Nano-Tonmineralien: Ein vielversprechender nano-immunologischer Schutz gegen COVID-19

Zusammenfassung

Trotz intensiver Bemühungen kann die Entwicklung eines wirksamen COVID-19-Impfstoffs noch lange dauern. Traditionelle Naturheilmittel, die bereits am Menschen erprobt sind, könnten eine frühere Lösung bieten. Aufbauend auf der Erfahrung des Forschungsteams mit Nano-Tonmineralien als hochaffine Materialien zur Krebsmetastase, Melanombehandlung und Knochenregeneration schlagen wir deren Einsatz zur Prävention und Behandlung von COVID-19 vor. Aufgrund ihrer hohen Affinität würden Nano-Tonmineralien Viren binden, bevor diese an das menschliche hACE2-Rezeptor andocken können. In dieser Studie wurden molekulares Simulationen und Modellierungen der Wechselwirkung zwischen Coronavirus-Spike- und hACE2-Proteinen mit und ohne Nano-Tonmineralien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine sehr hohe Affinität/Kohäsion zwischen SARS-CoV-2-Spike und Nano-Tonmineralien im Vergleich zur Spike-hACE2-Wechselwirkung. Da diese Nano-Tonmineralien bereits als Wirkstoffträger dienen, könnten sie auch als „reine Tonmineral-Medizin“ injiziert werden. Empfehlungen für zukünftige In-vitro- und In-vivo-Studien werden gegeben.

Hintergrund

Das plötzliche Auftreten und die rasante Ausbreitung des neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2 haben die Gesundheit und das Leben der Menschen schwer beeinträchtigt und die Weltwirtschaft kritisch getroffen. Das SARS-CoV-2-Spike-Protein S bindet mit hoher Affinität an das menschliche Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (hACE2) und nutzt es als Eintrittsrezeptor in Zielzellen. Das Virus-Oberflächen-Spike-Protein vermittelt den Eintritt in Wirtszellen. Der Rezeptor-bindende Domäne (RBD) des Spike-Proteins erkennt spezifisch hACE2. Die hACE2-Oberfläche enthält zwei Virus-bindende Hotspots, die für die Bindung von SARS-CoV-2 S entscheidend sind. Natürlich selektierte Mutationen im RBD umgeben diese Hotspots und regulieren Infektiosität, Pathogenese und Übertragung.

Nano-Tonmineralien: Ein vielversprechender nano-immunologischer Schutz gegen COVID-19

Derzeit gibt es keine klinisch zugelassenen Impfstoffe oder Medikamente, die spezifisch SARS-CoV-2 ansprechen. Die Impfstoffentwicklung nach Standardprotokoll dauert lange. Es besteht großes Interesse an therapeutischen Antikörpern, doch diese sind bislang kaum entdeckt worden, abgesehen von wenigen Versuchen. Ein Versuch zeigte potente Neutralisation durch Bindung an die RBD des S-Glykoproteins. Antikörper-Cocktails werden aufgrund erhöhter Neutralisation empfohlen. Allerdings zeigten Antikörper aus genesenen SARS-CoV-Patienten unerwünschte Reaktionen wie Antikörper-abhängige Verstärkung (ADE), die die Virusinfektiosität erhöht. Auch basierend auf Erfahrungen mit SARS-CoV- und MERS-Impfstoffen erscheinen die Aussichten für SARS-CoV-2 unsicher. Daher könnten naturheilkundliche Mittel mit sicherer Humananwendung als Behandlungsoption in Betracht gezogen werden. Als natürliches Material mit Historie menschlicher Nutzung schlagen wir „hochgeladene Nano-Tonmineralien“ als Coronavirus-Blocker und Inhibitoren der Spike-vermittelten Zellinvasion vor.

Nano-Tonmineralien, nanoskalige natürliche Materialien aus Sedimentgesteinen, weisen eine sehr hohe Affinität zu Bakterien und Viren auf. Durch isomorphe Substitution in ihrer Molekularstruktur besitzen sie Oberflächenladungsdefizite, die durch Wassermoleküle und gelöste Kationen neutralisiert werden. Die geladene Struktur und die große Oberfläche verleihen ihnen Affinität zu geladenen Entitäten auf bakteriellen Oberflächen und Toxinen. Ihre biomedizinischen Eigenschaften umfassen hohe Absorption, Fähigkeit Mikroben zu umhüllen und fehlende Toxizität. Jedes elektrisch aktive Tonmineral hat distincte Morphologie und Interaktionsverhalten. Die am besten untersuchte biomedizinische Anwendung ist der Einsatz als Träger für Antikrebsmedikamente wie 5-Fluorouracil und Trastuzumab. Sie sind potenzielle Alternativmedizin für diverse Erkrankungen. Aufgrund ihrer adhäsiven Natur dienen sie auch als Träger für Freisetzungssysteme. Nano-Tonmineralien adsorbierten und behandelten erfolgreich bovines Rotavirus und Coronavirus. Forscher interkalierten Methotrexat in anionischen Ton zu einem Nano-Hybrid-Wirkstoff. Bentonit-Nano-Ton eignet sich aufgrund Biokompatibilität und hoher Beladungskapazität für Wirkstofffreisetzungssysteme. Montmorillonit-Ton wird als Additiv und Träger für kontrollierte Freisetzung erforscht. Nano-Tonmineralien finden sich in dual-funktionalen Freisetzungssystemen zur Reduktion von Doxorubicin-Toxizität bei Schilddrüsenkrebs. Selbstassemblierende, lichtempfindliche Dendrimersomen-Vesikel-Plattformen ahmen virusähnliche Strukturen nach. Oberflächenmodifizierte bioaktive Virus-nachahmende organische Nano-Vesikel aus (Glyko)dendrimersomen zeigen strukturelle Modifikationen, die SARS-CoV-2-Wirt-Interaktionen und Immunflucht ermöglichen.

In umfangreicher Vorarbeit entwickelten wir Basischarakterisierung und Verhaltensmodellierung geladener Tonmineralien sowie Anwendungen zur Kontrolle von Krebsmetastasen, In-vitro- und In-vivo-Studien zur Melanombehandlung und Calciumablagerung/Knochenregeneration. Eine frühere Studie zeigte, dass Ton-Nanopartikel hohe Affinität zu geladenen Oberflächen besitzen. Die hohe Anziehungsaffinität der Nano-Tonmineralien und die erhöhte unspezifische Adhäsion von Krebszellen machen sie zu günstigen Kandidaten zur Metastasekontrolle. Wir demonstrierten den Einsatz von Na-Montmorillonit (SWy-3) und Palygorskit (PFl-l) zur Metastasekontrolle. Weiterhin zeigten In-vitro- und In-vivo-Studien, dass diese Nano-Tonmineralien hemmende Effekte auf Melanomzellen haben, insbesondere auf Proliferation und Vitalität. Neben Laborexperimenten wurden auch molekulare Simulationen der Nano-Ton-Zell-Interaktionen durchgeführt, die die relative Kohäsion/Affinität mit und ohne Ton-Nanopartikel bewerteten.

Basierend auf dieser Erfahrung schlagen wir vor, dass Nano-Tonmineralien als Antikörper mimiziert werden können und so Coronaviren anziehen und umhüllen, bevor diese an hACE2 binden. Dieser Artikel ist ein erster Schritt, dies durch molekulare Simulationen zu belegen. Basierend auf den Simulationsergebnissen werden Empfehlungen für nächste In-vitro- und In-vivo-Phasen skizziert. Da Nano-Tonmineralien bereits erfolgreich als Medikamententräger dienen, postulieren wir, dass sie auch als „reine Tonmineral-Medizin“ injiziert/eingesetzt werden können, und schlagen eine vorläufige Verabreichungsmethodik vor.

Materialien – Moleküle

Selektion und Formulierung von SARS-CoV-2 und hACE2

Moleküle von SARS-CoV-2 Spike S und hACE2 wurden von der Protein Data Bank (RCSB) bezogen. Die molekularen Modelle wurden in Materials Studio Software formuliert. Vor den Simulationen wurden diese Moleküle mit der Ladungsausgleichsmethode QEq der Software geladen.

Selektion und Formulierung des Nano-Ton-Kristallits

Na-Montmorillonit, eines der aktivsten Mitglieder der Smektit-Gruppe, wurde ausgewählt. Es ist ein geschichteter Phyllosilikat-Ton-Smektit. In kolloidaler Form können die Zwischenschichten freie Natrium-, Calcium- oder Magnesiumkationen enthalten, die elektrostatisch an negativ geladene Oberflächen gebunden sind. Im trockenen Pulverzustand existiert es als äquidimensionale Flocken/Blätter von ca. 0,5 × 0,5 × 0,001 Mikrometer. Negative Ladungen auf den Zwischenschichtoberflächen werden durch Kationen ausgeglichen. Als Kolloide dissocieren die Zwischenschichtkationen und assoziieren sich mit anderen negativ geladenen Oberflächen. Die Partikel besitzen auch positiv geladene Kanten durch gebrochene Bindungen. Morphologie und Eigenschaften sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Kristallite wurden in der Software basierend auf fundamentalen Eigenschaften wie Kationenaustauschkapazität, austauschbaren Kationen und Zwischenschichtladungen formuliert. Die Kristallitgröße basierte auf Partikelgrößenanalyse mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS). Nach Erstellung im Design-Modus wurden sie mit QEq geladen.

Methoden – Molekulare Simulationen

Diese Studie umfasste Simulation und Bewertung der Wechselwirkungen von SARS-CoV-2 Spike S mit Tonkristalliten und hACE2. Obwohl die Modelle keine vollständige Replikation tatsächlicher In-vitro-Bedingungen darstellen, enthalten sie alle wesentlichen Wechselwirkungen und eignen sich gut für relative und vergleichende Untersuchungen.

In der Software wurden Sorption und Simulationen der formulierten Konfigurationen von SARS-CoV-2 S, Na-Montmorillonit-Kristalliten und hACE2 mit Monte-Carlo (MC) und Molekularmechanik (MM) durchgeführt. Die Affinitätssteigerung wurde anhand der berechneten kohäsiven Energiedichte (CED) beurteilt – CED als Maß für die Kohäsion des molekularen Systems. Aufgrund der großen Rechenleistung wurden Hochleistungsrechner (HPC) an der KFUPM, KSA, genutzt. Die Methodik und Parameterwahl basierten auf Vorarbeiten der Autoren.

SARS-CoV-2 Spike (S) Interaktionen mit hACE2 und Tonkristalliten

Zur Simulation der Interaktion von SARS-CoV-2 S mit Tonkristalliten wurden verschiedene Anzahlen von Na-Montmorillonit-Kristalliten auf das Spike-S-Modell sorbiert. Für die Sorptionssimulationen wurde die Metropolis-Monte-Carlo-Methode im Sorptionsmodul gewählt. In jedem Sorptionsschritt besetzen Tonkristallite Räume um das Spike-S-Modell, um die Gesamtenergie des Komplexes zu senken. Die erforderliche Anzahl an Kristalliten wurde in maximal 25.000 Schritten sorbiert, anschließend wurde die Systemenergie mit dem Forcite-Modul basierend auf MD-Prinzipien minimiert. Der gleiche Sorptionsprozess wurde für die Interaktion von SARS-CoV-2 Spike mit hACE2 wiederholt: hACE2-Moleküle wurden um die RBD des Spike S sorbiert, gefolgt von Energieminimierung.

Das Forcite-Modul mit NPT-Ensemble (konstante Teilchenzahl, Druck, Temperatur) wurde für MD-Simulationen mit modifiziertem universellem Kraftfeld verwendet. Simulationen liefen 5 bis 30 ps mit 0,5-fs-Intervall bis konstantem Volumen. Ein Berendsen-Thermostat (Zerfallskonstante 0,1 ps) kontrollierte die Temperatur bei 310 K (37 °C) und atmosphärischem Druck (100 kPa). Ein Berendsen-Barostat (0,1 ps) kontrollierte den Druck. Die Berendsen-Methode erwies sich als am geeignetsten für Einzelkristallite nach Tests mit anderen Thermostaten/Barostaten. Im Monte-Carlo-Verfahren wurden Parameter für Austausch, Konformer, Rotation, Translation und Regrowth mit Verhältnissen 0,39, 0,2, 0,2, 0,2, 0,2 und entsprechenden Wahrscheinlichkeiten gewählt. Amplituden für Rotation und Translation: 5° und 1 Å.

Messung der kohäsiven Energiedichte (CED)

Die Affinität/Bindung in den SARS-CoV-2-Ton- und SARS-CoV-2-hACE2-Komplexen wurde durch Änderungen der CED gemessen. Nach Sorptions der Tonkristalliten und anschließender Molekulardynamik wurde die CED mit der CED-Option des Forcite-Moduls bestimmt. Die Autoren haben erfahren, dass das CED-Konzept (gesamt, van-der-Waals- und elektrostatisch) molekularen Prozesse und Interaktionen gut erklärt und das Ausmaß der Affinität/Bindung simuliert. Quantitativ ist CED die Energie, die für den Übergang von 1 Mol Material von flüssig zu gasförmig benötigt wird. Sie misst die gegenseitige Affinität/Anziehungskraft von Molekülen, ausgedrückt als elektrostatische und van-der-Waals-Kräfte, gemittelt über ein NPT-Ensemble.

Im Forcite-Modul wurden van-der-Waals-Energien mit atomaren Cutoffs berechnet. Nicht-bindende Interaktionen werden bis zu einer Cutoff-Distanz berechnet, darüber hinaus ignoriert. Um Diskontinuitäten zu vermeiden, wird eine Schaltfunktion verwendet, die Nicht-bindende Interaktionen über einen Distanzbereich sanft abschaltet. Ein effektives Potenzial entsteht durch Multiplikation des tatsächlichen Potenzials mit der Glättungsfunktion. Die Wahl der Funktion im intermediären Bereich ist entscheidend und sollte stetig differenzierbar sein, damit Kräfte berechnet werden können. In dieser Studie wurde eine kubische Spline-Glättungsfunktion mit Spline-Breite 1 Å und Cutoff-Distanz 12,5 Å verwendet.

Ergebnisse und Diskussion

Die finale Konfiguration des SARS-CoV-2 S-hACE2-Komplexes ist in Abb. 4a dargestellt, die Komplexe zwischen SARS-CoV-2 Spike und unterschiedlichen Anzahlen von Na-Montmorillonit-Kristalliten in Abb. 4b, c. Zum Vergleich sind die Gesamt-CEDs verschiedener Anteile/Anzahlen der Tonkristallite auf dem Spike und die Interaktion mit hACE2 in Abb. 5 aufgetragen.

Wir hypothesierten, dass Nano-Tonmineralien aufgrund ihrer hohen adhäsiven Eigenschaften als SARS-CoV-2-Inhibitoren wirken könnten, indem sie stark an das Spike-S-Protein binden. Die Simulationsergebnisse zeigen, dass die CED zwischen SARS-CoV-2 und Nano-Tonmineralien im Vergleich zu SARS-CoV-2 und hACE2 sehr hoch ist (Abb. 5), sodass sie SARS-CoV-2 davon abhalten könnten, an hACE2 zu binden. Zudem nimmt der hemmende Effekt dosisabhängig zu.

Nano-Ton-Interaktionen mit SARS-CoV-2 Spike S

Frühere Forschung der Autoren zeigte die Rolle von Nano-Tonmineralien bei der Förderung der Adhäsion zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung zur Metastasekontrolle. Adhäsionsmessungen einer 75/25-Mischung aus Na-Montmorillonit und Palygorskit zeigten eine 100%ige Erhöhung der Adhäsion zwischen Krebszellen und extrazellulären Matrixproteinen. Ein entsprechendes REM-Bild zeigt die Bindung von Raji-Zellen und Fibronektin-Proteinen durch Nano-Tonmineralien. Die Autoren entdeckten, dass elektrostatische, van-der-Waals- und ZP-Anziehungskräfte die Adhäsionsprozesse dominieren. Dieselbe Mechanismen würden auch die Bindung der adhäsiven Oberflächen der Nano-Tonmineralien an das SARS-CoV-2-Spike ermöglichen. ZP misst die Dispergier- oder Flockungstendenz in kolloidaler Form. Als Faustregel zeigt ein Zeta-Potential > 30 mV Dispergierungstendenz, < 5 mV Agglomeration. Die höhere Dispergierungstendenz der verwendeten Ton-Nanopartikel (−24 bis −32 mV) führt zu höherer Dispergierung und damit größerer Oberfläche, was die Interaktionen mit dem Spike verstärkt. Obwohl Na-Montmorillonit-Nanopartikel aufgrund ihres ZP hydrophil sind, fördern sie in Gegenwart von Salzen auch sekundäre Adhäsionsmechanismen zwischen hydrophoben und hydrophilen Oberflächen. Diese Nanopartikel haben hohe Dispergierungstendenz durch hydrophile Natur und relativ höhere abstoßende Säure-Basis-Interaktionen. Hohe Dispergierung erzeugt große Oberfläche für anziehende van-der-Waals- und elektrostatische Kräfte zwischen entgegengesetzt geladenen Oberflächen. Zudem werden positiv geladene Kanten der Na-Montmorillonit-Partikel elektrisch vom Spike S angezogen.

Die Simulationsergebnisse für die Interaktion von SARS-CoV-2 Spike S mit Tonkristalliten (Abb. 5) bestätigen die oben genannten Interaktionsverhalten. Die Sorptions der Tonnanopartikel führt zur Bildung eng interagierender starker van-der-Waals-Anziehungsfelder, die höhere CED der Ton/SARS-CoV-2-Konfiguration erzeugen. Der substantielle Anstieg der Gesamt-CED nach Zugabe der Tonkristalliten (Abb. 5) belegt die sehr hohe Affinität von SARS-CoV-2 zu diesen Partikeln im Vergleich zur Affinität zu hACE2.

Nano-Tonmineralien als Pseudo-Antikörper

Basierend auf aktueller und vergangener Forschung, die das hohe Affinitätspotenzial von Nano-Tonmineralien belegt, postulieren wir, dass sie als Antikörper mimiziert werden können und so Coronaviren anziehen und umhüllen, bevor diese an hACE2 binden. Antikörper sind Glykoproteine, die von Plasmazellen als Teil der adaptiven Immunantwort synthetisiert werden, um Infektionen zu beseitigen. Sie unterstützen die Beseitigung durch Opsonisierung, Komplementaktivierung, Agglutination und Neutralisation von Viren und Toxinen. Wenn sie an virale Oberflächenproteine binden, verhindern sie den Zelleintritt, indem sie die Anheftung der Viren an ihren Zielrezeptor blockieren. Antikörperbindung kann an verschiedenen Stellen des Oberflächenproteins erfolgen und verschiedene Mechanismen auslösen, die denselben Effekt haben. Bei SARS-CoV-2 wurden zwei Neutralisationsmechanismen durch Antikörper beobachtet und in Abb. 1c, d dargestellt. Ein Mechanismus beinhaltet direkte Bindung von Antikörpern an die Anheftungsstelle der SARS-CoV-2-RBD, wodurch der Antikörper mit dem Zielrezeptor hACE2 konkurriert. Ein anderer Mechanismus beinhaltet Bindung an andere RBD-Stellen ohne Konkurrenz zum Rezeptor; dieser wird durch das potenteste monoklonale Antikörper (mAb) vermittelt. Analog zur Antikörper-Interaktion mit SARS-CoV-2 RBD, die das Engagement mit hACE2 inhibiert, wurde ein ähnliches molekulares Modell für Nano-Tonmineralien erstellt, das eine ähnliche Inhibition der Coronaviren zeigt (Abb. 8). Aufgrund ihrer sehr hohen Affinität würden Nano-Tonmineralien an Spikes von SARS-CoV-2 gezogen und so die Bindung der RBDs an hACE2 einschränken.

Vorgeschlagene Nano-Ton-Verabreichungsmethodik

Die Verwendung von Ton als Wirkstoffträger wurde mehrfach getestet und zeigte vielversprechende Ergebnisse mit geringer bis keiner Zytotoxizität für menschliche Zellen. Kaolinit wurde auf Biokompatibilität und sehr geringe Zytotoxizität geprüft. Poly(d,l-lactid-co-glycolid)/Montmorillonit-Nanopartikel zeigten vernachlässigbare Zytotoxizität in vitro. Palygorskit-Polyethylenimin-Fluorescein-isothiocyanat-Nanokomposite wiesen ebenfalls fast keine Zytotoxizität auf. Die Autoren haben Nano-Tonmineralien subkutan zur Melanombehandlung in In-vivo-Studien injiziert. Basierend auf der Nutzung als Krebsmedikamententräger und in anderen Freisetzungssystemen schlagen wir vor, dass Nano-Tonmineralien als „reine Tonmineral-Medizin“ injiziert werden können, vorbehaltlich In-vivo- und klinischer Prüfung.

Obwohl Nano-Tonmineralien nicht biologisch abbaubar sind, könnte ein umfassendes Verständnis des Designs ähnlicher anorganischer Nanopartikel und ihrer metabolischen Leistung im Körper (Studie [49]) diese Nano-Tonmineralien auch als vom menschlichen Körper eliminierbare anorganische Agenten klassifizieren.

Schlussfolgerungen und Empfehlungen

Basierend auf aktueller und vergangener Forschung, die das hohe Affinitätspotenzial von Nano-Tonmineralien belegt, könnten diese als Antikörper mimiziert werden und Coronaviren anziehen und umhüllen, bevor sie an hACE2 binden.

Die Simulationsergebnisse für die Interaktion von SARS-CoV-2 Spike S mit Tonkristalliten führen zur Bildung eng interagierender starker van-der-Waals-Anziehungsfelder, die höhere CED der Ton/SARS-CoV-2-Konfiguration erzeugen. Der substantielle Anstieg der Gesamt-CED nach Zugabe der Tonkristalliten belegt die sehr hohe Affinität von SARS-CoV-2 zu diesen Partikeln im Vergleich zu hACE2.

Wir empfehlen, die Forschung mit In-vitro-Interaktionsstudien zwischen SARS-CoV-2 und verschiedenen Nano-Ton-Prozenten fortzusetzen. Basierend auf der optimalen Dosis aus der In-vitro-Phase sollten In-vivo-Studien an Tieren durchgeführt werden, sowohl mit als auch ohne Nano-Ton, um die Dosis zu finalisieren und die Grundlage für klinische Studien zu schaffen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

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