Folatrezeptor-gerichtete Bioflavonoid-Genistein-beladene Chitosan-Nanopartikel für eine verbesserte Antikrebswirkung bei Gebärmutterhalskrebs

Hintergrund

Gebärmutterhalskrebs beim Menschen ist weltweit eine der beliebtesten Krebsarten im fortpflanzungsfähigen Alter der Frau, die hauptsächlich durch das humane Papillomavirus (HPV) verursacht wird [1]. Als Hauptursachen für Gebärmutterhalskrebs nennt die „International Agency for Research on Cancer“ eine verminderte Immunabwehr, Rauchen und unregelmäßige sexuelle Aktivität [2]. Die neuesten Fortschritte in der Medizintechnik und Diagnose haben großen Einfluss auf die Senkung der Sterberate bei Gebärmutterhalskrebs; Dennoch nimmt diese Krebsart in Entwicklungsländern wie China immer noch zu. Zur Behandlung von Gebärmutterhalskrebs wurden zwei prophylaktische HPV-Impfstoffe (Gardasil und Cervarix) vermarktet; es zeigte jedoch nur bei erwachsenen Patienten Wirksamkeit und konnte bei den Patienten insgesamt nicht aufmuntern [3, 4]. Daher werden regelmäßig Behandlungsoptionen wie Chemotherapie, Operation und Strahlentherapie eingesetzt; jedoch ist keines bei der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs wirksam. Es wurde berichtet, dass Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle die Effizienz der Krebsbehandlung verbessern, wenn sie spezifisch verabreicht werden [5].

In letzter Zeit haben Naturstoffe bei der Behandlung von Krebs erhebliche Aufmerksamkeit erregt, da bekannt ist, dass sie im Vergleich zu Chemotherapeutika weniger toxisch sind [6]. Insbesondere Flavonoide, die in vielen Pflanzen vorkommen, haben entzündungshemmende und krebsbekämpfende Eigenschaften. Genistein (4′,5,7-Trihydroxyisoflavone) (GEN) ist ein potenziell wirksames Soja-Isoflavon, das aufgrund seiner wirksamen Antikrebs-Eigenschaften verstärkte Aufmerksamkeit erregt [7, 8]. Studien haben gezeigt, dass GEN Proteintyrosinkinasen und NF-κB hemmt und den Zellzyklus in der G2/M-Phase anhält. Dies wird zur Herunterregulierung von Genen führen, die mit der Zellproliferation und dem Wachstum von Krebszellen verbunden sind [9, 10]. Der G2/M-Phasenstopp wird die Migration und Invasion von Krebszellen unterdrücken und die Zellapoptose und den Zelltod induzieren [11]. Das klinische Potenzial von GEN wurde jedoch aufgrund seiner begrenzten Löslichkeit (~1,45 μg/ml) und begrenzter Bioverfügbarkeit behindert [12]. Daher besteht ein unmittelbarer Bedarf, die physikalisch-chemischen Eigenschaften von GEN und seine Antikrebseigenschaften zu verbessern.

Die Anwendung der Nanotechnologie in der Medizin gewinnt aufgrund ihrer Fähigkeit, die Antikrebseigenschaften verschiedener kleiner Moleküle zu verbessern, zunehmend an Aufmerksamkeit [13]. Die Verkapselung eines Wirkstoffs in einem Nanopartikel bietet zahlreiche Vorteile wie hohe Stabilität, verbesserte Wirkstoffbeladung, höhere Internalisierung, günstige Bioverteilung und verbesserte Pharmakokinetik [14]. Wichtig ist, dass Nanopartikel die Antikrebswirkung der eingekapselten Verbindung durch eine bevorzugte Akkumulation in Tumorgeweben erhöhen. Außerdem könnten Nanopartikel die Multi-Drug-Resistenz (MDR) von Tumorzellen umkehren [15, 16]. In der vorliegenden Studie haben wir natürlich gewonnene Chitosan-Nanopartikel aufgrund ihrer hervorragenden biologischen Abbaubarkeit und ihres Biokompatibilitätsprofils verwendet. Darüber hinaus bietet die primäre Amingruppe von Chitosan einige wichtige Eigenschaften, einschließlich Wasserlöslichkeit und Hämokompatibilität. Außerdem könnte eine Amingruppe verwendet werden, um die Oberfläche von Nanopartikeln zu verändern [17]. Um die Zielspezifität zu erhöhen, haben wir Folsäure auf der Oberfläche von Chitosan-Nanopartikeln konjugiert. Folsäure wurde aufgrund ihrer Überexpression in Gebärmutterhalskrebszellen als Targeting-Ligand ausgewählt. Die Folatrezeptoren sind in Gebärmutterhalskrebszellen in großer oder großer Zahl vorhanden. Um genau zu sein, ist FRs-α auch in normalen Zellen vorhanden, wird jedoch nicht dem Blutkreislauf ausgesetzt, während es im Falle von Krebszellen stark dem Blutkreislauf ausgesetzt ist, was es zu einem attraktiven Ziel für Folat-konjugierte Nanopartikel macht, die über Endocytose internalisiert werden könnten Mechanismen [18, 19].

In der vorliegenden Studie zielten wir in erster Linie darauf ab, die Antikrebseigenschaften von GEN gegenüber FR-α-überexprimierten HeLa-Zervixkarzinomzellen durch Einkapselung in FA-konjugierte Chitosan-Nanopartikel zu erhöhen. Die Nanopartikel wurden hinsichtlich Partikelgröße, Form und in vitro Freisetzungskinetik charakterisiert. Die zielgerichtete Wirkung von FA wurde durch einen zellulären Aufnahmetest in HeLa-Krebszellen untersucht. Die Antikrebswirkung von GEN und GEN-beladenen Nanopartikeln wurde durch Zytotoxizitätsassay, Lebend/Tot-Assay und Apoptose-Analyse untersucht.

Methoden

Materialien

Genistein wurde von Aladdin Chemicals (Shanghai, Volksrepublik China) gekauft. Folsäure, Chitosan (85% deacetyliert), wurde von Sigma-Aldrich, China, bezogen. EDC und NHS wurden ebenfalls von Sigma-Aldrich, China, bezogen. Alle anderen Chemikalien sind von Reagenzqualität und werden ohne Modifikationen verwendet.

Herstellung von GEN-beladenen Folsäure-konjugierten Chitosan-Nanopartikeln

Vor der Herstellung von Nanopartikeln wurde Folsäure-Chitosan-Konjugat hergestellt. Kurz gesagt wurden 44,1 mg Folsäure in DMSO zusammen mit einer Mischung aus 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDAC.HCl) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) (Molverhältnis 1:1,5:1,5 .) gelöst ). Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt, um die Aktivierung der funktionellen Gruppe zu ermöglichen. Die organische Lösung wurde tropfenweise in Chitosanlösung (0,5% Gew./Gew.) unter kontinuierlichem Rühren gegeben. Das Rühren wurde über Nacht unter dunklen Bedingungen fortgesetzt. Der pH wurde durch Zugabe von 1 M Natriumhydroxid auf pH 8 eingestellt. Am Ende wurde die Mischung zentrifugiert, um den gelben Niederschlag abzutrennen und mit Natriumcarbonat gewaschen und dann erneut mit Wasser dialysiert.

Um Nanopartikel herzustellen, wurden GEN, Chitosan und Chitosan-FA-Konjugat (10:1) in DMSO gelöst. Die DMSO-Lösung wurde dann tropfenweise in 0,5% Tween 80-Lösung unter kontinuierlichem Rühren zugegeben. Die Mischung wurde 3 h lang gerührt und nachdem alle Lösungsmittel verdampft waren, wurde die Suspension 30 Minuten lang bei 10.000 U/min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und durch das HPLC-Verfahren bewertet. Die Proben wurden durch HPLC (LC 1100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule bei 25 °C quantifiziert. Eine mobile Phase aus Methanol/Wasser (60/40, v /v) wurde als mobile Phase bei einer Flussrate von 1 ml/min verwendet.

Analyse von Partikelgröße und Oberflächenmorphologie

Die Partikelgröße und Größenverteilung der Nanopartikel wurde mit Malvern Mastersizer 2000 (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments Ltd., UK) beobachtet. Die Proben wurden vor der Analyse geeignet verdünnt. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt.

Die Oberflächenmorphologie der Nanopartikel wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEM-1230, JEOL, Tokio, Japan) bewertet. Kurz gesagt wurde die Nanopartikeldispersion mit 2% PTX gemischt und auf das TEM-Gitter gelegt und 10 Minuten lang unter schwacher Infrarotstrahlung getrocknet. Die Proben wurden mit Phosphotungistinsäure (2%) gegengefärbt und unter TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV untersucht.

In-vitro-Studie zur Wirkstofffreisetzung

Die Studie zur Wirkstofffreisetzung wurde durch ein Dialyseverfahren durchgeführt. Kurz gesagt wurden 5 mg Äquivalent GEN-Nanopartikel in 1 ml Freisetzungspuffer (PBS, pH 7.4) suspendiert und in ein Dialyseröhrchen (MWCO:3500) überführt. Das Dialyseröhrchen wurde in ein Falcon-Röhrchen gegeben, das 25 ml Freisetzungspuffer enthielt. Das Falcon-Röhrchen wurde unter leichtem Rühren bei 37 °C in einen Schüttler gegeben. In vorher festgelegten Intervallen wurde ein spezifisches Probenvolumen entnommen und durch frischen Puffer oder Medium ersetzt. Das aus dem Freisetzungsmedium freigesetzte Arzneimittel wurde durch HPLC untersucht.

Zellkultur

Die humane Zervixkarzinom-Zelllinie (HeLa-Zelle) wurde von ATCC, MS, USA bezogen und in DMEM mit 10 % FBS und einer Antibiotikamischung bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid gezüchtet.

Mobilfunkaufnahme

Die Targeting-Effizienz von Nanopartikeln (GCN und FGCN) wurde durch zelluläre Aufnahmeanalyse untersucht. In dieser Studie wurde Cumarin-6 als Fluoreszenzsonde verwendet. Die Zellen wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und 24 h anhaften gelassen. Das Kulturmedium wurde entfernt und durch frisches Medium ersetzt, das GCN und FGCN enthielt, und für verschiedene Intervalle inkubiert. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen, lysiert (Triton-X), zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Der Überstand wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität durch einen Mikroplattenleser (GENios, Tecan, Schweiz) zu bewerten. Die Absorption wurde bei einer Anregungswellenlänge von 430 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm gemessen.

Bildgebung der zellulären Aufnahme

Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (Olympus Fluoview FV-1000, Tokio, Japan) wurde verwendet, um die qualitative zelluläre Aufnahme in Krebszellen zu bestimmen. 2 × 10 ⁵ Zellen wurden in einer 6-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Die Medien wurden entfernt und durch frische Medien mit GCN und FGCN ersetzt und 2 h inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, fixiert und erneut gewaschen. Die Zellen wurden dann unter Verwendung von CLSM beobachtet.

Zytotoxizitäts-Assay

Die Zellabtötungseffizienz von freiem GEN, GCN und FGCN wurde mit Hilfe des MTT-Testprotokolls untersucht. HeLa-Zellen mit einer Aussaatdichte von 1 × 10 ⁴ Die Zellen wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und 24 h anhaften gelassen. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit freiem GEN, GCN und FGCN in 100 μl frischem Medium behandelt und 24 h inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und zweimal mit PBS gewaschen. Zehn Mikroliter DMEM, das MTT (5 mg/ml) enthielt, wurden in eine 96-Well-Platte gegeben und 4 Stunden beiseite gelassen. Die MTT-Lösung wurde abgesaugt und DMSO wurde zugegeben, um Formazankristalle aufzulösen, die lebenden Zellen entsprechen. Die Absorption von Formazan wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm mit einem Plattenlesegerät (Bio-Tek Instruments Inc., USA) untersucht. Der IC50 wurde auch mit der GraphPad Prizm-Software (Version 17) berechnet.

Live/Dead-Assay

HeLa-Zellen mit einer Aussaatdichte von 2 × 10 ⁵ Zellen wurden in einer 6-Well-Platte ausgesät und 24 h inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit freiem GEN, GCN und FGCN in 100 μl frischem Medium behandelt und 24 h inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden nach den Angaben des Herstellers (Molecular Probes, USA) verarbeitet. Calcein AM und Ethidiumhomodimer sind jeweils lebende und tote Zellfarbstoffe, die zum Färben verwendet werden.

Statistische Analyse

Die Daten wurden mithilfe von t . statistisch analysiert Prüfung. A P ein Wert von weniger als 0,05 wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu zeigen. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Gebärmutterhalskrebs beim Menschen ist weltweit eine der beliebtesten Krebsarten im fortpflanzungsfähigen Alter von Frauen, die hauptsächlich durch humane Papillomaviren verursacht wird. Daher werden regelmäßig Behandlungsoptionen wie Chemotherapie, Operation und Strahlentherapie eingesetzt; jedoch ist keines bei der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs wirksam. Es wurde berichtet, dass Chemotherapeutika oder andere kleine Moleküle die Effizienz der Krebsbehandlung verbessern, wenn sie spezifisch verabreicht werden. In letzter Zeit haben natürliche Verbindungen erhebliche Aufmerksamkeit bei der Behandlung von Krebs erlangt, da bekannt ist, dass sie im Vergleich zu chemotherapeutischen Arzneimitteln weniger toxisch sind. Genistein hat aufgrund seiner starken krebshemmenden Eigenschaften zunehmende Aufmerksamkeit erhalten. Das klinische Potenzial von GEN wurde jedoch aufgrund seiner schlechten Löslichkeit (~1,43 μg/ml) und seiner geringen Bioverfügbarkeit behindert. In der vorliegenden Studie zielten wir in erster Linie darauf ab, die Antikrebseigenschaften von GEN gegenüber FR-α-überexprimierten HeLa-Zervixkarzinomzellen durch Einkapselung in FA-konjugierte Chitosan-Nanopartikel zu erhöhen (Abb. 1).

Schematische Darstellung der Herstellung von Genistein-beladenen Folsäure-konjugierten Chitosan-Nanopartikeln

Physikochemische Charakterisierung eines GEN-beladenen Nanopartikelsystems

Die Größe und das Zeta-Potenzial des Partikelsystems spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Internalisierung und der systemischen Leistung von Krebsmedikamenten. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde verwendet, um die Partikelgröße und Größenverteilung der GEN-beladenen Nanopartikel zu bestimmen (Abb. 2). Die durchschnittliche Partikelgröße von GCN betrug ~140 nm, während FGCN ~165 nm mit einem ausgezeichneten Polydispersitätsindex betrug. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser des FGCN beträgt weniger als 200 nm, was ausreicht, um das Tumorgewebe mit verbesserten Permeations- und Retentionseffekten zu durchdringen. Die geringe Partikelgröße könnte der schnellen Clearance-Eigenschaft von Nanopartikeln aus dem Körper (RES) widerstehen [20]. Die Oberflächenladung gilt als wichtiger Indikator für die Partikelstabilität in Suspensionsform. Das durchschnittliche Zetapotential von GCN betrug +26 mV, während FGCN +21,5 mV betrug. Eine leichte Abnahme der Oberflächenladung könnte der Substitution der Amingruppe von Chitosan zugeschrieben werden. Darüber hinaus zeigten GCN und FGCN eine hohe Einschlusseffizienz von mehr als>95 %, was auf ihre Eignung für systemische Anwendungen hinweist. Die Partikelgröße und das Zetapotential von FGCN blieben während der Lagerung für 3 Monate unverändert, was auf seine hohe Lagerstabilität hindeutet (Abb. 3).

Transmissionselektronenmikroskop von FGCN

In-vitro-Freisetzungsprofil von GCN und FGCN in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7.4). Die Menge des freigesetzten Arzneimittels wurde durch die HPLC-Methode quantifiziert und das Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt

Oberflächenmorphologieanalyse

Die Oberflächenmorphologie von optimiertem FGCN wurde durch TEM charakterisiert. Die Nanopartikel wiesen eine kugelförmige Morphologie auf und waren gleichmäßig im Kupfergitter verteilt. Die bei der TEM-Analyse beobachtete Partikelgröße stimmte mit der DLS-Beobachtung überein (Abb. 4).

Zelluläre Aufnahmeanalyse von GCN und FGCN in HeLa-Zervixkarzinomzellen. a Quantitative Analyse der zellulären Aufnahme von Nanopartikeln mittels Fluoreszenzmethode. b Konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM)-basierte Analyse der zellulären Aufnahme. Cumarin-6 wurde als Fluoreszenzsonde verwendet

In-vitro-Wirkstofffreisetzungskinetik

Die Freisetzung von GEN aus GCN und FGCN wurde unter Verwendung von Dialyseverfahren durchgeführt. PBS wurde verwendet, um die Freisetzungsstudie durchzuführen, um physiologische Bedingungen zu simulieren. Wie erwartet waren die Freisetzungsprofile von GCN und FGCN fast ähnlich. Beide Formulierungen zeigten ein kontrolliertes Freisetzungsprofil für GEN und zeigten eine monophasische Freisetzungskinetik. Etwa 35–40 % des Wirkstoffs wurden nach 24 Stunden aus beiden Nanopartikelsystemen freigesetzt. Der Trend der GEN-Freisetzungsrate hielt bis zum Ende des Studienzeitraums an und schließlich wurden ~90% des Arzneimittels freigesetzt. Die Folatkonjugation an der Oberfläche beeinflusst die geringe Freisetzung des Arzneimittels, was auf den Einfluss des Vorhandenseins von konjugiertem Material hinweist. Es wurde berichtet, dass eine kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels aus NP der Verlängerung der Weglänge des Arzneimittels zum äußeren Freisetzungsmedium zugeschrieben wurde. Insgesamt deutet eine kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels bei pH 7,4 darauf hin, dass ein Großteil des Arzneimittels intakt ist und sich mit der Zeit im Tumorgewebe anreichert.

In-vitro-Studie zur zellulären Aufnahme

Die intrazelluläre Konzentration von GEN ist sehr wichtig, um seine zytotoxische Wirkung in den Krebszellen auszulösen. Daher ist das zelluläre Aufnahmepotential des NP-Systems aus Sicht der therapeutischen Wirksamkeit sehr wichtig. Die mit Cumarin-6 beladenen GCN und FGCN wurden zu verschiedenen Zeitpunkten in Krebszellen inkubiert. Beide NP-Systeme zeigten eine zeitabhängige zelluläre Aufnahme mit einer maximalen zellulären Aufnahme nach 4 h. Wie erwartet zeigte Folsäurerezeptor-gerichtetes FGCN eine statistische (p < 0,05) höhere zelluläre Aufnahme in HeLa-Krebszellen. Auch hier wird die überwiegende Aufnahme von FGCN in den meisten Fällen auf die Verfügbarkeit von FA auf der Partikeloberfläche zurückzuführen sein, das die Interaktion des Liganden mit den entsprechenden Rezeptoren erleichtern könnte und das in HeLa-Zellen in großer Zahl vorhanden ist [21].

Die zelluläre Aufnahme wird weiter durch mikroskopische Bildgebung bestätigt. Die Zellen wurden mit respektierten Formulierungen inkubiert und 2 h lang inkubiert. Wie zu sehen ist, wurde eine hohe Fluoreszenzintensität für FGCN-exponierte Krebszellen im Vergleich zu der von GCN-behandelten Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, dass Folsäure-konjugiertes FGCN aufgrund der Liganden-Rezeptor-(FA-FR-α)-Erkennung eine spezifische Affinität für die kanzerösen HeLa-Zellen aufwies.

In-vitro-Zytotoxizität

Die in vitro zytotoxische Aktivität von GEN, GCN und FGCN auf HeLa-Krebszellen wurde durch das MTT-Testprotokoll untersucht. Wie zu sehen war, waren Nanoformulierungen von GEN beim Abtöten der Krebszellen wirksamer als die von freiem GEN. Alle Formulierungen zeigten jedoch eine typische dosisabhängige zytotoxische Wirkung in den Krebszellen. Erwartungsgemäß wiesen Folsäure-markierte Nanoformulierungen einen statistisch (p < 0,05) höhere zytotoxische Wirkung im Vergleich zu nicht zielgerichteten Formulierungen. Die überlegene Antikrebswirkung von FGCN wurde der spezifischen rezeptorvermittelten Internalisierung von Nanopartikeln in die Krebszellen zugeschrieben, die die Wirkstoffkonzentration in der intrazellulären Umgebung erhöhen könnte. Darüber hinaus trug auch die Fähigkeit von Nanopartikeln, die Freisetzung der eingekapselten Verbindung zu kontrollieren, zur hohen Zytotoxizität von FGCN bei. Der IC50-Wert wurde verwendet, um die tatsächliche zytotoxische Wirkung von Formulierungen auf die Krebszellen zu bewerten. Im Allgemeinen ist es die Konzentration, die erforderlich ist, um die Hälfte der ursprünglichen Zellen abzutöten. Die Ergebnisse zeigten, dass der IC50-Wert von GEN bei Behandlung mit GCN von 33,8 auf 26,5 μg/ml abnahm. Wichtig ist, dass der IC50-Wert bei Behandlung mit FGCN nach 24-stündiger Inkubation auf 14,6 μg/ml abnahm. Von Nanopartikeln wurde berichtet, dass sie die MDR-Wirkung reduzieren, und es wird daher erwartet, dass sie die Antikrebswirksamkeit von GEN erhöhen, indem sie seinen durch das P-Glykoprotein vermittelten Efflux aus Zellen reduzieren. Die überlegene krebshemmende Wirkung von FGCN stand im Einklang mit seiner hohen zellulären Aufnahme in HeLa-Krebszellen [22].

Mikroskopische Analyse

Morphologische Analysen von Krebszellen wurden nach der Behandlung mit Krebsmedikamenten durchgeführt. Die Formulierungen wurden Krebszellen ausgesetzt und 24 h inkubiert. Die Kontrollzellen waren normal und verteilten sich auf dem Deckglas der Well-Platte, während die Zellen in der mit Formulierungen behandelten Gruppe schrumpften. In Übereinstimmung mit dem Zytotoxizitätsassay war die Morphologie der Krebszellen für verschiedene Formulierungen unterschiedlich. Wie gezeigt, waren die Zahl der mit FGCN behandelten Zellen geringer und die runde Morphologie weist auf die höhere Zytotoxizität der Formulierungen hin. Das GCN induzierte aufgrund seiner relativ höheren Aufnahme in Krebszellen auch bemerkenswerte Veränderungen in den Krebszellen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass mit Chitosan beschichtete Nanopartikel für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von Vorteil sind (Abb. 5).

In-vitro-Zytotoxizitätsanalyse von GEN, GCN und FGCN in HeLa-Krebszellen. Die Zellen wurden mit den jeweiligen Formulierungen behandelt und 24 h inkubiert. **p < 0,01 ist der statistische Unterschied zwischen FGCN und GEN.A

Live/Dead-Assay

Das zytotoxische Potenzial einzelner Formulierungen wurde durch Lebend/Tot-Assay weiter untersucht. Die Menge an lebenden und toten Zellen nach der medikamentösen Behandlung (für 24 h) wurde anhand der grünen Fluoreszenzintensität visualisiert. Calcein AM und Ethidiumbromid-Farbstoff sind repräsentative Marker für lebende und tote Zellen, die auf mit Formulierungen behandelte Zellen aufgebracht werden. Die verbleibenden lebenden Zellen, die nach der medikamentösen Behandlung vorhanden sind, nehmen Calcein auf und emittieren grünes Fluoreszenzlicht (488 nm). Wie gezeigt, zeigten unbehandelte Zellen eine hohe Fluoreszenzintensität (grüne Fluoreszenz), und die Behandlung von freiem GEN reduzierte auch die wachsenden Zellen nicht. Andererseits zeigte FGCN weniger lebende Zellen und mehr tote Zellen (niedrige Fluoreszenzintensität), was auf die starke Wirkung hinweist. Die hohe Zelltodrate der mit FGCN behandelten Gruppe wurde der höheren Internalisierung von Nanopartikeln in Krebszellen zugeschrieben. Das Ergebnis stimmt mit dem Zytotoxizitätstest überein (Abb. 6).

Morphologische Analyse von HeLa-Krebszellen nach Behandlung mit GEN, GCN und FGCN

Apoptose-Analyse

In dieser Studie haben wir ein einzigartiges, auf Folsäurerezeptoren ausgerichtetes Abgabesystem entwickelt, das die intrazelluläre Konzentration von GEN erhöhen und die Antikrebswirkung in Gebärmutterhalskrebszellen verbessern könnte. Um die apoptotische Induktionseigenschaft von freiem GEN, GCN und FGCN NP zu analysieren, wurden die Zellen daher durch Durchflusszytometrie nach Annexin V/PI-Doppelfärbung bewertet. 7 zeigt, dass mit freiem GEN behandelte Zellen keine nennenswerte Apoptose von Krebszellen induzierten, während GCN (~22%) die Apoptose in diesen Krebszellen wirksam induzierte. Wie erwartet zeigte FGCN eine bemerkenswerte Apoptose von Krebszellen (~55%), was auf seine überlegene Antikrebswirkung hindeutet. Die höhere Antikrebswirkung der Formulierungen war auf die spezifische Affinität des Liganden zu den entsprechenden Rezeptoren zurückzuführen, was wiederum die Wirkstoffkonzentration in den Krebszellen erhöhte. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass mit Chitosan beschichtete Nanopartikel für die Behandlung von Gebärmutterhalskrebs von Vorteil sein werden. Die Nanotechnologie-Plattform für die Krebsmedikamente erhöhte die Toxizität in den Krebszellen und erhöhte die therapeutische Wirksamkeit von Antitumormitteln (Abb. 8).

Lebend/tot-Assay von HeLa-Krebszellen nach Behandlung mit GEN, GCN und FGCN. Die grüne Fluoreszenz zeigt die lebenden Zellen an

Apoptoseanalyse von HeLa-Krebszellen nach Behandlung mit GEN, GCN und FGCN. Ein Durchflusszytometer wurde verwendet, um den Anteil der Zellapoptose zu analysieren. **p < 0,01 ist der statistische Unterschied zwischen FGCN und GEN

Schlussfolgerungen

In dieser Studie wurden neue folsäurekonjugierte Chitosan-Nanopartikel für die spezifische Abgabe des Bioflavonoids Genistein (GEN) an die Gebärmutterhalskrebszellen formuliert. FGCN zeigte in HeLa-Zellen ein verbessertes Internalisierungspotential als das von GCN. Die Ergebnisse zeigten, dass FGCN eine spezifische Affinität zu HeLa-Zellen aufweist, die zu einer besseren Behandlung beitragen wird. Folsäure-markierte Nanoformulierungen zeigten eine überlegene zytotoxische Wirkung im Vergleich zu nicht zielgerichteten Formulierungen. Konsequenterweise sank der IC50-Wert von GEN von 33,8 auf 14,6 μg/ml bei Behandlung mit FGCN nach 24 h Inkubation. Die Apoptose-Studien zeigten, dass die FGCN-Nanopartikel in Bezug auf die Antikrebsaktivität entweder GCN oder freies GEN waren. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Konjugation von Folat an das Abgabesystem einen großen Einfluss auf das Überleben von Gebärmutterhalskrebs haben könnte, der für die gesamte Krebsbehandlung von Vorteil sein wird. Die Studie am klinischen Tiermodell stellt den nächsten Schritt der vorliegenden Studie dar.

Abkürzungen

EPR:

Verbesserte Permeation und Retention

FGCN:

Folsäure-konjugierte GEN-beladene Chitosan-Nanopartikel

FR:

Folatrezeptoren

GCN:

GEN-beladene Chitosan-Nanopartikel

GEN:

Genistein