Cu:Ag-Bimetallische Nanopartikel: Erhöhte antibakterielle Wirksamkeit gegen antibiotikaresistente Stämme – Eine Molekulardocking-Studie

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie untersucht den Einfluss verschiedener Silberkonzentrationen in Cu:Ag-bimetallischen Nanopartikeln, die als vielversprechende antibakterielle Wirkstoffe gegen antibiotikaresistente Bakterien entwickelt wurden. Cu:Ag-bimetallische Nanopartikel mit unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen von Ag (2,5; 5,0; 7,5 und 10 Gew.-%) in einer festen Cu-Menge (bezeichnet als 1:0,025, 1:0,050, 1:0,075 und 1:0,1) wurden mittels Ko-Fällungsverfahren unter Verwendung von Ammoniumhydroxid und deionisiertem Wasser als Lösungsmittel, Polyvinylpyrrolidon als Kappmittel sowie Natriumborhydrid und Ascorbinsäure als Reduktionsmittel synthetisiert. Die hergestellten Produkte wurden durch verschiedene Techniken charakterisiert. Die Röntgendiffraktometrie (XRD) bestätigte die Phasenreinheit und wies die Anwesenheit distinkter fcc-Strukturen sowohl für Cu- als auch Ag-Phasen nach. Die FTIR-Spektroskopie bestätigte das Vorhandensein von Schwingungsmoden, die verschiedenen funktionellen Gruppen entsprechen, und detektierte charakteristische Peaks des Bimetallischen. Die UV-Vis-Spektroskopie zeigte eine Verringerung der Bandlücke mit zunehmendem Ag-Gehalt. SEM- und HR-TEM-Mikrographen zeigten eine sphärische Morphologie der Ag-dotierten Cu-Bimetallischen mit Klein- und Großskalen-Agglomerationen. Die Proben wiesen unterschiedliche Dimensionen und Schichtabstände auf. Die bakterizide Wirkung der synthetisierten Cu:Ag-bimetallischen NPs zeigte statistisch signifikante (P < 0,05) Inhibitionszonen für verschiedene Ag-Dotierkonzentrationen gegen Staphylococcus aureus (S. aureus), Escherichia coli (E. coli) und Acinetobacter baumannii (A. baumannii) im Bereich von 0,85–2,8 mm, 0,55–1,95 mm bzw. 0,65–1,85 mm. Insgesamt waren Cu:Ag-bimetallische NPs wirksamer gegen Gram-positive als gegen Gram-negative Bakterien. Eine Molekulardocking-Studie von Ag-Cu-bimetallischen NPs wurde gegen β-Lactamase durchgeführt, ein Schlüsselenzym des Zellwandbiosynthesewegs, sowohl von S. aureus (Bindungsscore: −4,981 kcal/mol) als auch von A. baumannii (Bindungsscore: −4,013 kcal/mol). Ebenso wurde eine Bindungsinteraktionsanalyse gegen FabI des Fettsäurebiosynthesewegs von A. baumannii (Bindungsscore: −3,385 kcal/mol) und S. aureus (Bindungsscore: −3,012 kcal/mol) sowie gegen FabH von E. coli (Bindungsscore: −4,372 kcal/mol) durchgeführt. Diese theoretischen Berechnungen deuten darauf hin, dass Cu-Ag-bimetallische NPs mögliche Inhibitoren der ausgewählten Enzyme sind. Es wird vorgeschlagen, das in-vitro-Inhibitionsvermögen dieser Materialien zu erforschen, was neue Wege für die Antibiotika-Entdeckung eröffnen könnte.

Einleitung

Eine Vielzahl von Mikroorganismen – Bakterien, Pilze, Viren und Parasiten – existiert in der Erde und ihrer Umwelt. Diese Arten verursachen Komplikationen bei der Herstellung und Verwendung von medizinischer Ausrüstung, Gesundheitsprodukten, verarbeiteten Lebensmitteln, Wasseraufbereitungssystemen und häuslichen Sanitärprodukten [1, 2]. Ärzte setzen routinemäßig Antibiotika ein, um krankheitserregende Bakterien bei Mensch und Tier abzutöten. Der Nachteil des häufigen Antibiotikaeinsatzes besteht darin, dass Bakterien mit der Zeit resistent werden. Antibiotika verringern auch die Anzahl der „guten“ Bakterien im Körper, die Infektionen bekämpfen. Erkrankungen durch Infektionen mit antibiotikaresistenten Bakterien sind heute ein großes Problem in der Medizin. In diesem Zusammenhang wurden viele Keime als medikamentenresistent identifiziert [3–7]. Neue Anstrengungen zielen darauf ab, das Problem medikamentenresistenter Bakterien anzugehen und aktuelle antimikrobielle Wirkstoffe durch effizientere und ergänzende Therapien zu ersetzen. Hierbei hat die Nanotechnologie wesentlich zur Herstellung von Nanomaterialien wie metallischen und Metalloxid-NPs (z. B. Ag, Cu, CuO, TiO₂, SiO₂, MgO, ZnO) beigetragen, um der stetig wachsenden Zahl antimikrobiell resistenter Mikroorganismen entgegenzuwirken. Unter diesen haben Cu- und Ag-NPs vielversprechende antimikrobielle Eigenschaften gezeigt [8–12].

In den letzten Jahren wurden bimetallische NPs für verschiedene Anwendungen in Chemie, Materialwissenschaft, Biotechnologie und Umweltschutz entwickelt. Bimetallische NPs aus Kupfer (Cu) und Silber (Ag) mit hohem Anteil an Oberflächenatomen und großer spezifischer Oberfläche wurden intensiv untersucht [13]. Diese bimetallischen NPs sind aufgrund ihrer verbesserten chemischen, optischen, katalytischen, biologischen, plasmonischen und besonders antimikrobiellen Eigenschaften von großem Interesse [14–20]. Ag-Ionen können unter atmosphärischen Bedingungen bei 800–1000 °C durch Ethanol zu Silber-NPs reduziert werden [21, 22]. Silber-NPs besitzen eine gute antimikrobielle Wirksamkeit und werden daher in Sonnenschutzcremes und Wasseraufbereitung eingesetzt [23]. Cu-NPs werden durch Reduktion von Kupfersulfat mit Hydrazin in Ethylenglykol unter Mikrowellenbestrahlung hergestellt und können ebenfalls als antibakterielles Mittel dienen [24–26].

Metalle wie Cu und Ag einzeln verfügen nicht über vielversprechende optische, katalytische und strukturelle Eigenschaften und können nicht in Bimetallische umgewandelt werden. Andererseits bietet die Kombination beider Metalle (Cu:Ag) neue Möglichkeiten, Struktur und Morphologie des resultierenden Produkts für gewünschte Anwendungen abzustimmen. Je nach endgültiger Struktur – z. B. Kern-Schale, Hantelstruktur, Zwei-Schnittstellen-Struktur, zufällig gemischte Struktur oder blütenförmige Struktur – können bimetallische NPs ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität aufweisen [27–31]. Verschiedene Methoden stehen für die Synthese bimetallischer NPs zur Verfügung, darunter Ko-Fällung, Sol-Gel, Hydrothermal, Reduktion, Mikroemulsion und Polyol-Verfahren [32–37].

In dieser Studie wurden Cu:Ag-bimetallische NPs durch das Ko-Fällungsverfahren unter Verwendung von Ammoniumhydroxid und deionisiertem Wasser als Lösungsmittel, Polyvinylpyrrolidon als Kappmittel sowie Natriumborhydrid und Ascorbinsäure als Reduktionsmittel synthetisiert. Vier Proben mit unterschiedlichen Ag-Konzentrationen (2,5; 5; 7,5 und 10 mol-%) wurden bei festen Cu-Verhältnissen hergestellt. Mit steigenden Ag-Konzentrationen in den hergestellten bimetallischen NPs zeigten die Proben eine erhöhte Aktivität gegen Bakterien Acinetobacter baumannii, die Fieber und Übelkeit verursachen. Das synthetisierte Material nahm während des schnellen Wachstums eine rote Färbung an, was darauf hindeutet, dass die antimikrobielle Aktivität mit zunehmenden Ag-Konzentrationen in den bimetallischen NPs zunahm. Darüber hinaus wurden In-silico-Vorhersagen mittels Molekulardocking durchgeführt, um das Interaktionsmuster von Cu:Ag-bimetallischen NPs gegen das β-Lactamase-Enzym des Zellwandbiosynthesewegs sowie gegen die FabI- und FabH-Enzyme des Fettsäurebiosynthesewegs zu identifizieren.

Methoden

Materialien

Kupfer(II)-chlorid (CuCl₂·0,2H₂O, 98,9 %) und Silbernitrat (AgNO₃) als Vorläufer, Polyvinylpyrrolidon (PVP, mittleres Molekulargewicht 40.000) als Kappmittel, Natriumborhydrid (NaBH₄, 99,9 %) und L-Ascorbinsäure (C₆H₈O₆, 99,0 %) als Reduktionsmittel sowie Ammoniumhydroxid (NH₄OH) wurden nach Bezug von Sigma Aldrich, USA, in der vorliegenden Studie verwendet.

Synthese bimetallischer Cu:Ag-NPs

Bimetallische Cu:Ag-NPs wurden mittels Ko-Fällungsverfahren hergestellt, wie in Abb. 1 dargestellt. In deionisiertem Wasser wurden 1,25 g PVP und 0,5 g Ascorbinsäure zugegeben und bei 100 °C kräftig gerührt. Zwei Lösungen von je 40 ml Ammoniumhydroxid wurden einzeln hergestellt; in die eine wurden 1,7 g Kupferchlorid, in die andere 1,7 g Silbernitrat gegeben. Diese beiden Lösungen wurden nacheinander in die ursprünglich vorbereitete Lösung gegeben, wobei 0,5 g NaBH₄ hinzugefügt wurde. Anschließend wurde die finale Lösung 4 Stunden bei 100 °C gerührt, um sie homogen zu machen, und später bei 6000 U/min zentrifugiert, um die NPs vollständig zu extrahieren. Die erhaltenen bimetallischen NPs wurden bei 100 °C getrocknet, um Feuchtigkeit und Verunreinigungen vollständig zu entfernen und sicherzustellen, dass die hergestellten bimetallischen Produkte in reiner Form vorlagen [12]. Analog wurden vier Proben mit verschiedenen Ag-Konzentrationen (2,5; 5; 7,5 und 10 mol-%) bei festen Cu-Verhältnissen hergestellt.

Antimikrobielle Aktivität

Das in-vitro-bakterizide Potenzial der Cu:Ag-bimetallischen NPs wurde gegen pathogene Bakterien S. aureus, E. coli und A. baumannii, isoliert aus boviner mastitischer Milch, mittels Agar-Well-Diffusionsmethode bewertet. Mannitol-Salz-Agar, MacConkey-Agar und Lauria-Bertani-Agar wurden mit isolierten Bakterien bei aktiviertem Wachstum von 1,5 × 10⁸ KBE/ml bestrichen. Nach Aushärtung des Agars wurden fünf Wells mit einer gelben Pipette (15 mm Durchmesser, 10 µl, 5 µg/ml) hergestellt. Frisch hergestellte Cu:Ag-bimetallische NPs wurden in unterschiedlichen Verhältnissen in die Wells gegeben, verglichen mit 10 µl Amoxicillin (5 µg/ml) als Positivkontrolle und 50 µl deionisiertem Wasser als Negativkontrolle. Die bakterizide Aktivität der synthetisierten Cu:Ag-bimetallischen NPs wurde durch Messung der Inhibitionszonen (in mm) nach 15-stündiger Inkubation bei 37 °C bestimmt.

Statistische Analyse

Die bakterizide Aktivität der synthetisierten NPs mit Inhibitionszonenmessungen (mm) wurde mit SPSS 20.0 mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) als statistisch signifikant eingestuft [57].

Molekulardocking-Studie

Antibiotika verringern das Bakterienwachstum und verursachen den Tod von Bakterien durch Zellwandschädigung, Störung biochemischer Prozesse, Zellmembranschädigung und Penetration durch Biofilme [38]. In den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche Nanopartikel mit potenzieller bakterizider Aktivität berichtet, die Bakterien entweder durch Zellwandstörung oder durch Blockierung der Nahrungsquelle mittels eines Mechanismus ähnlich bekannter Antibiotika abtöten [39–41]. Daher gelten Enzyme, die zu diesen biochemischen Wegen gehören, als wichtige und attraktive Ziele für die Antibiotika-Entdeckung [12]. Hier wurden Schlüsselenzyme aus dem Zellwandbiosyntheseweg (β-Lactamase) und dem Fettsäurebiosyntheseweg (FabH und FabI) als mögliche Ziele ausgewählt, um den Interaktionsmechanismus von Cu:Ag-bimetallischen NPs mit deren aktiven Taschen als Inhibitoren zu bewerten (siehe Abb. 2).

Die 3D-Strukturparameter der ausgewählten Enzyme wurden aus der Protein Data Bank bezogen: PDB-Code 4U0X (2,03 Å Auflösung) für β-Lactamase [42] und 6AH9 (1,74 Å) für Enoyl-[acyl-carrier-protein]-Reduktase (FabI) von A. baumannii. β-Lactamase (3D-Struktur) mit PDB-ID 1MWU (2,6 Å) [44] und FabI mit PDB-Code 4CV1 (1,95 Å) [45] von S. aureus, während FabH von E. coli PDB-Code 4Z8D (2,0 Å) [46] hat.

Die Molekulardocking-Studie der Cu:Ag-bimetallischen NPs wurde mit ICM Molsoft v3.8–4a oder höher (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) durchgeführt, um Bindungsinteraktionen mit Schlüsselresten der aktiven Stelle zu identifizieren [47]. Das Protein/Rezeptor-Vorbereitungstool von ICM wurde für Optimierung und Strukturvorbereitung der ausgewählten Enzymziele verwendet. Schritte umfassten Hinzufügen polarer H-Atome, Entfernen von Wassermolekülen und Energieminimierung mit Standardparametern. Das ko-kristallisierte Ligandmolekül wurde entfernt, um Platz für das Docking der NPs zu schaffen. Die Bindungstasche wurde mittels Gitterbox definiert, die die Position des kristallisierten Liganden spezifiziert. Die Konformation mit der niedrigsten Bindungsenergie aus den Top-10-dockten Konformationen wurde in jedem Fall ausgewählt, um Interaktionsmuster und Bindungstendenz der Ag-Cu-bimetallischen NPs in der aktiven Tasche zu analysieren. PyMOL und Discovery Studio Visualizer Software wurden für Analyse und 3D-Darstellung der Bindungsinteraktionen eingesetzt [48]. Die Struktur der Cu:Ag-bimetallischen NPs wurde von PubChem im .sdf-Format abgerufen.

Charakterisierung

Strukturanalyse und Phasenreinheit wurden mittels XRD (PAN analytical X'pert pro XRD) mit Cu-Kα-Strahlung (λ = 0,154 nm, 20° bis 80°) untersucht. Das Vorhandensein von Schwingungsmoden entsprechender funktioneller Gruppen wurde mittels Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) mit Perkin-Elmer-Spektrometer evaluiert. Absorptionsspektren wurden mit einem UV-Vis-Genesys-10S-Spektrophotometer aufgenommen. FESEM gekoppelt mit EDS-Spektrometer (JSM-6610LV) und HR-TEM (JEOL JEM 2100F) dienten zur Visualisierung der Oberflächenmorphologien. Die ICM v3.8-4a oder höher (Molsoft L.L.C., La Jolla, CA) Software wurde für die Molekulardocking-Analyse verwendet.

Ergebnisse und Diskussion

Die XRD-Analyse wurde durchgeführt, um die Phasenzusammensetzung und Kristallstruktur der formulierten Produkte zu beurteilen. Abbildung 3a zeigt das XRD-Muster zwischen 20° und 80°. Im bimetallischen Cu:Ag werden die beobachteten Reflexionen bei ~38,2°, 46°, 64,4° und 77,1° den (111), (200), (220) und (311) Ebenen der fcc-Ag-Phase gemäß JCPDS Nr. 04-0783 [32, 49–52] zugeordnet. Im Fall von Cu entsprechen die bei 32,6°, 44,2° und 51° auftretenden Beugungen den (110), (111) und (200) Gitterebenen, die das Vorhandensein von fcc-strukturiertem CuO und metallischem Cu bestätigen und gut mit JCPDS Nr. 04-0836 [32, 53–56] übereinstimmen. Im extrahierten Muster wurden sowohl Ag- als auch Cu-Peaks beobachtet, was das Vorhandensein von NPs mit sowohl Ag- als auch Cu-Phasen bedeutet. Zudem zeigt die Existenz von CuO in Proben mit niedrigerem Ag-Gehalt (z. B. 1:0,025, 1:0,050 und 1:0,075), dass Cu-NPs oxidiert waren und bei hoher Temperatur aufgrund niedrigerer Ag-Konzentrationen ein nicht-schützendes Verhalten aufwiesen [52]. Im Gegensatz dazu zeigt die Probe mit dem höchsten Ag-Gehalt (1:0,1) einen CuO-Peak geringer Intensität, was die Bildung eines teilweise oxidfreien Produkts anzeigt [57]. Dies deutet darauf hin, dass die Zugabe von Ag die Oxidationsbeständigkeit der bimetallischen NPs verbessert [52]. Innerhalb der Nachweisgrenzen des Instruments wurden keine zusätzlichen Verunreinigungspeaks detektiert, während jede kristallographische Ebene energetisch distinkte Orte basierend auf der Atodendichte umfasst. Sowohl Cu- als auch Ag-NPs haben Hochdichtefacetten an der (111)-Ebene, die die maximale Orientierung der Ebenen freilegen [51, 58]. Mittels Braggschem Gesetz wurden die d-Abstände von Ag und Cu zu 0,24 bzw. 0,21 nm berechnet, was der distinkten (111)-Ebene beider Elemente entspricht und mit HR-TEM-Ergebnissen (Abb. 6) übereinstimmt [51, 59–62]. Entsprechende SAED-Ringe (Abb. 3b–d), erhalten aus den hergestellten bimetallischen Produkten, zeigen distinkte Ringmuster, die gut kristallisierte Produkte belegen und gut mit den XRD-Mustern übereinstimmen.

FTIR-Spektren wurden zwischen 500 und 4000 cm⁻¹ aufgezeichnet (Abb. 3e); das transmittierte Band zwischen 600 und 900 cm⁻¹ wird durch die Bildung von Cu:Ag-Bindungen verursacht [63]. Das beobachtete Band bei ~1200 und 1400 cm⁻¹ wird C–O- bzw. C–H-Schwingungen zugeschrieben; Peaks bei ~1800 und 2100 cm⁻¹ entsprechen C=O- und N–H-Bindungen aufgrund von PVP und NH₄OH [64]. Transmittanzen um ~2800 cm⁻¹ und 3400 cm⁻¹ werden dem Vorhandensein von C≡N und Hydroxylgruppen (O–H) zugeschrieben [64].

Abbildung 4a zeigt die Absorptionsspektren der Ag-Cu-bimetallischen NPs mit klaren Absorptionsbanden bei 340, 410 und 500 nm, die der oberflächenplasmonischen Resonanzabsorption von metallischem Ag und Cu zugeschrieben werden [52]. Die Bande bei 410 nm entsteht typischerweise durch das Vorhandensein von Ag-NPs, der spätere Peak bei 510 nm wird der Existenz von Cu-NPs zugeschrieben [52, 57–59, 65–67]. Es kann vermutet werden, dass bimetallische NPs mit distinkten Ag- und Cu-Phasen gebildet werden, anstatt einer echten bimetallischen Entwicklung, was auch durch die XRD-Ergebnisse bestätigt wurde [52]. Ein leichter Rotverschiebung des Absorptionsbands bei 410 nm und eine Zunahme der maximalen Absorption mit zunehmendem Ag-Gehalt wurden beobachtet [58]. Mit der Tauc-Gleichung wurde die Bandlücke der hergestellten bimetallischen Produkte zu 3,2; 2,9; 2,7 und 2,6 eV berechnet, wie in Abb. 4b–e dargestellt.

Aus SEM-Bildern (Abb. 5a–d) der als synthetisierten Cu:Ag-bimetallischen Nanokomposite ging hervor, dass kleine Partikel auf der Oberfläche großer Partikel abgelagert waren. Eine Erhöhung des Ag-Gehalts von 2,5 auf 7,5 % führte zur Bildung verschiedener Partikel mit variierender Morphologie, die schließlich in klobige Cu:Ag-NPs mündeten. Zudem nahm die Anreicherung ungleichmäßiger und winziger Ag-Partikel mit steigender Dotierkonzentration zu, was das Erscheinen weiterer verstreuter Blöcke auf der Oberfläche nahelegt. Dies verdeutlicht den großen Einfluss, den Ag-Dotierung in Cu auf die Morphologie hat, was durch HR-TEM-Mikrographen (Abb. 5e–h) weiter bestätigt wurde.

Um die Morphologie und d-Abstände der hergestellten Bimetallischen weiter zu erläutern, wurde HR-TEM mit 10 nm Auflösung eingesetzt. In Abb. 6a entspricht der d-Abstand (0,21 nm) der Cu-NPs der (111)-Fazette von Cu, wie auch in den XRD-Ergebnissen (Abb. 3a) evident. Abbildung 6b zeigt eine leichte Zunahme des Schichtabstands (0,21 auf 0,22 nm) und Ag-NPs mit 0,24 nm Interplanarabstand, der mit der (111)-Ebene übereinstimmt. Ebenso zeigen Abb. 6c, d berechnete Schichtabstände und separate Phasen des Bimetallischen, während Abb. 6e die Partikelform von Ag- und Cu-NPs demonstriert. Die Partikel in den HR-TEM-Bildern scheinen eine Kern-Schale-Struktur zu besitzen. In Abb. 6d wurden innerhalb eines einzelnen Partikels Gitterstreifen von Cu und Ag aufgezeichnet. Dies deutet stark auf die Bildung von Kern-Schale-Bimetallischen NPs mit unterschiedlichen Cu:Ag-Verhältnissen hin, die irreguläre quasi-sphärische NPs ergeben. Darüber hinaus zeigte das TEM-Bild Partikel als dunkle und helle Bereiche. Dieser Kontrastunterschied innerhalb eines einzelnen Partikels kann das Vorhandensein zweier distinkter Bestandteilsmaterialien anzeigen und die Erschaffung bimetallischer Cu:Ag-Partikel suggerieren [70, 71].

Das Vorhandensein distinkter Peaks im EDS-Spektrum und die elementare Zusammensetzung, die vom Bimetallischen stammen, bestätigten die erfolgreiche Bildung von Cu:Ag-NPs. Abbildung 7a zeigt das EDS-Spektrum der 1:0,050-Probe mit klaren Peaks von Cu und Ag. Abbildung 7b stammt von der 1:0,10-Probe, wo Peaks für C und O in den dotierten Proben detektiert wurden. Diese treten auf, da Kohlenstoff-Tabs verwendet werden, um Proben während der SEM-Untersuchung zu halten und/oder aufgrund von Hintergrundzählungen im SEM-EDS-Sensor.

Die in-vitro-bakterizide Wirksamkeit der Cu:Ag-bimetallischen NPs mittels Agar-Well-Diffusionsassay ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen einen direkt proportionalen Zusammenhang zwischen der synthetisierten NP-Konzentration und den Inhibitionszonen (mm). Statistisch signifikante (P < 0,05) Inhibitionszonen für (2,5; 5; 7,5 und 10 Gew.-%) Ag-Dotiermittel gegen S. aureus, E. coli und A. baumannii reichten von 0,85–2,8 mm, 0,55–1,95 mm bzw. 0,65–1,85 mm (siehe Tabelle 1). Alle Ergebnisse wurden mit deionisiertem Wasser (0 mm) und Amoxicillin (4 mm) als Negativ- bzw. Positivkontrolle verglichen. Ebenso stieg die prozentuale Wirksamkeit der dotierten NPs auf (21,2–70 %), (13,7–48,7 %) und (16,2–46,2 %) gegen S. aureus, E. coli und A. baumannii. Insgesamt waren Cu:Ag-bimetallische NPs wirksamer gegen S. aureus (Gram-positiv) im Vergleich zu E. coli und A. baumannii (Gram-negativ).

Größe, Konzentration und Form der NPs beeinflussen direkt den oxidativen Stress, der durch Nanostrukturen erzeugt wird. Die bakterizide Wirksamkeit in Form von Inhibitionszonen (mm) verbesserte sich aufgrund höherer Gew.-%-Dotierung von Ag-dotierten Cu-bimetallischen NPs durch erhöhte Kationenverfügbarkeit (++). Die bakterizide Wirkung in Bezug auf Größe und Konzentration zeigt eine umgekehrte Beziehung zur Größe [58, 59]. Nano-strukturierte Materialien produzieren effizient reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die in bakteriellen Zellmembranen verbleiben, was zur Extrusion von Zellorganellen und letztlich zum Bakterientod führt [60]. Neben der ROS-Produktion führt die kationische Interaktion von Ag⁺ und Cu²⁺ mit negativ geladenen Teilen der bakteriellen Zellmembran zu verbesserter bakterizider Wirksamkeit bei steigenden Konzentrationen durch Zelllyse und Bakterienkollaps [58, 61].

Biologische Anwendungen verschiedener Nanopartikelklassen wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht. Aufgrund einzigartiger Eigenschaften von NPs wurden sie weitreichend als bakterizide Wirkstoffe mit der Fähigkeit genutzt, traditionelle Antibiotika zu ersetzen. NPs interagieren mit bakteriellen Zellen, stören die Zellmembranpermeation und zerstören wichtige Stoffwechselwege [72]. Der spezifische Mechanismus der Nanopartikel-Toxizität gegenüber Bakterien muss erforscht werden. Man geht davon aus, dass NPs mit bakteriellen Zellen über elektrostatische Kräfte, Van-der-Waals-Kräfte oder hydrophobe Interaktionen interagieren, was letztendlich zum Bakterientod führt. Enzyme wurden als Hauptvirulenzfaktoren bei bakteriellen Infektionen berichtet, und ihre Hemmung hilft, die verursachte Infektion zu bekämpfen [73]. Hier identifizierte die Molekulardocking-Studie von Cu:Ag-NPs gegen Enzymziele des Zellwand- und Fettsäurebiosynthesewegs das Bindungsinteraktionsmuster dieser NPs in der aktiven Tasche. Angesichts des in-vitro-antibakteriellen Potenzials dieser NPs gegen A. baumannii, S. aureus und E. coli wurden die Enzymziele aus diesen Mikroorganismen ausgewählt, um Einblick in den möglichen Mechanismus hinter ihrer bakteriziden Aktivität zu erhalten.

Die beste dockte Konformation von Cu:Ag-bimetallischen NPs mit β-Lactamase von A. baumannii zeigte Wasserstoffbrückenbindungen mit Glu272 (2,8 Å) und Ser286 (3,2 Å) sowie Metallkontaktinteraktion mit Val292, während der Docking-Score −4,013 kcal/mol betrug (Abb. 8a). Ebenso betrug der Bindungsscore von Ag-Cu-bimetallischen NPs gegen β-Lactamase von S. aureus −4,981 kcal/mol mit Wasserstoffbrückenbindungen an Ser403 (3,2 Å), Tyr519 (3,6 Å), Gln521 (3,0 Å) und Asn464 (3,1 Å) (Abb. 8b).

Das zweite Enzymziel, FabI, gehört zum Fettsäurebiosyntheseweg, und Molekulardocking-Vorhersagen wiesen Cu:Ag-bimetallische NPs als potenzielle Inhibitoren gegen dieses Ziel aus. Die Cu:Ag-bimetallischen NPs zeigten einen guten Bindungsscore (−3,385 kcal/mol) gegen FabI von A. baumannii mit Wasserstoffbrückenbindungen an Ser201 (2,7 Å), Ala199 (3,5 Å) und Leu198 (3,3 Å) (Abb. 8c). Ebenso zeigte die beste dockte Konformation von Ag-Cu-NPs mit der aktiven Stelle von FabI von S. aureus Wasserstoffbrückenbindungen an Gly202 (2,5 Å) und Gln155 (2,5 Å) bei einem Bindungsscore von −3,012 kcal/mol (Abb. 8d).

Zusätzlich wurde die Bindungskapazität von Cu:Ag-bimetallischen NPs gegen FabH von E. coli evaluiert, wobei ein Bindungsscore von −4,372 kcal/mol mit Wasserstoffbrückeninteraktionen an Thr254 (3,5 Å), HIE244 (2,6 Å) und Glu302 (3,0 Å) beobachtet wurde (Abb. 8e).

Schlussfolgerung

Cu:Ag-bimetallische Nanopartikel wurden durch Ko-Fällungsverfahren für Anwendungen zur Bekämpfung bakterieller Erkrankungen hergestellt. XRD-Profile bestätigten das Vorhandensein von fcc-strukturiertem CuO, metallischem Cu und Ag-Partikeln. Sowohl Ag- als auch Cu-Peaks wurden beobachtet, was bimetallische NPs mit Ag- und Cu-Phasen belegt. Die in der XRD-Analyse beobachteten Ebenen korrelieren gut mit den SAED-Ringen. An den formulierten Produkten anhaftende chemische Gruppen und das charakteristische Transmissionsband zwischen 600 und 900 cm⁻¹ wurden durch die Bildung von Cu:Ag-Bindungen verursacht. Die aufgetragenen UV-Vis-Spektren zeigten Absorption bei 410 nm, die typischerweise durch das Vorhandensein von Ag-NPs entsteht, und ein späteres Maximum bei 510 nm, das der Existenz von Cu-NPs zugeschrieben wird. Die Partikel in den HR-TEM-Bildern wiesen eine Kern-Schale-Struktur auf. Cu:Ag-NPs zeigten eindeutig die Bildung bimetallischer NPs mit unterschiedlichen Cu:Ag-Verhältnissen, die irreguläre quasi-sphärische NPs ergaben. Weiterhin entspricht der d-Abstand der Cu-NPs (0,21 nm) der (111)-Fazette von Cu, detektiert in den XRD-Ergebnissen. Eine leichte Zunahme des Schichtabstands (von 0,21 auf 0,22 nm) zeigt ebenfalls, dass Ag-NPs mit 0,24 nm Schichtabstand der (111)-Ebene entsprechen. Die Molekulardocking-Studie zeigte gute Übereinstimmung mit der in-vitro-bakteriziden Aktivität. Die Bindungstendenz von Cu:Ag-bimetallischen NPs gegen das β-Lactamase-Enzym des Zellwandbiosynthesewegs sowie gegen die FabI- und FabH-Enzyme des Fettsäurebiosynthesewegs demonstrierte ihr Inhibitionsvermögen, das durch Enzyminhibitionsstudien weiter erforscht werden muss.