Verbesserter Antitumor-Effekt von Dacarbazin und All-trans-Retinsäure ko-delivert über Lipid-Nanopartikel bei malignem Melanom

Zusammenfassung

Malignes Melanom ist ein hochaggressiver Hautkrebs, der für 80 % der Mortalität verantwortlich ist; das Gesamt-Medianüberleben bei Patienten mit metastasiertem Melanom beträgt nur 6–9 Monate. Kombinationstherapie durch simultane Verabreichung dualer Wirkstoffe in einem einzelnen Nanocarrier hat sich als elegant und effektiv zur Krebsbekämpfung erwiesen. Hier setzen wir eine Kombinationstherapie basierend auf Dacarbazin (DBZ), dem von der FDA zugelassenen Medikament gegen Melanom, und All-trans-Retinsäure (ATRA), einem vielversprechenden Antikrebsmittel, ein, geladen auf Lipid-Nanoformulierungen (RD-LNF) als neue Behandlungsstrategie für malignes Melanom. Wir haben beide Wirkstoffe erfolgreich in Lipid-Nanoformulierungen eingekapselt und eine kontrollierte Freisetzung der Payload über die Zeit demonstriert. Wir zeigten, dass die simultane Delivery von DBZ und ATRA die Zellproliferation in konzentrationsabhängiger Weise effektiv reduzieren kann. Die kombinatorischen Nanopartikel verringerten die Koloniebildungsfähigkeit von B16F10-Melanomzellen signifikant. Durchflusszytometrie-Analyse zeigte, dass RD-LNF einen größeren Anteil an Apoptose-Zellen induzierte mit signifikanter Inhibition von Zellzyklusfortschritt und Zellmigration. Diese Ergebnisse deuten auf das vielversprechende Potenzial von RD-LNF in der Behandlung von malignem Melanom mit hoher Effizienz hin.

Einleitung

Malignes Melanom ist eine der aggressiven Malignome, die vorwiegend in der menschlichen Haut auftreten [1]. Melanom macht 4 % aller dermatologischen Krebserkrankungen aus, ist jedoch für 80 % der Hautkrebs-Mortalität verantwortlich und wird zu einer wachsenden Sorge in unterentwickelten und Entwicklungsländern [2, 3]. Melanom hat hohe Tendenz, in verschiedene Körperteile einschließlich Gehirn, Herz und Lunge zu metastasieren, was es zu einer der aggressivsten Malignome macht [4]. Wenn im Frühstadium diagnostiziert, ist chirurgische Exzision eine potenzielle therapeutische Option. Chirurgischer Eingriff garantiert jedoch keine vollständige Genesung vom Melanom [5]. Zudem wird die radiale Wachstumsphase dieses Malignoms resistent gegen die Mehrheit anderer Behandlungsoptionen einschließlich Chemotherapie und Radiotherapie [6]. Spezifisch sind Peptidrezeptoren auf der Oberfläche von Melanomkrebszellen überexprimiert, was sie zu einem attraktiven Target macht. Der Subtyp-2-Somatostatin-Rezeptor (SSTR2) zeigte hohe Expression in Melanomzellen [7].

Dacarbazin (DBZ) oder Dimethyl-triazeno-imidazol-carboxamid (DTIC), ein DNA-alkylierendes Agens, ist die einzige und First-Line-Chemotherapie, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen ist [8]. DBZ ist ein starkes Alkylierungsmittel, das Krebszellen durch Hinzufügen von Alkylgruppen zur DNA oder zu Nuklearmaterialien der Krebszellen abtötet [9]. Trotz seiner potenten Wirkung leidet DBZ unter schlechter wässriger Löslichkeit und kurzer Halbwertszeit (41 min) in der Blutzirkulation, was seinen therapeutischen Effekt bei der Behandlung von Melanom-Malignomen verringert [10]. Zudem wurde eine enttäuschende Ansprechrate zwischen 10 und 25 % beobachtet mit weniger als 5 % vollständiger Krebsremission, was die Limitation einer Einzelwirkstoff-Therapie anzeigt [11, 12]. Daher besteht dringender Bedarf, eine alternative Strategie zur Verbesserung der Behandlungseffizienz von DBZ zu entwickeln.

Ko-Delivery mehrerer therapeutischer Wirkstoffe in einer einzelnen Verabreichung hat sich als effektiver erwiesen als einzelne therapeutische Wirkstoffe [13]. Die Ko-Delivery therapeutischer Wirkstoffe in einem einzelnen Carriersystem verleiht synergistische Aktivität, ähnliche pharmakokinetische Eigenschaften und höhere Antikrebswirksamkeit [14]. All-trans-Retinsäure (ATRA) ist ein vielversprechendes Antikrebsmittel, das in der Behandlung mehrerer Krebserkrankungen eingesetzt wird [15]. ATRA entfaltet seine therapeutische Wirksamkeit durch Bindung an Retinsäure-Rezeptoren im Zellkern von Krebszellen, was zu Inhibition von Wachstum, Proliferation, Differenzierung und schließlich Zelltod führt [16]. Im Gegensatz zu anderen Chemotherapeutika resultierte ATRA nicht in unerwünschten Effekten wie Kardiotoxizität oder Knochenmarkhypoplasie. ATRA wurde berichtet, die Antikrebswirksamkeit zu verstärken, wenn in Kombination mit einem geeigneten Chemotherapeutikum verwendet [17]. Wiederum leidet lipophiles ATRA unter schlechter wässriger Löslichkeit und rascher systemischer Clearance, was die Notwendigkeit eines stabilen Delivery-Systems erforderlich macht [17].

Nanopartikel-Delivery-Systeme haben gezeigt, die therapeutische Wirksamkeit eingekapselter Therapeutika zu verbessern, indem sie diese im Target-Tumorgewebe freisetzen und Off-Target-Effekte in der systemischen Zirkulation vermeiden, indem sie den Enhanced Permeation and Retention (EPR)-Effekt nutzen [18, 19]. Festlipid-Nanopartikel (SLN) gelten als Alternative zu vielen existierenden Carriern einschließlich Liposomen oder Mizellen aufgrund hervorragender Eigenschaften wie erhöhter Stabilität, kontrollierter Wirkstofffreisetzung, hoher Beladungseffizienz und einfacher Herstellung/Skalierung [20]. Ein wichtiger Aspekt von SLN als Drug-Delivery-Carrier ist das Sicherheitsprofil der Lipide, die GRAS-Status haben, gut verträglich und physiologische Lipide sind [21]. Die stabile Inkorporation von Wirkstoffen in den Lipidkern verbessert die wässrige Löslichkeit und das pharmakokinetische Profil und verlängert die physiologische Stabilität in der systemischen Zirkulation [22].

In dieser Studie adressieren wir eine vielversprechende Strategie der Ko-Delivery von DBZ und ATRA mittels Lipid-Nanoformulierungen für die Kombinationstherapie bei Melanom-Malignomen. DBZ wird erwartet, im Lipidkern geladen zu werden, während ATRA als struktureller Bestandteil der Nanopartikel erwartet wird. Wir untersuchten die physikochemischen Eigenschaften, zelluläre Aufnahme und In-vitro-Zytotoxizität der kombinierten Nanopartikel. Zusätzlich wurde der Antikrebs-Effekt durch Apoptose-Assay, Zellzyklusanalyse, Koloniebildung und Zellmigrationsanalyse weiter evaluiert.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir erfolgreich Dacarbazin- und All-trans-Retinsäure-beladene Lipid-Nanoformulierungen formuliert. Unsere Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass RD-LNF die Melanomzellproliferation hemmt, bemerkenswerte Apoptose induziert und Zellzyklusfortschritt und Zellmigration inhibiert. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Untersuchung der Antikrebswirksamkeit in klinisch relevanten Tiermodellen und die Entwicklung einer zielgerichteten Therapie gegen das Melanom-Malignom konzentrieren. Dies ist eine vorläufige Studie an Melanomzellen; breit angelegte Studien in verschiedenen klinisch relevanten Tiermodellen sind der nächste Teil unserer Forschungsarbeit.

Materialien und Methoden

Herstellung von DBZ/ATRA-beladenen Lipid-Nanoformulierungen

Die wirkstoffbeladenen Lipid-Nanopartikel wurden durch Sonikationsmethode hergestellt. Kurz: 10 mg DBZ und 10 mg ATRA wurden in 2 mL Chloroform-Lösung gelöst, die 50 mg Ei-L-α-Phosphatidylcholin (PC) und 2 mg DSPE-Methyl(polyethylenglycol)-2000 (mPEG₂₀₀₀) enthielt. Das organische Lösungsmittel wurde 20 min durch Argongas-Exposition getrocknet. Das getrocknete Wirkstoff-Lipid-Gemisch wurde mit 80 mg Trimyristin (Tm) versetzt und 1 h bei 65 °C inkubiert. Zu diesem Ölgemisch wurden 5 mL 4 % Poloxamer-Lösung zugegeben und sofort 6 min bei 80 W mit einer Sonde soniziert. Die resultierende Emulsion wurde 30 min auf Eis gekühlt. Die Nanopartikel wurden einer Amicon Ultra 0,5 Zentrifugalfiltereinheit (3 kDa Cutoff; Merck, Deutschland) bei 12.000×g für 20 min unterzogen. Die Menge an freiem DBZ und ATRA im Filtrat wurde per HPLC-Methode evaluiert und Beladungseffizienz und -kapazität berechnet. Ein Waters HPLC-System bestehend aus Waters 1525 Binärpumpe, Waters 2487 UV-Detektor, Waters 2475 Fluoreszenzdetektor, 1500 Säulenheizer und einer Symmetry C18-Säule wurde für die Wirkstoffanalyse verwendet. Für ATRA bestand die mobile Phase aus Acetonitril und Trifluoressigsäure im 90/10 v/v-Verhältnis bei 1 mL/min Flussrate und Detektion bei 348 nm. Für DBZ wurden Acetonitril und 0,05 M Dinatriumhydrogenphosphat im 30/70 v/v-Verhältnis mit 0,5 % TEA verwendet. Der pH-Wert der mobilen Phase wurde auf 3,7 gehalten bei 1 mL/min Flussrate.

Teilchengrößen- und Morphologieanalyse

Die Teilchengrößenverteilung der kombinierten Nanopartikel wurde mit Malvern Zetasizer Nano ZS90 mit He-Ne-Laser (633 nm) evaluiert. Alle Proben wurden mit destilliertem Wasser verdünnt und die Experimente bei 24 °C in Triplicate durchgeführt. Die Morphologie der Nanopartikel wurde per Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; JEOL JEM200CX bei 120 kV) evaluiert. Die verdünnten Partikel wurden mit 2 % Phosphortungstensäure gefärbt, getrocknet und unter TEM beobachtet.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung aus Wirkstoff-beladenen Nanoformulierungen

Die Freisetzung eingekapselter Wirkstoffe wurde per Dialysemethode evaluiert. Zwei Milliliter wirkstoffbeladene Nanopartikel, äquivalent zu 1 mg ATRA und 1 mg DBZ, wurden in einer Dialysemembran (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa) versiegelt. Das Dialyseröhrchen wurde in 25 mL Freisetzungspuffer gelegt und bei 100 rpm Rotation bei 37 °C gehalten. Zu vorgegebenen Zeitintervallen bis 72 h wurden 1 mL Proben entnommen und mit frischem Puffer gleicher Menge ersetzt. Die Menge an DBZ und ATRA wurde per HPLC-Methode wie oben beschrieben evaluiert.

Zellkultur und zelluläre Aufnahmeanalyse

Murine Hautmelanomzellen (B16F10) wurden von China Infrastructure of Cell Line Resources (Peking, China) bezogen. Zellen wurden in RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika-Gemisch kultiviert. Medien wurden regelmäßig alle 2 Tage gewechselt und nach 90 % Konfluenz weiterkultiviert. Für zelluläre Aufnahmeanalyse wurden B16F10-Zellen in einer 6-Well-Platte für 24 h Inkubation ausgesät. Die Nanopartikel wurden mit Coumarin-6 als fluoreszierendem Tracker beladen. Das alte Medium wurde entfernt und durch frisches Medium mit Coumarin-6-Lipid-Nanopartikeln ersetzt und 1–3 h in umgekehrter Reihenfolge inkubiert. Zellen wurden gewaschen und mit Zellschaber abgelöst. Zellen wurden 5 min bei 1200 rpm zentrifugiert und der Zellpellet in 1 mL kaltem PBS resuspendiert. Die Proben wurden per AccuriTM C6 Durchflusszytometer (BD Co., USA) analysiert.

In-vitro-Zytotoxizitätsassay

Der zytotoxische Effekt von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF auf B16F10-Zellen wurde per MTT-Assay evaluiert. Zellen (1 × 10⁴) wurden in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Zunächst wurden Zellen mit verschiedenen Konzentrationen freien ATRA und DBZ behandelt und deren Antikrebswirkung auf Melanomzellen getestet. Anschließend wurden Zellen mit fixer Konzentration von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF bei 25 µg/mL und 50 µg/mL behandelt. Zellen wurden 24 h inkubiert, dann das Medium vorsichtig entfernt und zweimal mit PBS gewaschen. Am Ende wurden Zellen mit 100 µL 5 mg/mL MTT-Lösung behandelt und 4 h inkubiert. Das Kultivierungsmedium wurde vorsichtig entfernt und 100 µL Isopropanol zugegeben und 15 min unter Schüttelbedingungen inkubiert. Die gelösten Formazankristalle wurden bei 570 nm mit einem Mikroplattenleser untersucht. Unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle und Berechnungen basierten auf der Zellvitalität der Kontrollen.

Apoptose-Assay – Durchflusszytometrie

Der Apoptose-Effekt von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF in B16F10-Zellen wurde nach Färbung mit PE Annexin V und 7AAD-basiertem Apoptose-Kit evaluiert. Zellen wurden in einer 12-Well-Platte bei Zelldichte 2 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät und 24 h inkubiert. Zellen wurden mit 25 µg/mL Äquivalenten von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF-Formulierungen behandelt; unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle. Nach 24 h Behandlungszeit wurden Zellen gemäß Herstellerprotokoll gefärbt. AccuriTM C6 Durchflusszytometer wurde für PE- und 7AAD-Expression verwendet; mindestens 10.000 Events wurden im Durchflusszytometer erfasst. PE-positive und 7AAD-negative Zellen waren frühe Apoptose; PE-positive und 7AAD-positive Zellen waren späte Apoptose.

Zellzyklusanalyse – Durchflusszytometrie

Zellen wurden in einer 12-Well-Platte bei Zelldichte 2 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät und 24 h inkubiert. Zellen wurden mit 25 µg/mL Äquivalenten von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF-Formulierungen behandelt; unbehandelte Zellen dienten als Kontrolle. Nach 24 h wurden behandelte Zellen gewaschen und durch Trypisinierung gesammelt und 2 h bei 4 °C mit 70 % Ethanol fixiert. Zellen wurden dann mit Ribonuklease behandelt, um RNA-Kontaminationen zu entfernen. Nun wurden Zellen 30 min bei 37 °C im Inkubator mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Die Fluoreszenz der PI-gefärbten Zellen wurde per AccuriTM C6 Durchflusszytometer bestimmt. Der Zellzyklus wurde in Sub-G1, G1, S und G2/M Phase unterteilt.

Koloniebildungsassay

Zellen wurden in 12-Well-Platten bei Zelldichte 2 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät und 24 h inkubiert. Zellen wurden mit 25 µg/mL Äquivalenten von freiem ATRA, DBZ, D-LNF und RD-LNF-Formulierungen behandelt. Behandelte Zellen wurden trypisiniert, gewaschen und mit einem Zellzähler gezählt. Zellen wurden dann in einer 6-Well-Platte bei Dichte 1500 Zellen/Well ausgesät. Zellen wurden 12 Tage bei 37 °C unter Umgebungsbedingungen inkubiert, bis Kolonien sichtbar waren. Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Methanol:Essigsäure:Wasser (1:1:8) 10 min fixiert, gefolgt von Färbung mit 0,1 % Kristallviolett 45 min. Die gefärbten Zellen wurden dann unter Lichtmikroskop beobachtet.

Zellmigrationsassay

12-Well-Transwell-Kammern mit 8 µm Porengröße wurden für diesen Assay verwendet. Zur Initiierung wurden 5 × 10⁴ Zellen/Well in die obere Kammer ausgesät. Das obere Medium war FBS-frei, während das untere Kammermedium 10 % FBS enthielt. Nach 24 h wurde die Menge der in die untere Membranoberfläche migrierten Zellen fixiert und mit 0,5 % Kristallviolett-Farbstoff gefärbt. Die Zellzahl wurde in fünf zufällig ausgewählten Feldern unter Lichtmikroskop gezählt; der Durchschnitt wurde aufgezeichnet und analysiert.

Statistische Analyse

Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und in Triplicate durchgeführt, sofern nicht anders erwähnt. Zwei Gruppen wurden mit ungepaartem t-Test verglichen, während der Vergleich von mehr als zwei Gruppen per einseitiger ANOVA mit Tukeys Multiple-Comparison-Test durchgeführt wurde. Statistik wurde mit GraphPad Prism Software durchgeführt; ein Unterschied von p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von DBZ/ATRA-beladenen Lipid-Nanoformulierungen

Die Behandlung von Melanom bleibt eine große Herausforderung; Standardbehandlungsoptionen einschließlich Chemotherapie, Radiotherapie oder chirurgischer Resektion sind nur bei soliden Bulk-Tumoren effektiv, begleitet von schlechter Prognose. Die FDA hat Medikamente wie Paclitaxel oder dessen Kombinationen zugelassen, doch diese verbesserten die Gesamtauswirkung auf Patientenüberleben und Krebsheilung nicht. Dacarbazin (DBZ) ist die First-Line-Chemotherapie, die von der FDA zugelassen ist; jedoch leidet DBZ unter schlechten physikochemischen Eigenschaften und resultierte in enttäuschender Ansprechrate zwischen 10 und 25 %. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, entwickelten wir eine neuartige therapeutische Strategie der Kombination von ATRA und DBZ in Lipid-Nanoformulierungen (Abb. 1). Wir hypothesierten, dass die Kombination zweier therapeutischer Komponenten die Antitumor-Wirksamkeit bei Melanom-Malignomen erhöhen wird. Bemerkenswert ist, dass ATRA zwar Antikrebs-Eigenschaften aufweist, keine unerwünschten Effekte in der systemischen Umgebung verursachte [23]. Da DBZ hydrophob ist, entwarfen wir Lipid-Nanoformulierungen, die hydrophobe Wirkstoffe stabil im Lipidkern inkorporieren können, während ATRA als struktureller Bestandteil der Nanopartikel geladen wird. Die Lipid-Nanopartikel, die die therapeutischen Komponenten tragen, helfen bei der Delivery in tiefe Tumore im Körper. Die Beladungseffizienz von DBZ und ATRA betrug 91,2 ± 1,25 % bzw. 95,8 ± 1,14 %. Die Beladungskapazität von DBZ und ATRA in RD-LNF betrug 7,07 ± 0,65 % w/w bzw. 7,48 ± 1,05 % w/w. Die Teilchengröße von D-LNF betrug 121,5 ± 1,65 nm mit Polydispersitätsindex (PDI) 0,134 und Zeta-Potenzial −23,5 ± 0,85 mV. Die Teilchengröße von RD-LNF betrug 138,2 ± 1,28 nm mit PDI 0,159 und Zeta-Potenzial −25,4 ± 0,58 mV. Der Anstieg der Gesamtteilchengröße war hauptsächlich auf die strukturelle Beladung von ATRA zurückzuführen; die finale Größe von RD-LNF war jedoch < 150 nm, was bevorzugte Anreicherung in malignen Melanom-Tumoren durch den EPR-Effekt ermöglicht. Zudem verhindert die Präsenz von hydrophilem PEG die Aggregation der Partikel und reduziert deren Aufnahme durch das retikuloendotheliale System (RES), wodurch die systemische Performance im Körper verbessert wird. Die Oberflächenladung um −25 mV verleiht exzellente Lagerstabilität. Die Partikelmorphologie wurde per TEM untersucht (Abb. 2). Wie zu sehen, sind sowohl D-LNF als auch RD-LNF perfekt kugelförmig und gleichmäßig im Kupfergitter verteilt. Der Größenunterschied zwischen D-LNF und RD-LNF war konsistent mit der DLS-Beobachtung. Fehlen von Partikeltrümmern, kleinen Partikeln und Aggregation deutet auf den Erfolg des Formulierungsprozesses hin.

Stabilitätsanalyse und In-vitro-Wirkstofffreisetzung aus D-LNF und RD-LNF

RD-LNF zeigte exzellente Stabilität sowohl bei pH 7,4 (PBS) als auch in Serum (10 % FBS) Bedingungen (Abb. 3a). Die Teilchengröße zeigte in beiden Bedingungen über den gesamten Studienzeitraum keinen signifikanten Anstieg, was die Stabilität der Nanopartikel anzeigt. Die Fähigkeit zur zeitgerechten Wirkstofffreisetzung entscheidet über die Effektivität des wirkstoffbeladenen Nanopartikelsystems. Wir führten die Freisetzungskinetik von DBZ und ATRA aus D-LNF und RD-LNF in Phosphat-gepuffertem Salin (PBS, pH 7,4) durch. Wie in Abb. 3b gezeigt, wurde kein Burst-Release oder phasenweiser Release von Wirkstoff ausいずれ der beiden Nanopartikelsysteme beobachtet, was die stabile Beladung im Kern der Nanopartikel und nicht an der Oberfläche anzeigt. Kein signifikanter Unterschied in der Freisetzung von DBZ wurde aus D-LNF und RD-LNF beobachtet, was anzeigt, dass die Präsenz von ATRA das Freisetzungsmuster von DBZ nicht verlangsamte oder veränderte. Eine leichte Verzögerung der DBZ-Freisetzung aus RD-LNF könnte auf den erhöhten Diffusionspfad durch ATRA in der Lipidstruktur zurückzuführen sein. Interessanterweise wurde ATRA signifikant langsamer freigesetzt als DBZ im RD-LNF-Carriersystem. Signifikante Unterschiede traten nach 24 h bis 72 h auf, hauptsächlich bedingt durch die extrem hydrophobe Natur von ATRA und dessen Rolle als struktureller Bestandteil. Insgesamt werden das Fehlen von Burst-Release und die kontrollierte Freisetzung therapeutischer Komponenten der Melanom-Krebsbehandlung zugutekommen.

In-vitro-Zelluläre Aufnahme

Höhere oder verbesserte zelluläre Aufnahme der Nanopartikel bestimmt die therapeutische Wirksamkeit in Krebszellen. Wir führten die zelluläre Aufnahme von RD-LNF in B16F10-Krebszellen durch; Coumarin-6 diente als fluoreszierender Tracker. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurde bemerkenswerte Internalisierung der Nanopartikel nach 1 h Inkubation beobachtet, und die Aufnahme stieg konsistent bis 3 h an. Die bemerkenswerte Aufnahme der Lipid-Nanoformulierungen ist konsistent mit der höheren zellulären Aufnahme lipidbasierter Carriersysteme. Es wurde spekuliert, dass passiver Diffusions- und Endozytose-basierter Mechanismus für die höhere zelluläre Aufnahme verantwortlich sein könnte. Nach Endozytose erreichen die Nanopartikel das Lysosom, wo die eingekapselten Wirkstoffe freigesetzt werden und ihre jeweiligen pharmakologischen Aktionen entfalten.

In-vitro-Zytotoxizitätsassay

MTT-Assay wurde an B16F10-Zellen nach Behandlung mit jeweiligen Formulierungen durchgeführt, um den Antikrebs-Effekt einzelner therapeutischer Wirkstoffe zu evaluieren (Abb. 5a). Zunächst wurde Zytotoxizität von individuellem freiem DBZ und ATRA evaluiert. DBZ zeigte konzentrationsabhängigen zytotoxischen Effekt in Melanom-Krebszellen, während ATRA signifikant höheren zytotoxischen Effekt in B16F10-Zellen aufwies. Bei 100 µg/mL zeigte DBZ ~45 % Zellvitalität im Vergleich zu ~22 % für ATRA, was die exzellente therapeutische Wirksamkeit von ATRA anzeigt. Um zu beweisen, dass Ko-Delivery von DBZ und ATRA potenziell Krebsprogression inhibieren könnte, wurden DBZ+ATRA-beladene Lipid-Nanoformulierungen (RD-LNF) an Melanomzellen appliziert. DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen (D-LNF) mit Einzelwirkstoff diente als Referenzgruppe, um die synergistische Effizienz von ATRA hervorzuheben (Abb. 5b). Wie erwartet zeigte ATRA bei 25 µg/mL fixer Konzentration leicht niedrigere Zellvitalität als DBZ, während nanopartikelbasiertes D-LNF den Antikrebs-Effekt von DBZ nicht verbesserte und weit von effektiv entfernt blieb. Wie erwartet zeigte RD-LNF signifikant niedrigere Zellvitalität und höheren Antikrebs-Effekt im Vergleich zu D-LNF, was einen offensichtlichen synergistischen therapeutischen Effekt der dualen Komponenten auf Melanom-Krebszelltod anzeigt. RD-LNF zeigte signifikant höheren Antikrebs-Effekt im Vergleich zu allen anderen Behandlungsgruppen. Es könnte erwartet werden, dass langsame und anhaltende Freisetzung von DBZ zusammen mit langsamer Freisetzung von ATRA aus dem Nanocarriersystem zum synergistischen therapeutischen Effekt beiträgt. In dieser Studie war Dacarbazin (DBZ) das Hauptchemotherapeutikum und ATRA wurde als struktureller Bestandteil der Lipid-Nanopartikel eingesetzt, daher wurde keine separate Gruppe für R-LNF erstellt. Wir untersuchten den Antikrebs-Effekt von nacktem ATRA und DBZ in Krebszellen. Zudem sind viele veröffentlichte Berichte Beweis für den Antikrebs-Effekt von ATRA; daher nutzten wir ATRA als strukturellen Bestandteil, der auch die Antikrebswirksamkeit eingekapselter Therapeutika synergistisch verbessern kann.

Koloniebildungsassay

Der Koloniebildungsassay wurde durchgeführt, um das Tumorigenese-Potenzial von Melanomzellen zu evaluieren. Wie gezeigt, haben freies DBZ und ATRA eine begrenzte Rolle bei der Inhibition der Koloniebildung, und同样 D-LNF war ineffektiv in der Kontrolle der Koloniebildung (Abb. 6). Wie erwartet resultierte die Kombination von DBZ + ATRA in signifikanter Potenzierung der Inhibition der Koloniebildung im Vergleich zu einzelnen freien Wirkstoffen oder einzelwirkstoffbeladenen Nanopartikeln. Der Koloniebildungsassay bekräftigt die überlegene Antikrebswirksamkeit von RD-LNF gegenüber freien Wirkstoffen.

In-vitro-Apoptose-Assay und Zellzyklusanalyse

Die Apoptose-Induktion von B16F10-Zellen nach Behandlung mit D-LNF und RD-LNF wurde per Durchflusszytometrie nach Färbung mit Annexin V-FITC/PI-Gemisch untersucht (Abb. 7a). Wie gezeigt, verursachten ATRA und DBZ nur 10–12 % Apoptose der Krebszellen, und ein Großteil der Zellen blieb intakt. Ein leichter Anstieg früher apoptotischer Zellen wurde nach D-LNF-Behandlung beobachtet, was den Effekt des Delivery-Carriers andeuten könnte. Wichtig: RD-LNF induzierte einen größeren Anteil an Apoptose-Zellen mit größerem Anteil an Zellen in späten und frühen Apoptose, was die überlegene Antikrebswirksamkeit der kombinatorischen Nanopartikel anzeigt. RD-LNF zeigte, dass späte Apoptose-Zellen um 21,5 % zunahmen, frühe Apoptose-Zellen bis zu 18,3 % stiegen, und der Anteil lebensfähiger Zellen von 95 % auf 52 % sank, was suggeriert, dass die Kombination von DBZ + ATRA zur Apoptose der Krebszellen beitrug und die proliferative Inhibition von B16F10-Melanomzellen hemmen konnte. Der Apoptose-Effekt der Formulierungen wurde durch Zellzyklusanalyse weiter bestätigt. Wie gezeigt, zeigten DBZ und ATRA leichten Anstieg der Sub-G0-Population, während D-LNF eine relativ höhere Sub-G0-Population im Vergleich zu einzelnen freien Wirkstoffen aufwies (Abb. 7b). Bemerkenswert: Ein bemerkenswerter Anstieg der Sub-G0-Population wurde für RD-LNF-behandelte Melanomzellen beobachtet, was die markante Apoptose der Krebszellen anzeigt. Es ist bekannt, dass DBZ p21, Caspase-3 und gespaltenes PARP Expressionslevel erhöhen und dadurch Zellapoptose durch Stabilisierung von p53 fördern kann. Die Induktion von p53 wird den Zellzyklusfortschritt inhibieren [24, 25]. Die Kombination von DBZ + ATRA wird erwartet, den Apoptose-Mechanismus zu potenzieren und den Zellzyklusfortschritt von Krebszellen zu stoppen und die Antikrebswirksamkeit zu entfalten.

Effekt der kombinatorischen Nanopartikel auf Zellmigration

Die Zellmigration wurde durch die Transwell-Membran analysiert und die migrierenden Zellen per Kristallviolett-Färbung beobachtet (Abb. 8). Nach 24 h hatten Kontrollzellen nahezu vollständige Migration der Krebszellen erreicht. ATRA schien Zellmigration relativ besser zu inhibieren als DBZ-behandelte Zellen. D-LNF zeigte auch einen bemerkenswerten inhibitorischen Effekt auf Zellmigration; jedoch wurde der bemerkenswerteste Zellmigrationseffekt in RD-LNF-behandelten B16F10-Melanomzellen beobachtet. Wie zu sehen, wurde ein vielfach verringerter Zellmigrationswert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen beobachtet. Diese Ergebnisse demonstrieren eindeutig, dass RD-LNF die aberrante maligne Zellproliferation potenziell verringert und Zellmigration effizient unterdrückt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht zutreffend

Abkürzungen

DBZ:

Dacarbazin

ATRA:

All-trans-Retinsäure

D-LNF:

DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen

RD-LNF:

ATRA/DBZ-beladene Lipid-Nanoformulierungen

SLN:

Festlipid-Nanopartikel