanopartikeln. Der Kolonie-Formulierungs-Assay bestätigt die überlegene Antikrebs-Wirksamkeit von RD-LNF gegenüber freien Arzneimitteln.

Wirkung von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF auf die Koloniebildung. B16F10-Zellen wurden mit entsprechenden Formulierungen behandelt und die Koloniebildung wurde nach Kristallviolettfärbung fotografiert.

In-vitro-Apoptose-Assay und Zellzyklusanalyse

Die Apoptose-Induktion von B16F10-Zellen nach Behandlung mit D-LNF und RD-LNF wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers nach Färbung der Zellen mit Annexin V-FITC/PI-Mischung untersucht (Fig. 7a). Wie gezeigt, verursachten ATRA und DBZ nur 10–12% der Apoptose von Krebszellen und viele der Zellen bleiben intakt. Eine leichte Zunahme der frühen apoptotischen Zellen wurde nach der D-LNF-Behandlung beobachtet, was auf die Wirkung des Trägers hinweisen könnte. Wichtig ist, dass RD-LNF einen größeren Anteil an Apoptosezellen mit einem größeren Anteil an Zellen in der späten Apoptose und frühen Apoptose induzierte, was auf die überlegene Antikrebswirkung von kombinatorischen Nanopartikeln hinweist. RD-LNF zeigte, dass die Zellen der späten Apoptose um 21,5% zunahmen, während die Zellen der frühen Apoptose auf bis zu 18,3% zunahmen und der Anteil der lebensfähigen Zellen von 95 auf 52% abnahm, was darauf hindeutet, dass die Kombination von DBZ + ATRA zur Apoptose von Krebszellen beitrug und hemmen die proliferative Hemmung von B16F10-Melanomzellen. Die Apoptosewirkung der Formulierungen wurde durch Zellzyklusanalyse weiter bestätigt. Wie gezeigt, zeigten DBZ und ATRA einen leichten Anstieg in der Sub-G0-Population, während D-LNF eine relativ höhere Sub-G0-Population im Vergleich zu einzelnen freien Arzneimitteln aufwies (Fig. 7b). Bemerkenswerterweise wurde ein bemerkenswerter Anstieg der Sub-G0-Population für mit RD-LNF behandelte Melanomzellen beobachtet, was auf die ausgeprägte Apoptose der Krebszellen hinweist. Es ist bekannt, dass DBZ die Expressionsniveaus von p21, Caspase-3 und gespaltenem PARP erhöhen könnte und dadurch die Zellapoptose durch die Stabilisierung von p53 fördert. Die Induktion von p53 hemmt die Zellzyklusprogression [24, 25]. Es wird erwartet, dass die Kombination von DBZ + ATRA den Apoptosemechanismus potenziert und das Fortschreiten des Zellzyklus von Krebszellen stoppt und die Antikrebswirkung zeigt.

a Illustration der Apoptose von B16F10-Zellen nach Behandlung mit freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF. Die unbehandelten Zellen wurden als geeignete Kontrolle betrachtet. Die Apoptose wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. b Illustrationen der Zellzyklusanalyse, die in B16F10-Zellen nach Behandlung mit entsprechenden Formulierungen durchgeführt wurde

Auswirkung kombinierter Nanopartikel auf die Zellmigration

Die Zellmigration wurde durch die Transwellmembran analysiert und die wandernden Zellen durch Kristallviolettfärbung beobachtet (Abb. 8). Nach 24 Stunden hatten die Kontrollzellen fast die vollständige Migration der Krebszellen erreicht. ATRA scheint die Zellmigration relativ besser zu hemmen als DBZ-behandelte Zellen. D-LNF zeigte auch eine bemerkenswerte hemmende Wirkung auf die Zellmigration; der bemerkenswerteste Zellmigrationseffekt wurde jedoch bei mit RD-LNF behandelten B10F16-Melanomzellen beobachtet. Wie zu sehen ist, wurde im Vergleich zu den nicht behandelten Kontrollzellen eine vielfach verringerte Zellmigration beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass RD-LNF möglicherweise die anomale maligne Zellproliferation verringert und die Zellmigration effizient unterdrückt.

Repräsentative Mikrofotografien des Zellmigrationsassays von B16F10-Zellen nach Behandlung mit freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF und deren Quantifizierung

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend

Abkürzungen

DBZ:

Dacarbazin

ATRA:

All-trans-Retinsäure

D-LNF:

DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen

RD-LNF:

ATRA/DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen

SLN:

Feste Lipid-Nanopartikel